Case report - Blood Transfusion

Case report
Allo-immunisation against Bga and HLA antigens in pregnancy
Donatella Londero, Valeria Miotti, Chiara Sindici, Franco Biffoni
Dipartimento di Medicina Trasfusionale, Azienda Ospedaliera SMM, Udine, Italia
Introduction
Introduzione
Human leucocyte antigens (HLA) are present in
immature red blood cell (RBC) membranes but usually
disappear from mature RBC. "Bennet-Goodspeed"
antigens, renamed in 1967 as Bga, Bgb, and Bgc1, represent
the remnants of HLA molecules in mature RBC and are
expressed in variable numbers from one individual to
another. In detail, Bg antibodies are specifically directed
against HLA-B7 (Bga), HLA-B17 (Bgb), and HLA-A2/HLA
A-28 (Bgc). Although Bg/HLA antibodies, when identified,
are not generally considered clinically significant, they have
been involved in cases of haemolytic transfusion
reactions 2-4 and of neonatal allo-immune
thrombocytopenia5-9.
We report a case of maternal anti-Bga/anti-HLA alloimmunisation occurring during pregnancy, presented here
in order to understand the risk to the newborn and to add
information on the clinical relevance of Bg/HLA antibodies.
Gli antigeni HLA sono presenti sulla membrana dei
globuli rossi immaturi e normalmente scompaiono in fase
di maturazione. Gli antigeni di "Bennet-Goodspeed',
rinominati nel 1967 come antigeni Bga, Bgb, and Bgc1,
rappresentano i residui degli antigeni HLA negli eritrociti
maturi e hanno un vario grado di espressività tra un
individuo e l'altro. In particolare, gli anticorpi anti-Bg sono
diretti in maniera specifica contro l'antigene HLA-B7 (Bga),
HLA-B17 (Bg b ), ed HLA-A2/HLA-A28 (Bg c),
rispettivamente. Benché gli anticorpi anti-Bg/HLA, una
volta identificati, non siano generalmente considerati
clinicamente significativi, essi sono stati coinvolti in casi
di reazioni trasfusionali emolitiche2-4 e di trombocitopenia
neonatale alloimmune5-9.
Riportiamo il caso di un'alloimmunizzazione materna antia
Bg /anti-HLA avvenuta in corso di gravidanza, allo scopo
di individuare il rischio neonatale e di supportare o meno
l'evidenza della rilevanza clinica degli anticorpi anti-Bg/HLA.
Case Report
Descrizione del caso
A 29-year old woman was referred to our laboratory
during her second pregnancy for an indirect anti-globulin
test (IAT), since she was Rh-negative. She developed antiBga at 28 weeks of gestation and the titre of the antibody
rose from 1/4 to 1/64 in 3 weeks. HLA-antibody screening
Received: 3 October 2004 - Accepted: 30 October 2004
Correspondence:
Dott.ssa Donatella Londero
Dipartimento di Medicina Trasfusionale
Azienda Ospedaliera S. Maria della Misericordia
Piazzale S. Maria della Misericordia 15
33100 Udine - Italia
E-mail: [email protected]
300
Una donna di 29 anni, alla sua seconda gravidanza, si
era rivolta al nostro laboratorio per il controllo del test
indiretto all'antiglobulina, in quanto Rh-negativa. La
paziente aveva sviluppato anticorpi anti-Bga, identificati
alla 28a settimana di gestazione, il cui titolo era aumentato
da 1/4 a 1/64 in 3 settimane. La ricerca di anticorpi anti-HLA
risultò positiva per la specificità HLA-B7. L'anamnesi della
paziente, positiva per anemia e tromboflebite, indirizzava
all'uso della terapia anticoagulante e suggeriva uno studio
familiare di compatibilità per gli alleli dei sistemi HPA ed
HLA.
Blood Transfus 2004; 2: 300-5
Alloimmunisation anti-Bga/anti-HLA in pregnancy
revealed the presence of antibodies with specificity for
HLA-B7. The patient’s previous medical history of anaemia
and thrombophlebitis required the use of anticoagulant
therapy and indicated the need for a study of family
members’ compatibility for human platelet antigens (HPA)
and HLA alleles.
Materials and methods
Maternal serum was screened for RBC antibodies using
an anti-globulin gel test (LISS-Coombs Cards and DiaCell
I-II-III; DiaMed AG, Cressier, Switzerland) and their
specificities were determined using different panels of RBC
suspensions (DiaMed AG; Ortho-Clinical Diagnostics,
Raritan, NJ, USA). Antibodies were monitored by titration
and the results expressed as a titre score.
HLA-antibody screening was performed by an ELISA
(GTI-Pak Plus; GTI Italia, Opera, MI, Italy) and the HLAantibody identified by testing the serum against a panel of
cells with known HLA specificity in a lymphocyte
microcytotoxicity test.
DNA was isolated from 200 mL of whole blood, using a
QIA-amp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN SpA, Milano,
Italy). Foetal DNA was isolated from 3.5 mL of maternal
plasma concentrated to a final volume of 200 mL by using a
centrifugal micro-concentrator (Centricon-100, Amicon
Italia, Milan, Italy). DNA was then extracted using the QIAamp-DNA-Blood Mini Kit and the final elution was in 60 mL
of distilled water. The concentration of DNA was determined
by UV quantification (OD260/280 ratio).
The typing of HLA-class-I antigens was performed by
DNA test PCR-SSP (Micro SSP HLA DNA Typing Trays,
One Lambda Inc, Canoga Park, CA, USA) and PCR-SSO
Reverse (Dynal RELI SSO HLA-B Typing Kit, Dynal
Biotech, Newington, UK).
HPA typing (alleles 1, 2, 3 and 5) was performed with
the PCR-SSP method (Domino System, Protrans GmbH,
Ketsch, Germany).
Results
Figure 1 illustrates the results of the molecular study of
the family for HPA and HLA alleles. There was complete
compatibility between the parents’ HPA alleles, thus
excluding the risk of neonatal alloimmune
thrombocytopenic purpura (NAITP) due to HPA antigens.
On the other hand, the B*07 allele was found in the
genotype of the father but not in that of the first child,
Blood Transfus 2004; 2: 300-5
Materiali e Metodi
La ricerca degli anticorpi anti-eritrociti è stata effettuata
con metodica in gel-test (LISS-Coombs Cards e DiaCell III-III; DiaMed AG, Cressier, Switzerland) e l'identificazione
delle specificità è stata ottenuta grazie all'uso di diversi
pannelli di sospensioni eritrocitarie (DiaMed AG;
Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey,
USA). Gli anticorpi sono stati monitorati tramite
titolazione, espressa come fattore di diluizione.
La ricerca di anticorpi anti-HLA è stata effettuata con
metodica ELISA (GTI-Pak Plus; GTI Italia, Opera, MI, Italia)
e l'identificazione della specificità è avvenuta mediante test
di microcitotossicità, testando il siero in esame con un
pannello di linfociti a specificità HLA nota.
Il DNA è stato estratto da 200 mL di sangue intero,
mediante il kit QIA-amp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN
SpA, Milano, Italia). Il DNA fetale è stato isolato da 3,5 mL
di plasma materno, concentrato a un volume finale di 200 mL,
tramite l'uso di un microconcentratore (Centricon-100,
Amicon, Milano, Italia). L'eluizione finale è stata fatta in 60 mL
di acqua distillata. La determinazione della concentrazione
di DNA è avvenuta tramite quantificazione UV (OD260/280
ratio).
La tipizzazione degli alleli HLA di classe I è avvenuta
mediante metodica PCR-SSP (Micro SSP HLA DNA Typing
Trays, One Lambda Inc, Canoga Park, CA, USA) e PCRSSO Reverse (Dynal RELI SSO HLA-B Typing Kit, Dynal
Biotech, Regno Unito).
La tipizzazione HPA (alleli 1, 2, 3, 5) è stata eseguita
mediante metodica PCR-SSP (Domino System, Protrans
GmbH, Ketsch, Germania).
Risultati
La figura 1 illustra i risultati dello studio molecolare
familiare condotto sugli alleli HPA ed HLA. Vi è compatibilità
completa tra i genitori per gli alleli HPA, permettendo così
di escludere un rischio di NAITP dovuto ad antigeni HPA.
D'altra parte, l'allele B*07 è stato evidenziato nel
genotipo paterno ma non in quello della primogenita.
Questo fatto depone a favore dell'ipotesi per cui
l'alloimmunizzazione anti-Bg/HLA sia presumibilmente
avvenuta nel corso della corrente gravidanza, dal momento
che dall'anamnesi della paziente non risultano ulteriori
gravidanze o aborti, né trasfusioni di sangue.
Si è tentato di verificare lo stato allelico del feto per
poter confermare la presenza dell'allele B*07. Dal momento
che la madre non si era sottoposta ad amniocentesi, l'unica
301
D Londero et al.
M o th e r
F a th e r
H L A A * 0 2 ,* 6 6 ;B * 1 8 , * 4 1 ;C w * 0 7 ,* 1 7
H P A 1 a a , 2 a a , 3 a b , 5 ab
H L A A * 0 1 ,* 3 2 ;B * 0 7 ,* 5 5 ;C w * 0 3 ,* 0 7
H PA 1aa, 2aa, 3ab, 5aa
F irst C h ild
HLA
A * 0 1 ,* 0 2 ;B * 5 5 ,* 1 8 ;C w * 0 3 ,* 0 7
Figure 1 - HLA and HPA types for each member of the family under study
suggesting that the woman being studied was very likely
to have become HLA-Bg alloimmunised during the current
pregnancy, because she had no history of other pregnancies
or abortions, or blood transfusions.
We tried to verify the allelic status of the foetus in
order to confirm the presence of the B*07 allele. Since the
mother did not undergo amniocentesis, the only source of
foetal DNA was the maternal plasma10. We, therefore,
extracted DNA from maternal plasma samples during the
first and second trimesters of pregnancy. The DNA
concentration ranged between 11.3-13.2 ng/mL. We
performed the SSO HLA-B typing test, according to the
manufacturer’s instructions, because the sensitivity of this
test is greater than that of other commercial PCR methods,
enabling us to use it on samples with a DNA concentration
in the order of 13 ng/mL.
The allelic status of the foetus was not identified with
certainty, but the mixed foetal-maternal pattern obtained
showed some amplification bands that could be attributed
to the B*07 allele.
In order to prevent the development of neonatal
pathologies at delivery, we planned the recruitment of
HLAB7- negative- platelet apheresis donors to collect fresh
platelets the day before the planned Caesarean section.
At the same time, HLA-compatible RBC products were
identified and reserved in order to avoid haemolytic
transfusion reactions if the mother needed transfusion.
In the thirty-ninth week of gestation, after a Caesarean
section, a healthy girl, group O, RhD-positive, was
born. The direct anti-globulin test was negative, her
haemoglobin at birth was 15.9 g/dL, haematocrit
47.3% and platelet count 304 x109/L. The neonate’s
302
fonte di DNA fetale disponibile è stata il plasma
materno10. È stato, perciò, estratto DNA da campioni
di plasma materno, durante il primo ed il secondo
trimestre di gravidanza. La concentrazione di DNA
è risultata tra gli 11,3 ed i 13,2 ng/mL. È stato eseguito
il test di tipizzazione SSO HLA-B, secondo le
istruzioni del rivenditore, dato che la sua sensibilità
è risultata più alta rispetto a quella dichiarata da altri
metodi PCR commerciali, consentendo così l'utilizzo
di campioni di DNA con concentrazioni sull'ordine
dei 13 ng/mL.
Lo stato allelico del feto non è stato identificato con
certezza, ma il pattern misto materno-fetale ottenuto ha
evidenziato diverse bande di amplificazione attribuibili
all'allele B*07.
Per prevenire l'insorgenza di patologie neonatali
alla nascita, è stato pianificato il reclutamento di
donatori di piastrine da aferesi HLAB7-negativi, così da
raccogliere piastrine fresche il giorno precedente il parto
cesareo programmato. Contemporaneamente, sono state
preparate emazie da donatori HLA-compatibili da utilizzare
in caso di bisogno di una trasfusione materna, evitando
così una reazione trasfusionale emolitica.
Alla 39a settimana di gestazione, con taglio cesareo, è
nata una bambina sana, di gruppo O RhD-positivo. Il test
di Coombs diretto è risultato negativo, l'emoglobina alla
nascita era di 15,9 g/dL, l'ematocrito di 47,3% e la conta
piastrinica di 304 x109 per L. Lo stato allelico HLA-B*07
della neonata è stato confermato sul campione di
cordone ombelicale.
Non è stato necessario alcun trattamento né per
la neonata né per la madre, e la dimissione è avvenuta,
Blood Transfus 2004; 2: 300-5
Alloimmunisation anti-Bga/anti-HLA in pregnancy
HLA-B*07 status was confirmed by tests on a
sample of umbilical cord blood.
Neither the newborn nor the mother required any
treatment and they were discharged from the hospital 5
days after the delivery, in good health, without
thrombocytopenia or anaemia.
Discussion
In the reported case, the maternal allo-immunisation
against the erythrocyte Bga antigen was the first signal to
investigate the serological status of the pregnant woman
and its causes. The finding of HLA antibodies led us to
carry out non-invasive investigations which confirmed that
the sensitisation was due to the ongoing pregnancy and,
later, to develop a plan of antenatal surveillance,
continuously
monitoring
the
maternal
immunohaematological status, and to decide the optimal
management and treatment of any neonatal complications
at delivery.
Antibodies to HLA reportedly exist in 31% of pregnant
women before delivery6, because mothers produce
antibodies against some but not all of the mismatched HLA
antigens of the foetus as early as the 8th week of
pregnancy11. These antibodies are, however, often
complexed with soluble HLA alloantigens and it was
reported that serum-soluble human leucocyte antigen class
I and class II concentrations can be predictive for a
successful pregnancy outcome12. In fact, an increased
humoral immune response by the mother against the foetus
may be involved in the pathogenesis of placental
abruption13 and the percentage of women producing
antibodies against paternal was significantly increased in
women with pre-term placental abruption.
Furthermore, although some authors suggest that
maternal HLA antibodies are absorbed by HLA antigens
expressed on foetal-placental tissues and, thus, do not enter
the foetal circulation in sufficient concentration to cause
accelerated neutrophil destruction14, there are case reports
of severe allo-immune neonatal neutropenia induced by
HLA class I antibodies15. These findings, together with
the relatively large number of cases of NAITP induced by
HLA antibodies 6-9, 16,17 led us to plan preventive protocols
of transfusion support.
We decided to recruit HLA class I-compatible platelet
donors from the regional bone marrow donor Registry, in
order to avoid expensive and labour-intensive recruitment
of new donors. On the other hand, maternal aphaeresis as
a source of platelets was not possible in this case because
Blood Transfus 2004; 2: 300-5
per entrambe, in buone condizioni di salute (senza
anemia né trombocitopenia), dopo 5 giorni dal parto.
Discussione
Nel caso studiato, l'alloimmunizzazione materna
contro l'antigene eritrocitario Bga è stata il primo
allarme che ha portato ad indagare lo stato sierologico
della gravida e le sue cause. La scoperta degli
anticorpi anti-HLA ha, in primo luogo, suggerito la
ricerca di un metodo non-invasivo che confermasse
che la sensibilizzazione era dovuta alla gravidanza,
e, in un secondo tempo, ha condotto allo sviluppo
di un piano di sorveglianza prenatale, dato dal
continuo
monitoraggio
dello
stato
immunoematologico della madre e dalla stesura di
un protocollo per la gestione ed il trattamento delle
eventuali complicazioni per il neonato alla nascita.
È noto, infatti, che gli anticorpi anti-HLA sono presenti
nel 31% delle gravide prima del parto6, dal momento che le
madri producono anticorpi contro alcuni ma non contro
tutti gli antigeni HLA non compatibili del feto, già dalla
ottava settimana di gestazione11. Questi anticorpi formano
spesso un complesso con gli alloantigeni HLA solubili, ma
sono stati descritti casi in cui le concentrazioni degli antigeni
leucocitari solubili di classe I e II sono predittive per un
esito favorevole della gravidanza12. Infatti, un aumento della
risposta umorale del sistema immunitario materno nei
confronti del feto può essere coinvolta nella patogenesi
della rottura placentare13 e la percentuale di donne che
presentano anticorpi anti-HLA paterni è notevolmente più
alta nelle donne con rottura pre-termine della placenta.
Inoltre, sebbene alcuni Autori affermino che gli anticorpi
anti-HLA materni sono assorbiti dagli antigeni HLA
espressi sui tessuti feto-placentari e che, perciò, non siano
presenti nel circolo fetale in concentrazione sufficiente da
determinare un'accelerata distruzione dei neutrofili14, sono
stati descritti casi di severa neutropenia neonatale
alloimmune indotta da anticorpi anti-HLA di classe I15.
Questi risultati, insieme ai non pochi casi documentati di
porpora neonatale allo immune (NAITP) indotti da anticorpi
anti-HLA6-9, 16,17, hanno portato alla preparazione di
un protocollo preventivo per il supporto
trasfusionale.
Si è deciso di contattare, come donatori di piastrine, i
donatori appartenenti al Registro regionale dei donatori di
midollo osseo, compatibili per gli antigeni HLA di Classe I,
in modo da evitare le spese ed il carico di lavoro richiesti
per l'arruolamento di nuovi donatori. D'altra parte, la
303
D Londero et al.
the mother was anaemic and also receiving
anticoagulant therapy.
Since the life span of transfused RBC may be shortened
in individuals sensitised to HLA and there is a documented
risk of haemolytic transfusion reactions secondary to HLA
alloimmunisation18, we also performed additional
immunohaematological testing of the mother throughout
the entire pregnancy and reserved HLA-selected RBC
products in case the mother need transfusion at delivery.
Another important consideration arising from this case
report is that genotyping of foetal DNA obtained from
maternal blood can be a valuable diagnostic tool for
understanding many cases of immunisation and for aiding
the management of pregnancies at risk.
In conclusion, the case described provides the
opportunity to make some general considerations about
the responsibility of health-care professionals. In fact,
although this report supports the belief that anti-Bga
antibodies are not dangerous for the foetus or the newborn
but that further studies are necessary in order to understand
the relationship between HLA specificities and NAITP, it
also demonstrates that a competent immunohaematologist
must always keep in mind that all antigens, related to RBC
or not, can represent a serious risk for neonatal pathologies
and that taking precautions such as preparing platelets
and RBC to avoid haemolytic reactions is not a useless
procedure. Finally, if we also take legal and deontological
responsibilities into account, the importance of continuous
technical-scientific updating of professionals (from
immunohaematology to molecular biology) is essential in
order to improve diagnostic and therapeutic interventions
in Transfusion Medicine.
304
donazione di piastrine materne da aferesi non era
possibile poiché la madre era anemica, nonché
sottoposta a terapia anti-coagulante.
Per di più, poiché in un soggetto immunizzato
all'HLA la vita media degli eritrociti trasfusi può essere
ridotta e vi è il rischio documentato di reazioni
trasfusionali emolitiche da alloimmunizzazione antiHLA18, sono stati eseguiti test immunoematologici
aggiuntivi sulla madre durante l'intera gravidanza e
sono state selezionate emazie HLA-compatibili da
utilizzare per un'eventuale trasfusione materna al parto.
Un'altra importante considerazione da farsi è che
l'utilizzo della genotipizzazione fetale a partire da sangue
materno rappresenta un importantissimo strumento
diagnostico per la comprensione delle immunizzazioni
materno-fetali e per la gestione delle gravidanze a rischio.
In conclusione, il caso descritto offre l'opportunità di
fare alcune considerazioni generali sulle responsabilità dei
professionisti sanitari. Infatti, benché i risultati di questo
lavoro supportino la tesi che sostiene che gli anticorpi antiBga non siano pericolosi per il feto e il neonato, e nonostante
siano necessari ulteriori studi per comprendere il rapporto
tra specificità HLA e NAITP, è pur vero che un esperto
immunoematologo dovrebbe sempre ricordare che tutti gli
antigeni, eritrocitari e non, possono costituire un serio
rischio per le patologie neonatali, e che l'utilizzo di modalità
operative precauzionali come la preparazione di piastrine o
di globuli rossi che evitino complicanze trasfusionali non
rappresenta una perdita di tempo. Alla fine, se si
considerano le responsabilità legali e deontologiche, si
evince che l'importanza di un continuo aggiornamento
tecnico-scientifico dei professionisti (che porta
dall'immunoematologia alla biologia molecolare) è
fondamentale per migliorare gli interventi diagnostici e
terapeutici in Medicina Trasfusionale.
Blood Transfus 2004; 2: 300-5
Alloimmunisation anti-Bga/anti-HLA in pregnancy
References
1) Seaman MJ, Benson R, Jones MN, et al. The reactions of the
Bennet-Goodspeed group of antibodies tested with the
Autoanalyzer. Br J Haematol 1967; 13: 464-73.
2) Molthan L. Transfusion reaction presumably due to antiBga (letter). Transfusion 1979; 19: 609.
10) Lo YMD. Fetal DNA in maternal plasma: biology and
diagnostic applications. Clin Chem 2000; 46: 1903-6.
11) Reed E, Beer AE, Hutcherson H, et al. The alloantibody
response of pregnant women and its suppression by soluble
HLA antigens and anti-idiotypic antibodies. J Reprod
Immunol 1991; 20: 115-28.
3) Weitekamp LA, Johnson ST, Larson LB, et al. Severe,
symptomatic hemolytic transfusion reactions secondary to
strong HLA antibody directed toward A2 public and private
epitopes (Abstract). Transfusion 1993; 33 (Suppl.): S209.
12) Vassiliadis S, Paflis M, Athanassakis I. Serum-soluble human
leucocyte antigen class I and class II concentrations as an
alternative diagnostic test for determining immune indices
required for normal pregnancies. Reprod Fertil Dev 2001;
13: 427-33.
4) Benson K, Agosti SJ, Latoni-Benedetti GE, Leparc GF. Acute
and delayed hemolytic transfusion reactions secondary to
HLA allo-immunization. Transfusion 2003; 43: 753-7.
13) Steinborn A, Seidl C, Sayehli C, et al. Anti-fetal immune
response mechanisms may be involved in the pathogenesis
of placental abruption. Clin Immunol 2004; 110: 45-54.
5) Kelton JG, Blanchette VS, Wilson WE, et al. Neonatal
thrombocytopenia due to passive immunization. N Engl J
Med 1980; 302: 1401-3.
14) Puri S, Shieh DC, Canavan A, et al. Quantitation and
characterization of plasma HLA in neonates. Tissue Antigens
1993; 42: 67-71.
6) King KE, Kao KJ, Bray PF, et al. The role of HLA antibodies
in neonatal thrombocytopenia: a prospective study. Tissue
Antigens 1996; 47: 206-11.
15) Tomicic M, Stercevic M, Bux J, et al. Severe neonatal
neutropenia due to anti-human leucocyte antigen B49
alloimmunization only: a case report. Transf Med 2003; 13:
233-7.
7) del Rosario ML, Fox ER, Kickler TS, Kao KJ. Neonatal
alloimmune thrombocytopenia associated with maternal antiHLA antibody: a case report, J Pediatr Hematol Oncol 1998;
20: 252-6.
16) Grainger JD, Morrell G, Yates J, Deleacy D. Neonatal
alloimmune thrombocytopenia with significant HLA
antibodies. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2002; 86: F2001.
8) Sasaki M, Yagihashi A, Kobayashi D, et al. Neonatal
alloimmune thrombocytopenia due to anti-human leukocyte
antigen: a case report. Pediatr Hematol Oncol 2001; 18: 51924.
17) Moncharmont P, Dubois V, Obegi C, et al. HLA antibodies
and neonatal alloimmune thrombocytopenia. Acta Haematol
2004; 111: 215-20.
9) Saito S, Ota M, Komatsu Y, et al. Serologic analysis of three
cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia associated
with HLA antibodies. Transfusion 2003; 43: 908-17.
18) Taddic Nance S. Do HLA antibodies cause hemolytic
transfusion reactions or decreased RBC survival? [editorial].
Transfusion 2003; 43: 687-90.
Blood Transfus 2004; 2: 300-5
305