UB100 – Real Check TRENB Urine 1 Introduzione 2 Preparazione
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UB100 – Real Check TRENB Urine 1 Introduzione 2 Preparazione
UB100 – Real Check TRENB Urine Materiale di riferimento in matrice per 17-α-trenbolone e 17-β-trenbolone nell’urina bovina 1 Introduzione Il trenbolone acetato (nome completo:17β-Hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one, numero CAS 10161-33-8) è uno steroide anabolizzante sintetico con effetto androgenico (Figura I). E’ vietato nella UE, ma viene ancora usato negli USA e in Canada come trattamento anabolizzante per gli animali da allevamento. Solitamente viene somministrato come trenbolone acetato mediante impianti sottocutanei. Nel sangue viene idrolizzato a 17-βtrenbolone (forma attiva del farmaco). Nelle urine, oltre alla forma attiva, si riscontra anche la presenza del metabolita 17-α-trenbolone. Il Piano Nazionale Residui 2012 indica il limite di rilevabilità del trenbolone a 2 µg/l (livello minimo richiesto dalla prestazione analitica) nell’analisi di urine di vitelli, vitelloni e vacche. Il materiale UB100 è un’urina bovina contaminata naturalmente contenente un’elevata concentrazione di 17-βtrenbolone e 17-α-trenbolone. Il materiale, diluito in un campione negativo secondo il fattore desiderato, può venire utilizzato nelle procedure di validazione di metodi analitici. Figura I: formula del trenbolone acetato 2 Preparazione, studio e assegnazione del valore 2.1 Preparazione del materiale Il materiale UB100 – Real Check TRENB Urine è stato preparato miscelando opportunamente le urine provenienti da tre animali (maschi di razza Salers di età compresa tra gli 11 e i 19 mesi). La prima urina e la seconda urina erano di tipo incurred (naturalmente contaminate) ed erano state ottenute da animali trattati con trenbolone acetato somministrato per via intramuscolare. I campioni sono stati uniti in un unico pool. La terza urina era di tipo blank, proveniente da un animale esente da trattamenti farmacologici. Tutte le urine sono state analizzate per il contenuto di trenbolone prima di venire utilizzate per la preparazione di UB100. Il pool incurred è stato opportunamente diluito con il campione blank e il tutto è stato omogeneizzato su un agitatore magnetico. Il materiale è stato dapprima distribuito in vials in vetro ambrato con un dispensatore, poi sottoposto ad un ciclo di liofilizzazione ed infine chiuso sottovuoto e conservato a -20°C. Test Veritas S.r.l. - Via Svizzera 16, Padova, Italia tel: 049/8256292, fax: 049/21064938, e-mail: [email protected] www.testveritas.com Pagina 1 di 3 LOTTO 011012 2.2 Omogeneità e stabilità Le prove hanno dimostrato che il materiale è omogeneo e stabile al trasporto a temperatura ambiente. Una volta ricevuto deve essere conservato al buio a -20°C. 2.3 Valore assegnato e incertezza del materiale ricostituito Il valore di concentrazione di α-trenbolone e β-trenbolone (Tabella 3) è stato assegnato attraverso un circuito interlaboratorio formato da tre laboratori esperti, di seguito elencati in ordine alfabetico: - AKER Norwegian Control Doping Laboratory (Oslo, Norvegia) - IZSLER Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna "Bruno Ubertini" – Reparto chimica degli alimenti di origine alimentare (Brescia, Italia) - LABERCA Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (Nantes, Francia). Molecola 17-α-trenbolone 17-β-trenbolone UB100: Real Check TRENB Urine Concentrazione1 Valore assegnato2 15,4 µg/kg 10,5 µg/kg Incertezza3 ±2,6 µg/kg ±2,9 µg/kg 1 Calcolata sulla media di 3 set di risultati ottenuti con metodologia di conferma Ottenuto su prove in cui il materiale era stato diluito di un fattore 10 3 Incertezza semplice 2 Tabella 3: valore assegnato, concentrazione e incertezza del materiale di riferimento UB100 Tutti i laboratori erano in possesso dell’accreditamento ISO 17025 per la prova in questione. A ciascuno è stato assegnato un codice identificativo. Ogni laboratorio ha ricevuto 3 unità di materiale UB100 ed un quantitativo di urina blank (urina BOV04 del pannello Real Check di Test Veritas) sufficiente per eseguire 3 determinazioni indipendenti dopo aver diluito il materiale 1:10. La Tabella 4 elenca risultati ottenuti. I dati sono stati sottoposti al test di Dixon e al test del box plot per escludere la presenza di outliers. Il valore assegnato del materiale è dato dalla media delle medie, mentre il valore di incertezza corrispondente è dato dall’errore standard relativo. I dettagli dei metodi impiegati sono indicati in Tabella 5. α-TRENBOLONE (µg/kg) Laboratorio Misura 1 Misura 2 Misura 3 MEDIA 1 1,92 1,83 1,96 1,90 2 0,77 1,18 1,13 1,03 3 2,00 0,80 2,30 1,70 Media delle medie [µg/kg] 1,54 Deviazione standard relativa RSD [%] 29,7 Errore standard RSE [%] 17,17 β-TRENBOLONE (µg/kg) Laboratorio Misura 1 Misura 2 Misura 3 MEDIA 1 0,76 0,75 0,80 0,77 2 0,79 0,75 0,73 0,76 3 1,80 1,70 1,40 1,63 Media delle medie 1,05 Deviazione standard relativa RSD [%] 47,7 Errore standard relativo RSE [%] 27,53 Tabella 4: singoli risultati provenienti dal circuito di caratterizzazione. I dati, corretti per il recupero, sono stati ottenuti dopo diluizione 1:10 in urina blank. Test Veritas S.r.l. - Via Svizzera 16, Padova, Italia tel: 049/8256292, fax: 049/21064938, e-mail: [email protected] www.testveritas.com Pagina 2 di 3 LOTTO 011012 Codice laboratorio ISO 17025 α-trenbolone CCα (µg/kg) α-trenbolone CCβ (µg/kg) β-trenbolone CCα (µg/kg) β-trenbolone CCβ (µg/kg) Metodo analitico Standard per le analisi cromatografiche Estrazione SPE Altre estrazioni Digestione SPE Clean up Clean up (altro) Metodologia HPLC Colonna Lunghezza colonna (cm) Diametro colonna (mm) Dimensione particelle 1 2 yes yes 0,60 0,12 0,66 0,12 0,54 0,43 0,59 0,49 HPLC/MS/MS GC/MS/MS NARL (α-tren), dr. Roussel Uclaf Ehrenstorfer (β-tren) Trattamento dei campioni MeOH/Acetate buffer β-gluc aryl sulfatase β-gluc aryl sulfatase ChromP+SiOH Immunoaffinity Hexane/diethylether chromatography Metodologia HPLC e condizioni gradient C18 15 2,1 3,5 - 3 yes 0,06 0,10 0,09 0,15 HPLC/MS/MS RIVM C18 Liq-Liq extraction (npentan) β-gluc aryl sulfatase OASISHLB - gradient C18 10 2,1 3 Tabella 5: dettagli sulle metodologie impiegate dai laboratori partecipanti al circuito di caratterizzazione. 3 Istruzioni per l’uso 3.1 Caratteristiche UB100 – Real Check TRENB Urine si presenta in forma liofilizzata ed è fornito in una singola bottiglietta in vetro ambrato. Ciascuna bottiglietta contiene la quantità di materiale sufficiente per ottenere 2,2 ml di urina bovina dopo ricostituzione in acqua bidistillata. 3.2 Precauzioni Applicare le normali procedure per la sicurezza in uso presso il laboratorio. 3.3 Ricostituzione - Portare UB100 a temperatura ambiente. - Ricostituire con 2,15 g di acqua bidistillata. La pesatura deve avvenire immediatamente dopo l’apertura della bottiglietta per ridurre al minimo il contatto del liofilo con l’umidità atmosferica. Agitare delicatamente per inversione. - Conservare overnight a 2-8°C ed utilizzare il giorno seguente. 3.4 Conservazione Il materiale deve essere conservato a -20°C. 3.5 Utilizzo Il materiale è destinato ad essere utilizzato nei controlli di qualità e nei processi di validazione dei metodi analitici. 3.6 Scadenza La scadenza di UB100 è fissata ad aprile 2014. Test Veritas S.r.l. - Via Svizzera 16, Padova, Italia tel: 049/8256292, fax: 049/21064938, e-mail: [email protected] www.testveritas.com Pagina 3 di 3 LOTTO 011012