Controllo della crescita microbica

Controllo della crescita
microbica
I microrganismi sono praticamente
ubiquitari. In un laboratorio possono
contaminare:
- aria
- superfici e strumenti
- operatori
Sia che si lavori con colture pure, sia che
si lavori con materiale contaminato da
associazioni più o meno complesse di
microrganismi è necessario evitare che il
materiale sperimentale sia contaminato
dai microrganismi presenti nell’ambiente.
Per evitare la contaminazione è necessario:
• prevenire per quanto possibile la
contaminazione con microrganismi presenti
nell’aria, o sulle superfici del laboratorio o sul
corpo dell’operatore
• utilizzare substrati sterili
• utilizzare attrezzi sterili
In microbiologia è molto importante tenere sotto
controllo la
Crescita microbica
Tale sorveglianza può avvenire attraverso un
processo di
inibizione
Oppure attraverso un processo di distruzione dei
microrganismi detto
sterilizzazione
Metodi fisici per il controllo della crescita
microbica
1. Calore
2. Radiazioni
2. filtrazione
Scopo dell’esercitazione
Descrivere le principali attrezzature e strumenti
presenti in un laboratorio di microbiologia:
• le precauzioni di asepsi
• strumenti e tecniche per la sterilizzazione
STERILIZZAZIONE
Per sterilizzazione si intende quella
procedura che permette di liberare un
oggetto da tutte le forme viventi che vivono
sulla sua superficie o al suo interno.
Il termine ha un valore assoluto, nel senso
che non esistono sostanze o oggetti poco
o quasi sterili, ma solo sterili o non sterili.
TECNICHE DI STERILIZZAZIONE
La sterilizzazione può essere ottenuta:
• con metodi fisici
• calore
• secco
• umido
• radiazioni
•UV
•raggi gamma
•filtrazione
• con metodi chimici
• ossido di etilene
La scelta del metodo di sterilizzazione dipende dal
materiale da trattare
Sterilizzazione mediante calore
Per tutti i microrganismi esiste una temperatura
massima di crescita oltre la quale muoiono
A temperature elevate le macromolecole perdono
struttura e funzionalità per un processo chiamato
Denaturazione
Effetto della
temp sulla
vitalità di un
batterio
mesofilo: il
10% delle
cellule rimarrà
vivo dopo 3
minuti a 70°,
12 min a 60°,
42 min a 50°
Questo concetto di tempo necessario per poter distruggere
dei microrganismi è fondamentale per la sterilizzazione
Infatti il tempo di sterilizzazione sarà più lungo a temperature
inferiori e più breve a temperature maggiori
Una sterilizzazione efficace sarà considerata tale solo se
temperatura e tempo saranno ottimali
Altro concetto importante è il tipo di calore utilizzato che può
essere secco o umido
Il calore umido è sicuramente il più efficace in quanto ha
un potere di penetrazione maggiore del calore secco e
permette di ottenere a parità di temperature e tempo una
riduzione più rapida del numero dei microrganismi vitali
Il parametro utilizzato per caratterizzare la sterilizzazione
mediante calore è il
Tempo di riduzione decimale D: tempo necessario per
ridurre di dieci volte, a una data temperatura la densità di
popolazione
a. Organismo mesofilo,
sono necessari 20 sec a
110 °C,
b. per un termofilo servono
10 min alla stessa
temperatura
Il tempo di riduzione decimale non è però facile da
determinare per cui si preferisce utilizzare il concetto di
Tempo di inattivazione termica: tempo necessario per
uccidere tutte le cellule di una popolazione ad una data
temperatura
Il tempo di inattivazione termica viene determinato
sottoponendo ad una fonte di calore popolazioni microbiche
diverse
Inoltre dipende anche dalla grandezza della popolazione
microbica
> è la popolazione maggiore dovrà essere il tempo e
viceversa
Strumenti utilizzati per la sterilizzazione
mediante calore
1. Autoclave (calore umido)
2. Pentola di Kock (calore umido)
3. Stufa di Pasteur (calore secco)
1. Autoclave: è una camera chiusa ermeticamente
che permette l’immissione di vapore saturo sotto
pressione
La normale procedura prevede il riscaldamento a
una pressione di 1,1 Kg/cm2 che permette una
temperatura di 121 °C
Questa è la temperatura che permette di
raggiungere la sterilizzazione in 10-15 minuti
Concetto fondamentale: non è la pressione a
provocare la morte dei microrganismi ma
l’elevata temperatura che può essere raggiunta
in condizione di vapore a una pressione
superiore a quella atmosferica
Ciclo di sterilizzazione: la temperatura dell’oggetto
sterilizzato aumenta più lentamente della temperatura
dell’autoclave
Tipica autoclave da laboratorio
coperchio
termometro
manometro
cestello
2. Pentola di Kock (calore umido)
Funziona come una pentola con acqua calda, quindi la
temperatura non supera mai i 100 °C
Si usa per composti termolabili che non possono essere
scaldati a temperaure superiori ai 100 °C
Sterilizzazione frazionata o tyndalizzazione:
In presenza di ingredienti termolabili si può ricorrere alla
sterilizzazione frazionata, che consiste in un trattamento al
calore del materiale termosensibile con vapore fluente
(100°C) per 30’ e per 3 giorni consecutivi (pentola di Koch).
Le endospore non vengono uccise a 100° e trovandosi in
ambiente favorevole, immediatamente dopo il
raffreddamento del mezzo cominciano a germinare, ciò
rende le cellule più suscettibili al calore nel trattamento del
giorno successivo.
3. Stufa di Pasteur (calore secco)
Viene utilizzata quando è indesiderabile che il
vapore in pressione giunga a contatto con il
materiale che stiamo utilizzando
Viene normalmente utilizzata per vetreria e
strumenti in metallo
Temperatura 150 °C per 2-4 ore
Differenze fra i diversi metodi di sterilizzazione
mediante calore
•Calore umido: Coagulazione delle proteine; le
forme sporali vengono distrutte in minuti
•Calore secco: ossidazione dei costituenti chimici;
forme sporali distrutte in ore
•calore secco (per vetreria, strumenti in metallo): in stufa
a circolazione d’aria, con il materiale avvolto in fogli di
alluminio, carta speciale o in contenitori: 150°C, 90 min o
180°C, 60 min .
• calore umido (per substrati, vetreria, materiali in
plastica): in autoclavi verticali o orizzontali: 121,1°C (1 atm
di sovrappressione) per 15-20 min.
Pastorizzazione
È un processo che riduce la popolazione microbica di
alimenti che non possono essere trattati ad alte
temperature. Prende il nome da Louis Pasteur
I termini sterilizzazione e pastorizzazione non sono sinonimi
in quanto con la seconda non si ha la totale distruzione
dei microrganismi a causa delle temperature più basse
Con la pastorizzazione si eliminano solo i microrganismi
patogeni
La pastorizzazione del latte avviene facendo passare i latte
stesso attraverso uno scambiatore di calore
a. Pastorizzazione istantanea: 71°C per 15 sec
b. Pastorizzazione di massa: 65°C per 30 min
Sterilizzazione mediante radiazioni
Le radiazioni elettromagnetiche sono una via efficace per il
controllo della crescita microbica
Si conoscono:
1. Raggi UV
2. Raggi X
3. Raggi γ
Le radiazioni agiscono sull’organismo con il quale vengono a
contatto rompendone il DNA, e portando così l’organismo
stesso alla sua morte
STERILIZZAZIONE MEDIANTE LE RADIAZIONI
Vengono utilizzate:
•Radiazioni ionizzanti- raggi γ, i raggi X emessi da
materiale radioattivo posseggono una tale energia da
determinare l’allontanamento di elettroni da molecole
organiche. Efficaci sterilizzanti, utilizzati per materiale
plastico termolabile. Necessarie opportune precauzioni.
•Radiazioni UV: effetto germicida dovuto alla capacità del
DNA di assorbire a 260-280 nm. Utilizzati per sterilizzare
l’aria in ambienti confinati. In realtà è disinfettante in quanto
alcune spore resistono agli UV. Inoltre potere di
penetrazione modesto, non passano attraverso il vetro, la
plastica, le soluzioni dense.
Sterilizzazione per filtrazione
La sterilizzazione per filtrazione è un metodo molto
efficace per sterilizzare liquidi che sono sensibili al
calore
I filtri sono sostanze con pori troppo piccoli per il
passaggio dei microrganismi, ma abbastanza larghi
per il passaggio di liquidi e gas
Le dimensioni dei pori per evitare il passaggio dei
M.O. non devono essere superiori a 10 µm ne
inferiori a 0,2 µm
Tipi di filtri
1. Filtri a spessore: costruiti
con strati fibrosi di carta,
lana di vetro, amianto. Le
particelle rimangono
intrappolate nei pori tortuosi
che si creano. Vengono
utilizzati come pre-filtri
2. Membrane filtranti: sono i
tipi di filtri più comunemente
utilizzati in microbiologia,
sono costituite da dischetti di
acetato o nitrato di cellulosa.
Sono costruite in modo che
le dimensioni dei pori siano
ridottissime. La loro funzione
è simile ad un setaccio
3. Filtri tipo Nucleopore:
utilizzati in microscopia a
scansione per la facilità con la
quale il microrganismo può
essere rimosso. Si ottengono
trattando un sottile strato di
policarbonato con radiazioni
nucleari e poi con un
composto chimico corrosivo.
Il diametro dei pori può
essere controllato dosando il
composto chimico
Uso delle membrane filtranti
Parte preventivamente
sterilizzata con calore
Metodi chimici per il controllo della crescita
microbica
Tutti i giorni sia a casa che a lavoro si utilizzano dei
prodotti chimici quali saponi, detergenti la cui
funzione è quella di limitare la crescita microbica
Agente antimicrobico: composto chimico naturale
o di sintesi che uccide i microrganismi o ne inibisce
la crescita
Gli agenti che uccidono hanno il suffisso –cida
•Battericidi
•Fungicidi
•Virocidi
Gli agenti che inibiscono ma non uccidono i
microrganismi hanno il suffisso –statico
•Batteriostatici
•Fungistatici
•Virostatici
Gli agenti antimicrobici possono o no avere una
tossicità selettiva. La tossicità selettiva è molto
utile per il trattamento delle malattie infettive in
quanto è possibile uccidere i microrganismi senza
danneggiare l’ospite (es. antibiotici)
Effetti sulla crescita degli agenti antimicrobici
Le modalità di azione possono essere diverse a
seconda che l’agente sia –statico, -cida o –litico
• Gli -statici agiscono sulla sintesi proteica,
inibendola (molti antibiotici funzionano così)
• I -cida provocano la morte della cellula senza
provocarne la lisi
• I -litici determinano la morte della cellula per lisi
cellulare, si ha la distruzione fisica delle cellule
(azione di antibiotici quali la penicillina)
Le tre possibilità di azione
degli agenti antimicrobici. Al
tempo indicato dalla freccia,
ad una coltura in fase
esponenziale è stata
aggiunta una
concentrazione di agente
inibente per la crescita.
Notare la relazione fra conta
totale e conta vitale
Misura dell’attività antimicrobica
L’attività antimicrobica si misura determinando la
concentrazione più bassa del composto in esame
necessaria per inibire la crescita di un dato
organismo
Questo valore viene detto
MIC: Minimun Inhibiting Concentration (minima
concentrazione inibente)
Concentrazioni sempre maggiori di antibiotico vengono
aggiunte ad una serie di provette inoculate ed incubate
Antisettici, disinfettanti, sterilizzanti
Antisettici: composti chimici che possono provocare la morte o
inibire la crescita dei MO. Sono poso tossici per l’uomo.
Vengono utilizzati per disinfettare mani e ferite superficiali
•Alcool (solubilizza i lipidi)
•Composti contenenti fenolo (distrugge la membrana cellulare)
•Detergenti cationici (interagisce con i fosfolipidi di membrana)
•Perossido d’idrogeno (agente ossidante)
•Composti iodofori (agente ossidante)
•Nitrato d’argento (precipita le proteine)
Disinfettanti e sterilizzanti: provocano la morte dei MO e
vengono usati per oggetti inanimati. Sono chiamati anche
germicidi
•Alcool (solubilizza i lipidi)
•Cloro gassoso (agente ossidante)
•Detergenti cationici (interagisce con i fosfolipidi di membrana)
•Composti clorati (agente ossidante)
•Solfato di rame (precipita le proteine)
•Ossido di etilene (agente achilante)
•Formaldeide (agente achilante)
•Composti fenolici (denaturano le proteine)
•Acido peracetico (forte agente ossidante)
MODALITA’ AZIONE AGENTI ANTIMICROBICI
Danneggiamento della parete cellulare: alcuni gram
positivi sono attaccati dall’enzima lisozima presente
nelle lacrime, nei leucociti.
Enzimi prodotti da
parecchie specie di batteri sono capaci di degradare la
struttura della parete cellulare di altre specie. La
disintegrazione è seguita dalla lisi. Altre volte l’effetto
antimicrobico è dovuto all’inibizione della sintesi della
parete. (Es. penicillina)
Antimetaboliti: interferenza in una biosintesi specifica.
Es. blocco della sintesi dell’acido folico da parte della
solfaniddamide.
MODALITA’ AZIONE AGENTI ANTIMICROBICI
Alterazione della permeabilità cellulare: la membrana
plasmatica preserva l’integrità dei costituenti cellulari.
Alcune sostanze (composti fenolici) distruggono la
permeabilità selettiva della membrana, permettendo
la fuga dei costituendi cellulari.
Inibizione dell’attività enzimatica: Ciascuna delle
centinaia delle reazioni è un potenziale bersaglio per
un inibitore. Es. il fluoruro inibisce la glicolisi,
l’arsenico trivalente il ciclo di Krebs.
Inibizione sintesi acidi nucleici:due categorie
inibiscono la sintesi degli acidi nucleici
1.Composti che interferiscono con la formazione delle
basi
2.Composti che interferiscono con la polimerizzazione.
Agenti antimicrobici utilizzati in vivo
Sono classificati in base alla loro struttura e del loro
meccanismo di azione. La loro caratteristica
fondamentale è la
TOSSICITÀ SELETTIVA
Cioè la capacità di inibire batteri o altri patogeni
senza produrre danni collaterali nell’ospite.
Vengono chiamati anche agenti chemioterapici
Due grandi categorie:
• Composti sintetici
• Antibiotici
Principali bersagli dei chemioterapici
Agenti
chemioterapici
antifungini:
essendo i funghi
degli eucarioti, gli
agenti antibatterici
non funzionano
Spettro d’azione antimicrobica di alcuni agenti
chemioterapici