ThromboType test (HPA 1

ISTRUZIONI PER L’USO
ThromboType® test
(HPA 1-6, 15)
REF
THROMBOTYPE
IVD
ThromboType Reagenti
E-Gel 48
INDICE
USO ............................................................................................................................................................................... 2
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE ..................................................................................................................................... 2
PRINCIPIO ..................................................................................................................................................................... 2
REAGENTI ..................................................................................................................................................................... 2
AVVERTENZE ............................................................................................................................................................... 3
PRECAUZIONI .............................................................................................................................................................. 2
RACCOLTA CAMPIONI ................................................................................................................................................ 3
PROCEDURA ................................................................................................................................................................ 3
Materiale Fornito....................................................................................................................................................... 3
Materiale Necessario ................................................................................................................................................ 4
Procedura ................................................................................................................................................................. 4
CONTROLLO DI QUALITA' .......................................................................................................................................... 7
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI ........................................................................................................................... 8
LIMITAZIONI .................................................................................................................................................................. 8
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DEL TEST ............................................................................................................. 8
REFERENZE ................................................................................................................................................................. 9
ThromboType test
1
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USO
A
ThromboType test è un’analisi per la determinazione molecolare dell’ HPA-1 (Pl ), HPA-2 (Ko), HPA-3 (Bak), HPA-4 (Pen), HPA-5
(Br), HPA-6 (Ca), e HPA-15 (Gov), mediante amplificazione PCR del DNA genomico.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE
Gli alloantigeni piastrinici umani (HPAs) sono associati a sostituzioni amminoacidiche nelle glicoproteine piastriniche. Non incidono
nella funzione di queste proteine, ma le modifiche ne alterano la conformazione. Il conseguente determinante antigenico può
diventare un bersaglio per anticorpi allo- e autoimmuni responsabili di disordini di sanguinamento, refrattarietà a trasfusioni
piastriniche, porpora post-trasfusionale e trombocitopenia neonatale allo immune. Le metodiche sierologiche per le tipizzazioni
piastriniche hanno dei limiti dovuti alla mancanza della caratterizzazione degli allo-antisieri e alla scarsità di piastrine nei pazienti
trombocitopenici. Con i progressi dell’immunogenetica piastrinica è ora possibile genotipizzare le singole differenze nucleotidiche che
caratterizzano i polimorfismi allelici dell’ HPA.
ThromboType test è un’alternativa alle metodiche sierologiche e in aggiunta al corrisponente HLA è utilizzato nella selezione di
piastrine compatibili con un ricevente alloimmunizzato. ThromboType test contiene i reagenti necessari per eseguire una PCR allele
specifica su DNA genomico isolato e identificare il genotipo per l’ HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6 e 15 in gel.
PRINCIPIO
L’analisi usa una esclusiva reazione a catena della polimerasi (PCR) allele specifica; il DNA è amplificato solo in presenza dell’allele
A
specifico. Questa amplificazione determina la presenza dell’allele per i polimorfismi piastrinici HPA-1 (PL ), 2 (Ko), 3 (Bak),
4 (Pen), 5 (Br), 6 (Ca), e 15 (Gov) nel DNA campione. Il DNA genomico deve essere prima isolato utilizzando un kit commerciale o
una tecnica pubblicata in modo tale da produrre DNA genomico puro. Il campione di DNA è amplificato utilizzando i reagenti e le
miniprovette fornite. Dopo l’amplificazione un’aliquota di ogni reazione viene pipettata in un pozzetto di un gel di agarosio,
l’elettroforesi di 15-20 minuti separerà i prodotti PCR in base alla loro grandezza. Il gel viene esaminato su un transilluminatore UV; la
presenza di bande della grandezza corretta indica la presenza degli alleli nel DNA campione. Bande prodotte da primer di controlli
interni dimostrano una condizione ottimale in ogni miniprovetta PCR. E’ possibile fotografare il gel per ottenere una foto dell’analisi.
REAGENTI
Numero massimo di test per kit:

ThromboType:
8 test per kit
Tutti i reagenti devono essere conservati come indicato sull’etichetta.
REF
404567
HPA Primer provette: microprovette PCR contenenti primer allele specifici essiccati. Le
microprovette sono racchiuse in un sacchetto richiudibile. Pronto all’uso.
a : Microprovette viola. Fila di microprovette contenente primer specifici per gli alleli A dell’
HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 15 e uno vuoto marcato con un puntino nero.
b: Microprovette verdi. Fila di microprovette contenente primer specifici per gli alleli B dell’
HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 15 e uno vuoto marcato con un puntino nero.
LAD
404542
Marcatore di bande 100 bp: Frammento di DNA a doppia elica da 100 a 1000 paia di basi (pb)
in tris buffer. Pronto all’uso.
PR
404549
Reagente 2X PCR: tampone Tris KCl contenente cloruro di magnesio, primer oligonucleotidi,
desossinucleotidi trifosfati liberi (dNTPs), altri componenti. Diluire prima dell’uso.
E-Gel 48
404607
E-Gel 48 Gel: gel agarosio pronto (4%) per la separazione dei prodotti PCR. Pronto all’uso
PT
a/b
PRECAUZIONI
•
•
•
•
•
•
•
Non usare reagenti e gel dopo la loro data di scadenza.
Non usare reagenti torbidi o contaminati.
Non usare gel che appaiono rotti o contaminati.
Microprovette PCR e reagenti contenuti nei kit non devono essere utilizzati con altri sistemi di analisi.
L’orientamento delle provette dei Primer è determinato dal pallino nero sulla provetta vuota. I numeri indicati sugli trip non sono
da considerare come riferimento.
Sostituzioni di componenti diversi da quelli contenuti nel kit possono portare a risultati incoerenti o errati.
Termociclatori diversi possono influenzare l’esecuzione del test, per otterene i risultati corretti, i laboratori
devono aggiustare i parametri del termociclatore in uso.
ThromboType test
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•
•
Non isolare il campione di DNA da sangue eparinato. L’eparina interferisce con l’amplificazione PCR.
La PCR è coperta da licenza della Roche Molecular Systems e F. Hoffman LaRoche Ltd. Per informazioni o licenze contattare (in
USA) il Director of Licensing a Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, o (fuori USA)
PCR Licensing Manager, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Grenzacherstr.124, CH-4070 Basel, Switzerland.
•
Pratica di laboratorio PCR
La PCR è in grado di amplificare una sequenza di DNA ma è sensibile a contaminazioni anche di piccole quantità di DNA
esogeno, evitare quindi introduzione di materiale amplificato in precedenza nel campione da analizzare.
Le contaminazioni possono essere ridotte separando la zona di pre-amplificazione da quella di post-amplificazione,
preferibilmente in stanze separate. Per la preparazione del DNA usare la cappa biologica per minimizzare la potenziale
contaminazione da aerosol. Per la post-PCR usare materiale in plastica e carta assorbente per assorbire gli schizzi. La carta
deve essere eliminata nei rifiuti biologici. Ogni area di lavoro deve avere una serie di pipette dedicate. Ridurre al minimo la
condivisione di attrezzature di laboratorio tra pre- e post-amplificazione, mentre ogni attrezzature dalla post deve essere pulita
con un agente inattivante DNA (per es. candeggina 10%) prima di essere trasferita nell’area pre. Usare un puntale nuovo per
ogni fase di dispensazione e puntali con filtro come barriera antiaerosol. Indossare un camice diverso per ogni area di lavoro e
cambiare frequentemente i guanti durante il lavoro. Infine, quando si esegue il test, predisporre il controllo del kit e quello
ambientale (controllo negativo contenente acqua al posto del DNA) dopo i campioni paziente.
AVVERTENZE



A completamento dell’ analisi, disporre il materiale di scarto nei rifiuti biologici e decontaminare il materiale residuo con candeggina
10% o altro agente inattivante DNA.
Il transilluminatore UV usato per visualizzare le bande prodotte dalla PCR emette luce ultravioletta che può danneggiare occhi e
pelle, quindi indossare sempre abbigliamento protettivo e occhiali anti-UV o lo scudo per il viso.
E-Gels contiene una piccola quantità di etidio bromuro per evidenziare il DNA. L’etidio bromuro è un noto agente mutageno
umano. Non aprire l’involucro contenente il gel. Smaltire il gel secondo le leggi e regolamentazioni locali.
RACCOLTA CAMPIONI
Isolare DNA utilizzando un metodo pubblicato o un kit commerciale, prodotto per tale scopo.
Risospendere DNA in acqua sterile o in 10mM tris, pH 8.0-9.0. Il campione non dovrebbe essere reidratato in soluzione contenente
una concentrazione maggiore di 0.5 mM EDTA o altro agente chelante che potrebbero interferire con la PCR.
Il DNA campione può essere analizzato immediatamente dopo l’isolamento o conservato in un freezer no-frost a -20°C per un lungo
periodo (più di un anno) senza interferire sul risultato. Il test ThromboType test su campioni congelati (-20°C) diluito in buffer
Tris/EDTA (10 mM Tris, pH 8.0 – 9.0/0.5 mM EDTA) e conservato in microprovette con tappo a vite e relaiva guarnizione ha mostrato
il 100% di sovrapponibilità con i risultati del sequenziamento del DNA sugli stessi campioni. Dati aggiuntivi su campioni congelati
sono disponibili da due kit commerciali di isolamento del DNA (Gentra Systems e QIAgen web sites).
Il campione di DNA dovrebbe avere un range da 10 – 200 ng/μL, con 260 nm/280 nm, ratio tra 1.60 e 1.90.
Presenza o contaminazioni eccessive da proteine o RNA, eparina, EDTA o altri agenti chelanti possono interferire con
l’amplificazione PCR.
PROCEDURA
NOTA: I flaconi possono contenere più reattivi di quanto descritto sull’etichetta. Quantificare con cura i reattivi con dispositivi
appropriati quando preparate le diluizioni.
Materiale Fornito
o
Confezione da conservare a 2 - 8 C
1. Otto sacchetti richiudibili, ognuno contenente

una strip di 8 microprovette per amplificazione (viola) per gli alleli a dell’ HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 15.

una strip di 8 microprovette per amplificazione (verde) per gli alleli b dell’ HPA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 15.
2. Reagenti per PCR 4 x 450 L 2X
3. Marcatore di bande 1 x 200 L 100 bp
4. 3 fogli adesivi
FS
Confezione da conservare a 15 - 25°C
1.
3 x 4% E-Gel 48
ThromboType test
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Materiale Necessario (ma non fornito)
Per la PCR

Taq Polimerasi, nativa o ricombinante, 5U/μL. Non usare altre polimerasi termostabili o preparati “hot start” di Taq polimerasi.

Termociclatore con cuvette da 0.2 mL per microprovette PCR.

Silicone spacer pad

Micropipette regolabili da 1 - 1000 L e puntali sterili con filtro

Acqua DNA- Dnase libera

Box ghiacciato o porta campioni freddo per miniprovette da 0.6 mL o 1.5 mL e 0.2 mL per PCR

Porta campioni PCR (0.2 mL)

Vortex

Microcentrifuga per microprovette (0.5 - 1.7 mL), DNA- e DNase-libera

Candeggina 10% o altro agente inattivante il DNA.
Per








l’ Analisi e l’ Elettroforesi
Camera Gel - E-Base Motherbase
Porta campioni PCR (0.2 mL)
Micropipette regolabili da 1 - 20 L e puntali sterili con filtro
Carta assorbente da banco di laboratorio
Transilluminatore UV
Candeggina 10% o altro agente inattivante il DNA.
Acqua deionizzata
Sistema di documentazione Gel
Opzionali

Micropipetta regolabile multicanale da 5 L a 10 µL, e puntali sterili con filtro

Pipetta elettronica o Pipetta con siringa da 25 µL e puntali sterili con filtro
Procedura
Prima del test
1.
Isolare DNA genomico da tutti i campioni da testare. Ogni campione dovrebbe avere una concentrazione di DNA in un range tra
10 – 200 ng/µL e 260 nm/280 nm ratio tra 1.60 and 1.90.
2.
Programmare il termociclatore con il programma PCR per il ThromboType test. Il programma è il seguente:
94 C
o
30 secondi
94 C
o
57 C
o
72 C
o
1 secondo
30 secondi
10 secondi
6 cicli
94 C
o
65 C
o
72 C
o
1 secondo
30 secondi
10 secondi
27 cicli
o
12 secondi
72 C
o
4C
NOTA:
Hold
Questo programma di cicli è stato sviluppato nella modalità di corsa MAX con ABI PE9700. A causa delle differenze dei
singoli termociclatori, ogni strumento deve essere validato mediante l’amplificazione di un campione noto. Se le bande
sono deboli, incrementare il tempo di annealing di 1 sec alla volta sino ad un massimo di 35 sec, fino ad ottenere un
prodotto accettabile. Se le bande sono deboli o appaiono bande problematiche di dimeri ridurre i tempi di annealing di 1
sec fino ad un minimo di 25 sec. fino a quando scompaiono le bande dei i dimeri.
PCR
3.
Accendere il termociclatore in anticipo, assicurarsi del corretto setup e che il coperchio raggiunga la temperatura operativa .
Controllare il programma.
4.
Tenere la Taq polimerasi e il reagente 2X PCR in ghiaccio o su piastra fredda.
5.
Preparare il piano di lavoro e le pipette pulendo con candeggina 10% o altro agente inattivante il DNA.
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6.
Determinare il numero di campioni da testare. Identificare delle microprovette con tappo in polipropilene da 0.6 mL o 1.5 mL per
ognuno. Identificare delle microprovette per il controllo negativo per la preparazione delle master mix. Porre in ghiaccio o piastra
fredda.
7.
8.
Fare una mappa che identifichi la posizione delle microprovette di ogni campione.
Per ogni campione da analizzare selezionare un sacchetto contenente le microprovette con i primer. Ogni campione richiede
uno strip A (viola) e uno strip B (verde). Porre questi strip su piastra fredda o in ghiaccio con le microprovette A sopra le B per
ogni campione e delle microprovette vuote (marcate con il pallino nero) a destra. Le microprovette devono essere orientate (da
sinistra a destra) HPA 1, 2, 3, 4, 5, 6, 15, e provetta vuota.
9.
Usare la colonna B della tavola 1 per preparare le diluizioni operative della Taq polimerasi (concentrazione finale di 0.5 U/l)in
microprovette da microcentrifuga. Per diluire l’enzima utilizzare acqua DNA-libera.Porre la Taq diluita in ghiaccio o piastra fredda.
Diluizione della Taq polimerasi
A
B
# Campioni
Diluizione Taq
1
2.4 L Taq
21.6 L acqua
24 L
2
4.4 L Taq
39.6 L acqua
44 L
3
6.0 L Taq
54.0 L acqua
60 L
4
8.0 L Taq
72.0 L acqua
80 L
5
9.8 L Taq
88.2 L acqua
98 L
6
11.5 L Taq
103.5 L acqua
115 L
7
13.5 L Taq
121.5 L acqua
135 L
8
15.0 L Taq
135.0 L acqua
150 L
10. Identificare delle microprovette (0.6 mL or 1.5 mL) per ogni campione da testare e una per il controllo negativo per la master mix.
11. Preparare la master mix per ogni campione usando i calcoli della tabella 2. Comunque se la concentrazione è tra 20 ng/µL e
100 ng/μL usare il metodo della tabella 3.
L’utilizzatore può usare un protocollo alternativo per microprovetta PCR:




12.5 μL di reagente 2X PCR
Taq polimerasi 0.5 Unità
40 – 200 ng DNA genomico umano
Acqua DNA-libera per un volume finale di 25 µL
Usare la Tavola 2 come guida.
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Preparazione delle Master Mix del Campione
16 provette PCR
25 µL = 400 µL
DNA volume (a)= 16 X
100 ng/provetta ÷ DNA
conc(ng/µL).*
Volume di acqua
Taq
polimerasi @
0.5U/µL
Reagente
PCR 2X
Volume totale
della Master
Mix
400 µL
1600 ng ÷ DNA conc
(ng/µL) = (a)µL
+ 184 µL – (a)
+ 16 µL
+ 200 µL
= 400 µL
*range di concentrazione del DNA 10-200 ng/µL
Preparazione delle Master Mixes del Campione Semplificata
Volume di Acqua
Reagente PCR 2X
Taq Polimerasi
(0.5 U/µL)
Campione
DNA
Volume totale della Master Mix
152 μL
200 μL
16 μL
32 μL
400 μL
12. Preparare il controllo negativo aggiungendo 25 L di reagente PCR 2X, 2 L di Taq polimerasi diluita, e 23 L acqua DNA-libera.
13. Chiudere tutte le master mix e agitare al vortex per 3 – 5 secondi.
14. Rimuovere e buttare i tappi delle microprovette PCR.
15. Per ogni campione, pipettare 25 μL della master mix nelle prime 7 microprovette della strip a (viola) e dallo strip b (verde).
Lasciare la microprovetta 8 dello strip vuota.
16. Pipettare 25 μL della master mix del controllo negativo in una delle microprovette vuote delle strip.
17. Chiudere accuratamente tutte le microprovette PCR con il foglio adesivo.
18. Esaminare le microprovette PCR dopo la chiusura con il foglio. Eliminare le eventuali bolle presenti nella microprovetta PCR.
Raccogliere qualsiasi goccia presente nella microprovetta PCR picchiettando delicatamente lo strip sul bancone o centrifugando
brevemente.
NOTA: È fondamentale che non siano presenti bolle nel volume di reazione nelle microprovette PCR e che non ci siano goccioline
di master mix sulle pareti delle microprovette. Disattenzioni in questa fase potrebbero portare ad una perdita
dell’amplificazione allele- specifica.
19. Far partire il programma del ThromboType test sul termociclatore. Quando il blocco porta campione raggiungere 70° C, mettere il
programma in pausa o hold. Trasferire le microprovette PCR dal ghiaccio o piastra fredda nel blocco porta campione del
termociclatore. Porre una strip di provette PCR vuote in più nel termoblocco in posizione opposta alle provette del test come
spaziatore.
20. Mettere un copri piastra in silicone sul foglio di chiusura delle microprovette PCR; assicurarsi di allineare correttamente le strip e
che il copri piastra in silicone non si muova chiudendo il coperchio del termociclatore.
NOTA: E’importante mantenere la pressione sul foglio che sigilla le piastre PCR per evitare evaporazioni durante le fasi PCR ad alta
temperatura. Per evitare questo, mettere delle strip vuote di microprovette PCR intorno alle strip in analisi per dare una
chiusura perfetta e uniforme anche ai bordi. Il copri piastra in silicone aiuta a mantenere una adeguata pressione e
compensa le piccole variazioni in altezza delle microprovette PCR.
21. Riprendere i cicli del programma PCR. Il programma dura circa 55 minuti.
22. Quando il termociclatore ha raggiunto l’ultima fase (4° infinito) rimuovere le microprovette PCR e trasferirle in una piastra porta
campioni. Se l’elettroforesi non può essere eseguita immediatamente, conservare le microprovette PCR in frigo ( 2-8° C) per un
massimo di 3 giorni o in congelatore a -20°C per un massimo di 7 giorni.
Rivelazione
NOTA: La fase di rivelazione deve essere eseguita in un’area separata da quella usata per eseguire la pre-PCR. I dispositivi non
devono essere trasferiti tra queste aree per evitare contaminazioni da trascinamento (carryover)
23. Preparare l’area di lavoro con carta assorbente, porre la camera gel, acqua deionizzata, marcatore di bande 100 bp e pipette.
24. Se i campioni amplificati sono congelati, rimuovere dal congelatore e lasciare scongelare prima dell’uso.
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NOTA: La procedura che segue descrive la rivelazione su un singolo E-Gel che può contenere fino a 3 diversi campioni. Se sono
stati amplificati più di tre campioni, servirà utilizzare più E-Gel.
25. Rimuovere un E-Gel dal sacchetto e rimuovere il pettine. Se necessario, pulire la superficie superiore del gel con carta
assorbente da laboratorio inumidita. E’ possibile utilizzare un pennarello per segnare il gel.
26. Far scorrere il gel sulla E-Base Motherbase garantendo il contatto tra gli elettrodi del gel e quelli della camera gel.
27. Pipettare 10 L di acqua deionizzata in tutti i pozzetti che conterranno i prodotti di PCR (14 pozzetti per ogni campione più uno
per il controllo negativo). Non aggiungere acqua nel pozzetto contrassegnato con M destinato al marcatore di bande 100 bp.
28. Per ogni campione, forare il foglio di chiusura delle microprovette PCR con puntali puliti. Pipettare 5 μL di ogni amplificato nel
pozzetto designato sul gel. Non forare il foglio di chiusura se non si è pronti per il trasferimento dell’amplificato nel gel.
NOTA: L’utilizzo di una pipetta multicanale accelera il caricamento dei campioni ma i volumi ridotti e la dispensazione multipla
potrebbero portare ad un errore di caricamento.
NOTA: Per ogni campione pipettare il prodotto ottenuto dall’amplificazione a e b, specifica per ciascun polimorfismo, in pozzetti
adiacenti del gel per facilitare l’interpretazione dei risultati.
29. Forare il controllo negative e pipettare 5 μL del prodotto di PCR nel pozzetto designato.
30. Pipettare 15 L del marcatore di bande 100 bp nei quattro pozzetti laterali a lui riservati (identificati con M).
NOTA: Se si fa correre un solo campione non bisogna pipettare il marcatore di basi 100 bp nei 4 pozzetti laterali, tuttavia, ogni
campione deve sempre correre con il marcatore di bande per determinare correttamente le dimensioni dell’amplificato.
31. Collegare la camera gel. Si accenderà una luce rossa e il display con il tempo di corsa. Utilizzare il tasto POWER (tasto destro)
per alternare EG MODE (invece di EP MODE).
32. Utilizzare il tasto di sinistra e impostare il tempo su 17 minuti.
NOTA: Una adeguata separazione delle bande si ottiene facendo correre per un tempo minimo di 15 minuti. Tuttavia la separazione
delle bande può migliorare facendo correre il gel per 17-20 minuti. Non far correre il gel per un tempo superiore a 20 minuti.
33. Premere il tasto POWER (tasto destro) per iniziare l’elettroforesi. La luce rossa cambia in verde e inizia la corsa.
34. Alla fine dell’elettroforesi la luce verde cambia in rossa lampeggiante e apparirà un segnale sonoro. Premere il tasto POWER per
stoppare la corsa. La luce rossa lampeggiante ritornerà rossa. Scollegare il dispositivo e rimuovere il gel dalla camera.
35. Prendere il gel e osservare le bande utilizzando un transilluminatore UV. Il gel deve essere osservato e registrato entro 20 minuti.
Se si desidera registrare la seduta è possibile fotografare il gel utilizzando un sistema di documentazione di immagine.
CONTROLLO DI QUALITA'
I primer del controllo interno producono una banda di 85 bp se è caricato in una reazione PCR, 40 ng o più di DNA umano
amplificato. Questa banda deve apparire in tutte le file dell’amplificazione tranne nel controllo negativo. Tuttavia, poichè
l’amplificazione allele-specifica compete con quella del controllo interno, il prodotto del controllo interno può essere debole o assente
nelle file in cui è presente la banda allele-specifica. L’assenza della banda di controllo interno nella fila dov’è presente la banda allelespecifica non dovrà essere motivo di preoccupazione. Tuttavia, se il DNA è stato caricato da una microprovetta PCR e la banda di
controllo o la banda allele-specifica sono assenti l’amplificazione è da considerare fallita. Questi fallimenti dell’amplificazione possono
derivare da deterioramento di uno dei reagenti, da errata programmazione dei cicli della PCR, dalla scarsa purificazione del DNA
campione, da una quantità insufficiente di DNA caricata nella PCR, o dalla mancata aggiunta di uno dei reattivi delle PCR. I risultati
invalidabili devono essere ritestati, preferibilmente isolando nuovamente il DNA.
Il marcatore di bande100 bp da un’indicazione delle dimensioni delle bande prodotte dalla PCR; il marcatore dovrebbe, quindi, essere
incluso in tutte le elettroforesi e le sue bande devono apparire nette e separate. Ogni analisi dove le bande del marcatore a ppaiono
compresse o non separate (effetto smear) dovrebbero essere ripetute e i risultati non validati.
Con alcuni campioni di DNA o termociclatori si possono formare bande di primer dimeri. Queste bande di 85 bp, o più piccole, non
influenzano la tipizzazione del ThromboType test la modifica del programma dei cicli della PCR, come descritto nella sezione
corrispondente, può minimizzare la loro presenza.
La fila del controllo negativo (acqua) non deve avere prodotti di PCR, bande allele specifiche o di controllo interno. La presenza di
una banda in questa fila indica un errore tecnico o una contaminazione dei reagenti. Se i controlli non sono quelli attesi i risultati non
sono validi e l’analisi deve essere ripetuta.
ThromboType test
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INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
La presenza di una banda allele specifica della corretta grandezza in una fila indica un risultato positivo per quell’allele. Leggere
l’elenco sottostante delle dimensione del prodotto PCR allele-specifico e l’elenco degli artefatti PCR osservati nel test ThromboType
test (p. 8). L’assenza della banda indica l’assenza di questo allele nel campione (risultato negativo). Se è presente la banda del
controllo interno, l’amplificazione è avvenuta correttamente. Se i prodotti di PCR sono assenti, controllo interno e banda allele
specifica, l’amplificazione non è avvenuta e il campione deve essere ritestato.
Prodotto
HPA-1
HPA-2
HPA-3
HPA-4
HPA-5
HPA-6
HPA-15 (Gov)
Controllo
Dimensioni (bp)
124
153
260
178
228
135
117
85
Per tutto il sistema HPA l’amplificazione a e b di un campione produce la stessa quantità di prodotto PCR se l’allele è presente.
Campioni eterozigoti possono produrre bande di una intesità molto simile per tutti i sette sistemi HPA tipizzati con questo test. Un
campione dove la banda allele specifica è più debole in confronto all’altra banda probabilmente non è eterozigote. Una banda debole
può derivare da un errore tecnico o dal proseguimento della lettura (read-through) della reazione PCR. Il proseguimento della lettura
(read-through) è causato da un livello di amplificazione basso del primer allele-specifico di un campione DNA che non presenta
quell’allele. Tali campioni dovrebbero essere ritestati usando una minore quantità di campione di DNA per confermare l’assenza di
errori tecnici. Dopo avere ritestato un campione , l’apparizione di una banda di simile intensità alternata all’allele, indica un risultato
positivo per la rezione in questione, e il campione può essere tipizzato come positivo per l’allele, un eterozigote vero. Questo
dovrebbe suggerire il verificarsi di un errore tecnico come causa del risultato originale sospetto. La presenza di una banda debole
dopo aver rifatto il test, indica un vero “read-through” o un falso positivo e il campione dovrebbe essere considerato negativo per
quell’allele.
LIMITAZIONI






ThromboType test contiene reattivi per l’amplificazione di una sequenza genomica di DNA con la reazione a catena della
polimerasi e identifica mediante rilevazione qualitativa gli alleli specifici dell’ HPA 1 - 6 e 15 (Gov) con elettroforesi su gel di
agarosio.Variazioni non conosciute nella sequenza del gene possono condurre a risultati errati.
Per assicurare risultati ottimali nell’analisi ThromboType test il DNA campione dovrebbe avere una concentrazione tra 10 ng/L
e 200 ng/µL con 260/280 ratio e 1.60 – 1.90. Amplificazioni povere possono derivare da dispensazione di una quantità
insufficiente di DNA per reazione, o da una scarsa purificazione del DNA campione.
Risultati falsi negativi possono derivare da errori nella manipolazione dei reattivi, errori procedurali, inibitori dell’amplificazione o
DNA campione inadeguato.
Risultati falsi positivi possono derivare da contaminazioni da acidi nucleici, eccesso di DNA campione caricato
nell’amplificazione, temperature sbagliate.
Questa analisi è stata sviluppata con DNA genomico umano adulto. Non è validata con campioni di DNA prenatale.
Questo test è stato validato utilizzando i termociclatori ABI PE9700, 9600, e 2720 e MJ Research PTC-200 (ora Bio-Rad), e
Eppendorf Mastercycler e Mastercycler EP. Sono possibili modifiche sui cicli PCR se si usano altri termociclatori che devono
essere calibrati e utilizzati come da istruzioni del produttore.
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DEL TEST
Accuratezza
La precisione dell’analisi ThromboType test è stato valutato da due differenti studi:
Confronto tra risultati ThromboType test e altro metodo molecolare per tipizzazione del DNA
Sono stati genotipizzati trentasei campioni, che coprono un vasto range di alleli HPA, con il test ThromboType test per HPA – 1a/b,
HPA – 2a/b, HPA – 3a/b, HPA – 4a/b, HPA – 5a/b, HPA – 6a/b, e HPA 15a/b. I campioni sono stati anche testati con un altro metodo
PCR basato sulla tipizzazione molecolare e valutati esternamente indipendentemente. Sono stati ottenuti 14 risultati per ogni
campione (504 risultati totali). Solo un campione raro è stato tipizzato con un sistema solo per HPA-6 a/b. I risultati ottenuti nei 506
test mostrano una concordanza del 99.8%.
Confronto tra risultati ThromboType test e sequenziamento del DNA
Quarantasei campioni che coprono un vasto range di alleli HPA sono stati testati con il il ThromboType test. E’ stata anche determinata
la sequenza del DNA di questi campioni per HPA – 1a/b, HPA – 2a/b, HPA – 3a/b, HPA – 4 a/b, HPA – 5a/b, HPA – 6a/b,
e HPA – 15a/b. I risultati del test ThromboType test mostrano una concordanza del 100% con i risultati ottenuti dal sequenziamento del
DNA.
ThromboType test
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Precisione del test
E’ stata valutata anche la riproducibilità del test ThromboType test testando in doppio tre campioni rappresentativi per un range di
alleli in nove giorni diversi. I risultati hanno dimostrato una riproducibilità del 100% nei diversi giorni.
Artefatti PCR osservati:
1. Mix di reazione HPA-3 (sia 3a e 3b) può generare uno “smear” di frammenti di DNA non-specifici. Questo “smear” ha un range di
peso molecolare di circa 300 bp o più. Se appare in una provetta dove si è generata una debole banda allele-specifica, lo
smear provoca una banda allele-specifica aumentata. Occasionalmente al posto dello smear appare una banda diffusa di >500
bp , oppure può essere vista tra lo smear. Questo artefatto ha dimostrato di non avere alcun effetto sulla presenza o assenza del
prodotto PCR allele-specifico non ha, quindi, alcun effetto sulla tipizzazione.
2. La mix di reazione HPA-3 può generare un debole artefatto di PCR con dimensioni di circa 165bp. Spesso questo compare
congiuntamente ad uno smear derivante dalle amplificazioni allele-negative descritte al punto 1.
3. La mix di reazione HPA-5 può generare una doppia banda anzichè una singola banda in un campione allele positivo. Questo è
stato osservato sia nelle provette dei primer 5a sia 5b. Lo sdoppiamento non ha alcun effetto sulla tipizzazione. Se un campione
è allele negativo, la reazione non produrrà bande nè singola nè doppia.
4. Sono comunemente osservati dimeri di Primer e primer non incorporati. Queste bande di peso molecolare debole, spesso poco
evidenti, più piccole di 85 bp, prodotto del controllo interno, possono essere ignorate.
5. Lettura completa delle bande – possono essere osservate deboli bande allele-specifiche in am plificazioni di campioni allelespecifici negativi, soprattutto caricando elevato DNA.
REFERENZE
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a
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