LA BIOLOGIA DELL`ESTIVAZIONE

LA BIOLOGIA DELL'ESTIVAZIONE: ADATTAMENTI STRUTTURALI DEL CUORE E DEL
RENE NEL DIPNOO AFRICANO, Protopterus dolloi
Proponente: Adamo Cristina
Membro del progetto: Barbieri Sandra Francesca
I lungfish (Dipnoi), teleostei appartenenti alla classe dei Sarcopterigi, sono attualmente
rappresentati da 3 generi: Lepidosiren (L. paradoxa, sud America), Neoceratodus (N. forsteri,
Australia) e Protopterus (P. dolloi, P. aethiopicus. P. annectens, P. amphibious, Africa). La loro
caratteristica peculiare è quella di possedere un rudimentale polmone derivante da un’estroflessione
ventrale dall’esofago. Ciò consente di respirare aria e sopravvivere per lunghi periodi anche in
assenza di acqua (Graham, 97), andando incontro all’insieme di modificazioni metaboliche e
strutturali che vanno comunemente sotto il nome di “estivazione”. Essa per molti versi è
comparabile all’ibernazione. Un esempio paradigmatico di estivazione è quella di P. dolloi. La
biologia, il comportamento, il metabolismo (Fishman et al.,1986) e la struttura cardiaca (Burggren
at al.,1986) dei Dipnoi sono ben documentate. Durante l’estivazione esso secerne un bozzolo
costituito da muco e sali e va incontro ad uno stato di torpore caratterizzato da cambiamenti cardiorespiratori e metabolici, quali il decremento del consumo di ossigeno, la riduzione della frequenza
cardiaca e della pressione sanguigna (Fishman et al.,1986). La perdita di liquidi è contrastata, oltre
che dal bozzolo anche da una riduzione della produzione di urina (oliguria), con conseguente
incremento delle scorie metaboliche, quali l’urea (Fishman et al 1986). Nonostante gli eventi sopra
riportati siano stati ben descritti (Fishman et al.,1986), mancano però studi a livello cardiaco e
renale circa i cambiamenti strutturali e molecolari ad essa associati.
Recenti studi hanno evidenziato un coinvolgimento dell’ossido nitrico (NO) nei cambiamenti delle
proprietà vascolari degli animali ibernanti, con significativi decrementi del flusso ematico al
miocardio e incrementi della resistenza vascolare coronarica (Kudey and Vatner 2003). Sebbene ad
oggi non siano noti effetti extracardiaci dello NO in condizioni di torpore metabolico, è accertato
che esso svolge un ruolo chiave nella regolazione del bilancio dei fluidi e nell’omeostasi del sodio
nel rene dei vertebrati mammiferi e non mammiferi (Kone 2004; Martin et al., 2002). Lo NO è una
molecola gassosa altamente diffusibile prodotta in vari tipi cellulari dalle tre isoforme dell’enzima
ossido nitrico sintasi (NOS): NOS neuronale (nNOS), NOS inducibile (iNOS) e NOS endoteliale
(eNOS). La loro attivazione produce significativi effetti funzionali in molti organi, inclusi il cuore
ed il rene dei mammiferi (Moncada and Higgs, 1993) e nei vertebrati non mammiferi quali anfibi e
teleostei (Tota et al., 2005, Imbrogno et al., 2001, Amelio et al. 2006 in press).
Scopo del presente progetto è quello di effettuare uno studio del riarrangiamento strutturale del
cuore e del rene di P. dolloi nella transizione dalla vita acquatica all’estivazione. Inoltre, in assenza
di informazioni di letteratura, ci proponiamo di descrivere l’eventuale presenza e il pattern di
distribuzione delle isoforme della NOS sia a livello del cuore che del rene, e il coinvolgimento dello
NO nella regolazione della funzionalità di questi organi. Forniremo quindi un quadro relativo alle
modificazioni morfo-funzionali connesse allo stato ipometabolico indotto dall’estivazione.
DESCRIZIONE DEL PROGRAMMA DI RICERCA
Nei Dipnoi, l'estivazione è associata a notevoli riarrangiamenti morfofunzionali che potrebbero
coinvolgere diversi effettori omeostatici quali lo NO e la famiglia delle NOSs predisposte alla sua
sintesi.
Il nostro obiettivo è quello di descrivere le variazioni strutturali ed ultrastrutturali che subisce il
cuore ed il rene di P. dolloi durante l’estivazione. Inoltre vogliamo analizzare la presenza
dell'attività totale della NOS e il diverso pattern di distribuzione delle tre isoforme enzimatiche
(eNOS, iNOS, nNOS) nel cuore e nel rene del P. dolloi in condizioni di vita acquatica (controllo),
dopo 6 giorni e dopo 40 giorni di estivazione. I dati, ottenuti mediante diverse tecniche (NADPH
diaforasi, immunofluorescenza, western blotting), saranno confrontati con le informazioni di tipo
strutturale e ultrastrutturale ottenute con l'ausilio di tecniche convenzionali di microscopia ottica ed
elettronica e completati con analisi morfometriche.
METODOLOGIA PREVISTA
I campioni di P. dolloi provenienti dal laboratorio del Prof. Ip, dell’Università di Singapore, saranno
divisi in 3 gruppi: A) controlli, B) sei giorni di estivazione e C) 40 giorni di estivazione. Cuori
(apice ventricolare) e reni (porzione mediana) saranno fissati in glutaraldeide al 3% e inclusi in
araldite. Su sezioni semifini ed ultrasottili verranno condotte analisi morfometriche del miocardio
sia a livello strutturale (“muscolarizzazione” del ventricolo, area superficiale e spessore delle
trabecole) che ultrastrutturale (area cellulare, rapporto nucleo/citoplasma, compartimenti
miofibrillari e mitocondriali). A livello renale, si analizzeranno i cambiamenti strutturali e
l’arrangiamento spaziale delle componenti del nefrone mediante l’utilizzo della microscopia a
scansione. L’attività totale della NOS sarà valutata mediante la NADPH-diaforasi su sezioni
criostatate provenienti da campioni fissati in azoto liquido e post-fissate in paraformaldeide al 4%.
L’identificazione del pattern di distribuzione delle isoforme della NOS avverrà mediante
immunofluorescenza diretta e indiretta impiegando anticorpi coniugati FITC (anti eNOS, iNOS,
nNOS) sia su sezioni criostatate che paraffinate. Queste ultime saranno ottenute da campioni di rene
e cuore fissati in una miscela di metanolo, acetone, acqua (MAW), inclusi in paraplast e tagliati al
microtomo. La valutazione quantitativa dell’espressione della NOS verrà effettuata mediante lettura
densitometrica delle bande ottenute da estratti cardiaci e renali processati mediante Western
Blotting.
RISULTATI ATTESI
Ci proponiamo di:
1) Fornire uno studio sistematico della struttura e dell'ultrastruttura del cuore e del rene del Dipnoo
Africano Protopterus dolloi;
2) Analizzare i cambiamenti strutturali eventualmente indotti in questi due organi dopo un breve (6
giorni) e un lungo periodo di estivazione (40 giorni);
3) Verificare la presenza (western blotting) la funzionalità (NADPH-diaforasi) e il pattern di
distribuzione cardiaco e renale delle isoforme della NOS (immunofluorescenza). Ciò consentirà di
evidenziare l’eventuale coinvolgimento dello NO nel controllo della contrattilità cardiaca e nella
regolazione del bilancio idro-salino sia in condizioni acquatiche che durante l’estivazione.
Il presente lavoro potrà fornire un’ampliamento delle attuali conoscenze relative ai cambiamenti
morfo-funzionali indotti dagli stati ipometabolici. Infatti, i lungfishes, grazie al loro particolare
ciclo vitale, forniscono un ottimo modello sperimentale per indagare tali cambiamenti.
BIBLIOGRAFIA
Burggren W. W., Johansen K. 1986 Circulation and respiration in lungfishes (dipnoi). Journal of
Morphology 190, S1: 217-236
Graham J.B. 1997. Metabolic adaption. In Air-breathing Fishes: Evolution, Diversity and
Adaptation, pp 223-240. London. Accademic Press.
Fishman A. P., Pack A.I., Delanmey R.G. and Galante R.J. 1986 Estivation in Protopterus. J. of
morphology supplement 1: 237-248.
Kudej RK, Vatner SF 2003. Nitric oxide-dependent vasodilation maintains blood flow in true
hibernating myocardium.J Mol Cell Cardiol. 35(8):931-5.
Kone BC. 2004 Nitric oxide synthesis in the kidney: isoforms, biosynthesis, and functions in health.
Semin Nephrol.24(4):299-315
Martin PY, Bianchi M, Roger F, Niksic L, Feraille E. 2002 Arginine vasopressin modulates
expression of neuronal NOS in rat renal medulla. Am J Physiol Renal Physiol. 283(3):F559-68.
Moncada S, Higgs A. 1993 The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med. 30;329(27):200212.
Tota B, Amelio D, Pellegrino D, Ip YK, Cerra MC. 2005 NO modulation of myocardial
performance in fish hearts. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. Oct;142(2):164-77
Imbrogno S, De Iuri L, Mazza R, Tota B. 2001 Nitric oxide modulates cardiac performance in the
heart of Anguilla anguilla. J Exp Biol 204(Pt 10):1719-27.
Amelio D., Garofalo F., Pellegrino D., Giordano F., Tota B. and Cerra M.C. 2006 Cardiac
exepression and distribution of nitric oxide sinthesys in the ventricle of the cold adapted Antartic
teleosts, the hemoglobinless C. Hamatus and the red blooded T. Bernacchi. Nitric Oxide In press
Rende, lì 03/03/2006
Il direttore del Dip. Biologia Cellulare
Prof.ssa Giovanna De Benedictis
Il proponente il progetto
Dr.ssa Cristina Adamo