FERRITIN MAb Sistema a componenti in fase

Diagnostic Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, NY 10962
http://www.diagnostics.com
FERRITIN MAb
Sistema a componenti
in fase solida per il dosaggio
della Ferritina
06B-160850
RIA HOT LINE U.S. ONLY: 1-800-431-1237
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IL DOSAGGIO DELLA FERRITINA
Catalogo nE 06B160850: Kit Ferritina MAb
E
(coated tubes)
E
Catalogo n 06B263991, Livelli standard di Ferritina
La Ferritina è una proteina di accumulo del ferro risultante dal complesso biochimico formato
fluidi extracellulari in equilibrio con le riserve di ferro del sistema reticoloen-doteliale. La
questo dato riguarda pertanto le diagnosi sia di carenza che di sovraccarico di ferro.
manifesti l'anemia1. Per questo motivo la ferritina serica o plasmatica decresce mentre la
RBC-protopor-firina) rimangono entro i livelli di norma. Di conseguenza, la determi-nazione della
presenza di anemia, sia la determi-nazione della percentuale di saturazione della transferrina
ferro-carenziale della situazione anemica. Qualora vengano approntati studi riguardanti la
percentuale di saturazione della transferrina che la ferritinemia poichè è stato rilevato che una
1
La determinazione della ferritinemia ha assunto significato diagnostico assieme alla percentuale
2
degli stati ferro carenziali. La ferritina serica si configura a livello diagnostico per la rilevazione
principalmente lo stato del ferro parenchimale.
3
Il rilevamento subclinico di carenza in ferro può configurarsi premonitore dello stato anemico;
definizione dello stato nutrizionale del paziente.
sovraccarico in ferro, nel qual caso il trattamento con ferro sarebbe controindicato. In questi
informazioni.
1
Nel caso in cui la riserva in ferro sia aumentata, è corrispondentemente rilevabile un aumento
del livello di ferritina. Altre condizioni possono comunque condurre ad un aumento della
ferritinemia1,4. Al contrario, patologie riguardanti la riserva in ferro raramente possono
associarsi a normali livelli di ferritina5.
Il sistema ICN Pharmaceuticals a componenti in fase solida trova applicazione per la
determinazione quantitativa della ferritina nel siero o plasma.
Principio di Dosaggio
Nel dosaggio immunoradiometrico (IRMA), secondo la cosidetta tecnica "sandwich", anticorpi in
eccesso formano un complesso con l'antigene6. L'anticorpo adeso al supporto solido cattura
l'antigene presente nel campione mentre un secondo anticorpo radioiodato con [I125] si lega
all'antigene legato. Il complesso radioattivo che così si forma sarà quindi in funzione diretta
con la concentrazione dell'antigene nel campione o nello standard.
Il sistema ICN Pharmaceuticals a componenti in fase solida prevede l'impiego di un anticorpo
monoclonale adeso alla parete di una provetta ed un anticorpo monoclonale radioiodato diretti
contro la ferritina.
Poichè il procedimento ICN Pharmaceuticals non è soggetto all'effetto "gancio" alle alte dosi, i
campioni ad alti valori in ferritina non danno stime falsate nell'intervallo di normalità.
Reagenti
Per uso diagnostico in vitro.
1. Provette sensibilizzate con anti-corpo anti-Ferritina (coated tubes). Catalogo nE 06B263905.
Provette in polistirene ricoperte con anticorpo monoclonale diretto contro Ferritina;
confezione da 100 provette. Conservazione: refrigerare a 2-8EC, chiuse nella confezione
originale. Non usare provette di lotti diversi nello stesso dosaggio. Stabilità: vedi la data di
scadenza sulla confezione.
2. Ferritina standard A-G. Catalogo nE 06B263991, contenenti ferritina epatica umana in
tampone con siero albumina umana*, sodio azide allo 0,1%** ed altri conservanti.
Standardizzazione contro lo standard WHO/MRC 80/602. Conservazione: refrigerare a 28EC. Stabilità: vedi la data di scadenza sul flacone.
Standard
ng Ferritina/ml
Volume/flacone (ml)
A
B
C
D
E
F
G
0
5
20
100
400
1000
2000
2
1
1
1
1
1
1
2
3. Catalogo nE 06B263915, conten-ente meno di 10 FCi (370 kBq) [I125]; anticorpo
monoclonale (topo) diretto contro Ferritina, in tampone con proteine, colorante, sodio azide
allo 0,1%** ed altri conservanti. 10 ml per flacone, sufficienti per l'allestimento di 50
provette. Conservazione: refrigerare a 2-8EC. Stabilità: vedi la data di scadenza sul
flacone.
* ATTENZIONE: MANEGGIARE COME SE FOSSE CAPACE DI TRASMETTERE INFEZIONE. Il
materiale da cui é derivato questo prodotto é stato trovato non reattivo per HBsAg e
negativo per l'anticorpo Anti-HIV quando testato con reagenti autorizzati. Nessun test puó
offrire garanzia che i prodotti derivati da sangue umano non siano infettivi. Far riferimento
alla Biosicurezza CDC/NIH Nei Laboratori di Microbioligia di Biomedica (Pubblicazione NHS nE
84-8395).
**
ATTENZIONE: i reagenti conten-gono sodio azide. Il sodio azide può reagire con il
piombo e il rame delle tubature idrauliche formando composti metallici altamente
esplosivi. All'atto dello scarico, far fluire grandi volumi d'acqua così da prevenire
l'accumulo. Altamente tossico per ingestione. A contatto con acidi libera gas altamente
tossico. In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatemente ed abbondantemente
cond'acqua.
IMPIEGO DI MATERIALE RADIOATTIVO: AVVERTENZE
L'acquisto, la ricezione, la detenzione, l'uso, il trasferimento e lo smaltimento di materiale
radioattivo, sono soggetti ai regolamenti ed ai permessi previsti dalle autorità legislative. Nella
mani-polazione di sostanze radioattive devono essere osservate le seguenti precauzioni:
Il materiale radioattivo deve essere conservato e manipolato in un'area del laboratorio
specificatamente designata a tale uso. L'ambiente di lavoro deve essere ben illuminato e
arieggiato. Le superfici di lavoro devono essere non porose in modo da ridurre al minimo la
contaminazione dovuta allo spargimento di liquidi radio-attivi. Considerata la piccola radioattività
contenuta nel flacone del tracciante (circa 10 FCi), l'uso del kit non pone alcun problema di
pericolo di radiazioni. Tuttavia per evitare inalazione o ingestione di materiale radioattivo è
necessario rispettare le buone norme generali di laboratorio. In particolare si raccomanda di: non
pipettare con la bocca soluzioni radioattive; non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell'area
di lavoro designata; pulire immediata-mente le superfici di lavoro dei materiali radioattivi
eventualmente versati; raccogliere il materiale contaminato solido e liquido in appositi contenitori
ed effettuarne lo smaltimento secondo le procedure previste; lavarsi accuratamente le mani dopo
l'uso di materiale radioattivo.
Attrezzature e reagenti richiesti ma non forniti
1. Provette per raccolta ematica tipo da 5 o 10 ml (con Eparina qualora si desideri operare su
plasma).
2. Acqua distillata.
3. Pipette semiautomatiche con puntali a perdere in grado di dispensare 25 Fl, 200 Fl e 2,0 ml.
4. Portaprovette.
3
5. Agitatore tipo Vortex.
6. Bagno termostatico in grado di mantenere 37 ± 1EC.
7. Contatore a scintillazione per la rilevazione delle radiazioni dello [125I].
Raccolta dei Campioni
Non è necessario alcun particolare accorgimento per la preparazione del paziente. Si raccomanda
comunque di verificare l'evenienza di precedenti trattamenti recenti del paziente con sostanze
radioattive in vivo.
Preparazione del campione per l'analisi: raccogliere il campione in siringa (con eparina se si
desidera il plasma) da 5 o 10 ml. Qualora si utilizzi il siero, attendere la coagulazione a temperatura
ambiente. Centrifugare e raccogliere il siero.
Spedizione dei campioni: il siero dovrebbe essere spedito a 2-8EC. Qualora il tempo di spedizione
dovesse superare le 48 ore, si raccomanda il congelamento. Il laboratorio ricevente dovrebbe conservare il campione ad almeno -20EC.
Conservazione: prima dell'analisi, il siero può essere conservato a 2-8EC. Qualora il tempo di
conservazione superi le 48 ore, si raccomanda di congelare ad almeno - 20EC. Non sgelare e
ricongelare. Sgelare a temperatura non superiore a 30EC. Non agitare su Vortex. Il mescolamento violento può denaturare la ferritina. Non sottoporre ad analisi campioni emolizzati o
fortemente lipemici.
Procedimento di Dosaggio
L'allestimento delle provette dei campioni, degli standard e dei controlli deve essere effettuato in
duplicato e simultaneamente.
Lo standard A rappresenta il legame non specifico e può essere usato al fine di correggere i
conteggi per la radioattività di fondo e per la quota di tracciante radioattivo adeso non
specificamente alla provetta.
Portare i reagenti e i campioni a temperatura ambiente prima dell'uso. Al fine comunque di ridurne
il deterioramento, evitare di mantenerli non refrigerati se non per il tempo necessario al loro uso.
Usare solo i reagenti forniti nel kit. Qualora debbano essere impiegati due flaconi dello stesso
reagente nel dosaggio, si consiglia di mescolarli assieme prima di iniziare il procedimento.
1. Se il metodo di elaborazione dei dati richiede l'attività totale, allestire due provette in polistirene.
2. Numerare 14 provette sensibiliz-zate (Ferritina-MAB coated tubes) per la curva standard.
Numerare altre due provette per ogni campione o controllo da dosare.
3. Aggiungere alle provette ferritina standard e campioni secondo lo schema di pipettamento che
segue.
4
4. Aggiungere 200 Fl di tracciante a tutte le provette. Agitare breve-mente. Ricoprire le provette.
5. Incubare tutte le provette a 37 ± 1EC in bagno termostatico per 1 ora.
6. Togliere dal bagno tutte le provette e scoprirle.
7. Aggiungere 2 ml di acqua distillata. Aspirare.
8. Ripetere il passaggio 7.
9. Determinare la radioattività delle provette aspirate e delle provette dell'Attività Totale (se
richiesta) in un contatore gamma per un minuto.
Sistema a Componenti in Fase Solida per il Dossagio Della Ferritina
Provetta
1, 2
3, 4
5, 6
7, 8
9,10
11,12
13,14
Campion
e
Standard
(Fl)
Siero
(Fl)
Tracciante
(FL)
25 A
25 B
25 C
25 D
25 E
25 F
25 G
--------------25
200
200
200
200
200
200
200
200
Incubazione
Lavaggio
Agitare e
incubare
tutte le
provette a
37EC per 1
ora.
Aggiunger
e 2 ml di
acqua
distillata.
Aspirare.
Ripetere.
Calcolo dei Risultati
La tabella 1 riporta dati tabulati
Calcolo automatico:
I risultati ferritinemici possono essere calcolati impiegando tecniche di elaborazione automatica dei
dati, così come l'interpolazione punto a punto, il sistema logistico a quattro parametri o altri
metodi.
Calcolo manuale:
La curva standard può essere ottenuta manualmente impiegando i conteggi in funzione delle
concentrazioni di ferritina. Può essere impiegato il seguente procedimento:
1. Calcolare la media dei conteggi delle provette 1 e 2 e di ogni paio di standard, campioni e
controlli.
2. Sottrarre la media dei conteggi delle provette 1 e 2 da ogni media dei conteggi degli stan-dard,
dei campioni e dei controlli ottenendo così i conteggi cor-retti.
3. La curva standard può essere interpolata
su
5
grafico
log-log
in ordinate le medie dei conteggi corretti relativi agli standard e in ascisse le
concentrazioni degli standard.
Vedi in figura 1 un grafico campione. Questi dati sono mostrati a titolo d'esempio e non devono
Esempio:
1.
2. Media conteggi per il campione 1 = 11.158
Conteggio corretto per il campione 1 = 10.555
4.
grafico di figura 1, al conteggio 10.555 corrisponde la concentrazione 100 ng/ml di
Ferritina.
L'effetto gancio delle alte dosi è una evenienza tipica nei saggi IRMA. La Ferritina MAb Irma ICN
è stata sviluppata in modo che la maggior parte dei campioni con concentrazione
da 2000 a 15000 ng/ml risulteranno maggiori di 2000 ng/ml.
la dose di un campione diluito risulta più alta rispetto al campione in toto, può essere un'indice
di effetto gancio. In generals, per una migliore accuratezza dei risultati, tutti i campioni a dose
La presenza di radioattività nel campione ematico può interferire sul dosaggio.
Valori Attesi
di siero di 205 soggetti con normale profilo ematochimico sono stati sottoposti a
dosaggio
ottenuti i seguenti intervalli di riferimento:
n
Intervallo; ng/ml
Uomini
74
10 - 385
Donne in menopausa
58
5 - 345
Ogni
normali.
La diminuzione delle scorte di ferro è generalmente associata a valori ferritinemici attorno a 20
mentre l'anemia sideropenica può essere sospettata a fronte di valori di ferritinemia di 10
ng/ml o minori
.
I valori da sovraccarico di ferro sono significativamente superiori a 300 ng/ml
.
I
6
come nell'infiammazione, malattia epatica o aumentato metabolismo eritrocitario1.
7
NON SI ACCORDI CON IL GUIDIZIO CLINICO, QUEST'ULTIMO DOVREBBE ESSERE
SEGUITO ED ULTERIORI INDAGINI DOVREBBERO ESSERE ESEGUITE.
Precisione:
sieri di controllo commerciali e due campioni sono stati dosati al fine di determinare la
precisione "nel saggio", (n = 20):
x
D.S.
1
2
16,5
1,10
90
3,96
444
20,4
4
5
9,7
0,85
776
52,8
Tre sieri di controllo e due campioni sono stati dosati al fine di determinare la precisione "fra i
saggi":
1
25
x̄
CV %
2,77
16,9
2
4
25
431
97
6,9
4,11
17
1,75
5,2
5
716
60
Recupero:
ottenuti i seguenti recuperi:
Ferritina
0
10
100
250
1000
Ferritina
trovata
6,1
55
103
97
97
467
877
92
87
8
Linearita':
Un campione di siero è stato diluito con standard A:
Fattore di
diluizione
Trovato ng/ml
% Trovato
0
2
4
8
16
32
64
128
2427
1183
593
303
150
80,8
39,6
19,8
--97
98
100
99
106
104
104
Sensibilità:
La sensibilità definita come +2 D.S. di venti determinazioni di Standard zero, è 1,3 ng/ml.
Specificità:
La reattività con la ferritina splenica umana è risultata essere il 86%
9
Table 1
ICN Pharmaceuticals Ferritin MAb
Solid Phase Component System: Tabulated Data
ng/mL
Tube
Ferritin
cpm
Total
290707
Total
289570
Std A
0
Std A
Std B
5
20
100
400
1122
1128
524
2668
2778
2175
11271
11374
10771
38004
38750
38147
70328
69725
90633
90030
11158
10555
39497
1000
Std F
Std G
603
11478
Std E
Std F
cpm
2889
Std D
Std E
cpm
1133
Std C
Std D
Corrected
679
Std B
Std C
527
Average
70410
70246
2000
89125
Std G
92142
Patient
11316
Sample
11000
10
Figure 1
Typical Ferritin Curve
11
References
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12. "Ciba Foundation Symposium: Iron metabolism". Elsevier/Excerpta Medica/ North Holland,
Amsterdam, Oxford and New York, 1977.
12
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QER Q00-303
3/30/01
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