FAST Sesame - R

RIDASCREEN®FAST Sesame
Saggio immunoenzimatico per l’analisi quantitativa
di sesamo
Art. No.: R7202
Test in vitro
Conservare a 2 - 8 °C
R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany
Tel. : +49 (0) 61 51 81 02-0 / Telefax: +49 (0) 61 51 81 02-20
Prodotto da:
R-Biopharm AG
An der neuen Bergstraße 17
D- 64297 Darmstadt
www.r-biopharm.com
Per informazioni:
Telefono:
Centralino
(0 61 51) 81 02-0
Telefax / E-Mail:
Ordini
(0 61 51) 81 02-20
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Marketing
(0 61 51) 81 02-40
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Distribuito da:
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20077 Melegnano MI
Telefono 02 9823 3330
[email protected] - www.r-biopharm.com
RIDA® e RIDASCREEN®
sono marchi registrati della R-BIOPHARM AG
Produttore: R-BIOPHARM AG, Darmstadt, Germania
R-BIOPHARM AG è certificata ISO 9001
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RIDASCREEN®FAST Sesame 15-03-30
RIDASCREEN®FAST Sesame
Introduzione
RIDASCREEN®FAST Sesame (Art. No. R7202) è un saggio immunoenzimatico a
sandwich per l’analisi quantitativa di sesamo o parti di sesamo in alimenti quali
cereali, dolci, gelato e cioccolato.
Tutti i reagenti richiesti per il saggio immunoenzimatico – inclusi gli standard –
sono contenuti nel kit. Il kit è sufficiente per 48 determinazioni (inclusi gli
standard). Per la quantificazione è richiesto un lettore per micropiastre.
Preparazione del
campione:
Tempo richiesto:
Limite di rilevabilità:
Limite
di quantificazione:
Specificità:
omogeneizzazione, estrazione e centrifugazione
preparazione dei campioni (10 campioni) ...... ca. 20 min
esecuzione del test (tempo d’incubazione) .......... 30 min
0.24 mg/kg (ppm) di sesamo corrispondente allo
0.000024% di sesamo
2.5 mg/kg (ppm) di sesamo corrispondente allo 0.00025%
di sesamo
Gli anticorpi individuano in modo specifico le proteine di
sesamo.
Non è stata osservata alcuna cross-reattività con
anacardi, noci del Brasile, noci pecan, nocciola, noce di
cocco, noce di macadamia, noce, castagne, semi di
girasole, sesamo e fagioli di lima.
RIDASCREEN®FAST Sesame 15-03-30
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La specificità del kit RIDASCREEN®FAST Sesame è stata determinata
analizzando le cross-reattività delle sostanze corrispondenti in un sistema
tampone. Nel campione la specificità può differire da quanto determinato nel
sistema tampone a causa dell’effetto matrice. Prima di analizzare le sostanze
cross-reattive, è necessario determinare il limite di rilevabilità e i valori di recupero
per le sostanze nella rispettiva matrice.
Il kit non è in grado di discriminare tra analita e sostanza cross-reattiva.
Prodotti correlati:
bioavid Lateral Flow Sesame (Art. No. BL609-10/-25)
SureFood® ALLERGEN ID Sesame (Art. No. S3108)
SureFood® ALLERGEN QUANT Sesame (Art. No. S3208)
1. Scopo
RIDASCREEN®FAST Sesame (Art. No. R7202) è un saggio immunoenzimatico a
sandwich per l’analisi quantitativa di sesamo o parti di sesamo (come ingrediente
o come contaminazione) in materie prime o alimenti processati quali cereali, dolci,
gelato e cioccolato.
2. Generale
I semi di sesamo (Sesamum indicum) sono utilizzati, a crudo o tosati, come
ingrediente in dolci, gelati, cereali, cioccolato o per la produzione di olio o creme
(Tahina). La presenza di sesamo deve obbligatoriamente essere indicata in
etichetta nei paesi dell’Unione Europea, in Canada ed Australia.
L’allergia alimentare ai semi di sesamo è un disagio per la salute sempre più
riconosciuto ed i sintomi variano dall’ eczema allergico al pericolo di vita a causa
di reazioni anafilattiche. Fino ad ora, sono state identificate come potenziali
allergeni sette diverse proteine di sesamo (Ses i 1 -7). L'unico trattamento efficace
per la protezione dei pazienti allergici è l’abolizione dell’assunzione di sesamo
con gli alimenti.
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3. Principio del test
Il test si basa su una reazione antigene-anticorpo. I pozzetti della micropiastra
sono rivestiti con anticorpi specifici diretti contro le proteine di sesamo.
Aggiungendo ai pozzetti gli standard o la soluzione con il campione, le proteine di
sesamo presenti si legano con gli anticorpi specifici. Il risultato è la formazione di
un complesso antigene-anticorpo. I componenti non legati sono rimossi con un
lavaggio. Si aggiunge quindi l’anticorpo coniugato con perossidasi (enzima
coniugato), che si lega al complesso antigene-anticorpo dando luogo a un
complesso anticorpo-antigene-anticorpo (sandwich). Dopo la rimozione mediante
lavaggio del coniugato all’enzima non legato, si aggiunge la soluzione di
substrato/cromogeno. L’enzima coniugato legato converte il cromogeno in un
prodotto blu. L’aggiunta della soluzione di stop porta al viraggio del colore dal blu
al giallo. La misurazione fotometrica viene eseguita a 450 nm. I valori di
assorbimento sono proporzionali alla concentrazione di sesamo nel campione.
4. Materiale fornito
Ciascun kit contiene materiale sufficiente per 48 misurazioni (incluse le analisi
degli standard). Ciascun kit contiene:
1 x Micropiastra da 48 pozzetti (6 strip da 8 pozzetti ciascuna)
rivestiti con anticorpi anti-proteine di sesamo
5 x Soluzioni standard *), 1.3 ml ciascuna
0 ppm (standard zero), 2.5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm
di sesamo in soluzione acquosa, pronte all’uso
1 x Coniugato (7 ml) .......................................................................... tappo rosso
anticorpo coniugato con perossidasi, pronto all’uso
1 x Red Chromogen Pro (10 ml) ...................................................tappo marrone
soluzione substrato/cromogeno di colore rosso
1 x Soluzione di stop (14 ml) ............................................................. tappo giallo
contiene acido solforico 1 N
1 x Tampone di estrazione (AEB) (125 ml) ....................................... tappo verde
concentrato 10x
1 x Tampone di lavaggio (100 ml) ................................................tappo marrone
concentrato 10x
*) Il fattore di diluizione pari a 20 per il campione è già stato considerato.
Pertanto, le concentrazioni di sesamo nei campioni possono essere lette
direttamente dalla curva standard.
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5. Materiale richiesto ma non fornito:
5.1. Attrezzatura:
− lettore per micropiastre (450 nm)
− centrifuga e relativi vial in vetro
− bagnetto d’acqua
− macinino da laboratorio / pestello e mortaio, Ultra-Turrax oppure omogenizzatore
− pipette graduate
− carta da filtro
− micropipette a volume variabile da 20 - 200 µl e 200 - 1000 µl
− se possibile pipette multicanale e/o pipetta multistepper
5.2. Reagenti:
− acqua distillata o deionizzata
− latte scremato in polvere (SMP, qualità alimentare)
6. Avvertenze e precauzioni per gli utilizzatori
Il test deve essere eseguito solo da personale di laboratorio esperto, seguendo
attentamente le istruzioni per l’uso fornite.
La soluzione di lavaggio contiene thimerosal: evitare il contatto con la cute.
La soluzione di stop contiene acido solforico 1 N (R36/38, S2-26).
Il kit può contenere sostanze pericolose. Per ulteriori informazioni sulla sostanze
contenute, far riferimento alla scheda di sicurezza (MSDS) scaricabile
direttamente online al sito www.r-biopharm.com
7. Conservazione
Conservare il kit a 2 - 8 °C (35 - 46 °F). Non congelare alcun componente del kit.
Riporre i pozzetti inutilizzati nella busta originaria, richiuderli nella confezione
insieme all’essiccante fornito e conservarli a 2 - 8 °C (35 - 46 °F).
La soluzione substrato/cromogeno è fotosensibile, evitare pertanto di esporla a
luce diretta.
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La garanzia di qualità scade alla data di scadenza riportata sulla confezione del
kit.
Non scambiare singoli reagenti appartenenti a kit con numero di lotto differente.
8. Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti
− qualsiasi colorazione bluastra della soluzione substrato/cromogeno normalmente
rossa, prima dell’esecuzione del test
− un valore inferiore a 0.8 unità di assorbanza (A450 nm < 0.8) per lo standard 5
9. Preparazione dei campioni
Il tampone di estrazione (AEB) è fornito concentrato 10X. Prima della
diluizione sciogliere eventuali cristalli mediante riscaldamento a 37°C(99°F) in un
bagnetto d’acqua e mescolare accuratamente. Successivamente diluire il
tampone riscaldato concentrato 1:10 (1+9) con acqua distillata prima di utilizzarlo
(es. 100 ml di tampone concentrato + 900 ml di acqua distillata) oppure in
alternativa portare l’intero contenuto del flacone fino a 1250 ml con acqua
distillata. Aggiungere 5 g di latte scremato in polvere (SMP) a 100 ml di tampone
di estrazione diluito (rispettivamente 62.5 g a 1250 ml). Il tampone di estrazione
diluito 1:10 senza SMP è stabile a 2-8°C (35-46°F) per circa 12 settimane mentre
con SMP è stabile per un giorno a 2-8°C (35-46°F).
9.1. Preparazione del test
Attrezzature da laboratorio non perfettamente pulite possono provocare la
contaminazione del campione o dei componenti del kit con il sesamo. E’ bene
quindi indossare i guanti durante l’esecuzione del test e prima di avviare la
procedura:
− pulire le superfici, le provette in vetro, i macinini/trituratori e tutta l’attrezzatura
prima e dopo l’analisi di ciascun campione
− eseguire l’estrazione del campione e la procedura ELISA in stanze separate
− pestare, sbriciolare ed omogeneizzare bene un quantitativo sufficiente di
campione (5 - 50 g)
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9.2. Campioni solidi:
− pesare 1 g di campione, aggiungere 20 ml di soluzione di estrazione (AEB)
preriscaldata (60°C/140°F), diluita ed addizionata con SMP, chiudere la provetta,
mescolare energicamente e riscaldare per 10 minuti a 60° C/140° F in un bagno
d'acqua.
− lasciare raffreddare il campione (ad esempio in un bagno di ghiaccio) e
centrifugare 10 min, almeno 2500 g, se possibile, a 4°C (39°F) e / o filtrare
l'estratto (In alternativa centrifugare 2 ml di estratto ad alta velocità per 10 min in
provette di reazione utilizzando una microcentrifuga)
− utilizzare 100 µl per pozzetto
9.3 Campioni liquidi:
− prelevare 1 ml di campione, aggiungere 19 ml di soluzione di estrazione (AEB)
preriscaldata (60°C/140°F), diluita ed addizionata con SMP, chiudere la provetta,
mescolare energicamente e riscaldare per 10 minuti a 60° C/140° F in un bagno
d'acqua.
− lasciare raffreddare il campione (ad esempio in un bagno di ghiaccio) e
centrifugare 10 min, almeno 2500 g, se possibile, a 4°C (39°F) e/o filtrare
l'estratto (In alternativa centrifugare 2 ml di estratto ad alta velocità per 10 min in
provette di reazione utilizzando una microcentrifuga)
− utilizzare 100 µl per pozzetto
Nota:
Ulteriori diluizioni possono essere eseguite utilizzando il tampone di
estrazione diluito ed addizionato con SMP.
Il campione estratto può essere conservato a 2-8°C (35-46°F) per 3 giorni.
L’estratto non utilizzato può essere conservato a -20°C (-4°F) per alcuni
mesi.
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10. Esecuzione del test
10.1. Preparazione del test ELISA
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25°C/68-77°F) prima dell'uso.
Il tampone di lavaggio è fornito concentrato 10X. Prima dell’uso il tampone deve
essere diluito 1:10 (1+9) con acqua distillata (ad esempio 100 ml di tampone
concentrato + 900 ml di acqua distillata). Prima della diluizione sciogliere eventuali
cristalli mediante riscaldamento a 37°C (99°F) in un bagnetto termostatico. Il
tampone di lavaggio diluito è stabile a 2-8°C (35-46°F) per 4 settimane.
10.2. Procedura per l'esecuzione del test
Eseguire attentamente la procedura di lavaggio raccomandata. Evitare
l’asciugamento dei pozzetti tra i vari passaggi del test.
Non utilizzare più di 3 strip (24 pozzetti) alla volta. Nel caso di più di tre strip, deve
essere utilizzata una seconda piastra non rivestita (ad es. a basso legame Greiner
Bio-One Cat.-No. 655.101) per evitare un cambiamento di piastra nel corso del
tempo. Tutti gli standard e i campioni devono essere aggiunti nella piastra non
rivestita e poi rapidamente trasferiti nella micropiastra rivestita con una pipetta a 8
canali.
1. Inserire un numero sufficiente di pozzetti nel supporto per tutti gli standard e
campioni da eseguire in duplicato. Registrare le posizioni assegnate agli
standard e ai campioni.
2. Pipettare, in duplicato , 100 µl di ciascuna soluzione standard o di campione
preparato nei pozzetti corrispondenti ed incubare per 10 minuti a temperatura
ambiente (20-25°C/68-77°F).
3. Eliminare il liquido dai pozzetti e picchiettare energicamente per 3 volte la
piastra capovolta su carta assorbente per eliminare ogni residuo di liquido.
Riempire i pozzetti con 250 µl di tampone di lavaggio (vedi par. 10.1.) e
svuotarli nuovamente. Ripetere l’operazione di lavaggio altre due volte.
4. In ogni pozzetto aggiungere 100 µl di enzima coniugato. Miscelare ed
incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (20-25°C/68-77°F).
5. Eliminare il liquido dai pozzetti e picchiettare energicamente per 3 volte la
piastra capovolta su carta assorbente per eliminare ogni residuo di liquido.
Riempire i pozzetti con 250 µl di tampone di lavaggio (vedi par. 10.1.) e
svuotarli nuovamente. Ripetere l’operazione di lavaggio altre due volte.
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6. Aggiungere in ogni pozzetto 100 µl della soluzione substrato/cromogeno.
Agitare delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra e incubare
per 10 minuti a temperatura ambiente (20-25°C/68-77°F) e al buio.
7. Addizionare 100 µl di soluzione di stop in ogni pozzetto. Miscelare
delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra e leggere le
assorbanze a 450 nm entro 10 minuti dall'aggiunta della soluzione di stop.
11. Risultati
Per la valutazione delle analisi eseguite con i kit per analisi immunoenzimatiche
RIDASCREEN® è disponibile un apposito software, denominato RIDA®SOFT Win
/ RIDA®SOFT Win.net (cod. Z9996). Il calcolo deve essere fatto usando una
funzione spline cubica. Il grafico della curva standard è riportato sul Certificato di
Controllo di Qualità allegato ad ogni kit.
In confronto al certificato, valori di assorbanza più elevati (A450 nm) per la curva di
calibrazione, soprattutto per lo standard zero, sono indice di lavaggio insufficiente
o di contaminazione da sesamo.
Si raccomanda una ulteriore diluizione ed una nuova lettura dei campioni per
valori di assorbanza (A450 nm) > dello standard 5.
Nota bene:
Operando in accordo alle procedure descritte, il fattore di diluizione è 20. La
concentrazione di sesamo può essere letta direttamente sulla curva standard
(vedi par.4 *) – il fattore di diluizione del campione pari a 20 è già stato
considerato.
Per diluizioni del campione superiori a 1:20 l’ulteriore fattore di diluizione deve
essere tenuto in considerazione per il calcolo della concentrazione di sesamo.
In generale:
A causa della varietà di campioni alimentari, l’effetto matrice non può essere
escluso.
In alimenti processati, le proteine possono essere alterate o frammentate. Ciò può
influire sui valori di recupero.
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Nota:
I campioni risultati negativi potrebbero contenere contaminazioni di sesamo al di
sotto del limite di rilevazione del test oppure contenere altri frammenti proteici di
sesamo (esempio olio).
Raccomandazioni:
Per ottenere prestazioni analitiche ottimali:
− ogni campione dovrebbe essere analizzato in duplicato
− utilizzare campioni privi di sesamo e contenenti sesamo (spiked) come test di
controllo
R-Biopharm non fornisce alcuna garanzia, esplicita o implicita, oltre a quella
relativa alla qualità standard dei materiali di cui sono costituiti i suoi prodotti.
Nel caso tali materiali risultassero difettosi, R-Biopharm si impegna a fornire
prodotti sostitutivi. Non esiste garanzia di commerciabilità o di idoneità del
prodotto per uno scopo particolare. R-Biopharm non è da ritenersi
responsabile per danni, ivi compresi danni speciali o indiretti, o spese
derivanti direttamente o indirettamente dall’utilizzo del prodotto.
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