Validazione di una multiplex PCR per l`identificazione di Vibrio

ITTIOPATOLOGIA, 2012, 9: 63-71
Validazione di una multiplex PCR per l’identificazione
di Vibrio alginolyticus e Vibrio parahaemolyticus e
applicazione allo screening di isolati ittici
Validation of a multiplex PCR for Vibrio alginolyticus and
Vibrio parahaemolyticus identification and use for the screening
of fish isolates
Fabio Zuccon*, Silvia Colussi, Simone Bertuzzi, Laura Serracca1,
Tommaso Scanzio, Marino Prearo, Pier Luigi Acutis
1
Istituto Zooprofilattico del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna, 148 - 10154 Torino.
Istituto Zooprofilattico del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Sezione di La Spezia, Via degli Stagnoni, 96 - 19100
La Spezia.
______________________________
RIASSUNTO - L’identificazione delle specie appartenenti al genere Vibrio con le metodiche tradizionali non risulta
sempre di facile esecuzione, in particolar modo per l’ampia variabilità biochimica che caratterizza i ceppi ambientali.
L’utilizzo di metodi molecolari può pertanto rappresentare un valido aiuto nell’identificazione dei patogeni ittici. A
tale scopo è stata sviluppata e validata una PCR multiplex basata sull’amplificazione del gene della collagenasi di
Vibrio alginolyticus e il gene della emolisina termolabile (tl) di Vibrio parahaemolyticus. Questa PCR è risultata
molto sensibile e specifica e rappresenta un metodo rapido e discriminante per questi due patogeni; applicata allo
screening di isolati ittici in parallelo alle metodiche tradizionali, ha consentito di individuare un livello di
concordanza medio tra i due approcci. L’applicazione della PCR multiplex ha consentito inoltre di rilevare
coinfezioni, erroneamente classificate con le metodiche tradizionali, per il prevalere di un singolo ceppo.
SUMMARY - The detection of Vibrio genus species, using standard microbiological methods, is not always easy to
make and sometimes leads to wrong interpretation, manly because of the great biochemical variability of the
environmental strains. The use of molecular methods may thus be a precise tool for identification of these pathogens.
To overcome ambiguous results a multiplex PCR based on the amplification of the collagenase gene for Vibrio
alginolyticus and of the thermolabile hemolysin (tl) gene for Vibrio parahaemolyticus was developed and validated.
This PCR resulted extremely sensitive and specific and could represent an efficient method for simultaneous detection
of these two pathogens. Moreover the new multiplex PCR was used to compare molecular tool based identification of
Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus versus conventional standard microbiological methods and for
screening of fish pathogen isolates; a medium rate of agreement between the two approaches was found. Multiplex
PCR allowed also the detection of coinfections otherwise unrecognized by the traditional techniques.
Key words: Vibrio alginolyticus; Vibrio parahaemolyticus; PCR multiplex; Validation.
______________________________
* Corresponding Author: c/o Istituto Zooprofilattico del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta, Via Bologna, 148 –
10154 Torino. Tel.: 011-2686367; Fax: 011-2686322; E-mail: [email protected].
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INTRODUZIONE
Il genere Vibrio comprende batteri Gram negativi estremamente diffusi negli
ecosistemi acquatici. La principale caratteristica di questo genere è la capacità di
provocare nell’uomo gravi intossicazioni alimentari dovute al consumo di pesci e
molluschi crudi o poco cotti: tra di essi un ruolo di primaria importanza quale agente
patogeno spetta a Vibrio cholerae, agente eziologico del colera. Tra i patogeni minori si
possono annoverare: Vibrio parahaemolyticus, causa occasionale di gastroenteriti
dovute all'ingestione di molluschi o crostacei crudi e contaminati (Yeung & Boor,
2004), Vibrio alginolyticus e Vibrio vulnificus, rari agenti infettivi di ferite cutanee o di
sepsi in soggetti immunocompromessi (Coleman et al., 1996; Aubert et al., 2001).
I germi appartenenti al genere Vibrio sono da considerarsi anche tra le principali cause
di mortalità nella fauna ittica, sia d’allevamento che di cattura. Numerosi episodi di
mortalità sono stati descritti in natura a partire dagli anni ’70 (Umbreit & Tripp, 1975),
con gravi perdite sul patrimonio ittico soprattutto in estuari, baie o golfi relativamente
protetti. In acquacoltura episodi gravi di vibriosi si verificano ogni anno soprattutto in
maricoltura, ma alcune di queste specie batteriche sono in grado di causare episodi
morbosi di grave entità anche in impianti con specie ittiche dulciacquicole (Prearo et al.,
2002; Cozzi & Ciccaglioni, 2005).
La classificazione delle Vibrionaceae risulta essere in continua evoluzione; al
momento, in tale famiglia sono compresi numerosi generi, tra i quali quelli che
rivestono maggiore interesse per la patologia ittica sono Vibrio, Listonella e
Photobacterium (Samuelsen et al., 2006; Stephen et al., 2006) di cui vengono
riconosciute numerosissime specie, tutte isolate da ambiente acquatico (Buller, 2004).
Nonostante i vibrioni non abbiano particolari esigenze nutrizionali e crescano bene nei
terreni di coltura comunemente utilizzati, l’identificazione delle varie specie non risulta
sempre di facile esecuzione con le tecniche fenotipiche tradizionali, in particolar modo
per l’ampia variabilità biochimica dei ceppi ambientali.
Lo sviluppo di metodi di biologia molecolare, quali la PCR, ha indubbiamente
favorito la corretta caratterizzazione dei ceppi: diverse metodiche di PCR sono state
infatti messe a punto per l’identificazione delle svariate specie appartenenti al genere
Vibrio (Bej et al. 1999; Kim et al., 1999; Di Pinto et al., 2005).
Nel caso specifico di V. parahaemolyticus e V. alginolyticus i metodi biochimici in
micrometodo, quali le gallerie API, si sono rivelati talvolta poco attendibili
determinando una classificazione di specie errata. Queste due specie presentano inoltre
un’elevata similarità genetica del gene che codifica per rRNA 16S, superiore al 99%,
(Kita-Tsukamoto et al., 1993; Ruimy et al., 1994) che rende inutilizzabile questa
tecnica, comunemente applicata nell’identificazione delle specie batteriche.
Nel presente lavoro viene messa a punto e validata una multiplex PCR per
l’identificazione delle due specie suddette e ne viene successivamente descritto
l’utilizzo su isolati ittici allo scopo di verificare l’attendibilità della caratterizzazione
fenotipica degli isolati nonché la caratterizzazione degli stessi in caso di non
assegnazione di specie.
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MATERIALI E METODI
Per validare la PCR multiplex sono stati utilizzati 15 ceppi certificati DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) e un ceppo certificato
ATCC (American Type Culture Collection) appartenenti al genere Vibrio e al genere
Aeromonas (Tabella 1) e 44 ceppi di campo (14 V. parahaemolyticus, 15
V.
alginolyticus e 15 V. anguillarum).
Vibrio parahaemolyticus
Vibrio alginolyticus
Vibrio anguillarum
Aeromonas allosaccharophila
Aeromonas veronii
Aeromonas ichthiosmia
Aeromonas salmonicida
Aeromonas trota
Aeromonas hydrophila hydrophila
Aeromonas caviae
Aeromonas encheleia
Aeromonas media
Aeromonas hydrophila anaerogenes
Aeromonas bestiarium
Aeromonas enteropatogenes
DSMZ 1027
DSMZ 2171
ATCC 43305
DSMZ 11576
DSMZ 7386
DSMZ 6393
DSMZ 12609
DSMZ 7312
DSMZ 30187
DSMZ 7323
DSMZ 11577
DSMZ 4881
DSMZ 30188
DSMZ 13956
DSMZ 6394
Tabella 1 - Elenco dei ceppi batterici certificati ATCC e DSMZ.
Table 1 – List of certified ATCC e DSMZ bacteria strains.
Vibrio anguillarum ed Aeromonas spp. sono stati inseriti quali controlli negativi; in
particolare germi appartenenti al genere Aeromonas talvolta vengono erroneamente
classificati dal punto di vista fenotipico per la somiglianza al genere Vibrio che li
caratterizza.
I ceppi sono stati coltivati in agar nutritivo (Difco) addizionato al 2% di NaCl. Gli
isolati di campo sono stati identificati biochimicamente mediante gallerie API 20E e
20NE (bioMérieux); sono stati sottoposti a valutazione della sensibilità all’agente
vibriostatico O129 10 µg e 100 µg ed è stata verificata la loro capacità agglutinante con
siero monovalente per V. anguillarum (Bionor Laboratories).
Il DNA è stato estratto mediante tecnica freeze-boiling che prevede incubazioni di 10
minuti alternate a 100°C e –80°C con centrifugazione finale a 13000 rpm per 3 minuti e
prelievo del surnatante. Ciascun campione estratto è stato quantificato mediante lettura
spettrofotometrica a 260 nm e ne è stata valutata la purezza con il calcolo della ratio
(OD260/OD280).
Prima dell’allestimento della multiplex PCR i ceppi sono stati testati con simplex
PCR specifiche per la specie in esame: i ceppi di V. parahaemolyticus sono stati
caratterizzati mediante PCR singola per il gene tl (termolisina termolabile) secondo i
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protocolli riportati da Bej et al. (1999); i ceppi di Vibrio alginolyticus sono stati definiti
geneticamente mediante amplificazione del gene della collagenasi (Di Pinto et al.,
2005); i ceppi di V. anguillarum sono stati caratterizzati mediante amplificazione del
gene rpoN (Gonzalez et al., 2004).
La reazione di PCR multiplex è stata allestita e validata con l’utilizzo contemporaneo
dei primer specifici per i geni tl e collagenasi che permettono di identificare
rispettivamente V. parahaemolyticus e V. alginolyticus. Le condizioni di PCR sono state
ottimizzate per permettere l’amplificazione dei rispettivi target.
Sequenza dei primer
5’-aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg-3’
5’-gct act ttc tag cat ttt ctc tgc-3’
5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’
5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’
Target
Emolisina
termolabile (tl)
Collagenasi
Riferimento bibliografico
Bej et al., 1999
Di Pinto et al., 2005
Tabella 2 - Sequenze dei primer utilizzati per la PCR multiplex e PCR simplex dei geni
per l’emolisina termolabile (tl) e la collagenasi.
Table 2 - Sequences of the primers used in multiplex PCR and simplex PCR amplifying
the thermolabile hemolysin (tl) and collagenase genes.
La miscela di reazione, condotta su un volume di reazione pari a 50 µl, era così
composta: Platinum® qPCR Supermix-UDG (Invitrogen), primer 300 nM riportati
(Tabella 2) e circa 150 ng di DNA batterico. La PCR multiplex prevedeva il seguente
profilo termico: 50°C per 2 minuti e 95°C per 2 minuti seguiti da 25 cicli 94°C per 30
secondi, 57°C per 30 secondi, 72°C per 60 secondi e un’estensione a 72°C di 5 minuti.
La rivelazione dei prodotti di PCR, è stata fatta tramite corsa elettroforetica a 80V per
un’ora, su gel di agarosio al 3% con aggiunta di Sybr Safe (Invitrogen). È stato
utilizzato il marcatore di peso molecolare AmpliSize Molecular Ruler (50-2000 pb
Ladder, BIO-RAD).
L’elaborazione delle immagini è stata effettuata mediante Gel
Doc (BIO-RAD).
La PCR multiplex è stata successivamente applicata a 68 ceppi isolati da prodotti
ittici caratterizzati fenotipicamente come V. parahaemolyticus (n=21),
V. alginolyticus (n=47); sono stati inoltre inclusi 23 ceppi caratterizzati come Vibrio
spp. Quali controlli positivi e negativi sono stati utilizzati i ceppi di riferimento DSMZ.
L’analisi dei dati è stata effettuata mediante l’utilizzo del programma informatico
STATA SE 10.
RISULTATI
Come mostrato in Figura 1 (pozzetti 1-15), la PCR multiplex ha correttamente
amplificato un prodotto di 450bp, relativo al gene tl sia nei ceppi di riferimento che
negli isolati ittici caratterizzati biochimicamente come V. parahaemolyticus e ha
evidenziato una banda di 737bp (Figura 3: pozzetti 1-16) del gene collagenasi in quelli
caratterizzati come V. alginolyticus. I campioni non appartenenti alle due specie in
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esame quali V. anguillarum (Figura 1: pozzetti 16-19 e Figura 2: pozzetti 1-12) e
differenti specie del genere Aeromonas (Figura 4: pozzetti 1-12) non hanno mostrato,
come atteso, alcun prodotto di amplificazione.
La PCR multiplex applicata per l’identificazione di V. parahaemolyticus e V.
alginolyticus si è rivelata di semplice e rapido utilizzo, consentendo un’identificazione
certa del patogeno: la sensibilità e la specificità sono infatti risultate del 100%, calcolate
ad un livello di confidenza del 95%, con limiti inferiori del 86,3% e 85,0%
rispettivamente.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 16 17 18 19
450 pb
Figura 1 – PCR multiplex applicata a campioni di Vibrio parahaemolyticus e Vibrio anguillarum. Risulta evidente la
banda amplificata di 450 paia di basi del gene della emolisina termolabile (tl) di Vibrio parahaemolyticus, pozzetti 114, pozzetto 15 Vibrio parahaemolyticus DSMZ 1027, nessun amplificato del Vibrio anguillarum, pozzetti 16-19, M
marker molecolare.
Figure 1 – Multiplex PCR applied to Vibrio parahaemolyticus and Vibrio anguillarum strains. The 450 base pairs
amplified band codifying the thermolabile hemolysin (tl ) of Vibrio parahaemolyticus was detected, lanes 1-14, lane
15 Vibrio parahaemolyticus DSMZ 1027, no amplification of Vibrio anguillarum, lanes 16-19, M molecular weight
ladder.
1
2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12 13 M
Figura 2 - PCR multiplex applicata a campioni di Vibrio anguillarum. Risulta evidente l’assenza di banda, pozzetti 112, M marker molecolare.
Figure 2 - Multiplex PCR applied to Vibrio anguillarum strains. No amplification band, lanes 1-12, M molecular
weight ladder.
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 1516 M
737 pb
Figura 3 – PCR multiplex applicata a campioni di Vibrio alginolyticus risulta evidente la banda amplificata di 737
paia di basi, pozzetti 1-15, pozzetto 16 Vibrio alginolyticus DSMZ 2171, M marker molecolare.
Figure 3 – Multiplex PCR applied to Vibrio alginolyticus strains. The 737 base pairs amplicon coded by the
collagenase gene was detected, lanes 1-15,lane 16 Vibrio alginolyticus DSMZ 2171, M molecular weight ladder.
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12 M
Figura 4 – PCR multiplex applicata su ceppi di Aeromonas spp. DSMZ. Risulta evidente l’assenza di banda, pozzetti
1-12, M marker molecolare.
Figure 4 – Multiplex PCR applied to Aeromonas spp. DSMZ strains. No amplification band, lanes 1-12, M molecular
weight ladder.
La PCR multiplex ha confermato l’identificazione biochimica di V. parahaemolyticus
su 14 isolati (58,3%) e di V. alginolyticus su 46 isolati (86,8%). Sette campioni
classificati biochimicamente come V. parahaemolyticus sono risultati, secondo l’analisi
molecolare V. alginolyticus; un campione di V. alginolyticus è risultato V.
parahaemolyticus in disaccordo con i metodi classici; inoltre la PCR di un campione
fenotipicamente V. alginolyticus, ha evidenziato entrambe le bande specifiche di 450 e
737bp, indicando la presenza di co-infezione da V. parahaemolyticus e V. alginolyticus
(Figura 5).
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L’analisi molecolare dei 23 ceppi di Vibrio spp. ha dato i risultati seguenti: 6
V. alginolyticus (26%), 1 coinfezione (Figura 5) e 16 assenze di banda specifica per
V. parahaemolyticus o V. alginolyticus.
Sulla base del calcolo della concordanza complessiva tra metodi biochimici e metodi
molecolari è stato ottenuto un valore medio di k = 0,5698 (I.C. 95% = 0,3644 -0,7752)
secondo Altman.
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
La scelta di mettere a punto una PCR multiplex che consentisse di individuare
facilmente V. parahaemolyticus e V. alginolyticus è stata motivata sia dall’importanza
patologica da essi rappresentata in acquacoltura, sia dal fatto che essi sono tra le specie
più frequentemente isolate da materiale ittico repertato nel nostro territorio di
competenza.
1
2
3
M
4
5
6
737 pb
450 pb
Figura 5 – Rivelazione della coinfezione di Vibrio alginolyticus e Vibrio parahaemolyticus in prodotti ittici mediante
PCR multiplex. Pozzetto 1 controllo PCR, pozzetti 2 e 3 isolati di campo, pozzetto 4 Vibrio alginolyticus DMSZ
2171, pozzetto 5 Vibrio parahaemolyticus DSMZ 1027, pozzetto 6 controllo di estrazione, M marker molecolare.
Figure 5 – Detection of Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus co-infection in fish products by multiplex
PCR. Lane 1 blank PCR, lane 2-3 isolated strains, lane 4 Vibrio alginolyticus DMSZ 2171, lane 5 Vibrio
parahaemolyticus DSMZ 1027, lane 6 extraction blank, M molecular weight ladder.
PCR simplex erano già state descritte per queste due specie (Bej et al., 1999); inoltre
una PCR multiplex per l’identificazione di V. parahaemolyticus, V. alginolyticus e V.
cholerae, basata sull’amplificazione del gene della collagenasi era stata descritta da Di
Pinto et al. (2005); tuttavia la specificità di questa metodica è stata valutata in un
numero esiguo di campioni e nel nostro caso non ha fornito i risultati attesi per
l’identificazione di V. parahaemolyticus (dati non riportati). Pertanto si è optato per lo
sviluppo di un differente sistema di PCR sempre in multiplex poiché la possibilità di
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allestire in un’unica reazione il saggio per l’identificazione di due patogeni diversi ha
consentito un minor dispendio economico rispetto alla conduzione di due differenti
PCR simplex.
La comparazione dei metodi svolta nel presente lavoro ha messo in evidenza un
livello di concordanza medio tra metodi molecolari e metodi biochimici per
l’identificazione delle due specie di Vibrio in esame.
La caratterizzazione molecolare ha mostrato una capacità di identificazione superiore
ai metodi biochimici, riuscendo ad attribuire la specie in isolati precedentemente non
classificati con i metodi tradizionali. La PCR multiplex, applicata a isolati ittici, ha
consentito di rilevare in due casi una coinfezione evidenziando ulteriormente
l’inefficacia delle tecniche biochimiche che in tali condizioni conducono invece
all’identificazione di un unico patogeno per il prevalere del fenotipo di una specie su
quella coinfettante.
L’accuratezza e la rapidità rendono pertanto la descritta PCR multiplex uno strumento
estremamente efficace a supporto delle tecniche diagnostiche tradizionali.
RINGRAZIAMENTI
Il presente lavoro è stato eseguito con fondi di Ricerca Corrente del Ministero della
Salute.
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