Vito Vece 17 maggio 2012

PROGETTO VeLiCa
Da colture antiche materiali e prodotti per il futuro
Estrazione e proprietà di
sostanze naturali dalle foglie
e dai semi di canapa
Responsabile: Prof. Giordano Lesma
Assegnista: Dr. Vito Vece
UNIVESITA’ DEGLI STUDI DI MILANO
DIPARTIMENTO DI CHIMICA ORGANICA ED INDUSTRIALE
via Venezian 21
20133 Milano
Estrazione e caratterizzazione di sostanze
naturali da foglie e semi di canapa
Tre cultivar di foglie e semi di canapa raccolte nel mese di luglio 2011
1. CANAPA CARMAGNOLA
2. CANAPA FELINA
3. CANAPA FUTURA
Scopo chimico-analitico
Scopo industriale-applicativo
Caratterizzazione QUANTITATIVA e
QUALITATIVA dei principali metaboliti
secondari, in particolar modo flavonoidi,
flavoni e antocianine.
Utilizzo diretto delle frazioni estratte
arricchite delle sostanze naturali per
scopi nutrizionali, cosmetici,
farmaceutici ed erboristici.
Isolamento e identificazione dei singoli
prodotti attraverso tecniche di
purificazione analitica e utilizzo di
specifici reattivi chimici.
Integratori alimentari, fitomedicine,
fitofarmaci, farmaci omeopatici,
creme di bellezza…
Attività svolta
Letteratura di riferimento: Verporte, J. Nat. Prod., 2004, 67, 953-957
Materiale FRESCO (Dott.ssa Mattana)
Foglie di canapa
Materiale SECCO (essiccato in stufa a 40°C per 24
h e conservato in frigo sotto vuoto)
Messa a punto e ottimizzazione di
metodologie estrattive
Frazione poco polare (circa 10%)
Frazione polare (circa 25%)
(estratta con cloroformio o esano)
(estratta con metanolo)
Separazione di materiale oleoso
contenente principalmente gliceridi e
acidi grassi polinsaturi (acido linoleico,
acido linolenico, acido oleico, …).
Identificazione di flavonoidi nelle frazioni arricchite
(collaborazione con Dott. Consonni CNR).
Cospicue quantità di zuccheri (saccarosio,
α-glucosio e β-glucosio) e presenza di alcuni
amminoacidi (asparagina, alanina e valina).
Attività svolta
Semi di canapa
Degrassaggio con Soxhlet:
ottenimento dell’olio di canapa.
(circa 30%)
Caratterizzazione degli acidi grassi
attraverso analisi 1H-NMR.
(G. Knothe et al., Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2004, 106, 88-96)
Estrazione dei semi degrassati
attraverso Metanolo/acqua 8:2.
(circa 9%)
Separazione cromatografica della
frazione metanolica per isolare i
principali metaboliti secondari.
Determinazione del profilo degli acidi grassi
presenti nell’estratto oleoso dei semi
attraverso analisi 1H-NMR.
(G. Knothe et al., Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2004, 106, 88-96)
trigliceride
O
e
h
H2C O
i
HC O
H2C O
h
g
f
O
acido α-linolenico (Ω-3)
g
e
e
acido linoleico (Ω-6)
g
f
O
b
e
e
acido oleico (Ω-9)
f
O
e
g
g
e
acido γ-linolenico (Ω-6)
c
f
Estratto oleoso dei semi di canapa caramagnola
(estrazione con Soxhlet)
f
l
h
i
g
e
d
b
a
Determinazione del profilo degli acidi grassi
presenti nell’estratto oleoso dei semi
attraverso analisi 1H-NMR.
50
47,3
46,6
45
40,3
40
36,1
percentuale [%]
35
30
25,1
25
20
18,2
acido linoleico (Ω-6)
20,6
19
18,6
acido oleico + acido γ-linolenico (Ω-6)
15,1
15
8,6
10
5
1,8
0
semi canapa CARMAGNOLA
Acidi grassi insaturi:
73,3%
Acidi grassi saturi:
26,7%
acido α-linolenico (Ω-3)
seni canapa FELINA
semi canapa FUTURA
semi lino commerciale
Acidi grassi insaturi:
76,0%
Acidi grassi saturi:
24,0%
Acidi grassi insaturi:
74,5%
Acidi grassi saturi:
25,5%
Acidi grassi insaturi:
73,5%
Acidi grassi saturi:
26,5%
Studio metabolomico di semi e foglie di canapa
Interesse economico nell’isolare direttamente estratti aventi determinate
caratteristiche chimico-farmaceutiche senza dovere isolare il principio attivo.
Le determinazioni vengono effettuate con uno spettrometro
UV-Vis in presenza di uno specifico riferimento.
Nell’estratto metanolico si determina:
• Contenuto fenolico totale mediante reagente di Folin-Ciocalteu
(H3PO4(MnO3)12(WO3)12); [λ = 760 nm, rif. acido gallico].
• Contenuto totale di flavonoidi mediante sistema cromogenico
(NaNO2/AlCl3/NaOH); [λ = 510 nm, rif. rutina]
• Contenuto totale di radicali liberi (antiossidanti) mediante tecnica Dot-Blot
(2,2-difenil-1-picrilidrazile [DPPH]); [λ = 517 nm, rif. DPPH].
Studio metabolomico di semi e foglie di canapa
Studio metabolomico di semi e foglie di canapa
Studio metabolomico di semi e foglie di canapa
I semi delle tre qualità di canapa analizzate posseggono
maggiori potere antiossidante e quantità più apprezzabili di
composti fenolici e flavonoidici rispetto alle foglie secche.
I semi della qualità “felina 32” risultano contenere una
maggiore quantità di composti flavonoidici.
La qualità “futura 75” ha un contenuto relativamente basso
di flavonoidi sia nei semi che nelle foglie.
I semi possiedono maggiori proprietà metabolomiche
Analisi HPLC dell’estratto metanolico dei semi di
canapa FUTURA svolto dalla Dr.ssa Martina Bava
Lab. Chimica Tossicologica
Diode array detector (DAD)
Gradiente dell’eluente:
Solvente A: 0.3% H3PO4 in H2O;
Solvente B: Acetonitrile;
Time (min)
Solvent A %
Solvent B %
0
90
10
45
80
20
65
40
60
66
90
10
85
90
10
Attraverso la comparazione con standard di riferimento, la metodica consentirà, la
determinazione qualitativa e quantitativa dei differenti componenti fenolici e
flavonoidici presenti nell’estratto.
Identificazione dei metaboliti secondari
Spettro in MeOD
300 MHz
Canapa carmagnola
(10 mg prodotto / 30 g semi)
d
h
e
g
i
c
f
N-trans-caffeoiltirammina
h
i
d
c
b
a
SVILUPPI SUCCESSIVI
• Identificazione e separazione di ulteriori metaboliti secondari
attraverso uso di colonne impaccate e apparecchi HPLC.
• Utilizzo di differenti fasi stazionarie e mobili per
l’apparecchiatura cromatografica nell’ottica di ottimizzare la
separazione dei metaboliti.
• Applicazione delle metodiche estrattive ai semi di lino.