IVD IVD Diagnostici in Vitro DMD/BMD

IVD
IVD Diagnostici in Vitro
DMD/BMD DETECTION KIT
Kit per la caratterizzazione molecolare della Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) e di
Becker (BMD)
Identificazione di delezioni in 19 esoni/promotore nel gene della distrofina attraverso
Multiplex PCR / elettroforesi capillare
Codice OBH-DMDB-001
Fabbricante: Orga Bio Human S.r.l.
25 Test
Store at -18 C to -25˚C
Data sheet, Revisione 1.6 (18/11/2012)
1 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Introduzione
Le distrofie muscolari di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD - variante allelica benigna) sono malattie degenerative
della muscolatura scheletrica ad eredità recessiva legata al sesso: gli individui maschi che ereditano il cromosoma X
affetto (che presenta cioè delezioni/duplicazioni intrageniche o mutazioni puntiformi in una specifica regione del
cromosoma X), manifestano sintomi clinici, mentre le femmine sono eterozigoti portatrici (asintomatiche almeno
nel 90% dei casi).
Il gene responsabile della patologia è localizzato nel braccio corto del cromosoma X (regione Xp21) ed è costituito
da 79 esoni-introni. Il suo prodotto proteico è una proteina strutturale del muscolo, la distrofina, che è
generalmente assente nel muscolo dei soggetti DMD ed è invece presente ma alterata sia a livello qualitativo che
quantitativo, nel muscolo dei soggetti BMD.
Le delezioni intrageniche di un numero variabile di esoni, con perdita di tratti più o meno estesi di DNA (da diverse
decine di bp a centinaia di kb), sono le mutazioni più frequenti (65-70%), responsabili di entrambi i quadri clinici.
Nella forma clinicamente più grave, la DMD, le delezioni causano uno slittamento del modulo di lettura, per cui la
distrofina non viene prodotta o viene rapidamente degradata; nella BMD, al contrario, le delezioni mantengono il
modulo di lettura consentendo la produzione di una proteina più corta, ma semifunzionale.
Il rimanente 30-35% dei casi è dovuto a mutazioni diverse dalla delezione: in particolare il 5-7% circa è dovuto a
duplicazioni di regioni intrageniche, mentre l’altro 25-30% è causato da mutazioni puntiformi, piccole delezioni o
inserzioni non identificabili con i metodi diagnostici comunemente utilizzati, a causa delle enormi dimensioni del
gene.
La Metodica
DMD/BMD Detection kit è in grado di identificare più del 95% delle delezioni nel gene della distrofina (65% circa dei
casi di DMD/BMD), attraverso la rilevazione di delezioni intrageniche specifiche in 19 esoni/promotore.
Il test consiste nella amplificazione simultanea di 18 esoni più il promotore del gene della distrofina con
oligonucleotidi primers-specifici (Multiplex PCR, costruiti sulla base del lavoro di Chamberlain et al., 1988 e Beggs et
al.,1990), con successiva separazione in elettroforesi capillare ed interpretazione dei dati.
Le 19 coppie di primers sono suddivise in due Mix, che utilizzano primers fluorescinati in 6’ FAM o in 5’ HEX.
La Mix 1 contiene le coppie di Primers, con il Forward fluorescinato in 6’ FAM, per amplificare le seguenti regioni
genomiche nel gene della distrofina: Ex4 (196bp), Ex44 (268bp), Ex12 (331bp), Ex8 (360bp), Ex51 (388bp), Ex17
(416bp), Ex19 (459bp), Ex48 (506bp), Ex45 (547bp)
La Mix 2 contiene le coppie di Primers, con il Forward fluorescinato in 5’ HEX, per amplificare le seguenti regioni
genomiche nel gene della distrofina: Ex52 (113bp), Ex60 (139bp), Ex47 (181bp), Ex6 (202bp), Ex13 (238bp), Ex50
(271bp), Ex43 (357bp), Ex3 (410bp), Ex49 (440bp), MSP (Promotore)(535bp).
In seguito alla amplificazione mediante Multiplex PCR, la corsa elettroforetica delle due mix garantisce una
separazione ottimale degli amplificati (nella Figura 1 sono mostrate le corse elettroforetiche con la fluorescenza in
6’FAM e 5’HEX di un campione normale di controllo). Un campione privo di delezioni intrageniche negli esoni
analizzati dovrà presentare tutti i 19 segnali in fluorescenza in 6’FAM e 5’HEX. La presenza invece di eventuali
delezioni intrageniche nel DNA analizzato potrà essere facilmente svelata e caratterizzata, perchè comporterà la
assenza di specifici segnali/picchi in fluorescenza tra i 19 attesi, corrispondenti agli esoni interessati dalla delezione.
2 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Per una corretta interpretazione della corsa elettroforetica ed in generale del corretto utilizzo del kit si raccomanda
di consultare il paragrafo “Interpretare i risultati e determinare il genotipo”.
Figura 1. Profilo elettroforetico di DMD/BMD Detection kit di un soggetto non affetto da DMD o BMD. Sono
presenti i 19 picchi relativi agli esoni/promotore del gene della distrofina con fluorescenza in 6’FAM (corsa di colore
blu, 9 picchi da 196 a 547paia di basi) e 5’HEX (corsa di colore verde, 10 picchi da 113 a 535 paia di basi). La
presenza di tutti i segnali in fluorescenza attesi consente di dimostrare la assenza di delezioni dei 19
esoni/promotore considerati nel gene della distrofina.
3 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Prestazioni e limiti del test
Prestazioni
1. Il test consente di evidenziare più del 95% delle delezioni fino ad oggi individuate nel gene della distrofina.
2. Il test permette di accertare esclusivamente la eventuale presenza di delezioni intrageniche specifiche (le
mutazioni più frequenti) in 19 esoni/promotore del gene della distrofina (MSP, 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45,
47, 48,49, 50, 51, 52, 60); le delezioni analizzate sono responsabili del 65% circa dei casi di DMD/BMD.
3.Il kit è stato testato per la capacità di evidenziare la presenza di tutti gli esoni utilizzati nel protocollo diagnostico
in soggetti normali, e per la presenza di delezioni specifiche in pazienti affetti con genotipo noto. Tali pazienti sono
stati selezionati in base al genotipo, per ottenere una validazione del kit in grado di testare la presenza/assenza di
tutti gli esoni considerati.
4. La sensibilità e la specificità stimate sono > del 99,9%.
Limiti
1. Il test non consente di evidenziare il 30/35% dei casi DMD/BMD dovuti a mutazioni diverse dalla delezione
(duplicazioni intrageniche, mutazioni puntiformi, piccole delezioni, delezioni in mosaico, inserzioni non identificabili
con il presente test).
2. Non sono identificabili il 5% delle delezioni osservate in pazienti DMD/BMD, in quanto non tutti i 79 esoni del
gene della distrofina sono rappresentati all’interno del kit.
3. l test, il più delle volte, non permette di stabilire con esattezza il confine distale/prossimale della delezione
identificata. E’ quindi necessario saggiare esoni aggiuntivi rispetto a quelli contemplati per definire precisamente
tutti gli esoni interessati nella delezione.
4. Il protocollo diagnostico ottimizzato non è in grado di garantire una analisi quantitativa con accuratezza
sufficiente da consentire una diagnosi di stato di portatrice su soggetti di sesso femminile, e/o la presenza di
eventuali duplicazioni in soggetti di entrambi i sessi.
Pertanto, considerando le specifiche del test ed i suoi limiti:
1. Il test è da utilizzarsi solo in soggetti di sesso maschile. In caso di soggetti di sesso femminile, il test non è in grado
di identificare le femmine portatrici.
2. Se l’analisi del DNA con il presente test non evidenzia alcuna delezione negli esoni considerati (negatività al test)
ciò non permette di escludere che il campione di DNA analizzato possa portare una delezione non identificabile dal
presente kit, o mutazioni diverse dalle delezioni (mutazioni puntiformi, duplicazioni). Se si identifica una delezione
in un solo esone/promotore, si raccomanda di confermare il test con altre metodiche.
3. Nei casi in cui venga identificata una delezione, è opportuno ai fini diagnostici stabilire con esattezza il confine
distale/prossimale della delezione identificata, testando esoni aggiuntivi e/o utilizzando altre metodiche.
4 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Materiale all’interno di ogni kit
Il kit da 25 determinazioni è costituito da:
•
N°2 vials contenenti 250µl 1x Multiplex Mix 1
•
N°2 vials contenenti 250µl 1x Multiplex Mix 2
•
N°1 vial contenente 12.5 µl 5U/µl Hot Rescue DNA Polymerase
Matariale necessario ma non fornito
•
Kit di estrazione di DNA umano (es. QiAmp DNA mini kit Qiagen);
•
Microcentrifuga da banco (4.000 - 6.000 g. p. m.);
•
Termostato per le provette tipo “eppendorf” con range di temperatura da 25 a 100°c (solo per alcuni kit di
estrazione);
•
Cappa biologica;
•
Puntali dotati di filtro (prevenzione aerosol);
•
Micropipette da 0,5-10 μl; 5-50 μl; 50-200 μl; 200-1000 μl;
•
Guanti lattice, camice;
•
Provette in polipropilene con tappo da 0,2 ml e da 1,5 ml o 2 ml;
•
Portaprovette;
•
Termociclatore;
•
Sequenziatore, polimero, Formammide, size standard;
•
H20 sterile;
•
Vortex;
Avvertenze e precauzioni
Tutti i materiali biologici impiegati per l’estrazione del DNA devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si
consigliano precauzioni di sicurezza appropriate quando si maneggiano materiali biologici
Si raccomanda l’utilizzo di un DNA non degradato, con rapporto 260/280 maggiore o uguale a 1,8.
Inoltre si raccomanda di:
1. Indossare guanti monouso durante l’uso dei reagenti e dei campioni, lavarsi accuratamente le mani al termine
della seduta lavorativa.
2. Non pipettare con la bocca.
3. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici e non maneggiare lenti a contatto nelle aree di lavoro del
laboratorio.
4. Non usare il kit dopo la data di scadenza.
5. Eliminare tutti i campioni ed i materiali utilizzati per il test come se potenzialmente in grado di trasmettere
infezioni. La loro eliminazione deve avvenire seguendo le normative di legge vigenti.
6. Manipolare all’interno di una cappa biologica (in accordo con quanto descritto nella pubblicazione “Biosafety
Level 2”, o linee guida equivalenti) tutti i materiali contenenti o sospettati contenere agenti infettivi.
7. Pulire e disinfettare tutte le superfici di lavoro utilizzando un disinfettante come ad es. l’ipoclorito di sodio allo
0,5%, o un altro disinfettante idoneo.
5 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
8. Evitare ogni contatto della pelle e delle mucose con i campioni e reagenti del kit. In caso di contatto, lavare
abbondantemente con acqua le parti esposte e consultare un medico.
9. Organizzare in modo unidirezionale le fasi operative per l’allestimento della reazione e l’utilizzo del kit, al fine
di prevenire l’eventuale contaminazione dei reagenti con prodotti amplificati. È buona norma mantenere
separate le aree e le dotazioni dedicate, rispettivamente, alla fase di estrazione dei campioni e di allestimento ed
esecuzione delle procedure di amplificazione.
10. Utilizzare puntali con filtro e guanti sterili DNA free.
11. Conservare i campioni da analizzare separatamente da tutti gli altri reagenti e, se possibile, aggiungerli nelle
Mix per la reazione in aree separate.
12 Scongelare tutti i componenti a temperatura ambiente prima di iniziare un saggio, mixare i componenti e
centrifugare brevemente.
Conservazione e stabilità
Il kit va conservato a -20°. La 1x Master Mix va conservata a -20° ed al buio per via dei fluorofori presenti all’interno
dei primers. La data di scadenza è indicata sulla scatola.
Prima dell’utilizzo, scongelare la 1x Master Mix. Evitare troppi cicli di congelamento e scongelamento attraverso
l’utilizzo di aliquote.
Ripetuti congelamenti e scongelamenti possono ridurre la sensibilità e devono essere evitati. E’ consigliato congelare
le Mix in aliquote per eventuali usi intermittenti.
Strumentazioni e polimeri da utilizzare
DMD/BMD Detection kit è stato testato utilizzando la seguente strumentazione:
Termociclatori
•
Verity Applied Biosystems
•
2720 Applied Biosystems
•
Personal Biometra
PeqSTAR Euroclone
Sequenziatori e relativi polimeri:
•
Applied Biosystems ABI 310 POP 4 e POP6
•
Applied Biosystems ABI 3130 POP4 e POP7
•
Applied Biosystems ABI 3500 POP7
L’utilizzo del kit con altre strumentazioni ed altri polimeri deve essere accuratamente validato dal laboratorio che
esegue il test.
Materiale di partenza
L’utilizzo del kit è stato testato su DNA estratto da sangue periferico e liquido amniotico. Per ogni analisi, si
raccomanda di utilizzare DNA con un rapporto 260 nm vs 280 nm compreso tra 1.8 e 2.
6 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Il Procedimento
Preparare le miscele di reazione
Per eseguire l’amplificazione degli esoni/promotore del gene della distrofina, allestire due Mix di PCR come
mostrato in Tabella 1. Preparazione delle due PCR Mix. Il volume finale di ciascuna delle miscele di reazione è di 25
µl.
Si raccomanda l’utilizzo di 20 ng di DNA per ogni miscela di reazione.
PCR Mix1
Volume per 1 reazione
1X Multiplex PCR Mix1
19.8 µl
5U/µl Hot Rescue DNA Polymerase
0,2 µl
DNA da testare (20 ng) +H20
5 µl
Volume Finale
25 µl
Volume per 1 reazione
PCR Mix2
1X Multiplex PCR Mix2
19.7 µl
5U/µl Hot Rescue DNA Polymerase
0,3 µl
DNA da testare (20 ng) +H20
5 µl
Volume Finale
25 µl
Tabella 1. Protocollo per la preparazione delle due Mix di PCR
In ogni corsa di PCR includere:
•
un controllo negativo (acqua) per valutare eventuali contaminazioni.
•
un campione normale per saggiare la corretta esecuzione del test e la capacità di evidenziare la presenza
degli ampliconi relativi a ciascun esone considerato nel protocollo diagnostico. Si raccomanda inoltre di
utilizzare periodicamente campioni di controllo a genotipo noto (presenza di specifiche delezioni) per
valutare e stimare l’accuratezza diagnostica di laboratorio.
Per preparare le due miscele di reazione, lavorare possibilmente al riparo dalla luce. Assicurarsi di aver scongelato
correttamente tutti i reagenti, vortexare e spinanre prima dell’uso.
Il volume finale di DNA+ H20 deve essere di 5 µl.
Se si utilizza ad esempio un DNA concentrato 10 ng/ µl, utilizzare 2 µl di DNA ed aggiungere 3 µl di H20.
Stabilire il numero di campioni da analizzare. Preparare in tubi da 0.2 µl il DNA, fino ad una concentrazione di 20 ng ed
un volume di 5 µl. Preparare in eppendorf da 1.5ml la mix per il numero di campioni da analizzare, moltiplicando i
volumi indicati in tabella 1.
Aliquotare il contenuto della eppendorf nei tubi da 0.2µl contenenti il DNA (20 µl di mix in ogni tubo da 0.2).
7 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Impostare il termociclatore (ciclo di PCR)
Caricare le reazioni di PCR (sia per le provette con Mix1 che con Mix2), nel termociclatore utilizzando i parametri
riportati nella tabella 2.
Step di PCR
Temperatura
Tempo
Cicli
Denaturazione iniziale
Denaturazione
Annealing
Extension
Extension finale
95°
95°
59°
72°
72°
10 min
30 sec
30 sec
45 sec
3 min
1x
27x
1x
Tabella 2. Condizione da utilizzare nel termocilcatore
Settare i parametri per la corsa elettroforetica
A seconda del sequenziatore utilizzato e del relativo polimero, sono riportati in Tabella 3 i parametri raccomandati
per eseguire le corse elettroforetiche.
ABI 310
POP4
POP6
Capillary length (Centimetri)
36
36
Heat plate temperature (Gradi)
60
60
Pre_Run_Time (Secondi)
-
180
Injection_Voltage (KVolt)
15
15
Injection_Time (Secondi)
5
5
EP Voltage (KVolt)
15
15
28 sec
45
150
240
Collection Time (Minuti)
Sirynge pump time (Secondi)
8 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
ABI 3130
POP4
POP7
Capillary length (Centimetri)
36
36
Oven_Temparature (Gradi)
60
60
6500
6500
Current_Stability (AMP)
5
50
PreRun_Voltage (KVolts)
15
15
Pre_Run_Time (Secondi)
180
18.0
Injection_Voltage (KV)
1.2
1.2
Injection_Time (Secondi)
18
23
Voltage_Number_Of_Steps
40
20
Voltage_Step_Interval
15
15
Data_Delay_Time
1
60
Run_Voltage (KVolts)
15
15
Run_Time (Secondi)
3000
1200
Poly_Fill_Vol (STEP)
ABI 3500
POP7
Capillary length
50
Oven_Temparature (Gradi)
60
Run_Voltage (KVolts)
19,5
PreRun_Voltage (KVolts)
15
Injection Voltage (KVolts)
1,6
Run_Time (Secondi)
1330
PreRun_Time (Secondi)
180
Injection Time (Secondi)
8
Data Delay (Secondi)
1
Tabella 3. Parametri da utilizzare per la corsa elettroforetica con ABI 310, ABI 3130, ABI 3500
9 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Settare i BINS
Per settare i Bins tenere in considerazione i pesi molecolarei degli amplificati, considerando per ognuno un range di
più o meno 2.
Esone
Paia di Basi
Fluorescenza
Ex 52
113
5’HEX
Ex 60
139
5’HEX
Ex 47
181
5’HEX
Ex 4
196
6’FAM
Ex 6
202
5’HEX
Ex 13
238
5’HEX
Ex 44
268
6’FAM
Ex 50
271
5’HEX
Ex 12
331
6’FAM
Ex 43
357
5’HEX
Ex 8
360
6’FAM
Ex 51
388
6’FAM
Ex 3
410
5’HEX
Ex 17
416
6’FAM
Ex 49
440
5’HEX
Ex 19
459
6’FAM
Ex 48
506
6’FAM
MSP
535
5’HEX
Ex 45
547
6’FAM
Tabella 4. Per ogni amplicone, relativo ai 19 esoni/promotore, sono riportate la sua grandezza in paia di basi (bp) e
la sua fluorescenza (6’FAM, 5’HEX).
10 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Eseguire la corsa elettroforetica
TM
Per analizzare i singoli amplificati in elettroforesi capillare è necessario essere muniti di: Gene-Scan-500 Rox
TM
size
standard e/o Gene-Scan-500 Liz (marcatore molecolare interno) e di Hi-Di Formammide e piastra compatibile con
il sequenziatore a disposizione.
Allestire una mix costituita da
ABI 310
TM
Gene-Scan-500 Rox
TM
size standard (o 500 Liz )
0,5µl
Hi-Di Formammide
15µl
Amplificato con Mix 1
1µl
Amplificato con Mix 2
1µl
Volume finale per singolo campione
17,5 µl
ABI 3130
TM
Gene-Scan-500 Rox
TM
size standard (o 500 Liz )
0,6µl
Hi-Di Formammide
16µl
Amplificato con Mix 1
1µl
Amplificato con Mix 2
1µl
Volume finale per singolo campione
18,6 µl
ABI 3500
TM
Gene-Scan-500 Rox
TM
size standard (o 500 Liz )
0,2µl
Hi-Di Formammide
10µl
Amplificato con Mix 1
1µl
Amplificato con Mix 2
1µl
Volume finale per singolo campione
12,2 µl
Tabella 5. Mix da allestire per la corsa elettroforetica in ABI 310, ed ABI 3130 e 3500
11 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Si raccomanda inoltre di:
1. Caricare in piastra prima il campione e poi la Mix.
2. Utilizzare la matrice di corsa compatibile. Per il marcatore di corsa interno 500 Rox la matrice di corsa compatibile
6
è la Multi-Capillary DS-30 (Dye set D) Matrix Standard Kit ( FAM, HEX, NED, ROX Dye). Per il marcatore 500 Liz la
matrice compatibile è la Multi-Capillary DS-33 (Dye set G5) Matrix Standard Kit(6-FAM, VIC, NED, PET, and LIZ Dye).
3. Denaturare i campioni 2 minuti a 94°.
4. Eseguire la corsa utilizzando sempre il DNA di un soggetto sano.
Interpretare i risultati e determinare il genotipo
L’interpretazione dei risultati necessita la valutazione della presenza/assenza di tutti i picchi elettroforetici nelle
fluorescenze 6’FAM e 5’HEX, come mostrato nella Figura 1. La presenza di tutti i segnali in fluorescenza attesi
consente di dimostrare la assenza di delezioni dei 19 esoni/promotore considerati nel gene della distrofina.
L’assenza di uno o più segnali in fluorescenza relativi ad di uno o più esoni in soggetti di sesso maschile consente di
evidenziare la presenza di una delezione specifica nel gene della distrofina. In particolare, in Figura 2 è mostrata la
corsa elettroforetica relativa ad un soggetto affetto da DMD che evidenzia una delezione che interessa gli esoni 49,
50 e 51 (assenza degli amplificati relativi alla delezione evidenziata con una banda di colore rosa nelle fluorescenze
6’FAM e 5’HEX).
Per interpretare correttamente i risultati:
- Settare i Bin, come mostrato precedentemente
- Confrontare la corsa elettroforetica con quella di un DNA in cui non sono presenti delezioni a carico del gene della
distrofina.
Sono da considerare accettabili, e quindi interpretabili, le corse elettroforetiche in cui tutti i segnali di fluorescenza
attesi presentino valori di RFU (Relative Fluorescence Unit) maggiori di 800 (eccezione è fatta per il picco di
fluorescenza relativo al promotore MSP ed all’esone 48, di cui sono considerati accettabili valori maggiori di 500).
Nel caso in cui i valori di RFU non rispettino i suddetti valori di riferimento, l’esperimento deve essere considerato
non valido e quindi ripetuto (vedi troubleshooting).
12 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Figura 2. Profilo elettroforetico di DMD/BMD Detection kit di un un soggetto affetto da DMD che evidenzia una
delezione a carico degli esoni 49, 50 e 51. E’ possibile constatare, confrontando con i risultati in Figura 1, l‘assenza
dei picchi elettroforetii corrispondenti a 388 paia di basi in 6’FAM (esone 51), 271 paia di basi in 5’HEX (esone 50),
440 paia di basi in 5’HEX (esone 49). Le delezioni sono messe in evidenza, a scopo dimostrativo, da barre di colore
rosa che sostituiscono i relativi picchi elettroforetici.
13 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Troubleshooting
Se DMD/BMD DETECTION KIT sembra non funzionare correttamente in laboratorio, cercare di seguire i consigli ed i
suggerimenti nelle tabelle sottostanti. Se il DNA sembra non amplificarsi correttamente, il processo di risoluzione
dei problemi dovrebbe concentrarsi sulla la PCR e/o sulle condizioni elettroforetiche.
1. Assenza di picchi di fluorescenza in elettroforesi
DNA
PCR
Possibile causa
Templato di DNA insufficiente o
degradato
Errato protocollo di PCR; Errato
programma del termociclatore
Azione suggerita
Estrarre nuovamente il campione
Ricontrollare il protocollo suggerito, seguendo passo per
passo la metodica. Eventualmente ripetere il test
2. Picchi di fluorescenza troppo deboli
DNA
Possibile causa
- DNA di scarsa qualità
- Presenza di inibitori di PC
- Scarsa quantità di templato di DNA
PCR
Protocollo di PCR non corretto
Azione suggerita
Ricontrollare la metodica di preparazione del campione
delle soluzioni, e della loro conservazione
Preparare nuovamente il DNA utilizzando il metodo
consigliato ed effettuare nuovamente il test
Estrarre nuovamente il campione
Controllare il programma nel termociclatore
Controllare la calibratura del termociclatore
Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato
ed
effettuare nuovamente il test
3. Picchi di fluorescenza troppo intensi durante l’elettroforesi
DNA
PCR
Possibile causa
Templato di DNA in eccesso
Utilizzato un programma non corretto
Azione suggerita
Diluire il DNA ed effettuare l’amplificazione
Controllare il programma nel termociclatore
Controllare la calibratura del termociclatore
Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo
consigliato ed
effettuare nuovamente il test
Eccessiva quantità di PCR caricata sul
sequenziatore
Diluire la PCR ed effettuare nuovamente la corsa
elettroforetica
4. Picchi di fluorescenza aspecifici
DNA
PCR
Possibile causa
Templato di DNA in eccesso
Eccessiva quantità di PCR caricata sul
sequenziatore
Azione suggerita
Diluire la quantità di DNA utilizzata per la PCR
Diluire la quantità di PCR da caricare nel sequenziatore
14 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
Referenze
1.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Chamberlain JS,
Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT. Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9;16(23):11141-56.
2. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM,
Kunkel LM. Hum Genet. 1990 Nov;86(1):45-8.
Orga Bio Human S.r.l.
Sede Legale
Via Helsinki 21 00144 – Roma
Tel. 06 97998273, Fax. 06 52246148
Sede Operativa
Via Amsterdam 75 00144 – Roma
Tel. 06 99701675, Fax. 06 99701675
Web
www.orgabiohuman.it
[email protected]
Simboli Utilizzati
Codice prodotto
Numero di lotto
Data d iscadenza
Numero di reazioni
Precauzioni
Versione
Fabbricante
Temperatura di conservazione
15 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human
16 DMD/BMD Detection Kit Data Sheet- Orga Bio Human