Standard di qualità nel laboratorio di seminologia e

Standard di qualità nel laboratorio di seminologia e fecondazione in vitro
Giovanni Coticchio
Biogenesi, Reproductive Medicine Centre, Istituti Clinici Zucchi, Monza
Introduzione
L’identificazione e implementazione di standard di qualità per il laboratorio di
embriologia e seminologia rispondono all’esigenza di guidare gli embriologi nei loro
compiti professionali. Essi rappresentano allo stesso tempo un supporto organizzativo
per il rispetto di obblighi normativi locali, nazionali e internazionali e per
l’ottenimento di risultati in ultima analisi più favorevoli per le coppie infertili (Magli
et al., 2008; Mortimer and Mortimer, 2005). Gli argomenti discussi nel presente
scritto intendono illustrare aspetti importanti della struttura, organizzazione e
funzione del laboratorio di embriologia e seminologia. La materia del “total quality
management” non è descritta nei suoi specifici contenuti, ma sono forniti alcuni
esempi dell’utilità della sua applicazione.
Layout del laboratorio
Il laboratorio dovrebbe possedere localizzazione, dimensioni e design appropriati alla
tipologia e volume del lavoro svolto. In particolare, esso dovrebbe essere strettamente
adiacente alla sala operatoria per rendere più spedite ed efficienti le fasi di recupero
degli oociti e transfer degli embrioni. Gli spazi del laboratorio di embriologia
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dovrebbero essere separati dalle postazioni di lavoro informatiche, dagli ambienti
dedicati alla crioconservazione, dal laboratorio di seminologia e da altri di laboratori
(per esempio di ricerca). La collocazione della strumentazione e delle apparecchiature
dovrebbe essere definita in modo da ridurre i percorsi attraverso cui il materiale
biologico (oociti ed embrioni) viene trasferito dagli incubatori alle cappe/microscopi e
viceversa. L’accesso dovrebbe essere strettamente limitato al personale addetto.
Analoga restrizione dovrebbe essere applicata per le aree di lavoro di
crioconservazione e per quelle ospitanti le postazioni di accesso alle banche dati
informatiche e cartacee. Le condizioni di temperatura e umidità dovrebbero essere
controllate in modo da offrire sufficiente comfort agli operatori. Le postazioni di
lavoro dovrebbero essere studiate secondo criteri ergonomici, tenendo anche conto
della necessità di ridurre lo stress di tipo visivo. La qualità dell’aria dovrebbe essere
garantita da sistemi di filtrazione/purificazione seguendo criteri delle norme vigenti.
Direzione del laboratorio
Il laboratorio di PMA dovrebbe essere diretto da un biologo con esperienza
pluriennale come embriologo clinico. Il possesso di titoli specifici (specializzazione,
master, dottorato) sarebbe auspicabile, ma non vincolante. Al direttore di laboratorio
spetta l’organizzazione delle attività, la verifica che il setup del laboratorio sia
adeguato alle funzioni richieste e al carico di lavoro in termini di attrezzature e risorse
umane, la scelta delle tecniche di laboratorio più appropriate, la redazione e revisione
del manuale di laboratorio, la pianificazione del training del personale di nuova
acquisizione e dell’educazione continua del personale già formato, l’analisi dei
risultati, l’implementazione di un sistema di qualità, l’interazione con lo staff clinico.
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È richiesto che il direttore di laboratorio svolga il proprio ruolo a tempo pieno e in
sede. È infatti indispensabile che la persona preposta abbia diretta e continua
percezione dell’ambiente di lavoro e dell’attività dei colleghi. Ruoli direttivi “a
distanza” o intermittenti sono difficilmente immaginabili.
Personale
La selezione, training, aggiornamento e motivazione del personale di laboratorio
rivestono un’importanza critica nella costituzione di una squadra di lavoro in grado di
garantire uno standard di risultati elevato e costante. Ciò richiede l’implementazione
di misure di tipo organizzativo e tecnico.
Lo staff biologico dovrebbe essere in numero adeguato e con appropriata formazione
ed esperienza. Si calcola che un rapporto sufficiente tra embriologi e numero di cicli
eseguiti sia circa 1:200. Ruoli, funzioni e livelli gerarchici dovrebbero essere descritti
in un organigramma ufficiale e in specifiche “job descriptions”. Per funzioni critiche
dovrebbero essere identificati titolari e sostituti. La formazione del personale di nuova
acquisizione e preesistente dovrebbe essere curato attraverso documentati programmi
di training e aggiornamento.
Documentazione
I processi a cui è sottoposto il materiale biologico dovrebbero essere descritti in un
manuale delle istruzioni operative. Tale manuale dovrebbe essere reso disponibile agli
operatori prima della sua applicazione ed essere accessibile in ogni momento. Esso
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dovrebbe contenere una dettagliata descrizione dei metodi e dei materiali applicati per
le diverse fasi di lavoro.
Documentazione scritta dovrebbe essere generata anche per a) norme di
comportamento riguardanti gli operatori (uso di divise, mascherine, cuffie; norme
igieniche), b) prove, controlli, collaudi e manutenzione delle attrezzature, c) controllo
della performance, d) azioni correttive, e) norme di sicurezza, f) movimentazione,
conservazione e stoccaggio dei materiali, g) aggiornamento delle procedure.
La documentazione dei risultati di laboratorio dovrebbe essere pertinente,
significativa, chiara e preferibilmente conforme a standard internazionalmente
riconosciuti.
Norme generali per le istruzioni operative
Preparazione dei campioni seminali.
L’obiettivo della preparazione dei campioni seminali consiste nella selezione degli
spermatozoi con motilità rapida progressiva e normale morfologia (se presenti) e nella
loro separazione dal plasma seminale. La preparazione standard del campione
seminale dovrebbe basarsi sull’applicazione di gradienti di densità i quali, oltre a
separare la popolazione di spermatozoi di interesse, rimuovono o riducono fortemente
la carica di agenti infettivi. La centrifugazione diretta del seme è sconsigliabile poiché
tale trattamento potrebbe generare un danno agli spermatozoi per effetto di specie
reattive dell’ossigeno (ROS) rilasciate da spermatozoi immaturi o da globuli bianchi.
Per tale ragione, lo swim-up da pellet centrifugato non dovrebbe essere applicato,
mentre può essere consentito lo swim-up da seme non trattato, nonostante in tal caso
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sia maggiore il rischio di contaminazione da plasma seminale e da eventuali agenti
infettivi.
Prelievo degli oociti.
Al prelievo, gli oociti dovrebbero essere valutati rispetto allo stato di maturazione per
selezionare, se necessario, quelli da destinare alla “standard IVF”. I dettagli
morfologici dell’oocita ancora incluso nel cumulo ooforo possono essere osservati
attraverso la tecnica dello spreading. Talvolta, la presenza delle cellule del cumulo
costituisce un impedimento all’osservazione dell’oocita. Tuttavia lo stato di
compattezza o espansione delle stesse cellule del cumulo è spesso indicativo della
maturità oocitaria. Coaguli di sangue di grandi dimensioni dovrebbero essere rimossi
con l’ausilio di aghi di siringhe da insulina, ma particolare attenzione dovrebbe essere
prestata per evitare danni accidentali all’oocita.
Standard IVF.
La standard IVF dovrebbe essere eseguita utilizzando una precisa concentrazione di
spermatozoi mobili. Tale concentrazione non dovrebbe essere in eccesso rispetto alle
oggettive necessità. Benché non siano noti studi sistematici sulla materia, si ritiene
che concentrazioni di 50.000-10.0000 spermatozoi mobili per ml siano adeguate.
ICSI.
La ICSI è una prassi consolidata e ben definita. In breve, per la sua esecuzione si
richiede che siano utilizzati spermatozoi mobili e, se possibile, con morfologia
normale. È indispensabile manipolare gli spermatozoi in modo da interrompere la
continuità della membrana cellulare e favorire il rilascio del contenuto cellulare
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all’interno dell’oocita, successivamente alla microiniezione. La microiniezione
dovrebbe essere eseguita in modo da evitare che l’ago non sia inserito in una zona
dell’oocita in cui si ritiene possa essere presente il fuso meiotico. La deposizione
dell’spermatozoo dovrebbe essere preceduta da una aspirazione del citoplasma
sufficiente a interrompere la continuità dell’oolemma.
Verifica della fecondazione (fertilization check).
La verifica della fecondazione dovrebbe essere effettuata intorno alle 18 ore post
inseminazione (p.i.) e comunque mai dopo le 20 ore p.i.. Di ciascun oocita inseminato
dovrebbe essere registrato lo stato meiotico, il numero di pronuclei, il numero di
globuli polari. In caso di mancata fecondazione dopo standard IVF, dovrebbe essere
descritta la presenza o assenza di spermatozoi aderenti alla zona pellucida. In
considerazione del fenomeno noto come “in vitro aging” gli oociti che appaiono non
fecondati entro 20 ore p.i non dovrebbero essere sottoposti a reinseminazione.
Mezzi di coltura.
L’uso di mezzi di coltura preparati in laboratorio non dovrebbe essere consentito, in
presenza di alternative commercialmente disponibili. Per la coltura embrionale
successiva al terzo giorno p.i. dovrebbero essere impiegati sistemi di coltura
sequenziali. L’uso di siero come supplemento proteico dovrebbe essere evitato, se
possibile anche per i terreni per la maturazione in vitro degli oociti.
Valutazione degli embrioni.
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La valutazione della qualità embrionale dovrebbe essere effettuata a tempi definiti
(per esempio a 42-44 ore p.i.) e secondo criteri riproducibili condivisi dai membri del
laboratorio.
Identificazione e tracciabilità dei campioni biologici
I campioni biologici dovrebbero essere identificati secondo criteri univoci e conformi
alle norme vigenti. Benché talvolta raccomandato, non esiste consenso sulla necessità
o opportunità di eseguire il doppio controllo (da parte di due operatori) dell’identità
dei campioni in fasi critiche del processo, quali l’inseminazione o il transfer di
embrioni. Durante tutto il processo, la localizzazione fisica dei campioni in spazi
specifici del laboratorio deve essere regolamentata.
Documentazione dell’attività di laboratorio
Ciascuna fase del processo di manipolazione e conservazione del materiale biologico
dovrebbe essere descritta tecnicamente in maniera esauriente e pertinente. Orario di
esecuzione e operatore dovrebbero essere riportati. Il destino di ciascun oocita,
embrione e campione seminale dovrebbe essere documentato. Eventuali deviazioni
dai protocolli prestabiliti dovrebbero essere registrate e motivate. Tutta la
documentazione dovrebbe essere prodotta in forma cartacea e informatica. Il backup
dei documenti informatici dovrebbe essere garantito da un sistema automatico. I
referti di laboratorio dovrebbero essere in forma chiara e contenere informazioni
pertinenti ed essere sottoposti ad accurato controllo e a convalida prima
dell’emissione.
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Materiali
Tutti i materiali (piastre di coltura, pipette, cateteri, etc) che possono entrare in
contatto direttamente o indirettamente contatto con gameti ed embrioni dovrebbero
essere non tossici e pertanto appartenere almeno alla categoria “tissue culture grade”.
Se disponibili, dovrebbero essere preferiti articoli “embryo tested”. Eventuali
(bio)chemicals dovrebbero essere di adeguata qualità e purezza. Di ogni lotto di
materiale dovrebbe essere disponibile il certificato di analisi. Per materiali non testati
per embriotossicità dovrebbero essere eseguito un accertamento di qualità. A tale
scopo, potrebbero essere utilizzati il “mouse embryo test” e lo “sperm survival test”.
Movimentazione, conservazione e stoccaggio dei materiali
La corretta conservazione del materiale durante il trasporto e lo stoccaggio dovrebbe
essere verificata. Le date di ricezione, preparazione (se applicabile) e utilizzo
dovrebbero essere registrate. I numeri di lotto dei materiali utilizzati dovrebbero
essere associati ai processi a cui sono sottoposti i campioni biologici. L’uso di
materiale scaduto dovrebbe essere evitato tramite l’applicazione di appropriate misure
preventive. Inoltre dovrebbero essere garantite scorte minime per ogni materiale.
Attrezzature
Le attrezzature dovrebbero essere appropriate al tipo e volume di attività. In
particolare, gli incubatori per la coltura di embrioni dovrebbero essere in numero
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superiore rispetto alle effettive esigenze e in ogni caso in numero superiore a uno. Per
apparecchiature di importanza critica sarebbe auspicabile l’impiego di sistemi di
allarme in grado di inviare informazioni a terminali informatici o telefoni cellulari. Le
bombole di CO2 o di miscele gassose dovrebbero essere poste in ambiente diverso dal
laboratorio. Le cappe per la manipolazione di materiale biologico dovrebbero
rispondere ai requisiti normativi. Le sostanze tossiche, quali fissativi, dovrebbero
essere utilizzate solo in associazione con cappe chimiche poste in ambiente diverso
dal laboratorio di embriologia. Inoltre, per mantenere la temperatura ideale di coltura
di oociti ed embrioni, il laboratorio dovrebbe essere dotato di una serie di dispositivi,
quali piani riscaldati per microscopi e piani di lavoro, blocchi porta-provette, miniincubatori da utilizzare sui piani delle cappe, etc.
Prove, controlli e collaudi delle attrezzature
Le attrezzature dovrebbero essere accompagnate dai relativi manuali originali. Di
ogni attrezzatura dovrebbe essere previsto un programma documentato di
manutenzione ordinaria e straordinaria, un resoconto del suo utilizzo e, se previsto,
delle calibrazioni. Controlli giornalieri dovrebbero essere eseguiti per apparecchiature
critiche, quali incubatori (per temperatura di esercizio e concentrazione di CO2),
frigoriferi e freezers (per temperature di esercizio), cryofreezers (per le curve di
raffreddamento) e banche per la crioconservazione a -196°C (per livelli di azoto).
Analisi non strumentali
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Per le analisi non strumentali è necessario stabilire l’accuratezza e la ripetibilità intere intra-operatore. Ciò è applicabile all’analisi seminale (per i valori di conta, gradi di
motilità, morfologia), la valutazione della qualità oocitaria, del pattern cromatinico
dei pronuclei e della qualità embrionale. È auspicabile la partecipazione del personale
di laboratorio a programmi esterni di “qualità assurance” (QA). Inoltre, per garantire
l’affidabilità degli accertamenti analitici non strumentali, sarebbe opportuno che
ciascun operatore eseguisse un numero minimo di operazioni.
Indicatori di efficienza
I programmi di QA forniscono uno strumento per monitorare i processi al fine di
migliorare l’efficacia di una procedura. In tal senso è essenziale valutare con
regolarità i risultati del laboratorio attraverso indicatori appropriati e oggettivi,
definendo allo stesso tempo valori soglia minimi. Per ridurre interferenze dovute a
variabilità nella popolazione dei pazienti, tali verifiche dovrebbero essere compiute su
categorie sufficientemente grandi in termini numerici. L’elenco sotto riportato indica
alcuni possibili indicatori di efficienza (esprimibili in valori percentuali).
-
oociti degenerati dopo rimozione delle cellule del cumulo, in preparazione
della ICSI
-
fecondazione IVF ed ICSI
-
oociti degenerati dopo ICSI
-
segmentazione (cleavage rate)
-
embrioni con 4 blastomeri a 42-44 ore p.i.
-
blastulazione
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-
blastocisti di buona/ottima qualità
-
embrioni e oociti vitali dopo crioconservazione
-
impianto
-
gravidanze
Safety
La sicurezza rappresenta un elemento essenziale degli standard qualitativi dei
laboratori di embriologia e seminologia. È necessario che sia nominato un
responsabile per la sicurezza, che esistano protocolli scritti, che siano predisposti
documentazione e training sui rischi operativi generali e specifici. Prima del
trattamento del campione biologico è necessaria la verifica degli esami infettivologici
dei pazienti. Devono essere approntati dispositivi di protezione da contaminazione da
fluidi biologici. L’uso di “pipet-aid” automatici dovrebbe essere garantito. Le cappe
dovrebbero garantire la possibilità di lavorare in condizioni asettiche ma anche
proteggere l’operatore (Classe II). Le immunizzazioni contro infezioni virali
dovrebbero essere incoraggiate. L’uso di sostanze tossiche dovrebbe essere
accompagnato da attrezzature e dispositivi di protezione. Dispositivi di protezione
personale sono richiesti anche per l’uso di azoto liquido. La decontaminazione
chimica e biologica, se necessaria, dovrebbe essere condotta secondo specifici
protocolli. Il rischio biologico deriva principalmente dalla contaminazione dei
campioni da HIV, HBV, HCV. Tutti i campioni dovrebbero essere trattati come
potenzialmente infetti. La conservazione e consumo di alimenti dovrebbero essere
proibiti. Il personale dovrebbe essere dotato di divise, occhiali di protezione, guanti
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(powder-free), etc. Attenzione dovrebbe essere posta alla contaminazione di oggetti di
comune utilizzo, quali telefoni e tastiere di PC.
Il rischio di ferite accidentali con materiali acuminati contaminati da seme e di
contatto tra seme e abrasioni, piccole lesioni cutanee, etc. dovrebbe essere prevenuto.
Materiali costituenti rischio biologico e materiali acuminati (sharps) contaminati
dovrebbero essere smaltiti secondo speciali procedure.
Le procedure di crioconservazione espongo a rischi di ustioni da contatto diretto con
azoto liquido, possibili danni oculari da esposizione a gas e asfissia. Per garantire la
sicurezza, è pertanto necessario disporre di locali dedicati, dispositivi di protezione
personale (quali occhiali/schermi per la protezione del viso, guanti isolanti) e
strumenti per la manipolazione di oggetti raffreddati in azoto liquido. Dovrebbe
inoltre essere garantito un elevato ricambio d’aria e la presenza di sistemi di
monitoraggio della concentrazione di ossigeno ambientale.
Specificità del laboratorio di seminologia
La definizione e attuazione di standard di qualità riguardano anche il laboratorio di
seminologia. L’attività di questo laboratorio, infatti, è critica per risultati aventi un
significato sia diagnostico, sia terapeutico. La ricerca di uno standard di qualità per il
laboratorio di seminologia è resa difficile dalla complessità delle analisi eseguite sul
liquido seminale. Tale complessità non è di carattere tecnico, ma piuttosto deriva
dalla natura altamente pleiotropica degli spermatozoi umani e dal fatto che gli attuali
metodi analitici generano ampie differenze valutative tra diversi laboratori e diversi
operatori dello stesso laboratorio. L’assenza di automazione enfatizza l’impatto
dell’errore umano nella conta e nell’analisi della morfologia e della motilità. I metodi
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di valutazione, per esempio della morfologia, sono molteplici e spesso non sono
riferibili ad adeguati campioni standard di riferimento. Inoltre, non bisogna
dimenticare che l’analisi seminale è effettuata su una minuscola sub-popolazione
dell’intero campione. Pertanto, la qualità dell’esito scade con la riduzione del numero
degli spermatozoi analizzati. Per esempio, valutazioni morfologiche eseguite su 50100 spermatozoi rivestono scarso valore.
In passato, le resistenze all’introduzione di criteri di qualità sono state notevoli. Ciò si
percepisce da posizioni prese ufficialmente da alcuni autori: “… it would appear that
semen analysis is for the most part carried out satisfactority all over the world and
therefore the energy exspended for running a QA program in relation to semen
analysis could be a waste of time” (Jequier, 1997). Più recentemente, però, l’esigenza
di programmi in grado di elevare lo standard qualitativo del laboratorio di
seminologia è emersa più decisamente: “QC and QA are firmly embedded in ISObased
quality systems and are requirements of regional, national and EC
legislations” (Pacey, 2010). Un esempio della necessità di standard qualitativi è
offerto dai risultati di un survey eseguito per determinare, in diversi laboratori, la
variabilità di misurazione della concentrazione degli spermatozoi. È emerso che, per
un campione di riferimento, il risultato possa variare fino a un fattore 5 e che la
variazione risulti maggiore nel caso in cui il dispositivo di misurazione sia diverso
dalla camera di Neubauer (Pacey, 2010).
Gli errori che conducono a differenze, talvolta notevoli, nei risultati posso essere di
diversa natura. Esistono errori definiti “random”, consistenti in differenze casuali e in
genere di segno diverso che sono introdotte nelle operazioni di campionamento e/o
lettura. Tali errori sono apprezzabili attraverso letture ripetute da parte dello stesso
osservatore o strumento. Altri errori, indicati come “sistematici”, alterano il risultato
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in una sola direzione e non possono essere identificati attraverso letture ripetute. La
ricerca di standard qualitativi eseguita attraverso programmi di qualità control (QC)
dovrebbe essere in grado di identificare, e se possibile limitare, sia gli errori random,
sia gli errori. Un QC interno dovrebbe essere in grado di stimare la precisione delle
misurazioni e rilevare eventualmente risultati esterni ai limiti di controllo. A tale
scopo sono necessari dei campioni standard. Sul mercato sono disponibili campioni
che garantiscono accuratezza e precisione, seppur in un intervallo limitato. I campioni
che possono essere preparati in laboratorio hanno il vantaggio di coprire un più ampio
intervallo di grandezze, ma implicano il limite della non conoscenza del valore target
reale. In ogni caso, per la misurazione di un certo parametro, con metodi statistici è
possibile controllare la variabilità intra- e inter-operatore. Per esempio le “X bar
charts” consentono di identificare risultati molto divergenti dal target value. Rispetto
a quest’ultimo, possono essere definiti livelli di attenzione e di azione per misure
correttive (WHO laboratory manual for the examination and processing of human
semen, 2010).
L’utilità di un programma di controllo qualità è dimostrata da uno studio eseguito per
valutare la coerenza dei valori di morfologia tra 19 tecnici di centri diversi durante un
periodo di 40 mesi. Lo studio ha previsto una fase di training iniziale per tutti i tecnici
allo scopo di uniformare le modalità di analisi. Per circa un quarto dei tecnici è stato
inoltre condotto un “refresh course” annuale. I risultati hanno indicato che 15 dei 19
tecnici (78%) hanno riportato letture con limiti di errore entro un intervallo di
0.5±SD. Inoltre, i partecipanti ai “refresh courses” hanno riportato letture con limiti di
errore entro un intervallo di 0.2±SD (Franken and Kruger, 2006). In merito alla
valutazione della morfologia, la recente indicazione delle manuale WHO 2010,
secondo cui il valore minimo di forme normali è pari al 4%, ha introdotto una
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considerevole difficoltà per l’implementazione di programmi di QC e QA. Essendo
infatti il valore minimo di normalità molto vicino a 0, deriva che analisi basate sulla
conta di meno di 100 spermatozoi producono dati con intervalli di confidenza
talmente ampi da rendere non significativa l’identificazione di campioni con valori di
morfologia maggiore o minore del 4%.
Conclusioni
Elevati standard qualitativi rappresentano ormai requisiti organizzativi, tecnici e
normativi indispensabili per i laboratori di embriologia e seminologia. Il
miglioramento della qualità dovrebbe coinvolgere tutti i principali elementi strutturali,
gestionali e operativi del laboratorio,
quali dotazioni impiantistiche, security,
organico, procedure, documentazione, indicatori di efficacia, attrezzature, materiali e
safety.
Anche se in evoluzione, la cultura del QC/QA non sembra però essere ancora del tutto
acquisita, nonostante sia appurato che le eventuale variabilità delle performance
possono essere monitorate e corrette. Allo scopo di favorire il progresso dell’intera
attività del laboratorio, i programmi di training ed educazione continua sono
essenziali.
Bibliografia
Franken DR, Kruger TF. Lessons learned from a sperm morphology quality control
programme. Andrologia. 2006. 38:225-9.
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Jequier AM. Clinical assessment of male infertility in the era of intracytoplasmic
sperm injection. Baillieres Clin Obstet Gynaecol. 1997. 11:617-39.
Magli MC, Van den Abbeel E, Lundin K, Royere D, Van der Elst J, Gianaroli L;
Committee of the Special Interest Group on Embryology. Revised guidelines for good
practice in IVF laboratories. Hum Reprod. 2008. 23:1253-62.
Mortimer D, Mortimer S. Quality and risk management in the IVF laboratory.
Cambridge University Press. 2005. Cambridge, UK.
Pacey AA. Quality assurance and quality control in the laboratory andrology. Asian J
Androl. 2010.12:21-5.
WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen
FIFTH EDITION. World Health Organization. 2010
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