ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551

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M1551/ November 2007
ELISA
PeliClass human IgG subclass kit
−
REF
M1551
kit ELISA per la determinazione quantitativa delle sottoclassi di IgG umane nel siero (it)
it
Ab
BLACK
Anticorpi diretti contro Nero
it
DIL
Diluizione
it
Rosso
it
WASH
Lavaggio
RED
GREEN
Verde
HRP
STOCK
Stock
WELL
Pozzetti
CAL
Calibratore
HUM
Umano
HRP
SEALS
Sigilli per piastra
REF
M1800
M1801
M1802
M1803
M1804
M1805
M1806
M1808
M1810
M1809
M1807
-
BUF
Tampone
STOP
Stop
CONJ
Coniugato
H2O2
Perossido di idrogeno
SUB
Sottoclassi
12x8
12x8
0.1 mL
0.1 mL
0.1 mL
50 mL
60 mL
5 mL
1.0 mL
0.5 mL
20 mL
MOU
Topo
SUBS
Substrato
≥-≤
YELLOW
Giallo
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
6
CONTROL
Controllo
Intervallo
ELISA
PeliClass ELISA kit
WELL
a-IgG1, a-IgG2
RED
BLACK
WELL
a-IgG3, a-IgG4 YELLOW GREEN
CAL
CONTROL
HRP
MOU Ab HUM IgG CONJ
BUF
WASH STOCK 1:20
BUF
DIL
STOCK 1:10
BUF
SUBS STOCK 1:10
ABTS STOCK 1:50
H2O2
STOCK 1:100
BUF
STOP
SEALS
1
it
I.
INTRODUZIONE
Le IgG umane comprendono quattro sottoclassi: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Le caratteristiche biochimiche delle sottoclassi di IgG sono
state ampiamente descritte (1-5). Le differenze tra le sottoclassi si riflettono in numerose importanti funzioni biologiche quali il
riconoscimento dell'antigene, l'attivazione del complemento ed il legame con i recettori cellulari di superficie. Molti studi hanno indicato
che la presenza di anomalie nei livelli serici delle sottoclassi di IgG può essere associata a diversi stati patologici. In modo particolare, è
stata ampiamente documentata la correlazione tra la carenza di immunoglobuline appartenenti alla sottoclasse IgG2 ed una maggiore
suscettibilità ad infezioni batteriche o virali (4,5). In pazienti affetti da infezioni ricorrenti a carico delle vie respiratorie superiori o inferiori
sono stati riscontrati livelli serici bassi di IgG2 o IgG3. In altri casi è stata riscontrata un'associazione tra concentrazioni seriche di IgG4
molto basse ed infezioni sino-polmonari ricorrenti (6). Anomalie nella concentrazione serica delle sottoclassi di IgG sono state osservate
anche in pazienti affetti da patologie autoimmunitarie, disturbi neurologici ed infezioni da HIV (4).
II.
RIFERIMENTI TECNICI
Il kit ELISA Sottoclassi umane PeliClass è un saggio enzimatico immunologico di tipo 'sandwich'. Il kit contiene strisce di micropozzetti
rivestiti con anticorpi monoclonali altamente avidi, ognuno specifico per una sottoclasse di IgG umane. I campioni da analizzare, il
calibratore ed il siero di controllo sono incubati nei rispettivi pozzetti. La sottoclasse di IgG da determinare si legherà alla fase solida e le
IgG non legate saranno rimosse con il lavaggio. Successivamente, ad ogni pozzetto si aggiunge l'antisiero anti IgG coniugato alla
perossidasi e l'anticorpo coniugato non legato è eliminato mediante lavaggio. Dopo l'incubazione con la soluzione contenente il substrato
(ABTS) e H2O2,la reazione è bloccata mediante aggiunta di un tampone acido. Il prodotto di reazione, di colore verde, è stimato
rilevandone l'assorbanza e la concentrazione della sottoclasse di IgG nel campione è calcolata per confronto con una curva di riferimento.
Il siero di controllo è saggiato per verificare la validità della curva di calibrazione e l'accuratezza delle determinazioni.
I livelli delle sottoclassi di IgG nel calibratore(i) sono stati determinati utilizzando un calibratore derivato dalla preparazione di riferimento WHO
67/97. I valori target utilizzati sono quelli raccomandati (5,0 g/L per IgG1; 2,6 g/L per IgG2; 0,4 g/L per IgG3 e 0,5 g/L per IgG4) (7).
III.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Conservare il kit ELISA Sottoclassi umane PeliClass in posizione verticale a 2-8 °C. Il kit può essere utilizzato fino alla data di scadenza
riportata sull'etichetta.
Dopo l'apertura, se conservati a 2-8 °C, tutti i componenti sono stabili fino ad 1 settimana.
Le condizioni di trasporto possono differire dalle condizioni di conservazione.
IV.
CONTENUTO DEL KIT
Vedere la tabella all’inizio del foglietto illustrativo.
Il kit ELISA Sottoclassi umane PeliClass contiene una quantità di reagenti sufficiente per 48 test per ogni sottoclasse, incluso i
calibratori, i controlli ed il bianco.
Gli anticorpi monoclinali sono stati purificati da asciti o da terreni di coltura mediante tecnica cromatografica (cromatografia a scambio
ionico e cromatografia di affinità). Il calibratore ed il controllo sono costituiti da siero umano liquido.
V.
−
−
−
−
−
−
ALTRO MATERIALE RICHIESTO
Acqua distillata per la diluizione del tampone di lavaggio e del tampone del substrato.
Pipette in grado di garantire una distribuzione accurata dei volumi.
Un incubatore (37 ± 2°C).
Un dispositivo standard per il lavaggio delle piastre ELISA o una bottiglia di plastica a spruzzo da 500 mL per il lavaggio automatico
o manuale delle strisce.
Un lettore ELISA standard per la misurazione dell'assorbanza a 414 nm o 405 nm.
Foglio logaritmico lineare.
VI.
TRATTAMENTO DEI CAMPIONI DA ANALIZZARE
Analizzare solo campioni di siero. I campioni devono essere quanto più freschi è possibile o devono essere conservati congelati.
I campioni devono essere diluiti manualmente prima dell'uso (vedere la sezione Vll: PROTOCOLLO DEL SAGGIO).
VII.
PROTOCOLLO DEL SAGGIO
−
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (18-25°C) e miscelare con cura. Evitare la formazione di bolle o di schiuma.
−
Si consiglia di analizzare in doppio tutti i campioni, i controlli e le diluizioni del calibratore.
1. MICROPIASTRE
Il kit ELISA Sottoclassi di IgG umane PeliClass garantisce la possibilità di utilizzare le piastre parzialmente in occasioni differenti.
Prima di aprire l'involucro di plastica, determinare il numero di strisce necessarie per analizzare il numero desiderato dei campioni più 14
pozzetti per i calibratori, i controlli ed il bianco in duplicato. Rimuovere le strisce che non saranno utilizzate dal telaio della piastra,
richiuderle nell'involucro plastificato contenente l'essiccante e conservarle a 2-8°C.
2. TAMPONI
Tampone di lavaggio: Preparare il tampone di lavaggio aggiungendo tutto il tampone concentrato contenuto nella bottiglia a 950 mL di
acqua distillata. Il tampone di lavaggio diluito deve essere conservato a 2-8°C ed è stabile per 1 settimana.
Nota: Il tampone concentrato può contenere cristalli di sale. Prima di preparare il tampone alla concentrazione di lavoro, riscaldare
BREVEMENTE il tampone concentrato a 37°C per dissolvere i cristalli.
Tampone di diluizione: Calcolare la quantità di tampone di diluizione richiesto (circa 2 mL di tampone concentrato per ogni striscia di
micropozzetti) e preparare una soluzione alla concentrazione di lavoro diluendo il tampone 10 volte in acqua distillata.
3. PREPARAZIONE DEL CALIBRATORE E DEI SIERI DI CONTROLLO
Per le concentrazioni vedere le tabelle 2 e 3 riportate nel foglietto illustrativo accluso.
Calibratore: (Vedere la tabella 1 del riportata nel foglietto illustrativo accluso) Etichettare una provetta da 10 mL con '1:500' ed 8
provette da 3 mL con 'Cal1 a Cal8' rispettivamente.
Pipettare 4,99 mL di tampone di diluizione nella provetta da 10 mL ed aggiungere 10 µL di siero di calibrazione (diluizione iniziale 1:500).
Pipettare 1,9 mL di tampone di diluizione nella provetta etichettata 'Cal1' e 1,0 mL nelle provette etichettate 'Cal2 - Cal8'.
2
Pipettare 100 µL del calibratore diluito 1:500 nella provetta Cal1 e, a partire da questa provetta, fare sette diluizioni seriali doppie
aggiungendo 1,0 mL dalla diluizione precedente nella successive provetta 'Cal'. Selezionare le serie di diluizioni del calibratore per ogni
sottoclasse di IgG: IgG1 1:80.000 -1:1.280.000 IgG2, IgG3 e IgG4 1:10.000 -1:160.000.
Controllo: Etichettare una provetta con ‘1:500’, e due provette da 3 mL rispettivamente con ‘1:30.000’ (per IgG2, 3, 4) e ‘1:240.000’
(per IgG1).
Pipettare 4,99 mL di tampone di diluizione e 10 µL di siero di controllo nella provetta etichettata 1:500.
Pipettare 885 µL di tampone di diluizione e 15 µL di diluizione 1:500 nella provetta etichettata 1:30.000.
Pipettare 875 µL di tampone di diluizione e 125 µL di diluizione 1:30.000 nella provetta etichettata 1:240.000.
Preparare una provetta da 3 mL con 1 mL di tampone (bianco).
4. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Diluire i campioni da analizzare con il buffer di diluizione seguendo il protocollo relativo al siero di controllo. In caso di risultati che
ricadono al di fuori degli intervalli stabiliti (vedere la tabella 1 contenuta nel foglietto illustrativo accluso) ripetere il test con una diversa
diluizione del campione.
5. PRIMO LAVAGGIO
Lavare quattro volte i micropozzetti nel telaio della piastra con il tampone di lavaggio. in caso di lavaggio manuale, riempire
completamente i pozzetti (> 300 µL) con il tampone di lavaggio ed eliminarlo, ripetere la procedura tre volte. Alla fine, i pozzetti devono
essere completamente vuoti. Aggiungere immediatamente il reagente successivo evitando che i pozzetti restino asciutti per periodi di
tempo prolungati.
6. PRIMA INCUBAZIONE
Aggiungere 100 µL di calibratori diluiti, controlli, campioni e bianchi nei pozzetti appropriati
Coprire la piastra con sigillante adesivo, agitare con cautela picchiettando sul bordo della micropiastra per pochi secondi in modo da
mischiare il contenuto di ogni pozzetto.
Incubare per 1 ora a 37°C.
Subito prima dei lavaggi, preparare il reagente per la successiva incubazione così come descritto al punto 8.
7. SECONDO LAVAGGIO
Aspirare il surnatante dai pozzetti e lavare la piastra come descritto al punto 5.
8. INCUBAZIONE CON ANTICORPO CONTRO LE IgG UMANE CONIUGATO CON HRP
Diluire il coniugato 1:500 aggiungendo 30 µL del coniugato a 14,97 mL di tampone di diluizione. Diluire ulteriormente il coniugato a:
1:3000 aggiungendo 1,2 mL della diluizione 1:500 a 6,0 mL di tampone di diluizione.
1:2000 aggiungendo 2,0 mL della diluizione 1:500 a 6,0 mL di tampone di diluizione.
1:1000 aggiungendo 3,5 mL della diluizione 1:500 a 3,5 mL di tampone di diluizione.
Aggiungere:
100 µL della diluizione 1:500 ai pozzetti delle anti-IgG1;
100 µL della diluizione 1:3000 ai pozzetti delle anti-IgG2;
100 µL della diluizione 1:2000 ai pozzetti delle anti-IgG3;
100 µL della diluizione 1:1000 ai pozzetti delle anti-IgG4;
Coprire la piastra con sigillante adesivo, agitare con cautela picchiettando sul bordo della micropiastra per pochi secondi in modo da
mischiare il contenuto di ogni pozzetto.
Incubare per 1 ora a 37°C.
Subito prima dei lavaggi, preparare il reagente per la successiva incubazione così come descritto al punto 10.
9. TERZO LAVAGGIO
Aspirare il surnatante dai pozzetti e lavare la piastra come descritto al punto 5.
10. INCUBAZIONE CON SUBSTRATO ABTS
Calcolare la quantità necessaria di soluzione contenente il substrato (approssimativamente sono necessari 0,9 mL per ogni striscia).
Aggiungere gli equivalenti di 200 µL di soluzione stock di perossido di idrogeno e 400 µL di soluzione stock di ABTS a 20 mL di tampone
del substrato alla concentrazione di lavoro (2 mL di soluzione stock del substrato + 18 mL di acqua distillata).
Aggiungere 100 µL di soluzione del substrato a tutti i pozzetti.
Agitare con cautela picchiettando sul bordo della micropiastra per pochi secondi in modo da mischiare il contenuto di ogni pozzetto.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (18-25ºC).
11. ARRESTO DELLA REAZIONE ENZIMATICA
Aggiungere 50 µL di soluzione bloccante a tutti i pozzetti.
12. LETTURA DELLA PIASTRA
Leggere entro 1 ora a 414 (preferibilmente) o 405 nm in un lettore per piastre ELISA.
VIII.
RISULTATI ED INTERPRETAZIONE DEI DATI
−
Registrare l'assorbanza a 414 (preferibilmente) o 405 nm per ogni pozzetto e fare la media delle letture in doppio.
−
Per ogni campione, le due letture non devono differire di più de 15% dal valore medio. Se almeno una delle due letture differisce
maggiormente il test deve essere ripetuto.
−
Riportare i valori medi di assorbanza dei calibratori sull'asse delle y e la concentrazione della sottoclasse correlata, in ng/mL,
sull'asse delle x del foglio logaritmico lineare.
−
Le concentrazioni delle sottoclassi di IgG nel siero di controllo devono ricadere all'interno dell'intervallo(i) illustrato nella tabella 3
contenuta nel foglietto illustrativo accluso.
−
Interpolare i valori medi di assorbanza relativi ad ogni campione sulla curva di riferimento.
−
I campioni con un valore medio di assorbenza che ricade all'esterno dell'intervallo delimitato dalla curva di riferimento devono essere
diluiti in modo appropriato.
−
Per una valutazione della concentrazione delle sottoclassi di IgG in un campione, confrontare i livelli relativi a valori normali delle
sottoclassi di IgG (vedere X INTERVALLI DI RIFERIMENTO).
IX.
INTERVALLI DELL'ANALISI
Per gli intervalli di saggio specifici consultare la tabella 1 contenuta nel foglietto informativo accluso
3
X.
INTERVALLI DI RIFERIMENTO
Intervalli di riferimento (g/L) relativi alle sottoclassi di IgG in campioni di siero di individui caucasici sani (8). Per altre popolazioni riferirsi a
diversi intervalli di riferimento.
Età
0
1
4
6
1
1½
2
3
4
6
9
12
XI.
a
b
1
4
6
12
1½
2
3
4
6
9
12
18
18
>
mese
mese
mese
mese
anno
anno
anno
anno
anno
anno
anno
anno
anno
IgG1
2,4 - 10,6
1,8 - 6,7
1,8 - 7,0
2,0 - 7,7
2,5 - 8,2
2,9 - 8,5
3,2 - 9,0
3,5 - 9,4
3,7 - 10,0
4,0 - 10,8
4,0 - 11,5
3,7 - 12,8
4,9 - 11,4
IgG2
0,87 - 4,1
0,38 - 2,1
0,34 - 2,1
0,34 - 2,3
0,38 - 2,4
0,45 - 2,6
0,52 - 2,8
0,63 - 3,0
0,72 - 3,4
0,85 - 4,1
0,98 - 4,8
1,06 - 6,1
1,50 - 6,4
IgG3
0,14 - 0,55
0,14 - 0,70
0,15 - 0,80
0,15 - 0,97
0,15 - 1,07
0,15 - 1,13
0,14 - 1,20
0,13 - 1,26
0,13 - 1,33
0,13 - 1,42
0,15 - 1,49
0,18 - 1,63
0,20 - 1,10
IgG4
0,04 - 0,56
<0,03 - 0,36
<0,03 - 0,23
<0,03 - 0,43
<0,03 - 0,62
<0,03 - 0,79
<0,03 - 1,06
<0,03 - 1,27
<0,03 - 1,58
<0,03 - 1,89
0,03 - 2,10
0,04 - 2,30
0,08 - 1,40
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DI FUNZIONAMENTO
Riproducibilità
Concentrazione sottoclassi IgG
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
Variazione intra-saggio (%)
4
3
4
2
Variazione inter-saggio (%)
2
2
7
7
Confronto tra il kit Sottoclassi di IgG umane PeliClass e Mancini
Le concentrazioni di IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 nei sieri sono state determinate con saggio ELISA e confrontate con i valori
corrispondenti trovati in Mancini. Di seguito sono riportate le correlazioni stabilite:
sottoclasse IgG
linea di regressione lineare
correlazione
IgG1
Y = 0,90X – 0,29
0,97
IgG2
Y = 1,01X – 0,17
0,93
IgG3
Y = 0,91X + 0,00
0,99
IgG4
Y = 0,96X – 0,03
0,98
Nota:
I valori riportati per le caratteristiche specifiche di funzionamento del test rappresentano risultati tipici e non devono essere considerati
specifici per questo kit.
XII.
LIMITAZIONI
1. L'utente deve essere istruito e deve familiarizzare con la tecnica ELISA e con la procedura dell'analisi.
2. Non utilizzare campioni molto emolizzati o lipemici. Campioni contenenti fattori reumatoidi, livelli alti di bilirubina o altri
immunocomplessi circolanti possono dare risultati inattesi. Analizzare questi campioni con metodi diversi.
3. Campioni che ricadono all'esterno degli intervalli di riferimento, ad esempio in caso di paraproteine, devono essere analizzati
nuovamente utilizzando diluizioni differenti.
4. Un risultato che evidenzia un livello ridotto di una delle sottoclassi IgG non può mai considerarsi una diagnosi definitiva. Al contrario,
esso deve essere considerato l'indicazione di un disturbo a carico del sistema immunitario che richiede ulteriori ricerche
diagnostiche.
5. Utilizzare sempre il siero di controllo per verificare la validità delle curve di calibrazione. Quando il controllo ricade al di fuori
dell'intervallo, i risultati del test non sono attendibili. Il test deve essere ripetuto.
6. I reagenti di lotti differenti non sono interscambiabili.
7. Non miscelare residui di reagenti (p.e. volume morto) con il contenuto di flaconcini appena aperti.
8. I tappi ed I flaconcini non sono interscambiabili. Rimettere il tappo sul flaconcino corrispondente.
9. Sebbene il calibratore umano ed i sieri di controllo siano stati testati per i marcatori di agenti specifici di trasmissione di patologie,
secondo le linee guida UE per le GMP, e siano stati trovati non reattivi, tutti i componenti di origine umana devono essere
considerati potenzialmente infettivi.
10. Conservante: Thiomersal® 0,001%.
11. Nel corso dell'esperimento ELISA, utilizzare un nuovo sigillante per ogni fase di incubazione/fissazione per evitare contaminazioni
incrociate. Non utilizzare fogli di alluminio.
12. Utilizzare puntali per pipette monouso per ogni trasferimento per evitare contaminazioni incrociate.
13. Preparare diluizioni fresche dei calibratori, del coniugato e dei tamponi ogni volta che si utilizza il kit.
14. Non utilizzare reagenti o strisce di micropozzetti diversi da quelli forniti con il kit.
15. La sodiazide inattiva l'HRP; non utilizzare soluzioni contenenti sodiazide; non aggiungere sodiazide ai tamponi forniti.
16. Eseguire lo smaltimento dei rifiuti nel rispetto delle normative interne di laboratorio.
4
XIII.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 19 (1986).
Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (1990).
Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8:26 (1989).
Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 81:357 (1990).
Hamilton, R.C., Clin. Chem., 33:1707 (1987).
Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., 124:94 (1981).
Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 150 119 (1985)
Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 52:561-67 (1994).
5