la ricerca sulla sclerosi multipla

Transcript

LA RICERCA SULLA
SCLEROSI MULTIPLA
Finanziata dalla
Fondazione Italiana Sclerosi Multipla
2013
A cura di
Roberta Guglielmino
Area Ricerca scientifica AISM-FISM
Coordinamento editoriale
Silvia Zino
Area Comunicazione e Ufficio Stampa AISM
Progetto grafico
Elena Tortora
Copyright 2013
Fondazione Italiana Sclerosi Multipla
Fondazione Italiana Sclerosi Multipla - Onlus
Via Operai 40 - 16149 Genova
Tel. 010 27 13 226
Fax 010 27 13 205
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anche se parziale, senza il permesso scritto dell’editore
Pubblicato e distribuito da
Associazione Italiana Sclerosi Multipla - Onlus
Via Operai, 40 - 16149 Genova
ISBN
XXXXXXXXX
indice
compendio 2013
INTRODUZIONE ................................................pag. 7
Patergnani Simone ................................................pag. 42
Analisi di parametri mitocondriali in oligodendrociti durante condizioni pro-infiammatorie
Diamo una risposta alle persone con SM .....pag. 9
Pieragostino Damiana ..........................................pag. 45
Strategie di proteomica nella SM: studi strutturali e funzionali delle
isoforme ossidate della transtiretina, un possibile biomarcatore di
malattia IMAGING
Filippi Massimo ......................................................pag. 14
Definizione delle misure di RM predittive dell’accumulo di disabilità e
compromissione cognitiva a lungo termine in pazienti con SM e un
esordio a ricadute della malattia: studio longitudinale a 13 anni
Verderio Claudia......................................................pag. 48
Microvescicole microgliali nel liquido cerebrospinale: un potenziale marcatore nella SM
Giannetti Paolo .......................................................pag. 17
Il ruolo della microglia attivata nella SM e nelle sindromi clinicamente isolate: studio di imaging immunologico
CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA
Bernardinelli Luisa .................................................pag. 52
Il ruolo del gene ACCN1 nella suscettibilità e patogenesi della SM
Rovaris Marco ........................................................pag. 19
Fisiopatologia del danno tissutale nella SM progressiva: studio
comparativo immunologico e di RM rispetto a pazienti con malattia del motoneurone
Bertolotto Antonio .................................................pag. 55
Correlazione tra neurodegenerazione e infiammazione nella
SM: NR4A2 come modulatore di infiammazione
Calabresi Paolo ......................................................pag. 58
Uno studio elettrofisiologico dei meccanismi di alterata plasticità sinaptica in modelli sperimentali di SM
QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE
Cerasa Antonio .......................................................pag. 23
Cecconi Francesco ...............................................pag. 61
I correlati di neuroimmagine della riabilitazione cognitiva nei
pazienti con SM con sintomi cerebellari
Ruolo dell’’autofagia nella regolazione delle cellule T associata alla SM
Grasso Maria Grazia .............................................pag. 25
Coccia Eliana Marina ............................................pag. 63
Cellule dendritiche plasmacitoidi: ruolo nel controllo della risposta immunitaria in pazienti trattati con IFN-beta
La disfagia nella SM: correlazioni cliniche di risonanza e di fibroscopia seguita da riabilitazione
Pantano Patrizia .....................................................pag. 27
Plasticità strutturale in pazienti con SM e atassia: variazioni longitudinali della microarchitettura della sostanza bianca associate con il training propriocettivo
Coen Matteo ...........................................................pag. 66
Caratterizzazione della parete venosa nella SM
Priori Alberto ...........................................................pag. 29
Constantin Gabriela ..............................................pag. 69
Ruolo di T-cell immunoglobulin and mucin domain (Tim)-1
nel traffico linfocitario nel sistema nervoso centrale infiammato
Restivo Domenico .................................................pag. 31
Fresia Chiara ...........................................................pag. 72
Ruolo dell’acido abscissico nella SM: studio dei livelli in vivo nei
pazienti e degli effetti in vitro su oligodendrociti e neuroni
Smania Nicola ........................................................pag. 33
Giardino Luciana ....................................................pag. 75
Insuccesso della rimielinizzazione in SM: un caso di ipotiroidismo tissutale indotto dall’infiammazione?
La stimolazione transcranica con correnti dirette (tDCS) delle
aree corticali motorie per il trattamento della fatica nella SM
Valutazione del trattamento della disfagia associata a SM con
stimolazione elettrica periferica del faringe. Studio pilota
Effetti di un training dell’abilità di integrazione sensori-motoria
sui disturbi dell’equilibrio in pazienti affetti da SM
BIOMARCATORI
Liuzzi Grazia Maria ................................................pag. 77
Analisi del network proteolitico nella SM: una breccia significativa verso la comprensione dei meccanismi patogenetici e
la valutazione laboratoristica dell’efficacia della terapia
Avanzi Gian Carlo ..................................................pag. 37
Menichetti Gianluca ..............................................pag. 80
Il ruolo di Gas6 e dei suoi recettori nella SM: studio clinico e
biologico
Regolazione oligodendrocitaria del potenziale intrinseco di crescita neuritica
Di Dario Marco ........................................................pag. 39
Profilo di espressione genica delle cellule mononuclete del sangue periferico: identificazione di potenziali marcatori molecolari
per la SM
Perluigi Marzia ........................................................pag. 84
Ruolo dello stress ossidativo nella SM. Un’analisi proteomica e
red-ox proteomica
3
indice
compendio 2013
compendio 2013
Rolla Simona ...........................................................pag. 87
Nencioni Alessio ..................................................pag. 127
FK866 e fluridone: nuovi agenti immunosoppressivi e anti-infiammatori per la sclerosi multipla?
Volpe Elisabetta ......................................................pag. 90
Passani Maria Beatrice ......................................pag. 129
Potenziali terapeutici di antagonisti del recettore istaminergico
H4 nel trattamento di neuropatologie autoimmuni
Caratterizzazione del repertorio TCR dei linfociti Th17 autoreattivi nella SM
Meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione dell’apoptosi
di cellule Th17 nella SM
Sette Claudio ........................................................pag. 131
MyD88: un nuovo bersaglio molecolare per la terapia della SM
VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS
PATHWAYS
PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI
STUDIO FINANZIATI DALLA FISM
Bifulco Maurizio ......................................................pag. 93
Progettazione, sintesi e studio dell’’efficacia terapeutica di nuovi
modulatori del sistema endocannabinoide nella SM
2012, 2011, 2010 ................................................pag. 132
Bolino Alessandra ..................................................pag. 96
Un possibile ruolo della proteina motrice kif13B nella mielinizzazione e ri-mielinizzazione del sistema nervoso centrale
COMITATO SCIENTIFICO
E SEGRETERIA SCIENTIFICA FISM
Bussolati Ovidio .....................................................pag. 98
L’induzione dei trasportatori per il glutamato EAAT da parte dei
retinoidi: un approccio per la prevenzione del danno eccitotossico degli oligodendrociti e dei loro precursori
2012..........................................................................pag. 150
COMITATO SCIENTIFICO FISM
Chiarugi Alberto ...................................................pag. 101
Inibizione del fenomeno dell’epitope spreading con farmaci inibitori della PARP-1 e relative implicazioni teraputiche in modelli
di R-ESA
2011, 2010 ..............................................................pag.154
Chiocchetti Annalisa ...........................................pag. 103
Mappatura funzionale dell’attività di osteopontina nell’ESA e
nella SM
de Curtis Ivan ........................................................pag. 106
Regolazione degli interneuroni GABAergici da parte delle GTPasi Rac: implicazioni per la SM
Fallarino Francesca .............................................pag. 109
Induzione di immunità protettiva in un modello murino sperimentale di SM mediante agonisti dei recettori TLR7 e TLR9
Gauzzi Maria Cristina .........................................pag. 112
1,25(OH)2D3 come modulatore della SM: metabolismo, attività
immunoregolatoria e relazione con l’IFN di tipo I in cellule dendritiche
Lovato Laura .........................................................pag. 115
Marcatura isotopica delle proteine per l’identificazione dei fattori
solubili coinvolti nell’azione neuroprotettiva mediata dalle cellule
staminali mesenchimali Mangano Katia .....................................................pag. 117
Trattamento epigenetico con il composto ipometilante 5-aza2-deossicitidina in modelli animali di SM
Mattoscio Miriam .................................................pag. 120
NTZ-HSC mobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche in
pazienti affetti da SM in terapia con anticorpo monoclonale anti
alfa-4 integrina: rilevanza funzionale e possibili applicazioni
Melcangi Roberto Cosimo ................................pag. 124
Valutazione degli effetti protettivi degli steroidi neuroattivi nel
modello della ESA
4
index
compendio 2013
compendio 2013
INTRODUCTION ..................................................pag. 7
Patergnani Simone ................................................pag. 42
Analysis of mitochondrial parameters in oligodendrocytes during
conditions that mimic inflammation Providing answers to people with MS .........pag. 9
Pieragostino Damiana ..........................................pag. 45
Proteomic strategies in MS: structural and functional investigations on oxidized transthyretin isoforms, a candidate biomarker
of disease
IMAGING
Filippi Massimo ......................................................pag. 14
Verderio Claudia......................................................pag. 48
CFS microglial microvesicles: a potential biomarker for MS
Definition of MRI predictors of long-term disability and cognitive
impairment in patients with relapse onset MS: a 13 years longitudinal study
Giannetti Paolo .......................................................pag. 17
Immunological imaging of MS and Clinically Isolated Syndromes:
the role of activated microglia
KNOWING THE CAUSES OF THE DISEAS
Bernardinelli Luisa .................................................pag. 52
The role of ACCN1 gene in MS susceptibility and pathogenesis
Rovaris Marco ........................................................pag. 19
Pathophysiology of tissue damage in progressive MS: an immunological and MRI comparative study versus motor neuron
disease
Bertolotto Antonio .................................................pag. 55
The relation between neurodegeneration and inflammation in
MS: NR4A2 puts a dampener on inflammation
Calabresi Paolo ......................................................pag. 58
An electrophysiological study of synaptic plasticity in experimental models of MS
QUALITY OF LIFE AND REHABILITATION
Cerasa Antonio ......................................................pag. 23
Neuroimaging correlates of cognitive rehabilitation in MS patients with cerebellar symptoms
Cecconi Francesco ...............................................pag. 61
Role of autophagy in the regulation of T cell associated with MS
Grasso Maria Grazia .............................................pag. 25
Coccia Eliana Marina ............................................pag. 63
Plasmacytoid DC in MS: role in the control of immune response
in patients under IFN-beta therapy
Pantano Patrizia ..................................................pag. 27
Coen Matteo ...........................................................pag. 66
Characterization of venous wall in MS
Dysphagia in MS patients: clinical, MRI and fibroscopy correlation followed by rehabilitation
Structural plasticity in MS patients with ataxia: longitudinal
changes in white matter microarchitecture associated with proprioceptive training
Constantin Gabriela ..............................................pag. 69
Role of T-cell immunoglobulin and mucin domain (Tim)-1 in
lymphocyte trafficking in the inflamed CNS
Priori Alberto ...........................................................pag. 29
Transcranial direct current stimulation (tDCS) of motor areas of
the cerebral cortex for the treatment of fatigue in MS
Fresia Chiara ...........................................................pag. 72
Role of abscisic acid in MS: study of the in vivo levels in patients
and of the in vitro effects on oligodendrocytes and neurons
Restivo Domenico .................................................pag. 31
Pharyngeal electrical stimulation as a treatment for dysphagia
associated with MS: a pilot study
Giardino Luciana ....................................................pag. 75
Remyelination failure in MS: a case of inflammation-induced tissue hypothyroidism?
Smania Nicola ........................................................pag. 33
Effects of sensori-motor integration balance training on balance
disturbances in patients with MS
Liuzzi Grazia Maria ................................................pag. 77
Analysis of the proteolytic network in MS: a hard breakthrough towards the understanding of pathogenesis and laboratory
evaluation of therapy effectiveness
BIOMARKER
Menichetti Gianluca ..............................................pag. 80
Oligodendrocyte regulation of intrinsic neuritic growth
properties
Avanzi Gian Carlo ..................................................pag. 37
The role of Gas6/TRK receptors in MS: a patient and biological
study
Perluigi Marzia ........................................................pag. 84
Role of oxidative stress in MS. A proteomic and red-ox proteomic analysis
Di Dario Marco .....................................................pag. 39
Gene expression profiling of peripheral blood mononuclear
cells: identification of potential biomarkers for MS
Rolla Simona ...........................................................pag. 87
Characterization of autoreactive Th17 T Cell Receptor repertoire in MS
5
index
compendio 2013
compendio 2013
Volpe Elisabetta ......................................................pag. 90
Passani Maria Beatrice ......................................pag. 129
The histaminergic H4 receptor as a novel therapeutic target for
the treatment of autoimmuneneuropathologies
Molecular mechanisms regulating Th17 cell apoptosis in MS
Sette Claudio ........................................................pag. 131
VALIDATION OF NEW TARGETS
PATHWAYS
MyD88: a novel therapeutic molecular target for the treatment
of MS
Bifulco Maurizio .....................................................pag. 93
Design, synthesis and study of the therapeutic efficacy of novel
modulators of the endocannabinoid system in MS
FISM FUNDED RESEARCH
PROJECTS AND FELLOWSHIPS
Bolino Alessandra ..................................................pag. 96
A possible role for the kif13B motor protein in the CNS myelination and remyelination
2012, 2011, 2010 ................................................pag. 132 SCIENTIFIC COMMITTEE AND
SCIENTIFIC SECRETARIAT FISM
Bussolati Ovidio ...................................................pag. 98
Retinoid-dependent induction of EAAT glutamate transporters:
an approach for the prevention of excitotoxicity in oligodendrocytes and oligodendrocyte precursor cells
2012 .........................................................................pag. 150
Chiarugi Alberto ...................................................pag. 101
SCIENTIFIC COMMITTEE FISM
Suppression of epitope spreading with inhibitors of PARP-1
and its relevance to R-EAE treatment
2011, 2010 .............................................................pag. 154
Chiocchetti Annalisa ...........................................pag. 103
Functional mapping of osteopontin activity in EAE and MS
de Curtis Ivan ........................................................pag. 106
Regulation of GABAergic interneurons by Rac GTPases: implications for MS
Fallarino Francesca .............................................pag. 109
Generation of protective immune environment in murine models of MS by TLR7 and TLR9 agonists
Gauzzi Maria Cristina ..........................................pag. 112
1,25(OH)2D3 as a disease modulator in MS: metabolic
pathways, immunoregulatory activity and relationship with the
type I IFN system in dendritic cells
Lovato Laura .........................................................pag. 115
Protein isotope tagging for the identification of molecular features involved in mesenchymal stem cells-mediated neuroprotection
Mangano Katia .....................................................pag. 117
Epigenetic interventions with hypomethilating agent 5-aza2-deoxycytidine in preclinical models of MS
Mattoscio Miriam .................................................pag. 120
NTZ-HSC: functional relevance of haematopoietic stem cell
mobilisation following therapeutic alpha 4-integrin blockade
in MS
Melcangi Roberto Cosimo ................................pag. 124
Evaluation of the protective effects of neuroactive steroids in
EAE model
Nencioni Alessio ..................................................pag. 127
FK866 and fluridone: new NAD+-related immunosuppressive
and anti-inflammatory therapeutics in MS?
6
introduzione
compendio 2013
compendio 2013
«A cent’anni, la mia attività di ricerca è più intensa di quando ne avevo 20. Perché si apre davanti a me questo
scenario: ridare la propria vita a chi è stato colpito, a tutti quelli che sanno cosa è la sofferenza dovuta alla
sclerosi multipla». L’ultima volta che Rita Levi - Montalcini fu presente a un evento AISM, nel 2009, consegnò
all’Associazione e ai suoi ricercatori un programma impegnativo e una meta imprescindibile: si può e, anzi, si
deve fare ricerca fino ai cent’anni e oltre, fino all’ultima goccia di energia, per “restituire” alle persone con SM
la propria vita.
È un segreto che va custodito gelosamente: la ricerca allunga e migliora la vita. Quella dei ricercatori, quella
delle persone con SM e dei loro familiari.
È la ricerca scientifica che rende tutti ugualmente persone, che insegna a domandare e ad individuare risposte
determinanti.
Questo 2013 è il primo anno in cui Rita Levi-Montalcini non potrà mandare il suo saluto al Congresso FISM,
insieme ai complimenti, come fece anche nel 2012: «Ancora una volta desidero congratularmi per il lavoro che
FISM continua a svolgere a livello di ricerca ma soprattutto per la salute delle persone afflitte da questa grave
patologia».
La Montalcini è stata a lungo un interlocutore prezioso e stimolante per tanti ricercatori cresciuti con AISM. A
tutti ha insegnato che la ricerca scientifica si nutre di memoria e di desiderio, di lavoro tenace che dura tutta una
vita e di intuizioni felici che arrivano in un lampo.
Le sue congratulazioni dunque, anche se non si ripeteranno, rimangono vive nel tempo e sono sfida, stimolo,
linfa viva per la ricerca dell’Associazione. Una sfida che AISM continua a raccogliere, come raccontano le pagine di questo Compendio scientifico che presenta gli studi finanziati da FISM e conclusi nel 2012, insieme ai
Progetti speciali attivi.
Anche quest’anno AISM ha investito 6,1 milioni di euro nella ricerca: circa 3,1 milioni per sostenere attraverso il
Bando 17 Progetti di ricerca e 12 Borse di studio; 3 milioni per promuovere importanti progetti Speciali, dal Progetto CoSMo sulla CCSVI nella SM fino a progetti sulla riabilitazione terapeutica, e sulla ricerca socio-sanitaria
centrata sui bisogni delle persone con SM
Sono numeri e titoli importanti, tanto più ragguardevoli in anni di spending review. A differenza di ciò che accade
quasi ovunque, nella ricerca sostenuta da AISM non si è ridotta nessuna spesa, non si è delusa nessuna attesa
delle persone, si sono mantenuti alti standard di investimento e di qualità.
C’è un numero, di quelli che spesso rimangono nascosti, che vale la pena portare alla luce: per il Bando 2012
erano pervenuti al Comitato scientifico FISM 100 progetti e 40 Borse di studio tra cui scegliere. Vuol dire che
la ricerca italiana nella SM è radicata, diffusa, scelta da tanti. AISM ha ‘dovuto’ limitare le proprie scelte, tramite
la peer review, a 17 progetti e 12 Borse. Ma c’è una certezza che va oltre i numeri: stando insieme con forza,
persone con SM, ricercatori, Associazione, istituzioni, cittadini, si può fare ancora meglio e di più, arrivare più
lontano ancora di quanto questo ricco Compendio documenta.
Un ultimo dato indica la direzione scelta con forza dall’Associazione nel promuovere ricerca di eccellenza sulla
SM: se nel 2011 i progetti riconducibili alla ricerca di base avevano fruito del 61% dei fondi disponibili, nel 2012
l’area di ricerca più finanziata è stata quella traslazionale, quella dedicata a tradurre la ricerca fondamentale in
clinica, con il 53% degli investimenti totali. I Progetti speciali, poi, che anno dopo anno vedono aumentare gli
investimenti, sono per la maggior parte svolti in ambito clinico, con un risvolto diretto nella vita delle persone.
Questa è la bussola di AISM: accompagnare la ricerca che finanzia attraverso tutte le fasi per arrivare a potenziare la ricerca traducendola in benefici concreti per le persone con SM.
Mario A. Battaglia
Presidente FISM
7
introduction
compendio 2013
compendio 2013
«At hundred years old, my research is more intense than when I was 20 as it opens up to me this scenario: giving life back to whom has been affected by multiple sclerosis, and to all those who know what is suffering due
to multiple sclerosis». The last time that Rita Levi-Montalcini attended an Italian MS Society event, in 2009, she
gave to the Society and its researchers a challenging program and an essential purpose: you can and, indeed,
you must do research up to hundred years and more, up to the last drop of energy, to “give back” to people
with MS their life.
It is a secret that must be guarded accurately: the research extends and improves life. The one of the researchers, of people with MS and of their families.
The scientific research makes all people as equal individuals, and teaches us to identify key questions and
answers.
This is the first year in which Rita Levi-Montalcini will not send his greetings to Italian MS Foundation Congress,
together with the compliments, as she did also in 2012: «Once again, I would like to congratulate Italian MS
Foundation on the role it continues to play in the research but especially on the health of people affected by this
serious pathology».
For a long time Rita Levi-Montalcini was a precious and stimulating interlocutor for many researchers grown with
the Italian MS Society. She taught to all of us that scientific research is nourished by memory and passion, hard
work lasting a lifetime and brilliant insights which arrive in a flash.
Therefore her congratulations, even if we cannot repeat them, remain alive in time and are challenging, inspiring,
and nourishment for the research promoted by our Society. A challenge that Italian MS Society continues to
take, as it is in the pages of this Compendium which presents the studies funded by Italian SM Foundation and
concluded in 2012, together with the ongoing special projects.
This year Italian MS Society has invested 6.1 million euros in research: about 3,1 million to support 17 research
projects and 12 fellowships by the Annual Call; 3 million to promote important special projects, such as CoSMo
project on CCSVI in MS, projects on therapeutic rehabilitation, and social-health projects targeted to the needs
of people with MS.
These numbers and topics are important, even more in years of spending review. Unlike what happens almost
everywhere, Italian MS Society has not reduced any expenses in research, without disappointing the expectations of people, and keeping investments and quality at high levels.
There are persons that often remain hidden and which is worth bringing to the light: for the 2012 Annual Call our
Scientific Committee received 100 projects and 40 fellowships. It means that Italian research on MS is entrenched, spread, and chosen by many researchers. The Italian MS Society has ‘due’ to limit its choice, through the
peer review, to a total of 17 projects and 12 fellowships. But there is a certainty that goes beyond the numbers:
only staying strongly together with people with MS, researchers, Society, institutions, citizens, we can do even
better and more to get further afield than what is documented in this Compendium.
One more data shows the direction chosen by the Society to keep promoting the research of excellence on
MS: if in 2011 we addressed the 61% of the funds to the projects on fundamental research, in 2012 the more
financed research area was the translational, the one dedicated to translate the fundamental research into the
clinical one, with 53% of the total investment. Then the special projects, where the investments is increasing
year after year, are mainly carried out in a clinical field, with a direct influence on people’s lives.
This is the Italian MS Society track: supporting funded research through all the steps to enhance research translation into concrete benefits for people with MS.
Mario A. Battaglia
Chairman FISM
8
Diamo una risposta alle persone con sclerosi multipla
Diamo una risposta alle persone con sclerosi multipla, questo l’impegno della ricerca promossa e finanziata dalla Associazione Italiana Sclerosi Multipla e attraverso la sua Fondazione. Diamo una risposta alle persone con sclerosi multipla:
oggi, per migliorare la qualità di vita di tutti coloro che sono coinvolti dalla SM; domani, per sviluppare percorsi terapeutici
per tutte le persone con SM e in futuro, per trovare le cause e la cura della SM.
Questa è una battaglia che non si può vincere da soli. L’Associazione si propone ai ricercatori come “partner”: da una
parte i ricercatori portano la loro eccellenza e i loro studi, dall’altra l’ Associazione Italiana SM offre loro molte opportunità:
dai finanziamenti, al supporto per i loro progetti e la loro carriera. Insieme concretizziamo i progetti per dare delle risposte
alle persone con SM. Ma non ci sono solo l’Associazione Italiana SM e i ricercatori: questo cammino è costruito insieme
alle persone coinvolte dalla malattia perché è a partire dalla raccolta e dall’analisi dei loro bisogni che si articolano gli
interventi. È una collaborazione reciproca con le persone con SM e con tutti coloro che hanno a che fare con la malattia
anche indirettamente, siano essi familiari o altri attori.
Il nostro è un impegno ambizioso perché è difficile misurare l’impatto della ricerca sulla malattia. Per fare questo bisogna
vedere come i progetti vanno avanti, come si evolvono e dove portano, e questo richiede un monitoraggio costante e la
collaborazione dei ricercatori.
Nella sequenza con cui vengono di seguito presentati gli studi conclusi nel 2012 si evidenzia un percorso che la ricerca
promossa dall’Associazione sta compiendo.
In prima battuta, gli esiti degli studi sulle neuro-immagini consentono di sviluppare ricerche sulla riabilitazione terapeutica
che già nel presente possono garantire alle persone con SM una vita di qualità, un’autonomia più consistente e una migliore gestione dei sintomi, anche per le condizioni di malattia più severe e invalidanti, per cui oggi non esistono specifiche
terapie farmacologiche.
Ma alle persone con SM interessa molto che «oggi» sia già «domani», che si accelerino le condizioni per identificare nuovi
trattamenti, che arrivi prestissimo il tempo in cui avere a disposizione una vera e propria medicina personalizzata, che
consenta a tutti di poter scegliere il trattamento giusto nel momento giusto. Rispondendo a questa necessità, una nutrito
gruppo degli studi finanziati presenta qui i risultati ottenuti nell’identificazione di nuovi marcatori biologici e nella validazione
di potenziali bersagli terapeutici.
Il terzo pannello dell’ideale trittico della ricerca promossa e finanziata dall’ Associazione Italiana Sclerosi Multipla nel 2012
è, da un altro punto di vista, il primo: nel momento in cui saranno finalmente definite le cause genetiche, virali e immunologiche; la sclerosi multipla non sarà più un presente o un futuro, ma solo un passato. Questa è l’ultima e più importante
frontiera che le persone con SM si aspettano di varcare. Per questo l’Associazione continua a investire risorse in questo
ambito fondamentale di ricerca. È un impegno che viene da lontano, dai primi anni in cui abbiamo iniziato il nostro percorso. E l’Associazione non rinuncerà mai a investire in questo ambito.
Anche se non sono rendicontati in questo Compendio, nel 2012 i «Progetti Speciali» hanno rivestito un importanza cruciale nella collaborazione tra Associazione e comunità scientifica.
Una nuova sfida raccolta nel 2012 riguarda l’accelerazione della ricerca di trattamenti specifici per le forme progressive
di SM. L’associazione Italiana SM è tra i promotori della nuova iniziativa dell’International Progressive Multiple Sclerosis
Collaborative, che proprio in Italia, a Milano, ha vissuto a inizio 2013 il primo meeting scientifico dedicato alla condivisione
di conoscenze, priorità e percorsi della ricerca.
Fondamentale è anche il progetto speciale curato da Maria Pia Abbracchio (Università di Milano). Si impegna nell’identificazione di alcune molecole che, bersagliando il nuovo interruttore molecolare GPR17, potrebbero riparare le lesioni
presenti nella sclerosi multipla. L’obiettivo finale è individuare, tra le molecole studiate, le migliori candidate a sviluppare
una nuova terapia che favorisca la rimielinizzazione delle cellule del sistema nervoso danneggiate dalla SM. Questo percorso è nato da un progetto finanziato da FISM con il Bando 2010. In due anni, ha condotto l’Associazione Italiana SM
e l’Università di Milano a depositare il brevetto per la proprietà intellettuale delle molecole che ora si iniziano a studiare.
Può essere considerato emblematico di ciò che l’Associazione si propone finanziando la ricerca: far crescere uno studio
dal laboratorio fino a un risultato clinico che cambi la vita delle persone. Una ricerca che indirizza altra ricerca. Una ricerca
che, soprattutto, crea valore e opera nel primario interesse delle persone con sclerosi multipla.
Il progetto speciale coordinato da Diego Centonze (Università Tor Vergata, Roma) è un ulteriore impegno di ricerca clinica
nel campo della riabilitazione terapeutica. Punta a sviluppare e convalidare nuovi trattamenti di stimolazione transcranica
per ottimizzare la gestione dei sintomi nei pazienti con SM. Inoltre si propone di studiare il rapporto tra la plasticità indotta
da neurostimolazione, determinanti genetici di trasmissione e plasticità sinaptica, per individuare il meccanismo centrale
di recupero dei sintomi e per identificare le popolazioni di pazienti responsivi o refrattari agli interventi proposti.
9
compendio 2013
compendio 2013
DIAMO UNA RISPOSTA ALLE PERSONE CON SM
Inoltre, vogliamo qui ricordare l’avvio del Progetto speciale «PENSAMI», coordinato dalla dottoressa Solari (Istituto Neurologico C. Besta di Milano), dedicato a fornire alle persone affette da forma grave di malattia e alle loro famiglie un
programma di cure palliative a domicilio, con obiettivo di migliorare la loro qualità di vita. I ricercatori si propongono,
come fine ultimo, di consegnare alle Istituzioni un modello assistenziale che, secondo i principi della medicina palliativa,
si baserà su un approccio globale dei problemi fisici, spirituali e sociali della persona, nel pieno rispetto della sua autonomia e dei suoi valori, integrando i servizi già esistenti e non sostituendosi a essi.
Conoscere le basi genetiche nella patogenesi della SM può portare a individuare le cause e progettare terapie mirate
per combattere la malattia. Per questo è stato promosso il progetto speciale “Immunochip”, che ha coinvolto diversi
gruppi internazionali. Lo studio si propone di analizzare 200.000 varianti genetiche che si trovano su geni risultati associati, negli studi di analisi su tutto il genoma finora eseguiti, a diverse malattie autoimmuni, inclusi 55 geni associati alla
sclerosi multipla.
L’Associazione Italiana SM sostiene con importanti investimenti il Progetto «MESEMS», dedicato al trapianto di cellule
staminali mesenchimali sull’uomo. Partito alla fine del 2012, è coordinato da Antonio Uccelli (Università degli Studi di
Genova) e coinvolge ricercatori clinici e di base di otto nazioni (Italia, Spagna, Francia, Inghilterra, Svezia, Danimarca,
Svizzera e Australia).
Infine, nel 2012 si è concluso l’iter dello studio «CoSMo», su cui AISM ha investito 1,7 milioni di euro. CoSMo è stato il
più ampio studio multicentrico, in doppio cieco, sinora effettuato per indagare l’eventuale associazione tra sclerosi multipla e CCSVI. Sono state analizzate 1.767 persone in 35 centri neurologici, con 26 sonologi formati e distribuiti sull’intero
territorio nazionale. La valutazione finale dello studio CoSMo è stata effettuata su 1.165 persone con diverse forme di
SM, 376 controlli normali e 226 persone con altre malattie neurologiche. I risultati dello studio hanno evidenziato che il
97% delle persone con SM non ha la CCSVI. Nel rimanente 3% la CCSVI è riscontrabile con percentuali del tutto analoghe a quelle rilevate nei pazienti con altre malattie neurologiche e persino nei controlli sani. Lo studio CoSMo è stato
presentato in occasione di due convegni scientifici internazionali: il 43° Congresso SIN (Società Italiana di Neurologia),
svoltosi a Rimini dal 6 al 9 ottobre, e il 28°Congresso ECTRIMS (European Committee for Treatment and Research in
Multiple Sclerosis) tenutosi a Lione in Francia dal 10 al 13 ottobre. A testimonianza della rilevanza di questo studio nella
ricerca internazionale su SM e CCSVI, a gennaio 2013 su Neurological Sciences è stato pubblicato un articolo che
presenta il razionale e la metodologia adottata in CoSMo
(1).
L’associazione Italiana SM vuole dare una risposta alle persone colpite dalla SM. La ricerca può essere un importante
strumento di advocacy. Nessuna persona con SM, nessun ambito di ricerca, nessun bisogno di cura, nessun diritto
rimangono fuori dalla ricerca che AISM sceglie di indirizzare, promuovere e finanziare.
Paola Zaratin
Direttore Ricerca Scientifica AISM-FISM
(1)
Comi G, Battaglia MA, Bertolotto A, Del Sette M, Ghezzi A, Malferrari G, Salvetti M, Sormani MP, Tesio L, Stolz E, Mancardi G. Italian
multicentre observational study of the prevalence of CCSVI in multiple sclerosis (CoSMo study): rationale, design, and methodology.
Neurol Sci. 2013 Jan 24. [Epub ahead of print]
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Providing answer to people with multiple sclerosis
Providing answers to people affected by multiple sclerosis, this is the commitment of the research promoted and
funded by the Italian MS Society and its Foundation.
Providing answers to people with MS: today, to improve the quality of life of all the people affected by MS; tomorrow, to develop therapeutic treatments for all the people with MS and in the future to find the cause and the
cure of MS.
This is a battle we cannot win alone. The Italian MS Society acts as a partner for their researchers: on the one
hand, the researchers bring their excellence and studies, on the other Italian MS Society offers them many opportunities, i.e. financing, support for their projects and career. We want to put our efforts together to make their
projects real in order to give answers to people with MS. This effort doesn’t involve only the Italian MS Society
and the researchers but all the people affected by MS. Only starting from the collection and analysis of their
needs we can plan the interventions. It’s a mutual collaboration with people with MS and all those affected by
the disease, even indirectly, being them relatives or other actors.
Our commitment is challenging as it is difficult to measure the impact of research on MS. In order to do this we
need to monitor constantly projects progression with the help of researchers.
The sequence of studies ended in 2012 and presented below, shows a research pathway promoted by Italian
MS Society. At first, the results of the neuro-images studies allow to develop research on therapeutic rehabilitation that already in the present, can provide people with MS a better quality of life, a more consistent autonomy
and a better management of symptoms. This is true also for more severe and debilitating disease conditions, for
which there are currently no specific drug therapies.
But people with MS are very interested in moving “today” into “tomorrow”, in speeding up the conditions to
identify new treatments. They ask for a real personalized medicine, which allows everyone to choose the right
treatment at the right time. Responding to this need, a large group of funded studies presents here the results
obtained in the identification of new biomarkers and validation of potential therapeutic targets.
The third part of the ideal triptych of research promoted and funded by Italian MS Society in 2012 is, from another point of view, the first: when the genetic, viral and immunological causes, will finally be defined the multiple
sclerosis will be defeated.
This is the last and most important frontier that people with MS are waiting for crossing. Thus, Italian MS Society
continues to invest resources in this key research area. It is a commitment that comes from afar, from the early
years when we started our activity. Italian MS Society will never give up to invest in this field.
In 2012 “Special Projects” have played a key role in the collaboration between Italian MS Society and the scientific community, even if they are not reported in this Compendium,
A new challenge was taken in 2012 for speeding up the research on treatments for progressive forms of MS.
Italian MS Society is one of the promoters of the new initiative of the Progressive Multiple Sclerosis Collaborative, and, at the beginning of 2013 has been organized in Milan the first scientific meeting to share knowledge,
priorities and pathways of research.
Another crucial project is the one coordinated by Maria Pia Abbracchio (University of Milan), focused on identification of several molecules that, targeting the Receptor GPR17, could repair the MS lesions. The final goal is to
identify, among the molecules studied, the best candidate to develop a new therapy that promotes remyelination
of neurons in CNS, damaged in MS. This pathway was identified within a project funded in 2010 FISM Call. In
two years, this project led Italian MS Society and University of Milan to register a patent for the intellectual property of molecules that are now beginning to be studied. It can be considered emblematic of what the Society
want to realize by funding research: to bring a study from the laboratory to a clinical result that could change
people lives. A research that addresses other research. Above all, a research that creates value and work in the
primary interest of people with multiple sclerosis.
The special project coordinated by Diego Centonze (University Tor Vergata, Rome, Italy) is a further commitment
to clinical research in the field of rehabilitation therapy. The project aims to develop and validate new transcranial
stimulation treatments to optimize the management of the symptoms of MS patients. Moreover, it studies the
relationship between plasticity induced by neurostimulation, transmission genetic determinants and synaptic
plasticity to identify the central mechanism for recovery of symptoms and patient populations responsive or
refractory to proposed interventions.
11
compendio 2013
compendio 2013
PROVIDING ANSWER TO PEOPLE WITH MS
Furthermore, we remind here the «PENSAMI» special project, coordinated by Dr. Solari (Neurological Institute
C. Besta, Milan), dedicated to provide people with severe form of the disease and their families a palliative care
program at home. The aim of this project is improving the quality of life of people with MS. The researchers propose, as the final goal, to deliver a welfare model to the institutions, in accordance to the principles of palliative
medicine, which will be based on a global approach of physical, spiritual and social problems of people, with
full respect for their autonomy and values, integrating existing services and not replacing them.
Knowing the genetic basis of the pathogenesis of MS may lead to identify the causes and design targeted therapies to fight the disease. For this reason, the “Immunochip.” special project has been promoted. It involves
several international groups that aim to analyze 200,000 genetic variants of genes found to be associated, in
genome-wide studies conducted so far, to several autoimmune diseases, including 55 genes associated to
multiple sclerosis.
Italian MS Society supports with major investments the “MESEMS” project, dedicated to the transplantation of
mesenchymal stem cells in humans. Started at the end of 2012, the project is coordinated by Antonio Uccelli
(University of Genoa) and involves clinical and basic researchers from eight countries (Italy, Spain, France, England, Sweden, Denmark, Switzerland and Australia).
Finally, the “CoSMo” study, in which Italian MS Society has invested 1.7 million Euros, has been concluded
in 2012. CoSMo is the largest multicenter, double-blind study, so far carried out to investigate the possible
association between MS and CCSVI. We analyzed 1.767 people in 35 neurological centers, with 26 trained
sonologists throughout all national territory. The final evaluation of the CoSMo study was conducted on 1.165
people with different MS forms, 376 healthy controls and 226 people with other neurological diseases. The results of the study showed that 97% of people with MS present no association with CCSVI. In the remaining 3%
CCSVI is found with percentages that are analogous to those seen in patients with other neurological diseases
and even in healthy controls.
The CoSMo study was presented at two international scientific meetings: the 43rd SIN Congress (Italian Society of Neurology), held in Rimini in October 6th to 9th, and the 28th ECTRIMS (European Committee for
Treatment and Research in Multiple Sclerosis ) Congress, held in Lyon, France in October 10th to 13th. As evidence of the importance of this study in the international research on MS and CCSVI, in January 2013 an article
was published on Neurological Sciences presenting rationale and methodology adopted in the CoSMo study .
(1)
Italian MS Society wants to provide answer to people affected by MS. The research can be an important tool
for advocacy. No person with MS, no research field, no need to cure and no right remain outside the research
that Italian MS Society chooses to influence, promote and finance.
Paola Zaratin
AISM-FISM Scientific Research Director
(1)
Comi G, Battaglia MA, Bertolotto A, Del Sette M, Ghezzi A, Malferrari G, Salvetti M, Sormani MP, Tesio L, Stolz E, Mancardi G. Italian
multicentre observational study of the prevalence of CCSVI in multiple sclerosis (CoSMo study): rationale, design, and methodology.
Neurol Sci. 2013 Jan 24. [Epub ahead of print]
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IMAGING
Definizione delle misure RM predittive dell’accumulo di disabilità
e compromissione cognitiva a lungo termine in pazienti con SM
e un esordio a ricadute della malattia: studio longitudinale a 13 anni
Massimo Filippi
Neuroimaging Research Unit, Istituto di Neurologia Sperimentale, Divisione di Neuroscienze
e Università Vita-Salute San Raffaele, Milano
Collaboratori
Giancarlo Comi, Andrea Falini, Vittorio Martinelli, Elisabetta Pagani, Gianna Riccitelli, Maria Assunta Rocca
Collaborazioni con altri gruppi
Angelo Ghezzi, Dipartimento di Neurologia, Ospedale S. Antonio Abate, Gallarate
Domenico Caputo, Dipartimento di Neurologia, Fondazione Don Gnocchi, Milano
PREMESSE E OBIETTIVI
RISULTATI
La risonanza magnetica (RM) è uno strumento paraclinico fondamentale nel work up diagnostico dei
pazienti con sospetta sclerosi multipla (SM) e rappresenta un outcome fondamentale per valutare
l’efficacia delle terapie.
Data la sempre maggiore disponibilità di nuovi trattamenti per i pazienti con SM, per ottimizzare la
scelta terapeutica, è necessario identificare fattori
prognostici precoci per definire quei pazienti con
un’evoluzione clinica sfavorevole a lungo termine e
che necessitano di un trattamento più aggressivo.
È ormai dimostrato che la quantificazione dell’atrofia globale dell’encefalo o di specifiche regioni
cerebrali e le misure derivate dalla RM con trasferimento di magnetizzazione (RM con MT) siano due
tecniche sensibili per caratterizzare i differenti substrati patologici della SM.
Obiettivi di questo studio prospettivo clinico e di
RM sono stati: 1) valutare il ruolo delle tecniche di
RM nel migliorare la comprensione dei meccanismi responsabili dell’accumulo di disabilità clinica
irreversibile nella SM, e 2) identificare misure di RM
predittive di un accumulo a lungo termine di una
compromissione locomotoria e cognitiva in pazienti con SM con esordio a ricadute e remissioni.
Sono stati inclusi nello studio 73 pazienti con SM,
selezionati in quanto valutati clinicamente e con
una RM a 1.5 Tesla al basale e dopo un anno, circa
13 anni fa. Alla rivalutazione dopo 13 anni (durata media del follow up [FU] 13.3 anni), 59 pazienti
hanno effettuato una valutazione neurologica con
definizione della scala di disabilità Expanded Disability Status Scale (EDSS) e del Multiple Sclerosis
Functional Composite (MSFC), 7 pazienti sono
deceduti e 7 pazienti sono stati persi. 44 pazienti
hanno effettuato una valutazione neuropsicologica
(batteria di RAO) e, utilizzando uno scanner a 3.0
Tesla, per 43 pazienti sono state acquisite sequenze di RM convenzionale (doppio eco, double inversion recovery [DIR], 3D T1 e sequenze pesate in
diffusione) e funzionale (resting state).
I principali risultati ottenuti in accordo con gli obiettivi dello studio sono i seguenti:
1. Valutazione delle misure di RM convenzionale e con
MT e delle loro variazioni in un anno nel predire l’accumulo di disabilità clinica dopo 13 anni, in pazienti con SM:
alla valutazione finale, 48/73 (66%) dei pazienti (14 con
sindrome clinicamente isolata [CIS], 21 pazienti con SM
a ricadute e remissioni e 13 con forma secondariamente
progressiva) hanno presentato un peggioramento clinico.
Il modello di analisi multivariata, in cui il deterioramento
dell’EDSS al FU finale era la variabile dipendente, ha identificato il volume di sostanza grigia (SG) al basale (odd
ratio [OR]=0.79, 95% intervallo di confidenza [IC]=0.650.96, p=0.01), come predittore indipendente del peggioramento a lungo termine della disabilità. Il modello risultava in un C-index = 69%.
2. Stima del valore delle precedenti misure di RM nel
predire lo sviluppo di compromissione cognitiva dopo
13 anni in questi pazienti:
al FU, 15/40 (37%) dei pazienti hanno presentato un decadimento cognitivo (dopo aver escluso 4 pazienti già
cognitivamente compromessi al basale).
Il modello di analisi multivariata, in cui il deterioramento
cognitivo al FU era la variabile dipendente, ha identificato
la durata di malattia al basale (OR=1.50, 95% IC=0.942.39, p=0.08) e il valore medio di MT della SG al basale
(OR=0.870, 95% IC=0.77-0.99, p=0.03) come predittori indipendenti della compromissione cognitiva a lungo
termine. Il modello risultava in un valore C-index = 97%.
CONCLUSIONI
Abbiamo applicato un approccio di RM multiparametrico sensibile ai diversi aspetti fisiopatologici della SM
per determinare quali siano i migliori predittori del deterioramento clinico dopo un lungo FU. Il danno alla
SG cerebrale, sia in termini di atrofia che di accumulo
di danno diffuso, durante il primo anno di FU, predice
con una buona accuratezza l’accumulo di disabilità
locomotoria (misurata con l’EDSS) a lungo termine in
pazienti con SM ad esordio a ricadute e remissioni. Il
valore medio di MTR della SG al basale rappresentava
14
IMAGING
il solo predittore di compromissione cognitiva globale
a 13 anni.
Questi risultati rafforzano la nozione che la SM è una
patologia estremamente eterogenea e che le sue manifestazioni cliniche sono il risultato di un complesso
equilibrio tra differenti meccanismi. Questi risultati suggeriscono inoltre che il contributo dei vari substrati fisiopatologici della malattia, incluse le lesioni focali, la
demielinizzazione (misurata con la RM con MT) e la
perdita tissutale irreversibile (misurata con l’atrofia),
possa fornire importanti informazioni sull’evoluzione a
lungo termine dei pazienti con SM.
I risultati di questo studio confermano che l’interessamento della SG gioca un ruolo chiave nell’accumulo di
disabilità locomotoria e di compromissione cognitiva
nei pazienti con SM, e che la sua quantificazione con
opportune misure di RM è utile per monitorare l’evoluzione della malattia.
Definition of MRI predictors of long-term disability and cognitive impairment
in patients with relapse-onset MS: a 13 years longitudinal study
INTRODUCTION AND AIMS
Magnetic resonance imaging (MRI) is a fundamental tool
included in the diagnostic work up of patients with a
suspicion of multiple sclerosis (MS) and is considered
an important outcome measure of treatment efficacy.
Several therapeutic opportunities are currently available for MS patients and, in order to optimize their
management, there is an urgent need to identify early
prognostic factors to better define those MS patients
with a long-term unfavourable clinical outcome who
might need a more aggressive therapy.
The quantification of atrophy of the whole brain or of
specific central nervous system compartments, and
measures derived from magnetization transfer (MT)
MRI are thought to be sensitive to different aspects
of MS pathology.
Aims of this prospective clinical and MRI study were:
1) to assess the role of MR-based techniques to
improve our understanding of the mechanisms responsible for the accumulation of irreversible clinical
disability, and 2) to investigate the MRI predictors of
long-term disability and cognitive impairment in patients with relapse-onset MS.
To this aim, 73 patients with relapse-onset MS were
included in the project. These MS patients were selected because they were studied clinically and with
1.5 Tesla brain MRI at baseline and after one year
13 years ago. At the current reassessment (median
follow up [FU] duration = 13.3 years), 59 patients underwent clinical evaluation, with rating of the EDSS
and MSFC, 7 patients died, and 7 patients were lost.
44 MS patients underwent neuropsychological evaluation (RAO’s battery) and for 43 MS patients, we
also acquired structural (dual-echo, double inversion
recovery [DIR], 3D T1-weighted and diffusion tensor
MRI sequences) and functional MRI (fMRI) (resting
state sequence) using a 3.0 Tesla scanner.
15
RESULTS
The following are the main results obtained according
to the main objectives:
1. Assess the value of conventional and MT MRI quantities and their changes over one year in predicting the
accumulation of clinical disability after 13 years in patients with relapse-onset MS:
at final assessment, 48/73 (66%) patients (14 clinically
isolated syndrome [CIS], 21 relapsing remitting [RR]
MS and 13 secondary progressive [SP] MS) were considered clinically worsened. The multivariate model,
where EDSS deterioration at final FU was the dependent variable, identified baseline gray matter fraction
(GMF) (odds ratio [OR]=0.79, 95% confidence interval
[CI]=0.65-0.96, p=0.01), as independent predictor of
long-term worsening of disability. This model had a Cindex of 69%.
2. Estimate the value of the previous MRI quantities
in predicting the development of cognitive dysfunction
after 13 years in these patients:
at FU, 15/40 (37%) patients were considered cognitively worsened (after excluding 4 patients who were
already cognitively impaired at baseline).
The multivariate model, where cognitive deterioration
at final FU was the dependent variable, identified baseline disease duration (OR=1.50, 95% CI=0.94-2.39,
p=0.08), baseline GM average MTR (OR=0.870, 95%
CI=0.77-0.99, p=0.03) as independent predictors of
long-term cognitive impairment. This model had a very
high C-index of 97%.
CONCLUSIONS
We applied a multiparametric MR approach sensitive to various aspects of MS pathology to determine
which are the best predictors of clinical deterioration
over a long FU period.
Damage to the brain GM, in terms of atrophy and
compendio 2013
compendio 2013
IMAGING
accumulation of diffuse damage during the first year
of FU, predicts with a reasonable accuracy the accumulation of disability (measured with the EDSS) over
the long term in relapse-onset MS patients, while baseline GM MTR was the only predictor of global CI at
13 year visit.
These findings further strengthen the notion that MS
is an extremely heterogeneous disease and that its
clinical manifestations are the result of a complex balance between several pathological factors.
These findings suggest that the interplay among the
different pathological substrates of the disease, including focal lesions, demyelination (measured with
MT MRI) and irreversible tissue loss (measured with
atrophy), can provide important prognostic pieces of
information on the long-term disease outcome.
The results of this long-term study support the notion
that GM involvement plays a key role in the accumulation of locomotor disability and cognitive impairment in patients with MS and prompt the use of MRI
measures of GM damage to monitor MS evolution.
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Pubblicazioni e Comunicazioni a Congressi
Rocca MA, Preziosa P, Copetti M, Riccitelli GC, Messina R, Comi G, Filippi M. Gray matter damage predicts the accumulation of disability and cognitive impairment 13 years later in patients with multiple sclerosis. Neurology 2012; 78 (suppl): S51.005 [doi: 10.1212/WNL.78.1_MeetingAbstracts.S51.005] (64° Congresso American Academy of Neurology, New Orleans
21-18 April 2012)
Filippi M, Rocca MA, Preziosa P, Copetti M, Riccitelli G, Comi G. Grey-matter damage predicts the accumulation of disbilty and cognitive impairment 13 years later in patients with multiple
sclerosis. J Neurol 2012; 259 (Suppl 1): S149-S150 (22° Congresso European Neurological Society. Prague, 9-12 June 2012)
Filippi M, Preziosa P, Copetti M, Riccitelli G, Messina R, Comi G, Rocca MA. Grey matter damage predicts the accumulation of disability and cognitive impairment 13 years later in patients
with multiple sclerosis. Eur J Neurol 2012; 19 (Suppl 1): 346 (16° Congresso European Federation of Neurological Societies. Stockholm, 8-11 September 2012)
Filippi M, Preziosa P, Copetti M, Riccitelli G, Horsfield MA, Martinelli V, Comi G, Rocca MA. Grey matter damage predicts the accumulation of disability and cognitive impairment 13 years
later in patients with multiple sclerosis. Mult Scler Journal 2012; 18 (suppl 4): 34 (28° Congresso ECTRIMS. Lyon, 10-13 October 2012)
Filippi M, Preziosa P, Copetti M, Riccitelli G, Horsfield MA, Martinelli V, Comi G, Rocca MA. Gray matter damage predicts the accumulation of disability and cognitive impairment 13 years
later in patients with multiple sclerosis. Neurol Sci 2012; 33 (Suppl 2): S34-S35 (43° Congresso SIN. Rimini, 6-9 Ottobre 2012)
Rocca MA, Preziosa P, Copetti M, Riccitelli G, Messina R, Comi G, Filippi M. Gray matter damage predicts the accumulation of disability and cognitive impairment 13 years later in patients
with multiple sclerosis. Proc Intl Soc Mag Reson Med 2012; 20: 3121 (20° Congresso ISMRM. Melbourne, 5-11 May 2012)
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di 60.000 €
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16
Il ruolo della microglia attivata nella sclerosi multipla e nelle
sindromi clinicamente isolate: studio di imaging immunologico
Paolo Giannetti
Department of Neuroscience and Mental Health, Imperial College London, London
Mentore
Richard Nicholas
In un recente lavoro, utilizzando la tecnica di tomografia ad emissione di positroni (PET) con il tracciante 11C11195PK (PK), specifico per la microglia
attivata, abbiamo mostrato che pazienti con sclerosi
multipla (SM) presentano nella sostanza bianca apparentemente normale e grigia, livelli di microglia attivata anormali.
Nel presente progetto è stata utilizzata la stessa metodologia per studiare pazienti con sindrome clinicamente isolata, (CIS), nelle stesse sedi anatomiche
per valutarne le possibili indicazioni prognostiche.
Sono stati arruolati 18 pazienti con CIS e 8 volontari
sani. Per tutti la visita iniziale includeva anamnesi,
esame neurologico, risonanza magnetica (RM) e
PET. Tutte queste indagini tranne la PET sono state
ripetute annualmente con almeno due anni di followup. È stato usato il SUPERPK, un metodo di misura del legame specifico del PK relativo al volume
non specifico.
RISULTATI
I risultati hanno mostrato un globale incremento del legame del tracciante nella sostanza bianca apparentemente normale delle CIS rispetto ai controlli, che aumentava
anche con il numero di lesioni alla RM. Nei soggetti con
lesioni alla RM l’attivazione della microglia correlava con
la disabilita`. L’aumento del segnale specifico alla PET si
notava anche a livello della sostanza grigia non corticale.
Da un punto di vista prognostico, i soggetti che hanno
sviluppato SM (sette) mostravano una correlazione tra
disabilità e il segnale PET nel lobo temporale, oltre a un
incremento dell’attivazione della microglia nel putamen.
CONCLUSIONI
L’attivazione della microglia nelle CIS è globalmente
aumentata nella sostanza bianca apparentemente normale e correla con il numero delle lesioni alla RM. L’attivazione della microglia nella sostanza grigia si verifica
soprattutto nelle strutture centrali. In entrambe le sedi
questa attivazione può fornire indicazioni prognostiche.
Immunological imaging of multiple sclerosis and clinically
isolated syndromes: the role of activated microglia
In a previous positron-emission tomography, PET, study with 11C11195PK (PK), a specific ligand for activated
microglia, we have demonstrated abnormal levels of
activated microglia in normal appearing white matter
(NAWM) and grey matter (GM) of subjects with multiple
sclerosis (MS). Here we have applied PK-PET methodology to study the GM and NAWM changes in clinically isolated syndromes (CIS) subjects. PK-PET scan
in CIS patients could add knowledge on the microglia
activation, fundamental for central nervous system inflammation, hence help in therapeutic decisions, further to provide a baseline status with possible prognostic indications. Aim of this project is to assess levels
of microglial activation in the NAWM and GM, and their
possible prognostic value in subjects with CIS.
Eighteen subjects with CIS and 8 healthy controls
17
(HC) subjects have been enrolled. The baseline visit
included history, neurological examination, magnetic
resonance imaging (MRI) and PK-PET scans. All the
assessments apart from the PET scanning were repeated at one year follow-up. We used the SUPERPK
method of analysis, which measures the binding
(PKBP) relative to the non-specific volume.
RESULTS
Global NAWM PKBP in the CIS group was higher
than in the HC group (p=0.019) with a positive correlation with the number of T2 MRI lesions (p=0.0376;
r=0.493). Also in CIS patients with T2 MRI lesions (as
compared to CISs without lesions), levels of PKBP in
NAWM correlated with the expanded disability status
scale (EDSS) (p=0.007; r=0.6725). In the GM of central structures PKBP was higher in the CIS group than
compendio 2013
compendio 2013
IMAGING
in HCs (p=0.0062).
In the CIS subjects who developed MS at one year
(N=7), there was a correlation between baseline EDDS
and PKBP in NAWM of temporal lobe (p=0.0127;
r=0.8617). Moreover, these subjects showed at baseline higher PKBP in putamen (p=0.0025) in comparison
to HCs.
CONCLUSIONS
Microglial activation in the NAWM of CIS subjects is globally increased in comparison to HCs and correlates positively with the number of WM lesions. GM changes in
levels of activated microglia in CISs are localized in central areas. Both NAWM and GM changes in microglia of
CIS could provide prognostic values for developing MS.
.................................................................................................................................................
Giannetti P, Politis M, Su P, Turkheimer F, Malik O, Keihaninejad S, Waldman A, Niccolini F, Reynolds R, Nicholas R and Piccini P. Microglia activation in clinically isolated syndrome:
11
C11195PK-PET change within normal appearing white matter and deep grey matter structures. 65th American Academy of Neurology Meeting, San Diego, March 16-23, 2013.
Niccolini F, Giannetti P, Politis M, Su P, Turkheimer F, Waldman A, Reynolds R, Nicholas R, Paola Piccini P. In Vivo Detection of Thalamo-Cortical Pathology in Patients with Clinical Isolated
Syndrome.. 65th American Academy of Neurology Meeting, San Diego, March 16-23, 2013.
Borsa di studio finanziata con il Bando 2010 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di € 50.000
...................................................................................................................................................
18
Fisiopatologia del danno tissutale nella sclerosi multipla
progressiva: studio comparativo immunologico
e di RM rispetto a pazienti con malattia del motoneurone
Marco Rovaris
Centro Sclerosi Multipla, IRCCS S. Maria Nascente, Fondazione Don Gnocchi, Milano
Collaboratori
Paola Tortorella, Maria Marcella Laganà, Marina Saresella, Ludovica Griffanti, Ivana Marventano,
Pietro Cecconi, Domenico Caputo, Mario Clerici
Massimo Corbo, Cristian Lunetta, Centro Clinico NEMO, Ospedale Niguarda, Milano
Le conoscenze relative alla fisiopatologia della sclerosi
multipla (SM) sono ancora parziali. In particolare non è
del tutto chiaro il ruolo svolto da infiammazione e degenerazione nelle varie fasi della malattia, pur ipotizzandosi
che gli aspetti degenerativi prevalgano nella fase cronicoprogressiva (CP), quando la disabilità clinica dei paziente
è ingravescente ed irreversibile. Una migliore comprensione di questi aspetti è fondamentale per lo sviluppo di
nuove strategie terapeutiche. Tra le malattie del motoneurone, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) può essere
considerata un esempio di patologia principalmente, se
non esclusivamente, degenerativa, in cui il ruolo dell’infiammazione è controverso. Il presente studio si è quindi
proposto di utilizzare metodiche di laboratorio e di risonanza magnetica (RM) per confrontare le caratteristiche
del danno tissutale ed il concomitante profilo immunologico nella SMCP e nella SLA allo scopo di verificare l’ipotesi che la degenerazione sia la componente prevalentemente responsabile dell’accumulo di disabilità nella SM,
ma anche di studiare le correlazioni tra marcatori biologici
e RM di attività/severità della malattia e la loro potenziale
utilità come misure di efficacia di trattamenti sperimentali.
RISULTATI
Lo studio ha completato il previsto arruolamento di 20 pazienti con SM primariamente progressiva (SMPP), 20 pazienti con malattia del motoneurone (MMN) (affetti da SLA
o sclerosi laterale primaria) e 20 controlli sani. Da un punto di vista immunologico, il sangue prelevato dai soggetti
partecipanti è stato analizzato con tecniche di citometria
ottenendo marcatori di processi infiammatori, degenerativi e riparativi. Tutti i soggetti sono stati sottoposti a RM
dell’encefalo e della colonna cervicale con valutazione di
misure di atrofia (volumi tissutali normalizzati) e di integrità
del tratto corticospinale (TCS) e del midollo cervicale (diffusività media –DM- e anisotropia frazionaria –AF), queste
ultime ottenute da scansioni con sequenza pesata in diffusione.
L’analisi dei dati RM ha rivelato la presenza di significative
alterazioni del TCS sia nei pazienti con SMPP che in quelli
con MMN: in entrambi i gruppi, infatti, i valori medi di MD
e AF sono risultati rispettivamente superiori ed inferiori ri-
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spetto ai controlli sani. Nei pazienti con SMPP i valori di
DM e FA erano significativamente alterati anche nel midollo cervicale. Il confronto tra i due gruppi di pazienti ha
rivelato che il danno del TCS è maggiore nei pazienti con
MMN che in quelli con SMPP (valori di DM significativamente più elevati nei primi), mentre l’atrofia della sostanza
grigia cerebrale è più marcata nei pazienti con SM che in
quelli con MMN. Tra i due gruppi di pazienti non è stata riscontrata alcuna differenza significativa negli altri parametri valutati, inclusa l’atrofia della sostanza bianca e i valori
di DM/AF del midollo cervicale.
Sia nei pazienti con SMPP che in quelli con MMN le percentuali di linfociti CD4+ produttori di interleuchina (IL)-17,
IL-22 e interferone (IFN)-gamma, così come quella di linfociti CD8+ produttori di BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), erano aumentate rispetto ai controlli sani.
Nei pazienti con MMN anche la percentuale di linfociti
produttori di IL-21 era aumentata rispetto ai controlli sani,
mentre la percentuale di linfociti CD4+ produttori di BDNF
era più elevata sia rispetto ai controlli sani che rispetto ai
pazienti con SMPP.
Non sono emerse correlazioni degne di nota tra i parametri suddetti e la gravità clinica delle due condizioni,
come espressa dai punteggi dei pazienti a scale di disabilità specifiche per la SM e le MMN. Sfortunatamente,
meno del 50% dei pazienti arruolati hanno completato la
prevista batteria di test neuropsicologici in modo completo e analizzabile; per questo motivo, la prevista analisi di
eventuali associazioni tra marcatori RM o immunologici e
il grado di compromissione cognitiva dei soggetti non è
stata effettuata.
CONCLUSIONI
I risultati di questo studio confermano che SM e MMN,
pur essendo entrambe caratterizzate da disabilità
neuromotoria ingravescente, presentano significative
differenze di sede per quanto riguarda il danno tissutale prevalente, che si colloca nel TCS per la MMN
ma comprende anche la sostanza grigia nella SM, a
conferma della ipotesi patogenetica che, in quest’ultima malattia, il coinvolgimento della sostanza grigia
stessa ricopra un ruolo fondamentale e non sia solo
secondario al danno della sostanza bianca. I riscontri
compendio 2013
compendio 2013
IMAGING
immunologici supportano l’ipotesi che, sia nella SMPP
che nelle MMN, agiscano meccanismi infiammatori
e non solo degenerativi. Il riscontro di un aumento di
cellule produttrici di BDNF in pazienti con SMPP ma
ancor più in pazienti con MMN può essere interpretato
come un segno di stimolazione di meccanismi riparativi
nel tentativo di controbattere l’evoluzione del danno.
Lo studio ha fornito risultati interessanti, ma sicuramente preliminari e meritevoli di conferma da parte di
altri gruppi in popolazioni di dimensioni maggiori e in
studi longitudinali, soprattutto per verificare il possibile
utilizzo di queste misure come marcatori di evoluzione
della malattia.
Pathophysiology of tissue damage in progressive multiple sclerosis:
an immunological and MRI comparative study versus motor neuron disease
Our knowledge about multiple sclerosis (MS) pathophysiology is still limited. In particular, the role played by
inflammation and degeneration in the different disease
stages remains not fully understood, even though it
has been hypothesized that degenerative features may
prevail in the chronic progressive (CP) phase, when patients’ disability is worsening and irreversible. A better
understanding of these aspects is of outmost importance for the development of new therapeutic strategies. Among motor neuron disorders, amyotrophic
lateral sclerosis (ALS) can be considered a mainly, if not
merely, degenerative condition, in which the role played by inflammation is controversial. The present study
was, therefore, performed to compare the characteristics of tissue damage and the concomitant immunological profile in patients with CP MS and ALS, using
laboratory and magnetic resonance (MR) techniques.
The aims were to test the hypothesis that degeneration
is the main component underlying disability accumulation in MS and to investigate the correlations between
MR-based and laboratory markers of disease activity/
severity, as well as their potential utility as outcome measures of experimental treatment efficacy.
RESULTS
We completed the planned enrollment of 20 patients
with primary progressive (PP) MS, 20 with motor neuron disease (MND) (ALS or primary lateral sclerosis)
and 20 healthy controls. As regards immunology, flowcytometry analysis of subjects’ blood samples was
performed, to obtain markers of tissue inflammation,
degeneration and repair. All subjects underwent MR
imaging (MRI) of the brain and cervical cord. Measures
of atrophy (normalized tissue volumes) and cortico-spinal tract (CST) / cervical cord integrity (mean diffusivity
–MD- and fractional anisotropy –FA) were computed.
MD and FA were derived from diffusion-weighted sequences.
20
MRI data analysis revealed the presence of significant
CST abnormalities in both PPMS and MND patients.
In both groups, average MD and FA values were respectively higher and lower than in controls. In PPMS
patients, MD and FA were also abnormal in the cervical cord. Between-patient groups comparisons revealed that CST damage was more pronounced in MND
than in PPMS patients (being MD values significantly
higher in the former group), while brain grey matter
atrophy was significantly greater in MS than in MND
patients. No between-patient group differences were
found for the other MRI parameters, including white
matter atrophy and cervical cord MD/FA. A significant
increase of interleukin (IL)-17, IL-22 and interferon
(IFN)-gamma producing CD4+, as well as of brainderived neurotrophic factor (BDNF) CD8+ cell percentages was found both in MS and in MND patients.
IL-21 -producing CD4+ cell percentage was also significantly higher in MND patients than in controls. An
increased percentage of BDNF-producing CD4+ cells
was found in MND compared to both controls and MS
patients. No relevant correlations were found between
all these parameters and the clinical severity of MS
and MND, as expressed by disease-specific disability scale scores. Unfortunately, less than 50% of patients completed the neuropsychological assessment
in a reliable manner. Thus, the planned analysis of the
correlations between MRI/immunological markers and
patients’ cognitive profile could not be performed.
CONCLUSIONS
The results of this study confirm that MS and MND,
albeit being both characterised by worsening neurological disability, may have different patterns of tissue
damage distribution. Such damage seems to be prevalent in the CST for MND, whereas in MS it mostly
affects grey matter too. This finding corroborates the
hypothesis that, in MS, grey matter damage plays a
pivotal role in the disease pathogenesis and is not
merely secondary to white matter disruption. Immunological findings support the hypothesis that, in both
MS and MND, inflammation and not only degeneration
are acting as pathogenetic mechanisms. The presence of increased BDNF-secreting cells in PPMS and
even more in MND patients could be interpreted as
an attempt to counterbalance the disease worsening
by stimulating reparative processes. This study has
produced interesting, albeit preliminary, results, which
warrant confirmation from other researcher groups
in larger patient samples and in longitudinal studies,
mainly to assess whether these measures could be
used as paraclinical markers of disease evolution.
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Rovaris M, Tortorella P, Laganà M, Saresella M, Clerici M, Marventano I, Mendozzi L, Tronci F, Cavarretta R, Cecconi P, Caputo D. Pathophysiology of tissue damage in progressive multiple
sclerosis: an immunological and MRI comparative study vs. motor neuron disease. Congresso Scientifico Annuale FISM, 2011
Tortorella P, Griffanti L, Saresella M, Laganà M, Marventano I, Pinardi G, Corbo M, Lunetta C, Cecconi P, Caputo D, Clerici M, Rovaris M. Pathophysiology of tissue damage in progressive
multiple sclerosis: an immunological and MRI comparative study versus motor neuron disease. Multiple Sclerosis Journal 2011; 17 (Supplement 10): S380.
Tortorella P, Griffanti L, Saresella M, Laganà M, Marventano I, Pinardi G, Corbo M, Lunetta C, Cecconi P, Caputo D, Clerici M, Rovaris M. Pathophysiology of tissue damage in progressive
multiple sclerosis: an immunological and MRI comparative study versus motor neuron disease. Neurological Sciences 2011; 32 (Supplement): S496.
Tortorella P, Laganà M, Saresella M, Griffanti L, Marventano I, Pinardi G, Corbo M, Lunetta C, Cecconi P, Caputo D, Clerici M, Rovaris M. Pathophysiology of tissue damage in progressive
multiple sclerosis: an immunological and MRI comparative study versus motor neuron disease. Neurology 2012 (Supplement): P3055.
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2009 per il periodo di due anni e l’ammontare di 55.000 €
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QUALITÀ DELLA VITA
E RIABILITAZIONE
I correlati di neuroimmagine della riabilitazione cognitiva
nei pazienti con sclerosi multipla con sintomi cerebellari
Antonio Cerasa
Unità di Neuroimmagini, ISN-CNR di Germaneto, Catanzaro
Collaboratori
Aldo Quattrone, Paola Valentino, Rita Nisticò, Domenico Pirritano, Maria Cecilia Gioia, Carmelina Chiriaco,
Paola Perrotta
Il presente progetto si è proposto di sviluppare una metodica innovativa per la riabilitazione cognitiva di pazienti
affetti da sclerosi multipla ed in particolare di pazienti con
forma recidivanti remittenti con segni cerebellari. Visto
che questa malattia (ed in particolare le forme cerebellari) è associata con il decadimento delle abilità attentive, il
presente progetto aveva come scopo principale quello di
sviluppare un modello riabilitativo che fosse specifico ed
intensivo per queste facoltà. Per questo motivo sono stati
selezionati gruppi di pazienti (con o senza danno cerebellare) che avessero una preponderante compromissione
delle abilità attentive i quali sono stati sottoposti sia ad una
valutazione neuropsicologica che di risonanza magnetica
funzionale, pre e post trattamento.
RISULTATI
I principali risultati di questo studio indicano che la
riabilitazione cognitiva delle abilità attentive produce un effettivo miglioramento, come rilevato in particolare dal test
Stroop, ma soprattutto si associa a fenomeni di plasticità
neurale rilevati con la risonanza magnetica funzionale in
aree criticamente coinvolte in questi processi: cervelletto
posteriore e corteccia parietale superiore.
Le risorse finanziante dall’AISM sono state in parte utilizzate soprattutto per l’attuazione del protocollo di ricerca
relativo alla della risonanza magnetica e per la divulgazione scientifica dei risultati di questo studio in diversi congressi. Non tutti gli obiettivi del lavoro sono stati raggiunti,
in quanto non siamo riusciti a raggiungere un numero
staticamente valido di pazienti con segni cerebellari i quali
ci avrebbero permesso di capire meglio quale ruolo gioca
esattamente questa struttura nei fenomeni di recupero
funzionale delle abilità attentive.
CONCLUSIONI
I risultati raggiunti hanno portato ad una fondamentale innovazione scientifica in questo campo di studi e sono stati premiati con una pubblicazione sulla
più importante rivista al mondo di neuro riabilitazione:
Neurorehabilitation and Neural Repair.
Le eventuali ricadute di questo progetto potrebbero
essere legate più al medio/lungo termine in vista di
uno sviluppo della terapia riabilitativa rimborsata dal
servizio sanitario nazionale. Infatti, in maniera simile a
quanto previsto oggigiorno per la riabilitazione cognitiva di pazienti affetti da ictus o trauma cranico, anche per pazienti con sclerosi multipla dovrebbe essere
contemplata la possibilità di rivolgersi a strutture pubbliche per il recupero di funzioni cognitive importanti
per migliorare la qualità della vita di questi pazienti così
come il loro inserimento nel mondo lavorativo.
Neuroimaging correlates of cognitive rehabilitation in multiple sclerosis
patients with cerebellar symptoms
This project is aimed at developing an innovative method for cognitive rehabilitation of patients suffering
from multiple sclerosis and in particular of patients
with relapsing-remitting form with cerebellar signs.
Since this disease (and in particular the cerebellar form) is associated with deficits of attentional
abilities, the aim of this project was to develop a
new specific and intensive rehabilitation approach
23
for recovering of these faculties. For this reason,
we selected groups of patients (with or without
cerebellar damage) that had a predominant impairment of attentional skills which underwent to both
neuropsychological and functional neuroimaging
examinations, pre-and post-treatment.
RESULTS
The main results of this study are that the cognitive reha-
compendio 2013
compendio 2013
QUALITÀ DELLA VITA
E RIABILITAZIONE
bilitation of attention abilities produce a real improvement as revealed by the Stroop test, but also is
associated with neural plasticity changes detected
by functional magnetic resonance imaging in brain
regions critically involved in these processes: cerebellum posterior and superior parietal cortex.
Founding provided by the AISM were partly used
primarily for the implementation of the research
protocol within the MRI and for the dissemination
of the scientific results of this study in different
conferences. Not all objectives have been achieved, as we are not able to reach a statically valid number of patients with cerebellar signs which
would enable us to better understand what role is
played by cerebellum on the functional recovery of
attention abilities.
CONCLUSIONS
Our results have led to a fundamental scientific advances in this field of study and were rewarded with a publication on the most important scientific journal in the
worlds in the field of neuro rehabilitation: Neurorehabilitation and Neural Repair. Any impact of this project
could be linked more to the medium / long term since
the development of rehabilitation therapy re-founded by
the national health service. In fact, in a manner similar
to what is expected today for cognitive rehabilitation of
patients suffering from stroke or head trauma, even for
patients with multiple sclerosis should be contemplated
the possibility of contact in public facilities for the recovery of cognitive functions important for improving the
quality of life of these patients as well as their integration
into the working world.
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Cerasa A, Valentino P, Chiriaco C, Pirritano D, Nisticò R, Gioia MC, Trotta M, Del Giudice F, Tallarico T, Rocca F, Augimeri A, Bilotti G, Quattrone A. MR imaging and cognitive correlates of relapsingremitting multiple sclerosis patients with cerebellar symptoms. Journal of Neurology 2013, DOI: 10.1007/s00415-012-6805-y.
Cerasa A, Gioia MC, Valentino P, Nisticò R, Chiriaco C, Pirritano D, Tomaiuolo F, Mangone G, Trotta M, Talarico T, Bilotti G, Quattrone A. Computer-assisted cognitive rehabilitation of attention
deficits for multiple sclerosis: a randomized trial with fMRI correlates. Neurorehabilitation and Neural Repair 2013, DOI: 10.1177/1545968312465194
Cerasa A, Passamonti L, Valentino P, Nisticò R, Pirritano D, Gioia MC, Mangone G, Chiriaco C, Quattrone A. Cerebellar-Cortical dysfunctions in multiple sclerosis patients with cerebellar signs.
Experimental Neurology 2012; 237(2): 418-426
Cerasa A, Bilotta E, Augimeri A, Cherubini A, Pantano P, Zito G, Lanza P, Valentino P, Aldo Quattrone. A Cellular Neural Network methodology for the automated segmentation of Multiple Sclerosis
lesions. Journal of Neuroscience Methods 2012; 203(1):193-9.
Gioia MC, Cerasa A, Valentino P, Chiriaco C, Pirritano D, Nisticò R, et al Blind Randomized Controlled Study of the Efficacy of Cognitive Rehabilitation in Multiple Sclerosis. Società Italiana di
Neurologia (SIN), 22-26 Ottobre, Torino, 2011.
Nisticò R, Cerasa A, Valentino P, Pirritano D, Chiriaco C, Gioia MC et al Cortical-Cerebellar dysfunctions in multiple sclerosis patients with cerebellar signs.. Società Italiana di Neurologia (SIN),
22-26 Ottobre, Torino, 2011.
Valentino P, Cerasa A; Chiriaco C, Pirritano D, Nisticò R, Gioia MC, et al.Neuroanatomical correlates of relapsing-remitting multiple sclerosis patients with cerebellar symptoms: a VBM study.
Società Italiana di Neurologia (SIN), 22-26 Ottobre, Torino, 2011.
Cerasa A, Valentino P, Chiriaco C, Pirritano D, Nisticò R, Gioia MC et al. Neuroimaging correlates of cognitive rehabilitation in multiple sclerosis: an intervention for attentional deficits”. Società
Italiana di Neurologia (SIN), 22-26 Ottobre, Torino, 2011.
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24
La disfagia nella sclerosi multipla: correlazioni cliniche
di risonanza e di fibroscopia seguita da riabilitazione
Maria Grazia Grasso
IRCCS Fondazione S. Lucia, Roma
Collaboratori
Alessandro Cuccaro, Alessandro Clemenzi, Roberta Beccari
Claudio Solaro, Dipartimento Testa-Collo, U.O. Neurologia, ASL3, Genova
Francesco Patti, Centro Sclerosi Multipla, Dipartimento di Neurologia, Università di Catania, Catania
Roberto Bergamaschi, Dipartimento di Neurologia - Istituto Neurologico C. Mondino, Pavia
I problemi disfagici, ovvero le difficoltà ad ingoiare cibi
e/o liquidi, sono relativamente comuni nella sclerosi
multipla (SM) e si stima siano presenti tra il 33% e il
43 % dei casi. La disfagia permanente può iniziare
ad essere rilevante nelle persone con moderata disabilità e la prevalenza aumenta con l’aumento della disabilità raggiungendo il 65% nelle persone con
più alto grado di disabilità. La diagnosi precoce può
essere importante per limitare le conseguenze di
questa disfunzione. Infatti, la presenza della disfagia può essere di grande rilevanza, sia compromettendo la qualità della vita sia aumentando il rischio
di infezioni polmonari e di malnutrizione, frequente
causa di morbilità e morte nella SM.
Il sintomo è spesso sottostimato e il suo trattamento è finora limitato solo a centri di alta specializzazione. e rimane ancora senza un’adeguata evidenza
scientifica.
Scopo della ricerca è stato valutare la frequenza del
sintomo disfagia, e costruire un percorso riabilitativo individualizzato in base alle caratteristiche del
disturbo.
RISULTATI
Sono state arruolate 219 persone con SM reclutate da
4 centri italiani, con età media di 50 anni (±11.9) durata di malattia di 15 anni (±10) EDSS (scala che misura la disabilità) di 5.4 (±2,3) Ogni persona è stata
sottoposta a valutazione mediante scale cliniche per
verificare il grado di disabilità neurologica, la presenza del disturbo disfagico, la personale percezione
della fatica e della qualità della vita. È stata inoltre sottoposta a esame di risonanza magnetica per
evidenziare correlazioni del danno anatomico con la
presenza del disturbo deglutitorio.
Per obiettivare il disturbo disfagico è stata utilizzata
una valutazione mediante esame con fibroscopia,
strumento in grado di osservare dal vivo le diverse
disfunzioni della deglutizione. Il disturbo disfagico
è stato evidenziato in 61 persone che, in base alla
25
gravità del loro quadro, sono state inserite in un
programma individualizzato, previo un periodo di inserimento in lista di attesa. Di queste, 38 sono state sottoposte ad un reale trattamento riabilitativo,
mentre le rimanenti 23 hanno ricevuto consigli su
come comportarsi quando il disturbo si manifesta.
Il terapista ha focalizzato il trattamento osservando la persona durante il pasto, dando consigli sulla
consistenza del cibo e sulle posture più idonee da
adottare per rendere sicura la deglutizione.
Nelle 32 persone trattate con esercizi specifici, il terapista ha operato per aumentare la sensibilità tattile e termica del tratto superiore degli organi deputati
alla deglutizione, usando specifiche tecniche per ottimizzare l’attività motoria orale, faringea e laringea,
aumentando l’efficienza del riflesso della tosse. In
base al grado di gravità della disfagia il numero dei
trattamenti è stato variabile tra 3 e 15 sedute.
CONCLUSIONI
La prevalenza della disfagia nella nostra popolazione è simile a quella stimata in letteratura, confermando l’importanza che il sintomo deve essere
attentamente valutato, preso in carico e indirizzato
a strategie che permettano un’adeguata alimentazione in condizioni di sicurezza.
Dalla nostra casistica appare rilevante che già il
counselling informativo possa rappresentare uno
strumento per avviare la persona con SM e disfagia
lieve ad una deglutizione sicura con una prospettiva
di miglioramento della vita.
Nelle persone con disfagia più severa diventa invece indispensabile una presa in carico riabilitativa
che consenta un’efficacia di trattamento fondato su
elementi strumentalmente oggettivabili.
compendio 2013
compendio 2013
QUALITÀ DELLA VITA
E RIABILITAZIONE
Dysphagia in multiple sclerosis patients:
clinical, MRI and fibroscopy correlation followed by rehabilitation
Swallowing problems are relatively common in MS people and have been estimated to occur in 33 to 43%
of cases. Permanent dysphagia starts in mildly impaired
patients and becomes increasingly prevalent as disability
increases, reaching 65% in the most severely disabled
subjects. Thus, an early diagnosis of dysphagia may limit the consequences of this dysfunction. The impact
of dysphagia may be marked, not only reducing the
patient’s quality of life but also creating a potential risk
of aspiration and consequent bronchopneumonia, a frequent cause of morbidity and death in MS. However, this
symptom is sometimes underestimated, with treatment
being limited to highly specialized centers; moreover, the
role of rehabilitation as a treatment has not yet been fully
established.
The aims of the study were to evaluate the frequency
of dysphagia and to plan an individualised rehabilitative training programme, according to the severity of the
symptoms.
RESULTS
We recruited 219 consecutive patients, with a mean age
of 50 (±11.9) years, mean disease duration of 15 (±10) years and a EDSS of 5.4 (±2.3). Every person was evaluated
by means of a general and neurological examination as
well as scales designed to assess activity, fatigue, quality
of life and identify the presence of swallowing difficulties.
Furthermore, every patient underwent a brain MRI to evaluate correlations between symptoms and anatomical damage. To objectively evaluate the dysphagic problems, we
used the Fiberoptic Endoscopy Evaluation of Swallowing
(FEES), a device that assesses swallowing dysfunctions
in vivo
Dysphagic dysfunctions were found in 63 MS people.
According to the severity of dysphagia, the patients were
placed on a waiting list to receive rehabilitative training.
Thirty-two of these patients underwent the full rehabilitative treatment, whereas the remaining 31 received suggestions on the self-cues they should use when difficulty
occurs. The therapist observed the whole feeding session, providing advice on postures, food consistencies
and ways of swallowing safely. In addition, the 32 patients
who underwent the full treatment were also given advice
on how to increase thermal and tactile sensitivity in the
upper swallowing tract, using patterns to optimize oral,
pharyngeal and/or laryngeal motor activity (oral praxis),
and on how to enhance the efficiency of the cough reflex.
Patients received from 3 to 15 treatment sessions according to the severity of dysphagia.
CONCLUSIONS
The prevalence of dysphagia in our population was similar to that estimated in the literature, thus confirming
the importance of the presence of this symptom, which
needs to be carefully evaluated and treated by means
of strategies that ensure a correct and safe food intake. The results of our study suggest that counselling in
people with slight dysphagia makes swallowing safer
and consequently improves the quality of life in such
patients. People with severe dysphagia instead require
treatment based on a rehabilitative approach and objective evaluations.
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Grasso MG, Cuccaro A, Solaro C, Patti F, Bergamaschi R.
Dysphagia in MS: clinical correlation between MR and FEES and following rehabilitation.
Neurol Sci 33,suppl October , S 366
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2009 per il periodo di 2 anni (prorogato 14 mesi) e l’ammontare di 80.000 €
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Plasticità strutturale in pazienti con SM e atassia: variazioni
longitudinali della microarchitettura della sostanza bianca
associate con il training propriocettivo
Patrizia Pantano
Dipartimento di Neurologia e Psichiatria, Sapienza Università di Roma, Roma
Collaboratori
Luca Prosperini, Emilia Sbardella, Eytan Raz, Francesca Tona, Nikolas Petsas, Carlo Pozzilli
Il deficit dell’equilibrio è frequentemente osservato
nei pazienti affetti da sclerosi multipla (SM) e rappresenta uno tra i sintomi maggiormente disabilitanti, poiché impatta negativamente sulla mobilità,
riduce l’autonomia, espone al rischio di fratture e
traumatismi e, in definitiva, compromette la qualità
della vita. I meccanismi neuropatologici alla base
dei disturbi dell’equilibrio nei pazienti con SM non
sono stati ancora completamente delucidati. La
compromissione del controllo posturale osservata
in queste persone, le quali sono portatrici di un
danno esteso e variabile a livello del sistema nervoso centrale (SNC), può essere dovuto a molteplici cause che differiscono da paziente a paziente. Non esistono ad oggi terapie farmacologiche
efficaci nel ridurre i disturbi dell’equilibrio; tuttavia,
recentemente sono state fornite evidenze cliniche
che i pazienti con SM e atassia possano migliorare il loro equilibrio mediante una riabilitazione di
tipo visuo-propriocettivo. Nel presente progetto il
nostro obiettivo era quello di investigare: (i) la relazione tra deficit di equilibrio, stimato mediante
posturografia statica computerizzata, e danno al
SNC (encefalo e midollo spinale), valutato mediante tecniche di Risonanza Magnetica (RM) non-convenzionale; (ii) la relazione tra i miglioramenti indotti
dalla riabilitazione e le variazioni microstrutturali a
livello dell’encefalo e del midollo spinale.
RISULTATI
Sono stati finora arruolati 50 pazienti con SM e
20 controlli appaiati per sesso ed età. Tutti sono
stati sottoposti ad un esame di posturografia statica e a RM con un magnete 3 Tesla. Abbiamo osservato un danno esteso della sostanza bianca e
della grigia in 45 pazienti rispetto ai 20 controlli.
Nei pazienti, la severità del deficit di equilibrio è
risultata associata al danno di alcuni tratti specifici di sostanza bianca (connessioni cerebellari ed
emisferiche, ponte, talamo, fibre associative sovratentoriali) e all’atrofia della sostanza grigia del lobo
anteriore del cervelletto e del lobulo VIII. In un altro
studio, abbiamo osservato che il deficit di equilibrio, valutato ad occhi aperti, era principalmente
correlato all’atrofia del verme cerebellare e al cari-
27
co lesionale sui peduncoli cerebellari medi, mentre
l’atrofia della corda midollare e il carico lesionale
a livello del troncoencefalo risultavano correlati
ad un peggiore controllo posturale ad occhi chiusi (privazione visiva). Di conseguenza, questi dati
ci forniscono non solo il fondamento anatomico
per interpretare il substrato patologico dei disturbi
dell’equilibrio, ma anche per capire quali strutture
danneggiate dalla malattia potranno essere coinvolte nei miglioramenti indotti dalla riabilitazione.
In ultimo, abbiamo dimostrato l’efficacia di un
intervento riabilitativo domiciliare mediante Nintendo Wii Balance Board in 36 pazienti con SM.
Sebbene si tratti di una piattaforma ludica commerciale, essa è stata recentemente inclusa tra
gli strumenti riabilitativi basati su feedback visivo/
realtà virtuale, analogamente agli esercizi visuopropriocettivi. Un sottogruppo di pazienti arruolati
in quest’ultimo studio sono stati sottoposti a RM
seriate nel tempo con lo scopo di valutare i cambiamenti microstrutturali del SNC indotti dall’esercizio riabilitativo. L’acquisizione e l’analisi dei dati
sono ancora in corso.
CONCLUSIONI
I nostri dati suggeriscono che l’atrofia del cervelletto nei pazienti con SM sia secondaria alla
disconnessione della corteccia cerebrale e del
midollo spinale, quindi supportando l’ipotesi che
l’atrofia nella SM sia un evento secondario alla demielinizzazione.
L’individuazione di specifiche strutture del SNC
coinvolte nel deficit di equilibrio dovuto alla SM
può permettere una migliore selezione del paziente che necessita di strategie riabilitative mirate a
ridurre il rischio di cadute a terra accidentali.
compendio 2013
compendio 2013
QUALITÀ DELLA VITA
E RIABILITAZIONE
Structural plasticity in MS patients with ataxia: longitudinal changes in brain
microarchitecture associated with proprioceptive training
Balance impairment is frequently observed in patients
with multiple sclerosis (MS) and it is one of the most disabling symptoms, since it reduces mobility and independence, leads to falls and injuries, and impacts upon
overall quality of life. The neuropathological mechanisms
leading to balance impairment in people with MS are not
yet well determined. The poor postural control in these
persons, who have an extensive and variable damage in
central nervous system (CNS), may be due to multifactorial causes that differ from one person to the next.
Pharmacological interventions aimed at ameliorating
balance disturbances are largely ineffective, while there is recent clinical evidence that patients with MS and
suffering from ataxia can improve their balance with
visuo-proprioceptive training. In this project, we aimed
to investigate: (i) the relationship between imbalance, as
estimated by computer-based static posturography, and
CNS damage (brain and spinal cord), as detected by
non-conventional Magnetic Resonance Imaging (MRI)
techniques; (ii) the relationship between training-induced
improvements and changes in brain and spinal cord and
microarchitecture of the brain and spinal cord.
and hemispheres, pons, thalamus, and supratentorial associative bundles, as well as with grey matter atrophy of
anterior lobules and lobule VIII of the cerebellum. In another
study, we found the balance deficit in eyes open condition
as mainly related to cerebellar atrophy and demyelination
of middle cerebellar peduncles, while spinal cord atrophy
and lesions in the brainstem were the principal contributors of a worse postural control when the visual input was
lacking (eyes closed). Therefore, these findings provides us
an anatomical framework not only for interpreting the pathological substrate of the balance disorders, but also to
detect rehabilitation-related changes in disease-modified
brain structures.
Lastly, we also demonstrated the effectiveness of a homebased training of balance using the Nintendo Wii Balance
Board in 36 patients with MS. Albeit commercial, this game
platform has recently been included into the definition of visual feedback/virtual reality training and it works similarly to
visuo-proprioceptive training. A subgroup of patients with
MS originally enrolled in this latter study underwent also serial MRI scan in order to detect rehabilitation-induced changes also in terms of CNS microstructures. Data acquisition
and analysis are still ongoing.
RESULTS
CONCLUSIONS
A total of 50 patients with MS and 20 sex/age-matched
healthy volunteers were enrolled up to now. They underwent a static posturography assessment and MRI of
brain and spinal cord by a 3 Tesla magnet. We found extensive white and grey matter damage in 45 PwMS when
compared to healthy controls. The severity of balance impairment in patients with MS was associated with white
matter tract damage, including the cerebellar connections
Our findings suggest a cerebellar atrophy in PwMS secondary to disconnection from the cerebral cortex and
spinal cord, thus supporting the hypothesis that atrophy
in MS could be secondary to demyelination. The detection of specific CNS structures involved in balance deficit
due to MS can allow to better select patients requiring
specific rehabilitative strategies to reduce the risk of accidental falls.
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Prosperini L, Sbardella E, Raz E, Cercignani M, Tona F, Bozzali M, Petsas N, Pozzilli C, Pantano P. White and grey matter damage associated with balance deficit as detected by static posturography in multiple sclerosis. Radiology 2013 (in press)
XXVII ECTRIMS congress Amsterdam, Netherlands, 19-22 October 2011 and XLII SIN Turin, Italy, 22-25 October 2011
Prosperini L, Fortuna D, Giannì C, Leonardi L, Marchetti MR, Pozzilli C. Home-based balance training using the Wii Balance Board: a randomized, cross-over pilot study in multiple sclerosis.
Neurorehabil Neural Rep 2013 (in press).
Oral communication at XVII RIMS congress Hamburg, Germany, 31 May-2 June 2012, and XLIII SIN congress, Rimini, Italy, 6-9 October 2012
Prosperini L, Petsas N, Raz E, Sbardella E, Tona F, Mancinelli CR, Pozzilli C, Pantano P.
The contribution of cerebellum and spinal cord atrophy to imbalance in multiple sclerosis. Neurology 2013 (submitted).
XXVIII ECTRIMS congress Lion, France, 10-13 October 2012, and SIN Rimini, Italy, 6-9 October 2012
Prosperini L, Sbardella E, Raz E, Cercignani M, Tona F, Bozzali M, Petsas N, Pozzilli C, Pantano P. White and grey matter damage associated with balance deficit as detected by static posturography in multiple sclerosis. Radiology 2013, (in press)
Sbardella E, Petsas N, Tona F, Prosperini L, Raz E, Pace G, Pozzilli C, Pantano P. Assessing the correlation between grey and white matter damage with motor and cognitive impairment in Multiple
Sclerosis patients. PLoSOne 2013 (under review).
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28
La stimolazione transcranica con correnti dirette (tDCS) delle aree
corticali motorie per il trattamento della fatica nella sclerosi multipla
Alberto Priori
Fondazione IRCCS Ca’ Granda, Ospedale Maggiore di Milano e Università degli Studi di Milano, Milano
Collaboratori
Elio Scarpini, Milena De Riz, Filippo Cogiamanian, Roberta Ferrucci, Matteo Ciocca, Maurizio Vergari
La fatica nei pazienti affetti da sclerosi multipla (SM) è stata definita come “una mancanza soggettiva di energia
mentale e/o fisica in grado di interferire con lo svolgimento delle comuni attività della vita quotidiana”. Nonostante
essa costituisca uno dei sintomi più comuni e disabilitanti nei pazienti affetti da SM, la sua fisiopatologia appare tuttora non chiarita. Diverse evidenze suggeriscono
tuttavia che, almeno in parte, la fatica sia un disturbo riconducibile ad disfunzione della corteccia motoria. Studi
di imaging funzionale hanno mostrato un’alterazione del
metabolismo del glucosio nell’area motoria e mediante
la stimolazione magnetica transcranica (TMS) è stato
possibile dimostrare un’alterazione nei circuiti inibitori
della corteccia motoria primaria in pazienti affetti da SM
e fatica. La stimolazione cerebrale transcranica con correnti dirette (tDCS) di bassa intensità si è dimostrata in
grado di modulare in modo prolungato l’eccitabilità della corteccia cerebrale motoria. In uno studio preliminare
condotto su un campione di 12 pazienti con SM e fatica
abbiamo dimostrato l’efficacia della stimolazione anodica dell’area motoria primaria (15 minuti/die per 5 giorni
consecutivi). I risultati ci hanno suggerito di disegnare un
nuovo studio per confermare gli effetti della tDCS anodica in un campione più ampio di pazienti con SM.
RISULTATI
I nostri risultati dimostrano che la tDCS anodica induce
un miglioramento della fatica nel 65% dei pazienti. La stimolazione anodica applicata per cinque giorni consecutivi sull’area motoria induce un miglioramento della fatica
di circa il 30%, che non solo si manifesta subito dopo il
ciclo di trattamento, ma si mantiene fino ad almeno un
mese. Il 47% dei pazienti riporta un lieve miglioramento
della fatica anche dopo stimolazione ‘placebo’.
CONCLUSIONI
La tDCS è una metodica priva di rischi, non invasiva e
di basso costo, la dimostrazione di una riduzione dei
sintomi di affaticamento nei pazienti affetti da sclerosi
multipla aprirebbe la strada ad un utilizzo clinico-terapeutico della stimolazione cerebrale con correnti dirette in un settore in cui la terapia farmacologia appare di
non sicura efficacia.
Transcranial direct current stimulation (tDCS) of motor areas
of the cerebral cortex for the treatment of fatigue in multiple sclerosis
Fatigue in patients with multiple sclerosis (MS) has been
defined as “a subjective lack of physical and/or mental
energy that is perceived by the individual or caregiver
to interfere with usual and desired activities”. Although fatigue is one of the most common and disabling
symptoms of MS, its ethiology and pathophysiology
are not understood. Several lines of evidence suggest
that it is, at least in part, a cortical phenomenon. Functional imaging study have shown abnormal glucose
metabolism in motor cortical area and an impairment
of inhibitory circuits in primary motor cortex have been
recently demonstrated in MS patients with fatigue
29
using transcranial magnetic stimulation (TMS). Direct
currents (DC) delivered through the scalp (transcortical
DC stimulation or tDCS) at weak intensities and for
long periods induce changes in motor cortical excitability that persist for almost one hour after current
offset and depend on current polarity.
In a preliminary trial assessing the effect of tDCS in 12
patients with MS we demonstrated that anodal tDCS
over the motor cortex (15 minutes/day for five consecutive days) can significantly improve fatigue symptoms. These preliminary study prompted us to design a study investigating the effects of anodal tDCS in
a larger sample size of MS patients.
compendio 2013
compendio 2013
QUALITÀ DELLA VITA
E RIABILITAZIONE
RESULTS
Our results showed that the fatigue score decreased after
anodal tDCS in 65% of the patients. After patients received tDCS for 5 days their fatigue scores in FIS improved
by about 20% and the beneficial effects of tDCS persisted
1 month after treatment ended. Few patients (47%) reported some improvements also after sham tDCS.
CONCLUSIONS
The study of the effect of anodal tDCS of motor cortex in
MS patients with symptoms of fatigue opens the possibility of non-pharmacological alternative approaches to
the decreased faticability in MS patients.
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Ferrucci R, Bocci T, Cogiamanian F, Vergari M, Tomasini E, Ciocca M, De Riz M, Scarpini E, Priori A. Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for Fatigue in Multiple Sclerosis (under review)
Ferrucci R, Cogiamanian F, De Riz M, Ciocca M, Vergari M, Mameli F, Fumagalli M, Scarpini E, Priori A. Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) for fatigue in Multiple Sclerosis Neurological
Sciences, 2012, vol 33 – S249. XLIII Congresso della Società Italiana di Neurologia, Rimini 6-9 ottobre 2012.
Priori A, Ferrucci R, Mameli F, Rossi L, Barbieri S. - Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) as potential therapeutic tools for neurological and psychiatric disorders. Current Medicinal
Chemistry, 2012, vol 19 – SL 111. 4th International Conference on Drug Discovery e Therapy, Dubai 12-15 febbraio 2012
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2009 per il periodo di 1 anno (prorogato di 12 mesi) e l’ammontare di € 40.000
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30
Valutazione del trattamento della disfagia associata a sclerosi
multipla con stimolazione elettrica periferica del faringe.
Studio pilota
Domenico Antonio Restivo
Unità operativa di Neurologia, P.O. “Nuovo Garibaldi”, Catania
Collaboratori
Antonino Pavone, Davide Maimone, Maurilio Russo
La disfagia è considerate una complicazione della sclerosi
multipla (SM) molto severa ed invalidante. La sua prevalenza
può essere stimata intorno al 30-40%. Inoltre la polmonite
da aspirazione (polmonite ab ingestiis) associata a disfagia è
una delle prime cause di morte nei pazienti con SM.
Ad oggi non esiste alcun trattamento farmacologico per
la disfagia nei pazienti affetti da SM. Recentemente, la
stimolazione elettrica del faringe ha dimostrato di essere
utile nell’apportare nuovi dati e conoscenze circa i possibili
meccanismi con cui agiscono nell’uomo le terapie fisiche
riabilitative per la deglutizione. Questi studi hanno dimostrato che le alterazioni corticali cerebrali indotte dallo stimolo
elettrico sono correlate con un miglioramento nelle funzioni
deglutitorie e ad una riduzione dell’aspirazione nei soggetti
con disfagia associate a stroke. La stimolazione faringea a
frequenze di 5 Hz per 10 minuti ha prodotto un significativo
incremento dell’eccitabiltà cortico-bulbare. L’effetto facilitatorio massimale è occorso 60 e 90 minuti dopo la fine della
stimolazione elettrica.
Scopo del presente studio è stato quello di valutare, in 20
pazienti con disfagia associate a SM, l’effetto della stimolazione elettrica faringea a 5Hz sulle funzioni deglutitorie studiate mediante videofluroscopia, elettromiografia e scale
di valutazione cliniche quali la Penetration/Aspiration Scale
(PAS) e la scala di severità della disfagia a 5 punti.
RISULTATI
Dopo stimolazione vera (gruppo “real”) si è osservato un
significativo miglioramento (p < 0.05) di tutti i parametri di outcome, rispetto alla stimolazione fittizia (gruppo
“sham”). L’effetto era più evidente al quinto giorno (T1),
subito dopo la fine dell’ultima sessione di stimolazione
elettrica ed a 2 settimane (T2) dopo la fine, ma manteneva ancora la sua significatività anche a 4 settimane (T3).
CONCLUSIONI
I risultati di questo studio pilota suggeriscono che
la stimolazione elettrica periferica del faringe di breve durata è potenzialmente in grado di migliorare le
funzioni deglutitorie. Considerando il vasto impatto
della disfagia sulla progressione e sulla severità della
malattia e considerando anche l’assoluta carenza di
terapie farmacologiche, questo trattamento terapeutico e riabilitativo, in associazione con altri trattamenti
riabilitativi e fisici già utilizzati potrebbe rappresentare
un utile approccio per trattare un sintomo così grave e
disabilitante quale la disfagia associata a SM.
Pharyngeal electrical stimulation as a treatment for dysphagia
associated with multiple sclerosis: a pilot study
Dysphagia, is considered a very severe and life-threatening complication of MS. Its prevalence in MS can be
attested around 30-40%. Furthermore, the aspiration
pneumoniae due to dysphagia is the leading cause of
death in MS patients. No specific pharmacological treatment has been reported for dysphagia in MS patients,
up to now. Recently, peripheral electrical stimulation has
provided some insight into the possible mechanisms
by which functional swallowing therapies may work in
humans. These studies have also demonstrated that
31
stimulus-induced cortical changes are correlated with
measurable improvement in swallowing physiology and
reduced aspiration. Pharyngeal stimulation at 5 Hz for
10 min produced a significant excitatory effect on corticobulbar excitability. Maximal facilitation occurred at
60 sand 90 min after the end of electrical pharyngeal
stimulation.
The aim of this study was to assess the efficacy and
effects of 5 Hz pharyngeal electrical stimulation, as compared to sham stimulation, on swallowing functions in
20 dysphagic MS patients, measured by videofluoro-
compendio 2013
compendio 2013
QUALITÀ DELLA VITA
E RIABILITAZIONE
scopic, electromyographic, and clinical evaluations represented by the Penetration/Aspiration Scale (PAS) and
by the 5-point dysphagia severity scale.
RESULTS
A significant (p < 0.05) improvement was observed
in “real” as compared to “sham” group in all the outcome measures. The effect was stronger at day 5
(T1), immediately after the last session of electrical
stimulation, at two (T2) weeks, but still persisted at
4 weeks (T3).
CONCLUSIONS
The results of this pilot study suggest that short-term
peripheral pharyngeal electrical stimulation is potentially
capable of improving swallowing functions. Considering
the large impact of dysphagia on the disease progression and severity, and considering also the complete
lack of pharmacological treatment, this technique, in
association with physical/rehabilitation, may represent
an useful approach to treat this very disabling and troublesome symptom.
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Restivo DA, Casabona A, Centonze D, Marchese-Ragona R, Maimone D, Pavone A.
Pharyngeal electrical stimulation for dysphagia associated with multiple sclerosis: A pilot study. Brain Stimul. 2012 Sep 23. doi:pii: S1935-861X(12)00155-6. 10.1016/j.brs.2012.09.001
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di euro 20.000
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32
Effetti di un training dell’abilità di integrazione sensori-motoria
sui disturbi dell’equilibrio in pazienti affetti da sclerosi multipla
Nicola Smania
Centro di Ricerca in Riabilitazione Neuromotoria e Cognitiva, U.S.O Riabilitazione Neurologica, Policlinico GB
Rossi Borgo Roma, Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata di Verona, Verona
Collaboratori
Maria Donata Benedetti, Marialuisa Gandolfi, Alberto Gajofatto, Christian Geroin, Daniele Munari,
Alessandro Picelli
I disturbi dell’equilibrio rappresentano una delle maggiori
cause di disabilità nei pazienti con sclerosi multipla (SM).
Essi espongono al rischio di cadute e contribuiscono ad instaurare la cosiddetta “paura delle cadute”, circolo vizioso
che porta ad una progressiva riduzione dell’autonomia nelle attività della vita quotidiana e della vita sociale. I disturbi
di equilibrio nella SM sono determinati, oltre che da deficit
primitivi delle funzioni sensoriali e motorie, da deficit centrali
delle funzioni di integrazione sensori-motoria rilevanti per il
controllo posturale sia in condizioni statiche che durante
la deambulazione. Allo stato attuale i dati provenienti dalla
ricerca sulla riabilitazione dell’equilibrio nei pazienti con SM
sono scarsi. È riportato, infatti, un solo studio pilota che
mostra come un training riabilitativo finalizzato a migliorare le capacità d’integrazione sensori-motoria nel corso di
esercizi di controllo posturale possa affinare l’equilibrio in
pazienti con SM. In virtù di ciò e unitamente al fatto che
i trattamenti farmacologici normalmente non migliorano la
stabilità posturale, sono necessari altri studi scientifici.
Lo scopo del presente progetto di ricerca è stato quello di
valutare gli effetti di un trattamento riabilitativo sperimentale,
costituito da specifici esercizi di equilibrio eseguiti in diverse
condizioni di conflitto sensoriale (i.e. diverse superfici, occhi
aperti, chiusi), sulle capacità di mantenere la stabilità posturale durante attività in stazione eretta, durante la deambulazione, sul numero di cadute, sulla fatica e sulla qualità di
vita dei pazienti con SM. I pazienti sono stati randomizzati
in 2 gruppi. Un gruppo ha eseguito un training riabilitativo costituito da esercizi specifici per sollecitare l’equilibrio
in diverse condizioni di conflitto sensoriale (trattamento
“sperimentale”). Un gruppo ha eseguito un trattamento riabilitativo neuromotorio “convenzionale”. Entrambi i gruppi
hanno effettuato trattamenti riabilitativi individuali (3 sedute/
settimana; 15 sedute totali di 50 minuti ciascuna) per 5 settimane consecutive. Ogni paziente è stato valutato prima,
alla fine e dopo un mese dalla conclusione del trattamento
con i seguenti strumenti di valutazione clinica e strumentale
specifici per i disturbi della stabilità posturale sia in condizioni statiche che durante la deambulazione: Berg Balance
Scale, Activities-specific Balance Confidence Scale, Fatigue Severity Scale, numero di cadute, Multiple Sclerosis
Quality Of Life (MSQOL)-54, Sensory Organization Balance
Test, GAITRite® System e pedana stabilometrica.
33
RISULTATI
Sono stati arruolati nello studio 80 pazienti affetti da SM recidivante remittente (Età: 30-60 anni; EDSS:1.5-6.0). Trentanove pazienti sono stati assegnati al trattamento “sperimentale” e quarantuno al trattamento “convenzionale”.
68 pazienti, 32 nel gruppo sperimentale e 36 nel gruppo
convenzionale, hanno completato lo studio. Prima del trattamento, non vi erano differenze significative tra i gruppi alla
Berg Balance Scale e alla Activities-Specific Balance Confidence Scale. Dopo il trattamento (5 settimane) il gruppo
che ha eseguito il trattamento “sperimentale” ha mostrato
rispetto al gruppo “convenzionale” una rilevante riduzione
dei disturbi dell’equilibrio valutati alla Berg Balance Scale
(p=.001) e alla Activities-specific Balance Confidence Scale
(p=.033), una riduzione della fatica (P=.026), un miglioramento della performance in compiti che richiedono integrazione sensori-motoria valutati al Sensory Organization
Balance Test sia su superfici stabili (occhi chiusi e Dome)
che complianti (occhi aperti e chiusi) (P<0.05), un aumento della velocità del cammino (P=.026), una riduzione della
larghezza della base di appoggio (P=.027) e della durata
della fase di doppio appoggio (P=.05) del passo. Questi
effetti sono stati mantenuti a distanza di 1 mese dalla fine
del trattamento. Inoltre, sono stati ottenuti effetti in favore del
trattamento “sperimentale”, anche se non statisticamente
significativi, per quanto riguarda il numero delle cadute e la
qualità della vita.
CONCLUSIONI
I disturbi dell’equilibrio sono molto frequenti nei pazienti con SM e contribuiscono a rendere insicuro il
mantenimento della stazione eretta, il cammino e aumentano il rischio di cadute. Con ciò i disturbi dell’equilibrio riducono l’autonomia nelle attività della vita
quotidiana e la qualità di vita dei pazienti con SM.
La nostra ricerca ha mostrato l’efficacia di un training specifico finalizzato a migliorare le capacità di
integrazione sensori-motoria nel migliorare tutti questi aspetti e ha fornito importanti spunti per la comprensione dei meccanismi di recupero di tali disturbi
in pazienti con SM. I risultati sono avvalorati da importanti aspetti metodologici quali l’ampia casistica,
le procedure di randomizzazione e l’effettuazione di
specifiche valutazioni sia cliniche sia strumentali.
compendio 2013
compendio 2013
QUALITÀ DELLA VITA
E RIABILITAZIONE
Effects of sensori-motor integration balance training on balance disturbances
in patients with multiple sclerosis
Balance impairment is one of the primary causes of
disability in people with multiple sclerosis (MS). It increases the risk of falls and contributes to the development of fear of falling, a vicious cycle that leads
to a progressive limitation in activities of daily living.
Balance impairment may be caused by motor and
sensorial deficits as well as sensori-motor integration deficits. Despite its negative effects, literature regarding its rehabilitation is very scant. To our
knowledge only two studies have been published on
MS balance rehabilitation. The first paper described
case reports on MS balance rehabilitation using the
Bobath approach.
The second paper performed a preliminary randomized controlled study describing the effectiveness of
restoring balance control and reducing risk of falling
using a specific training program aimed at improving
sensori-motor integration in people with MS. Considering the several limitations of this study, further
trials are warranted to assess the usefulness of specific sensory-motor training on balance impairment.
The aim of this randomized controlled clinical trial
was to evaluate whether a training program consisting of exercises performed under different sensory
conflict conditions can lead to an improvement in
postural stability in patients with MS.
This in turn might lead to an improvement in walking
ability, independence in activities of daily living and
quality of life in people with MS. Patients were allocated into 2 groups, according to a randomization
design. The experimental group (EG) underwent a
specific training program aimed at increasing balance ability in several sensory conflict conditions.
The training program consisted of fifteen sessions of
50 minute each, over a 5-week period (3 sessions/
week). The control group (CG) underwent conventional neurorehabilitation treatment following the same
pattern of sessions as the study group. At recruitment, after treatment (5 weeks) and at the follow-up
(1 month), each patient was tested with the following
clinical and instrumental procedures: Berg Balance
Scale, Activities-specific Balance Confidence Scale,
Fatigue Severity Scale, Number of Falls, Sensory
Organization Balance Test (SOT), Multiple Sclerosis
Quality Of Life (MSQOL)-54 instrument, GAITRite®
System and platform stabilometry.
34
RESULTS
Eighty outpatients with relapsing remitting MS (Age:
30-60 years; EDSS:1.5-6.0) were randomly assigned to an experimental (EG=39) or control group
(CG=41). Sixty-eight patients, 32 patients in the
EG and 36 in the CG, completed the study. Before treatment, no significant differences were found
between groups in regards to the Berg Balance Scale and Activities-specific Balance Confidence Scale.
After treatment, the EG training was more effective
than the CG training in reducing balance disorders,
as demonstrated by significant improvements in
the Berg Balance Scale (P=.001), Activities-specific
Balance Confidence Scale (P=.033), Fatigue Severity Scale (P=.026), SOT stabile surface-eye closed
and Dome conditions, SOT compliant surface-Eye
open and eye closed conditions (P<.05), gait speed
(P=.026), heel to heel base of support (P=.027) and
double support time (P=.05). Effects were maintained 1 month after treatment. Moreover, between
groups differences were found in favor of the experimental training in the MSQOL-54 PHC, MSQOL-54
and falls, however not significant.
CONCLUSIONS
Balance impairment is a common and very disabling disturbance in people with MS. It contributes
to deteriorate upright stance and gait performance,
thus increasing the risk of falls, decreasing independence in activities of daily living and quality of life.
Our research showed that a specific training aimed
at increasing sensori-motor integration under different sensory-motor conflict conditions during balance may reduce balance impairments and improve
mobility in patients with MS, contributing new and
important findings about the effectiveness of rehabilitation at improving balance disorders, as well
as knowledge about the mechanisms of recovery
of such disorders. These results are supported by
important methodological aspects such as the large sample size, the randomization procedures and
assessments that included both clinical and instrumental procedures.
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Gandolfi M, Munari D, Geroin C, Midiri A, Ianes P, Sanzogni M, Fontana C, Picelli A, Ceriani E, Gajofatto A, Benedetti MD, Waldner A, Smania N. Sensorimotor training for balance disorders in
patients with multiple sclerosis. Submitted to Neurology.
Munari D, Ceriani E, Fontana C, Casarotto M, Benedetti MD, Fiaschi A, Gandolfi M, Smania N. Effects of sensori-motor integration training on balance impairment in patients with multiple sclerosis.
XXXVII National Congress S.I.M.F.E.R, Venice 23-27 May 2010. Eur J Phys Rehabil Med. 2010 Jun;46(Suppl.1 to N.2 ): p. 52. ISSN: 1973-9087
Geroin C, Gandolfi M, Midiri A, Munari D, Picelli A, Gajofatto A, Benedetti MD Smania N.
Effects of sensori-motor integration training on balance disorders in patients with multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM 2012
Midiri A, Munari D, Gandolfi M, Geroin C, Sanzogni M, Ceriani E, Picelli A, Gajofatto A, Benedetti MD, Fiaschi A, Smania N.. Effetti di un training di integrazione sensori – motoria sui disturbi
dell’equilibrio in pazienti con sclerosi multipla: uno studio randomizzato controllato. XII Congresso Nazionale Società Italiana Riabilitazione Neurologica S.I.R.N., Milano, 3-5 Maggio 2012.
Gandolfi M, Geroin C, Munari D, Midiri A, Berto G, Sanzogni M, Picelli A, Ceriani E, Gajofatto A, Benedetti MD, Fiaschi Antonio, Smania Nicola. Effectiveness of a sensorimotor integration training
on balance disorders in patients with multiple sclerosis: a randomized controlled trial. 9th Mediterranean Congress of Physical and Rehabilitation Medicine - 40° National Congress SIMFER.
Sorrento 21-25 October 2012. Giornale Italiano di Medicina Riabilitativa 2012 Agosto-Dicembre; 26 (2-3): p. 201.
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2009 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 70.000 €
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35
BIOMARCATORI
Il ruolo di Gas6 e dei suoi recettori nella sclerosi multipla:
studio clinico e biologico
Gian Carlo Avanzi
Dipartimento di Medicina Traslazionale, Università del Piemonte Orientale “A. Avogadro”, Novara
Collaboratori
Sainaghi Pier Paolo, Alciato Federica, Ranza Elena, Leone Maurizio
Gas6 è una proteina coinvolta nella regolazione della risposta immune e ha un effetto protettivo su differenti popolazioni neuronali. In modelli animali di sclerosi multipla
(SM), i topi privi di Gas6 mostravano una peggior prognosi. Abbiamo ipotizzato che il sistema Ga6/recettori
possa avere un ruolo chiave nella patogenesi della SM.
Lo scopo del progetto è stato di misurare le concentrazioni di Gas6 e dei suoi recettori solubili Axl, Mer e Tyro3,
nel liquor e nel plasma di persone con SM e correlarle
con le caratteristiche cliniche della malattia.
RISULTATI
Abbiamo valutato persone al primo attacco di SM
recidivante remittente e controlli. Abbiamo dimostrato che la concentrazione di Gas6 nel liquor, ma non
nel plasma, è più alta in caso di attacchi più brevi,
quando vengono coinvolti meno sistemi funzionali e
quando l’EDSS si mantiene più basso. Al contrario la
concentrazione liquorale di Gas6 non è correlata con
il grado di recupero dopo un attacco. Le concentrazioni di Axl e Tyro3 solubili non risultano correlate alle
caratteristiche dell’attacco e all’evoluzione di malattia. Anche la concentrazione di sMer non è correlata
alle caratteristiche della ricaduta ma risulta correlata
ad un maggior numero di ricadute annuali sia nel liquor (maggiore) che nel plasma (minore).
CONCLUSIONI
I nostri dati suggeriscono il coinvolgimento di Gas6
nel controllo della risposta autoimmune alla mielina
e la misurazione della sua concentrazione potrebbe essere utile per predire l’evoluzione di un attacco ma
non lo sviluppo della malattia. Inoltre la concentrazione
di sMer sia plasmatica che liquorale è correlata con la
frequenza degli attacchi quindi, seppur con le limitazioni
dello studio condotto, potrebbe essere utile come predittore di progressione della malattia.
Il progetto incrementa le conoscenze riguardo alla patogenesi della SM studiando il sistema Gas6/recettori
come nuovi fattori prognostici o come target per nuovi
trattamenti. A tale proposito la misurazione della concentrazione plasmatica di sMer potrebbe dare al neurologo utili informazioni riguardo alla progressione della
patologia, mentre la valutazione di Gas6 può aiutare
nell’identificazione delle caratteristiche del singolo attacco. Inoltre, il nostro studio fornisce nuove conoscenze
riguardo la regolazione dell’omeostasi del sistema immunitario per quanto riguarda la risposta innata e probabilmente potrebbe aprire nuove prospettive per l’intervento terapeutico nella SM. L’applicazione pratica alla
terapia richiede ancora studi. In particolare nel prossimo
futuro intendiamo dimostrare come il dosaggio plasmatico di Gas6 e recettori solubili possa essere utile come
predittore di risposta alla terapia con interferone.
The role of Gas6/TRK receptors in multiple sclerosis:
a patient and biological study
Gas6 is a protein involved in the control of immune response and has a protective effect on different neuronal
populations. On multiple sclerosis (MS) animal model,
mice without Gas6 resulted to have a worst prognosis.
So we evaluated if the Gas6/receptor system could play
a role in MS pathogenesis.
Therefore, the aim of the project was to measure the
concentrations of Gas6 and its soluble receptor Axl, Mer
37
and Tyro3 in CSF and plasma of MS persons and to
relate them with clinical features of the disease.
RESULTS
We considered patients with first attacks of relapsing
remitting-MS and controls. We demonstrated that CSF
Gas6, but not plasma concentration, was higher in shorter relapses, in relapses with less FS involved and when
EDSS is lower. Conversely, CSF Gas6 did not vary ac-
compendio 2013
compendio 2013
BIOMARCATORI
cording to the completeness of recovery. Soluble Axl and
Tyro3 concentration in CSF or plasma did not vary according to relapse features or disease evolution. Also sMer
mean concentration did not differ according to relapse features; however its concentration was different according
to a major number of annualized relapse rate either in CSF
(higher) and in plasma (lower).
CONCLUSIONS
These data suggest a role of Gas6 protein in limiting the
acute autoimmune aggression to myelin and its measurement can be useful to predict relapse evolution but not
the course of the disease. Additionally, sMer concentrations both in CSF and plasma were related to the frequency of relapses; with the limitation of this preliminary
study, we propose that sMer may therefore be useful as
a predictor of disease progression.
The project increases the knowledge of MS pathogenesis studying the Gas6/receptor system in patients as
new prognostic factors or targets for new treatments.
The measurement of plasma sMer concentration could
give useful informations for the neurologist about the MS
progression. Moreover Gas6 evaluation could help the
specialist in predict relapse evolution.
The involvement of Gas6/TAM system in MS provides
new insight on the regulatory mechanisms of inflammation in central nervous system opening new perspectives for therapeutic interventions in MS. The proximity to
cure need further investigations. In particular in the next
future we would like to show how the plasmatic assay of
Gas6 and sTAM could be useful as predictor of response to interferon treatment.
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Sainaghi PP, Collimedaglia L, Alciato F, Molinari R, Ranza E, Naldi P, Monaco F, Leone MA, Avanzi GC Growth Arrest Specific Protein 6 (Gas6) concentration in cerebrospinal fluid correlates with
relapse severity in multiple sclerosis patients. (submitted)
Alciato F, Ranza E., Sainaghi PP, Leone M, Avanzi GC. Il ruolo di Gas6 e dei suoi recettori nella sclerosi multipla: studio clinico e biologico. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma 25-26
maggio 2011
Ranza E, Alciato F, Sainaghi PP, Leone M, Avanzi GC. Il ruolo di Gas6 e dei suoi recettori nella sclerosi multipla: studio clinico e biologico. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma 30-31
maggio 2012
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di un anno e l’ammontare di 30.000 €
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38
Profilo di espressione genica delle cellule mononucleate
del sangue periferico: identificazione di potenziali marcatori
molecolari per la sclerosi multipla
Marco Di Dario
Istituto di Neurologia Sperimentale (INSPE)-Dibit2- Istituto San Raffaele, Milano
Mentore
Cinthia Farina
Il programma di formazione è inserito nel contesto di
uno studio di transcrittomica (che studia l’insieme degli
RNA messaggeri di una cellula) nella sclerosi multipla
(SM). Abbiamo valutato l’espressione genica nelle cellule mononucleate periferiche del sangue (PBMC) di
pazienti affetti da SM e controlli sani nel contesto di
uno studio di genere. Per ridurre la variabilità, abbiamo
incluso solo i pazienti con decorso clinico di sclerosi
multipla recidivante-remittente (SMRR), non sottoposti
a trattamenti immunomodulatori e con assenza di altri
disturbi infiammatori acuti o cronici.
Lo scopo di questo programma di formazione è stato quello di acquisire nuove competenze nel campo
della biologia molecolare, dell’immunologia e biologia
cellulare. Inoltre, ho avuto modo di affrontare diversi
problemi connessi a studi clinici, come ad esempio la
definizione dei criteri di inclusione dei pazienti o l’accurata preparazione del campione.
RISULTATI
Questa borsa di studio di mi ha dato l’opportunità di
contribuire a uno studio recentemente pubblicato
su Journal of Autoimmunity. Durante i due anni del
programma di addestramento ho avuto la possibilità
di comprendere e affrontare le principali questioni e
problematiche legate agli studi microarray di profili di
espressione genica e ho lavorato nel contesto di uno
studio di trascrittomica nella SM. Prima di tutto ho
avuto a che fare con le diverse problematiche relative
ad uno studio clinico, come la definizione dei criteri
di inclusione dei pazienti o l’accurato procedimento
di preparazione del campione. Ho collaborato con i
neurologi, al fine di raccogliere dati clinici e radiologici, verificare i criteri di inclusione, pianificare le visite
ambulatoriali e i prelievi di sangue. Inoltre, mi sono occupato dell’isolamento di PBMC mediante gradiente
di Ficoll; quindi della conseguente estrazione di RNA
tramite fenolo / cloroformio e, infine, dei controlli di
qualità dell’RNA. Ho, inoltre, acquisito nuove competenze tecniche nel campo della biologia molecolare,
come la PCR real-time (qRT-PCR) e della biologia
cellulare. Ho avuto anche l’opportunità di studiare il
modello animale della malattia, infatti ho acquisito le
competenze necessarie per indurre l’Encefalite Sperimentale Autoimmune, (ESA) in topi C57/BL6 e per
l’interpretazione dei dati. Infine, ho imparato ad ese-
39
guire la citometria a flusso utilizzando lo strumento e
il relativo software per l’analisi dei dati.
Per quanto riguarda il progetto, abbiamo effettuato
uno studio di microarray sui profili di espressione
genica di PBMC derivati da pazienti con SMRR e
controlli. Inizialmente abbiamo osservato una certa
variabilità tra i gruppi dei pazienti con SM e dei controlli sani quando generati senza tener conto della
differenza di genere. Al contrario, tenendo conto di
questo fattore, l’analisi ha portato a risultati che esibivano una significativa riduzione della variabilità.
Utilizzando metodi statistici per massimizzare il numero delle differenze esistenti tra i generi, circa il
10% dei geni filtrati risultano sesso-specifici nella popolazione sana, mentre solo il 2% in soggetti con
SM. Inoltre, solo una minima parte dei geni sessospecifici in pazienti con SM erano geni naturalmente
preesistenti.
Questi dati dimostrano chiaramente che la SM è associata ad una mancata regolazione nei geni sessospecifici. Per questo motivo, è stato applicato un
approccio di genere per la selezione dei geni differentemente espressi (DEG) nella SM. L’applicazione di
metodi statistici più stringenti ha permesso di identificare profili in grado di classificare una seconda popolazione indipendente di SM. Inoltre, abbiamo validato l’espressione di alcuni DEG in maschi e femmine
con SM, mediante real-time PCR. Le analisi globali di
cluster unsupervised su 60 soggetti hanno mostrato
che 29/31 persone di sesso femminile e 27/29 persone di sesso maschile erano correttamente identificate. In particolare, la SM era associata a profili di
espressione distinti in donne e uomini che però avevano in comune alcune funzioni molecolari, processi biologici e interattori. In particolare meccanismi di
controllo epigenetico sono apparsi come tema principale comune nella malattia. Inoltre, l’analisi in silico
ha indicato che le differenze di espressione genica
nelle donne e uomini con SM dipendevano dal fattore di trascrizione SP1. Studi in vitro e in vivo nell’ESA hanno supportato l’ipotesi che la trascrizione del
gene SP1 sostiene la neuro infiammazione. Così,
un approccio di genere con la ridotta eterogeneità
e l’identificazione delle reti molecolari e funzionali ha
portato con successo alla scoperta di differenze, ma
anche di punti comuni associati alla SM in uomini e
donne permettendo di far luce su un processo pato-
compendio 2013
compendio 2013
BIOMARCATORI
genetico nuovo nella neuro infiammazione.
CONCLUSIONI
Il nostro studio ha dimostrato che set di geni distinti
in uomini e donne con SM, hanno in comune funzioni biologiche e molecolari, nonché interattori. Temi
legati all’epigenetica sono predominanti in entrambi
i sessi e nell’interattoma comune (la rete composta
da tutte le possibili interazioni fisiche proteina-proteina che avvengono naturalmente in una cellula o
in un organismo), suggerendo che potrebbero dare
forma e/o sostenere processi patogenetici nella SM. Noi crediamo che, a causa delle differenze
biologiche tra maschi e femmine, le future strategie
volte ad acquisire nuove informazioni sulla malattia
debbano tener conto di queste differenze.
Gene expression profiling of peripheral blood mononuclear cells:
identification of potential biomarker for multiple sclerosis
This training program is inserted in the context of a large
transcriptome study in multiple sclerosis (MS).We investigated the contribution of gender to global gene expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from
MS patients and healthy controls. To reduce variability,
we included only patients with the relapsing-remitting
clinical course (RRMS), free from immunomodulatory
treatments and any other acute or chronic inflammatory
disorders.
Aim of this training program was to acquire new skills in
molecular biology, immunology and cell biology. Further,
it included dealing with several issues related to clinical
studies, such as definition of the inclusion criteria of patients or accurate sample processing.
RESULTS
This training fellowship gave me the opportunity to
contribute to a study which was recently published
in the Journal of Autoimmunity (May-2012 issue).
During the 2 years of the training program I had
the possibility to understand and address the main
issues and problems related to microarray-based
gene expression profiling studies. In fact, during
these two years, I worked in the context of a large transcriptome study in MS. First of all I had to
deal with several issues related to a clinical study,
such as definition of the inclusion criteria of patients
or accurate sample processing. I have collaborate
with the neurologists in order to collect clinical and
radiological data, verify our inclusion criteria, plan
the outpatients’ visits and blood drawings. Further
I was in charge of peripheral blood mononuclear
cells (PBMC) isolation from whole blood by Ficoll
gradient, then of RNA extraction by phenol/ chloroform steps and finally of RNA quality controls. Moreover, I acquired new technical skills in molecular
biology such as quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) and cellular biology. In addition, I had
40
the opportunity to deal with the animal model of the
disease. In fact I acquired the necessary expertise
to induce EAE in C57/BL6 mice and data interpretation. Finally, I learnt performing flow cytometry by
using the instrument and the relative software for
data analysis.
Regarding the project, we performed microarraybased gene expression profiling on PBMC derived from RRMS patients and healthy controls. We
observed high heterogeneity in the diseased and
control groups when gene lists were generated without taking into account the gender factor. On the
contrary, gender-based case-control comparisons
led to gene lists which exhibited a significant reduction in the variability.
Using statistics methods to maximize the number
of differences existing in blood between genders,
about 10% of the filtered genes resulted sex-specific in the healthy population, while only 2% in MS
subjects. In addition, only a minor part of the MS
sex-specific genes were natural, pre-existing sexspecific genes. These data clearly demonstrated
that MS pathology is associated with deregulation
in sex-specific genes. For this reason, we applied
a gender-based approach for selection of differentially expressed genes (DEG) in MS. Application of
stringent statistics defined gender-based signatures
which classified a second independent MS population with high precision. Moreover, we validated the
differential expression of some MS female and male
DEG by real-time PCR. The global unsupervised
cluster analyses for 60 subjects showed that 29/31
female and 27/29 male samples were properly identified. Notably, MS was associated in women and in
men with distinct gene signatures which however
shared several molecular functions, biological processes and interactors. Issues regarding epigenetic
control of gene expression appeared as the main
common theme for disease. Additionally, in silico
analyses predicted that the differential expressions
in MS women and men were depending on the
transcription factor SP1. In vitro and in vivo studies
in EAE supported the hypothesis that SP1 dependent gene transcription sustains neuroinflammation.
Thus, the gender-based approach with its reduced
heterogeneity and the systems biology tools with the
identification of the molecular and functional networks successfully uncovered the differences but also
the commonalities associated to MS in women and
men and shed light on a new pathogenic process in
neuroinflammation.
CONCLUSIONS
Our study demonstrated that the distinct MS male
and female genesets shared biological and molecular functions as well as interactors. Themes related
to epigenetics were predominant in both female and
male MS signatures and in the shared interactome,
suggesting they might give shape to and/or sustain
pathogenic processes in multiple sclerosis.
We believe that due to objective differences in the
biology between males and females, future strategies aiming at acquiring new information on the disease must take these differences into account.
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Menon R, Di Dario M , Cordiglieri C, Musio S, La Mantia L, Milanese C, Di Stefano AL, Crabbio M, Franciotta D, Bergamaschi R, Pedotti R, Medico E, Farina C. Gender-based blood transcriptomes and interactomes in multiple sclerosis: involvement of SP1 dependent gene transcription. J. Autoimmun. 2012 May;38(2-3) J144-55
Menon R, Di Dario M , Cordiglieri C, Musio S, La Mantia L, Milanese C, Di Stefano AL, Crabbio M, Franciotta D, Bergamaschi R, Pedotti R, Medico E, Farina C. Systems biology of gender-based
blood transcriptomes unraveles a role for SP1 dependent gene transcription in multiple sclerosis Congress and place of the meeting: 11th International Congress of Neuroimmunology, Boston
(Massachussets, USA), 4th-8th November 2012
Di Dario M, Menon R, Cordiglieri C, Musio S, La Mantia L, Milanese C, Di Stefano AL, Crabbio M, Franciotta D, Mantegazza R, Bergamaschi R, Pedotti R, Medico E, Farina C.
Gene expression profiling of peripheral blood mononuclear cells: identification of potential biomarkers for Multiple Sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM, Maggio 30-31, Roma
Di Dario M, Menon R, La Mantia L, Milanese C, Di Stefano AL, Crabbio M, Franciotta D, Mantegazza R, Bergamaschi R, Medico E, Farina C. Systems biology applied to gender-based casecontrol transcriptomics in multiple sclerosis highlights cohesive processes and Interactomes despite sexual dimorphism.
Congresso Scientifico Annuale FISM, Maggio 25-26, Roma (May 2011).
Menon R, Di Dario M, La Mantia L, Milanese C, Di Stefano AL, Crabbio M, Franciotta D, Mantegazza R, Bergamaschi R, Medico E, Farina C. Gender-based systems biology in multiple sclerosis
unravels distinct blood gene signatures but common epigenetic facets. 10th ISNI Congress (Sitges,Spain) October 26-30, 2010.
Di Dario M. Gene expression profiling of peripheral blood mononuclear cells: identification of potential biomarkers for multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM, Maggio, 26-27
Maggio,Roma
Farina C, Di Dario ., Di Stefano AL, Ballerini C, Biagioli T, Franciotta D, Mantegazza R, Confalonieri P, Massacesi L, Bergamaschi R, La Mantia ., Milanese C, Medico E.
Blood gene signatures in clinically isolated syndromes and Multiple Sclerosis. 60th Annual Meeting of the American Academy of Neurology, 12 – 19 April Chicago 2008
Borsa di studio finanziata con il Bando 2009 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 36.000 €
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41
Analisi di parametri mitocondriali in oligodendrociti
durante condizioni pro-infiammatorie
Simone Patergnani
Dipartimento di morfologia, chirurgia e medicina sperimentale - Università di Ferrara, Ferrara
Mentore
Paolo Pinton
determini una robusta produzione di O2-. Indagando riguardo i livelli proteici dei complessi della mETC, abbiamo verificato che OPCs trattati con TNFα presentano livelli ridotti della sub unità NDUFB8 del complesso-I della
mETC; inoltre, questa regolazione negativa è riscontrata
anche in OPCs trattati con TNFα ed indotte al differenziamento.
Per correlare ulteriormente difetti nel differenziamento
degli OPCs ad alterazioni del metabolismo mitocondriale, abbiamo sottoposto gli OPCs a trattamenti con
disaccoppianti della catena respiratoria. Come risultato,
questi trattamenti (capaci di modulare negativamente i
livelli di Ψm, calcio e ROS) determinano effetti sul differenziamento oligodendrocitario speculari a quelli riscontrati in seguito ad esposizione con TNFα.
Per estendere queste scoperte a un sistema più “fisiologico”, abbiamo ripetuto i medesimi esperimenti in colture di glia-mista (in cui gli OPCs vengono fatti crescere
su uno strato di cellule di astrociti). Anche in questo sistema cellulare, il TNFα determina un’alterazione della
fisiologia mitocondriale e una conseguente alterazione
del differenziamento degli OPCs. Inoltre, per rafforzare
la nostra ipotesi, attraverso saggi di mielinizzazione, in
cui gli OPCs vengono co-coltivati insieme a neuroni cresciuti su uno strato di astrociti, è stato osservato come
il trattamento con TNFα determini una forte riduzione
della quota di mielina intorno all’assone.
Negli ultimi anni è stato dimostrato che il tumor
necrosis factor alpha (TNFα) è una delle citochine
principali nell’eziologia della sclerosi multipla (SM).
Infatti, i livelli di questa citochina sono direttamente
correlati alla progressione della malattia e alterano
la normale fisiologia degli oligodendrociti. Il target finale di questo progetto prevede di indagare l’ipotesi
che un’alterazione del processo di differenziamento
delle cellule oligodendrocitarie (OPCs) sia causato
dal TNFα e correlato ad un’alterazione della normale
omeostasi dei mitocondri.
RISULTATI
Una prima analisi ha permesso di osservare che bassi
livelli di TNFα bloccano il differenziamento degli OPCs:
in seguito ad esposizione del TNFα, abbiamo, infatti,
osservato un aumento di cellule NG2+ (OPCs) e un abbassamento di cellule O4+ e MBP+ (cellule oligodendrocitarie mature), senza riscontrare alterazioni nei livelli
di apoptosi. Partendo da questa osservazione, abbiamo indagato su un eventuale effetto del TNFα a livello mitocondriale. Prima di tutto, è stata riscontrata una
riduzione significativa dei livelli di calcio esclusivamente
nel distretto mitocondriale. Successivamente, abbiamo
misurato i parametri direttamente coinvolti nell’omeostasi del calcio mitocondriale, il potenziale di membrana
mitocondriale (Ψm) e i livelli di frammentazione della rete
mitocondriale. Abbiamo così riscontrato che in seguito
ad esposizione a TNFα, i mitocondri degli OPCs non
presentavano alcuna alterazione a livello della rete mitocondriale, bensì una forte riduzione dei livelli di Ψm.
È riportato in diversi studi che modificazioni del Ψm sono
spesso correlate ad alterazioni del metabolismo delle
specie reattive dell’ossigeno (ROS). Per ottenere informazioni sul metabolismo dei ROS negli OPCs, abbiamo misurato i livelli di O2- (mediante l’utilizzo delle sonde fluorimetriche Mitosox e DHE, capaci di distinguere
rispettivamente O2- prodotto nei mitocondri e O2- prodotto nel citoplasma) e H2O2 (con l’impiego della sonda
DCF). Come risultato, nei campioni sottoposti a trattamento con TNFα è stato riscontrato un forte accumulo
solamente della sonda Mitosox, indicando, quindi, che
i mitocondri degli OPCs sono fortemente indotti a produrre O2-.
È assodato che un’alterazione dell’attività dei complessi I e III della catena respiratoria mitocondriale (mETC)
CONCLUSIONI
I risultati ottenuti ci permettono di assumere che il
TNFα definisca un blocco nel differenziamento oligodendrocitario mediante un’alterazione della fisiologia
dei mitocondri.
Basandoci su osservazioni riportate in letteratura, crediamo che i mitocondri ricoprano un ruolo cruciale
nella progressione della SM. Quindi, è nostra intenzione provare ad identificare nuovi meccanismi molecolari alla base della SM in modo da sviluppare nuovi
approcci terapeutici. Testeremo una serie di composti
capaci di modulare specifici parametri mitocondriali,
in modo da contrastare gli effetti negativi indotti dal
TNFα.
A questo scopo, stiamo portando a termine uno
screening di molecole come succinato (substrato del
complesso-II della ETC), ciclosporina-A (inibitore del
poro di permeabilità mitocondriale), cgp37157 (inibitore dello scambiatore Na+/Ca2+), tempol (forte anti-
42
BIOMARCATORI
ossidante), metformina (regolatore della respirazione
mitocondriale).
Per concludere, confidiamo che i nostri studi e i nostri
risultati possano gettare nuove basi per la creazione di
nuovi approcci terapeutici contro la SM.
Analysis of mitochondrial parameters in oligodendrocytes during conditions
that mimic inflammation
It has been well established that the tumor necrosis factor alpha (TNFα) is one of the most relevant cytokines
involved in the pathogenesis of multiple sclerosis (MS).
In fact, it has been widely reported how the levels of this
cytokine correlate with the exacerbation of the pathology
as well as how it could affect the physiology of oligodendrocytes (the principal target of degeneration during aetiology of MS) in vitro. In this study we address the hypothesis, that impairment of differentiation due to TNFα
exposure is linked to affected mitochondrial physiology.
RESULTS
Initially, we found that exposure to low concentrations of TNFα impair oligodendrocyte precursor cells
(OPCs) differentiation. We observed an accumulation
of NG2+ cells (early progenitors) while reducing the relative amount of O4+ and MBP+ (immature oligodendrocytes and adult oligodendrocytes respectively). This
phenomenon was not accompanied by a significant
induction of apoptosis. Basing on this, we tested whether at this early stage TNFα was able to affect mitochondrial physiology. As first, we observed a significant
reduction in calcium (Ca2+) levels only in the mitochondrial side. To obtain a deeper comprehension about
what this mitochondrial perturbation consists of, we
measured the mitochondrial membrane potential (Ψm)
and mitochondrial fragmentation during early TNFα exposure, considering them principal features linked to
mitochondrial Ca2+. Interestingly, while mitochondria in
treated cells did not change in neither size nor number,
they displayed a significantly lower Ψm.
Variations of the Ψm are often linked to impaired energy
production as also to alterations of ROS metabolism.
In particular, a strong elevation of Ψm has been reported to lead to accumulation of different reactive species
of oxygen.
To obtain a general overview of ROS metabolism we
monitored production of both O2- and H2O2 with fluorimetric dyes. We were also able to distinguish between
mitochondrial and cytoplasmic O2- through the use of
two different dyes (MitoSOX and DHE respectively).
Interestingly, we found that only MitoSOX gave a si-
43
gnificantly higher staining in treated cells compared to
control, suggesting that mitochondria were stimulated
in O2- production by TNFα. To date, the two most
important mitochondrial sources for O2- are the mitochondrial respiratory complexes I and III. Impairment
of their activity leads to rapid and robust O2- production.
Through immunoblot we verified that OPCs treated
with TNFα for 24h display a strong reduction in respiratory complex I subunit NDUFB8 and even more interestingly, the altered levels were maintained in adult
cells during differentiation.
To further link mitochondrial impairment with oligodendrocytes differentiation, we observed that exposure to a low concentration of a generic mitochondrial
uncoupler was able to reproduce the reduction in Ψm
observed for TNFα, as also to reduce the amount of
MBP+ and O4+ cells with concomitant accumulation
of NG2+ positive cells.
To extend these observations in a more physiological system, we assessed experiments in a mixed-glia
culture, where OPCs grow on top of a bed layers of
astrocytes. As result, we observed that also in this environment, TNFα led to a reduction in mitochondrial
activity and physiology, an alteration that seems to be
responsible for the lacking of OPCs differentiation in
mature oligodendrocyte. Moreover, performing a series of myelinization assays (where OPCs were cocultured with primary neurons from rat cerebrum on a
feeder layer of rat cerebrum astrocytes), we observed
that sub-toxic treatment with TNFα determinate a significantly lower amount of MBP around the axon (and
thus the number of mature oligodendrocytes).
CONCLUSIONS
The results proposed to now show a correlation
between TNFα induced differentiation blockade and
mitochondrial conditioning. Starting from observation reported in literature, we believe mitochondria
cover a crucial role during MS pathogenesis; thus,
we would able to identify novel molecular mechanism
at the basis of MS and a consequent therapeutical
approaches. To achieve this, our intention is to test
compendio 2013
compendio 2013
BIOMARCATORI
chemical compounds targeting selected feature of
mitochondria to try to revert effect of TNFα on OPCs
differentiation. At the moment, we are screening a
series of mitochondrial active compounds: succinate
(substrate for II mitochondrial respiratory complex),
ciclosporin-A (inhibitor of the mitochondrial perme-
ability transition pore), cgp37157 (inhibitor of mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger), tempol (a synthetic
antioxidant), metformin (regulator of mitochondrial
respiration), to name but a few. Thus, we strongly believe that our studies and our goals will be important
for addressing novel therapeutic approaches.
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Patergnani S, Suski JM, Agnoletto C, Bononi A, Bonora M, De Marchi E, Giorgi C, Marchi S, Missiroli S, Poletti F, Rimessi A, Duszynski J, Wieckowski MR, Pinton P (2011) Calcium signaling
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Marchi S, Giorgi C, Suski J, Agnoletto C, Bononi A, Bonora M, De Marchi E, Missiroli S, Patergnani S, Poletti F, Rimessi A, Duszynski J, Wieckowski MR, Pinton P (2012) Mitochondria-ROS
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Giorgi C, Agnoletto C, Bononi A, Bonora M, De Marchi E, Marchi S, Missiroli S, Patergnani S, Poletti F, Rimessi A, Suski JM, Wieckowski MR, Pinton P (2012) Mitochondrial calcium homeostasis
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Bononi A, Missiroli S, Poletti F, Suski JM, Agnoletto C, Bonora M, De Marchi E, Giorgi C, Marchi S, Patergnani S, Rimessi A, Wieckowski MR, Pinton P (2012) Mitochondria-associated membranes (MAMs) as hotspot Ca2+ signalling units. Adv Exp Med Biol 740:411-38
Bonora M, Patergnani S, Rimessi A, De Marchi E, Suski JM, Bononi A, Giorgi C, Marchi S, Missiroli S, Poletti F, Wieckowski MR, Pinton P (2012) ATP synthesis and storage. Purinergic Signalling
8:343–357
Giorgi C, Baldassari F, Bononi A, Bonora M, De Marchi E, Marchi S, Missiroli S,Patergnani S, Rimessi A, Suski JM, Wieckowski MR, Pinton P (2012) Mitochondrial Ca2+ and apoptosis. Cell
Calcium 52:36-43
Bonora M, Bononi A, De Marchi E, Giorgi C, Lebiedzinska M, Marchi S,Patergnani S, Rimessi A, Suski JM, Wojtala A, Wieckowski MR, Kroemer G, Galluzzi L, Pinton P (2013) Role of the c subunit
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Patergnani S. Intracellular Ca2+ homeostasis and mitochondria in oligodendrocytes during oxidative stress and their role in apoptotic cell death” Riunione nazionale dottorandi ABCD, Gubbio
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Patergnani S. Analisi di parametri mitocondriali in oligodendrociti durante condizioni pro-infiammatorie. Congresso Scientifico Annuale FISM, 2011 e 2012.
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44
Strategie di proteomica nella sclerosi multipla: studi strutturali
e funzionali delle isoforme ossidate della transtiretina,
un possibile biomarcatore di malattia
Damiana Pieragostino
Dipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche, Unità di Biochimica Analitica e Proteomica del Ce.S.I.
Centro Studi sull’Invecchiamento, Università “G. d’Annunzio” di Chieti e Pescara
Mentore
Paolo Sacchetta
La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria autoimmune che genera disabilità croniche, probabilmente a
causa della degenerazione dei neuroni, a cui segue il fallimento del processo di rimielinizzazione. La transtiretina
(TTR) è il principale vettore dell’ ormone tiroideo (TH) nel
sistema nervoso centrale (SNC). L’TH è una componente
importante della macchina molecolare che regola la proliferazione e differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in oligodendrociti mielinizzanti. I nostri dati
preliminari di proteomica hanno mostrato come la cisteina
10 della TTR può ossidarsi formando ponti disolfuro a tiocisteina e sulfo-cisteina in maniera differenziale nel liquido
cerebrospinale (CSF) di pazienti con SM.
Il primo obiettivo è stato realizzare esperimenti funzionali e
strutturali sulla TTR cerebrale, su cui si erano ottenuti dati
preliminari di proteomica. Il secondo obiettivo è stato quello
di evidenziare nuovi potenziali biomarcatori di SM attraverso un’ analisi comparativa dei peptidi e metaboliti nei fluidi
biologici di pazienti mediante spettrometria di massa.
sembra essere in accordo alla teoria che l’ossidazione
del TTR possa influenzare il trasporto di TH nel SNC. Il
secondo obiettivo del progetto era la caratterizzazione di
un intervallo molecolare differente rispetto al primo metodo di proteomica impiegato, per effettuare un’analisi comparativa dei peptidi e metaboliti nel CSF. A questo scopo
abbiamo scelto di studiare specie lipidiche, poiché studi
recenti riportano mediatori lipidici nei processi autoimmuni. Mediante un approccio LC-MS lo studio di lipidomica
condotto ha messo in luce, per la prima volta, alti livelli di
lyso-glicerofosfatidilcoline (lysoPC) e glicerofosfatidilcoline
(PC) nel siero di pazienti SM. Per analizzare un fluido biologico in contatto con SNC, come programmato nella proposta di progetto, è stata selezionata una piccola coorte di
soggetti SM e OND. Per analizzare alterazioni metaboliche
nella SM, il CSF è stato analizzato mediante approcci di
metabonomica e i livelli di amminoacidi e carnitine sono
stati correlati con livelli di lipidi polari. Queste analisi preliminari hanno mostrato livelli differenziali di diverse specie
molecolari (soprattutto lipidi) nei gruppi clinici investigati.
RISULTATI
CONCLUSIONI
Per chiarire come le ossidazioni sulla cisteina 10 (Cys10)
possano modificare il folding della TTR e il suo legame con
il TH abbiamo studiato, mediante spettrometria di massa,
diversi campioni di SM, campioni di pazienti affetti da EncefaloMielite Acuta Disseminata (ADEM), considerata parte
della SM, e un gruppo di pazienti con altre malattie neurologiche (OND). I risultati mostrano elevati livelli delle modifiche post traduzionali (PTMs) ossidative nella SM. Mediante
Western Blot di questa proteina, abbiamo mostrato, in
campioni di SM, una doppia banda riconducibile ad un dimero anomalo quasi sempre assente negli altri gruppi clinici. I risultati hanno dimostrato un andamento proporzionale
(p <0,05) tra la percentuale di dimero anomalo e i livelli delle
isoforme ossidate di TTR. Dati di letteratura hanno messo
in luce come la sulfidrilazione delle proteine (-SH) sembra
essere modulata da acido solfidrico (H2S) endogeno. Per
questo motivo abbiamo misurato i livelli di H2S nel CSF dei
gruppi studiati ottenendo livelli significativamente più elevati
nei soggetti ADEM. Non è stata trovata nessuna differenza
tra pazienti SM ed OND. Inoltre il livello medio di T4 libero
nel CSF di soggetti con SM è risultato di 8,47 ± 0,98 pmol
/ L, mentre di 11,96 ± 1,43 pmol / L nei pazienti OND , mostrando una concentrazione significativamente (p <0,001)
minore di T4 libero nella SM. Questo risultato preliminare
45
In conclusione, questi dati biochimici potrebbero aiutare
a comprendere il complesso meccanismo molecolare
attivato durante le fasi di ricaduta e remissione di SM. I
nostri dati mostrano come la TTR svolga un ruolo importante in questo meccanismo, e come le PTMs ossidative
potrebbero essere correlate alla sua funzione. Tenendo in
mente il limite di questa indagine e la necessità di comprendere più in profondità tale fenomeno, questo studio
può rappresentare un importante punto di partenza per
la caratterizzazione dei PTMs della TTR cerebrale. Inoltre,
questo studio può aiutare a comprendere il ruolo della
TTR nel trasporto di THs nel SNC. Se confermati tali dati,
le potenziali applicazioni potrebbero essere significative
soprattutto in virtù della possibilità di utilizzarli, da un punto
di vista clinico. La PTMs della TTR, così come i livelli di
THs nel CSF potrebbero essere usati come biomarcatori
di malattia, così come per la ricerca di nuovi bersagli farmacologici per migliorare la diagnosi e la prognosi. Infine,
le indagini di metabolomica/lipidomica hanno completato
la panoramica del repertorio molecolare nei fluidi biologici.
Le presunte alterazioni metaboliche evidenziate dovranno
essere ulteriormente validate in studi clinici più ampi, ma
le loro potenzialità sono sicuramente intuibili, considerato che il campo risulta completamente inesplorato.
compendio 2013
compendio 2013
BIOMARCATORI
Proteomic strategies in multiple sclerosis: structural and functional investigations
on oxidized transthyretin isoforms, a candidate biomarker of disease
Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory autoimmune
disorder that generates chronic disabilities probably due
to neuron injure and degeneration, which follow remyelination failure. TTR is the major Thyroid Hormone (TH)
carrier in the Central Nervous System. TH is a major
component of the molecular machinery that regulates
oligodendrocytes precursor cells (OPC) proliferation and
differentiation and so OPC conversion into myelinating
oligodendrocytes. Our preliminary proteomics data showed as Cysteine in position 10 of the TTR can oxidizes
forming disulfide bridges adjective to thio-cysteine and
sulfo-cysteine isoforms. We measured high levels of these isoforms in CSF of MS patients. The first objective
of this project was to carry out functional and structural
experiments on cerebral transthyretin (TTR), on which
we obtained preliminary proteomics data. The second
objective was to highlight new potential biomarkers of
SM through a comparative analysis of metabolites in biological fluids by mass spectrometry.
RESULTS
To elucidate how the oxidations on Cys 10 can modify TTR folding and its binding with TH we studied,
by mass spectrometry, MS samples, samples of
patients with Acute Disseminated Encephalomyelitis (ADEM), considered part of the MS borderline
disease, and a group of patients with Other Neurological Disease (OND). Results show high levels of
oxidative PTMs in MS . By Western Blot analysis we
showed a significant presence of a double band predominantly in MS subjects, that was reconducted
to an anomalous dimer. Furthermore we demonstrated a proportional trend (p<0.05) between the % of
anomalous dimer and the relative intensity of thio
and sulfo TTR isoforms registered. A lot of works
describe that protein sulfhydration (-SH) seems to
be modulated by endogenous H2S. For this reason
we measured a total ppm of H2S in CSF of studied
groups, obtaining significantly high levels in ADEM
subjects while no difference between MS and OND
patients was found. Level of free T4 in CSF was of
8.47±0.98 pmol/L and of 11.96±1.43 pmol/L in MS
and OND respectively, showing significant (p<0.001)
lower concentration of free T4 in MS. This preliminary result seems to be in agreement to the theory that
oxidation of TTR influences T4 binding. The second
objective of the project was to search new potential
biomarkers by mass spectrometry approach looking
46
in a different molecular range in respect to the first
proteomic method employed. For this purpose we
investigated lipids species in biological fluids since
recent studies suggest lipid mediator in the autoimmune process. The first application was an LC-MS
based lipidomics approach in serum. Preliminary
data of this lipidomics approach highlighted altered
levels of glycerophosphatidylcholine (lysoPC) and
glycerophosphatidylcholine (PC) species in MS.
Moreover, to analyze a biological fluid in contact
with CNS, as programmed in the project proposal a
small cohort of MS and OND CSF was screened by
targeted and un-targeted mass spectrometry approaches in order to highlight metabolic pathways
alteration in MS disease. Levels of AminoAcids and
carnitines, have been correlated to circulating polar lipids, showing altered levels of several molecular species (especially lipids) between investigated
groups.
CONCLUSIONS
Our biochemical data could help in understanding
the complex molecular machinery activated during
MS attack and remission. Our data on TTR show
that this protein plays an important role in this opera, and as the oxidative PTMs could be related to
its function. Bringing in mind the limitation of this
investigation and the needed of deeply understand
such a phenomenon, this study may represent an
important starting point in the understanding of TTR
PTMs role in THs transport into the brain. If confirmed these data, the potential applications could be
significant, especially in virtue of the possibility to
use them, from a clinical point of view. The PTMs
of TTR, as well as the levels of THs in CSF may be
used as biomarkers of disease, as well as in the
search for new pharmacological targets. Finally, the
metabolome/lipidome investigation, completed the
overview of the molecular repository of biological
fluids even if our preliminary studies could be further
validated in a more extensive clinical study, but their
potential is certainly definitely because the field is
completely unknown.
...................................................................................................................................................
Pieragostino D, Del Boccio P, Di Ioia M., Pieroni L, Greco V, De Luca G, D’Aguanno S, Rossi C, Franciotta D, Centonze D, Sacchetta P, Di Ilio C, Lugaresi A. and Urbani A. Oxidative modifications
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Del Boccio P, Pieragostino D, Di Ioia M, Petrucci F, Lugaresi A, De Luca G, Gambi D, Onofrj M, Di Ilio C, Sacchetta P, Urbani A. “Lipidomic investigations for the characterization of circulating
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Pieragostino D, Del Boccio P, di Ioia M, Pieroni L, D’Aguanno S, Greco V, Centonze D, Franciotta D, Di Ilio C, Lugaresi A, Sacchetta P, Urbani A. Oxidative modifications of cerebral transthyretin
are associated with multiple sclerosis. Proteine 2012- Chieti 25-26 Settembre 2012
Pieragostino D, Del Boccio P, di Ioia M, Pieroni L, , Greco V, Centonze D, De Luca G, Franciotta D, Di Ilio C, Centonze D, Sacchetta P, Lugaresi A, Urbani A. Proteomic investigations on differential
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post-translational modifications of transthyretin in multiple sclerosis.
Italian Proteomics Association, 6th Annual National Conference” Torino 21-24 Giugno 2011
Pieragostino D, Del Boccio P, di Ioia M, Pieroni L, Centonze D, Franciotta D, Di Ilio C, Lugaresi A, Urbani A and P. Sacchetta. Proteomic strategies in multiple sclerosis: structural and functional
investigations on oxidized transthyretin isoforms, a candidate biomarker of disease. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma 2011
...................................................................................................................................................
47
Microvescicole microgliali nel liquido cerebrospinale:
un potenziale marcatore nella sclerosi multipla
Claudia Verderio
Istituto CNR di Neuroscienze, Dipartimento di Biotecnologie e medicina Traslazionale, Milano
Collaboratori
Michela Matteoli, Elena Turola, Loredana Riganti
Roberto Furlan, Unità di Neuroimmunologia Clinica, Divisione di Neuroscienze, Ospedale San Raffaele, Milano
tico di correlazione con parametri prognostici (tempo di
conversione a SM, etc.). Questi risultati suggeriscono
che il numero delle MVs nel fluido cerebrospinale riflette l’attivazione della microglia/l’infiltrazione di macrofagi
periferici, che è strettamente associata alla severità della
SM e che contribuisce ai sintomi clinici della malattia al
suo esordio. Inoltre, questi dati identificano le MVs presenti nel liquor come un marcatore di attivazione in vivo
di microglia/macrofagi, potenzialmente utile come strumento complementare per la diagnosi della SM e /o per
monitorare l’efficacia di farmaci nel corso della malattia.
Obiettivo 2
Per svolgere il secondo obiettivo del progetto, ossia
identificare putative molecole specificamente contenute
nelle MVs isolate da persone con SM, abbiamo analizzato il contenuto di miRNA in MVs prodotte in vitro
da microglia polarizzata verso un classico fenotipo infiammatorio o un fenotipo pro-rigenerativo o esposte
al peptide amiloidogenico A beta 1-42, la proteina tossica associata alla demenza di Alzheimer, in modo da
simulare l’ambiente a cui è esposta la microglia in vivo in
condizioni neuro-infiammatorie o degenerative. L’analisi
dei miRNA è stata effettuata tramite tecnologia Exiqon,
utilizzando piastre per microRNA “LNA Universal PCR”.
Con questo approccio abbiamo osservato che molti miRNA sono differenzialmente up-/down-regolati in
MVs prodotte da microglia polarizzata verso fenotipo
infiammatorio, rispetto ai miRNA presenti in MVs rilasciate da cellule esposte ad A beta 1-42 o ad agenti
che inducono nella microglia un fenotipo anti-infiammatorio e pro-rigenerativo. Come sopra accennato, dato
che il progetto è stato finanziato come pilota, non abbiamo avuto tempo e risorse per confermare mediante
RT-PCR le variazioni dei livelli di miRNA rilevate tramite
piastre Exiqon e per validare i risultati ottenuti in vitro utilizzando MVs isolate da persone con SM o controlli sani.
Le microvescicole (MVs) rilasciate dalla superficie
cellulare sono state identificate come importanti
mediatori di comunicazione intercellulare e stanno
emergendo come nuovi biomarcatori di danno tissutale. Scopo del nostro progetto è stato valutare se la
produzione di MVs da microglia/macrofagi potesse
aumentare nel corso di sclerosi multipla (SM) e chiarire se le MVs potessero rappresentare un biomarcatore della malattia. Gli obiettivi proposti prevedevano di: 1) quantificare tramite citometria a flusso la
quantità di MVs di derivazione microgliale nel liquido
cerebrospinale (CSF) di persone con SM 2) identificare miRNA/mRNA presenti nelle MVs rilasciate in
vitro da microglia reattiva, come possibili nuovi biomarcatori di SM 3) valutare se e come le MVs isolate
da CSF di persone con MS potessero influenzare la
funzionalità di neuroni e oligodendrociti, sia in vitro
che in vivo. Lo studio è stato finanziato come progetto pilota in quanto il Comitato Scientifico ha ritenuto che i dati ottenuti nei pazienti fossero troppo
preliminari. Ci siamo quindi concentrati sui primi due
obiettivi del progetto proposto, quantificando le MVs
nel liquido cerebrospinale di persone con SM e analizzando il contenuto di microRNA in MVs rilasciate
da cellule microgliali in vitro.
RISULTATI
Obiettivo 1
Abbiamo affrontato il primo obiettivo analizzando il liquor
prelevato da due coorti indipendenti di donatori sani,
persone con sindrome clinica isolata (CIS, n = 28, con
un possibile stato acuto iniziale della malattia), persone
con diagnosi definitiva di SM (n = 72), e pazienti affetti da
altre malattie neurologiche. La quantificazione mediante
citometria a flusso ha rivelato che la concentrazione di
MVs di origine mieloide (prodotte da microglia o macrofagi) è significativamente aumentata nel liquido cerebrospinale prelevato da persone con CIS e con SM in fase
acuta. Inoltre, abbiamo osservato che la concentrazione
di MVs è correlata al numero di lesioni captanti gadolinio in persone con SM per le quali entrambi i parametri
erano disponibili. Tutti gli altri parametri clinici che abbiamo esaminato non hanno mostrato alcuna associazione
significativa. È attualmente in corso uno studio prospet-
CONCLUSIONI
I nostri risultati identificano le MVs presenti nel liquido
cerebrospinale umano come un strumento diagnostico utile per valutare l’attività della SM. Suggeriscono
inoltre che le microvescicole di origine microgliale possano rappresentare un valido strumento prognostico
per identificare le persone che necessitano un rapido
passaggio a trattamenti terapeutici di seconda linea, o
48
BIOMARCATORI
pazienti con sindrome clinica isolata (CIS) che necessitano un trattamento precoce.
Anche se ulteriori studi sono necessari per chiarire se
l’analisi del contenuto delle MVs possa aiutare a decifrare il fenotipo acquisito dalla microglia durante la SM,
i dati, per ora, ottenuti facilitano la futura identificazione di marcatori specifici per SM all’interno delle microvescicole, risultato che potrebbe aumentare in modo
significativo il potenziale delle MVs nella diagnosi della
malattia.
CFS microglial microvesicles: a potential biomarker for multiple sclerosis
Microvesicles (MVs) released from the cell surface have
been indicated as important mediators of intercellular
communication and are emerging as new biomarkers of
tissue damage. Aim of our project was to evaluate whether production of MVs from microglia/macrophages
may increase in the course of multiple sclerosis (MS) and
whether myeloid MVs may serve as biomarkers of the
disease. Proposed objectives of the project were to: 1)
quantify by flow cytometry the amount of microglia-derived MVs in the cerebrospinal fluid (CSF) of persons with
MS 2) identify mRNA/miRNAs in microglial MVs released in vitro from reactive microglia, as possible novel MS
biomarkers 3) to assess if and how MVs collected from
CSF of MS persons affect the functionality of neurons
and oligodendrocytes, both in vitro and in vivo.
The application was funded as a pilot project because
the Scientific Committee thought that data obtained in
human patients were too preliminary. We therefore focused on the first two objectives of the proposed project by
quantifying the amount of MVs in the CSF of MS patients
and by analysing the microRNA content of MVs shed in
vitro.
RESULTS
Objective 1
We addressed the first objective by analyzing the CSF
from two independent cohorts of healthy donors,
subjects with Clinical Isolated Syndrome (CIS, n=28, a
possible initial and acute stage of the disease), subjects
with definite MS (n=72), and patients with other neurological diseases. Quantification by flow cytometry revealed that myeloid MVs are significantly increased in the
CSF from both CIS and relapsing MS subjects. Furthermore, we observed that the concentration of MVs
is correlated to the number of gadolinium enhancing
lesions in MS persons, where both parameters were
available. All other clinical parameters we examined
showed no significant association. A perspective study on prognostic parameters (time to MS conversion,
time to confirmed progression, etc.) is ongoing.
These results suggest that the amount of MVs in the
CSF reflects activation of microglia and infiltration of
peripheral macrophages, which are strictly associated
49
with MS severity and contribute to clinical symptoms
in early disease. Moreover, these data identify CSF
myeloid MVs as novel biomarker of microglia/macrophage activation in vivo, potentially useful as companion tool for disease diagnosis and/or for monitoring
the efficacy of drugs targeting MS.
Objective 2
To address the second objective of the project
and identify putative MS signatures inside MVs we
analysed the miRNA content of MVs shed in vitro from
microglia polarized towards a classical inflammatory
phenotype or a pro-regenerative phenotype or exposed to the amyloidogenic peptide Aβ1-42, the toxic
protein associated to Alzheimer’s disease, to mimic
conditions occurring in neuro-inflammatory or in degenerative diseases. miRNA detection was carried out
with Exiqon mercury LNA Universal microRNA PCR
Panels. By this approach we found that many miRNAs
are differentially up-/down-regulated in MVs shed from
inflammatory microglia, polarized towards M1 phenotype with inflammatory cytokines, as compared to MVs
produced from cells exposed to A beta 1-42 or M2
polarizing agents. As mentioned above, given the proposed project was founded as a pilot project we did
not have time and resources to confirm changes of
miRNAs by RT- PCR and to validated them on MVs
isolated from MS persons and healthy controls.
CONCLUSIONS
Our results identify microglia-derived MVs present in
human CSF as a companion diagnostic tool to capture multiple sclerosis activity and suggest that microvesicles may also represent a valuable prognostic
tool to identify very active patients, likely to need a
prompt shift to second line treatments, or patients
with Clinical isolated syndrome (CIS) needing early
treatment.
Although further work is necessary to clarify whether
analysis of MVs content may help deciphering the
phenotype acquired by microglia during MS, our results pave the way towards possible identification of
MS specific cell signature, which may increase the
potential of myeloid MVs as companion tool for MS
diagnosis.
compendio 2013
compendio 2013
BIOMARCATORI
...................................................................................................................................................
Antonucci F, Turola E, Riganti L, Caleo M, Gabrielli M, Perrotta C, Novellino L, Clementi E, Giussani P, Viani P, Matteoli M,Verderio C. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity
via enhanced sphingolipid metabolism. EMBO Journal, 2012. Jan 13. doi: 10.1038/emboj.2011.489
Verderio C, Muzio L, Turola E, Bergami A, Novellino L, Ruffini F, Riganti L, Corradini I, Francolini M, Garzetti L, Maiorino C, Servida F, Vercelli A, Rocca M, Dalla Libera D, Martinelli V, Comi G, Martino
G, Matteoli M, Furlan RMyeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Ann Neurol. 2012 Oct;72(4):610-24. doi: 10.1002/ana.23627.
Turola E, Furlan R, Bianco F, Matteoli M,Verderio C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Front Physiol. 2012;3:149. doi: 10.3389/fphys.2012.00149. Epub 2012 May 22.
Colombo E, Borgiani B,Verderio C, Furlan R. Microvesicles: novel biomarkers for neurological disorders Front Physiol. 2012;3:63. doi: 10.3389/fphys.2012.00063. Epub 2012 Mar 29.
Verderio C.Microvesicles shed from microglia represent a new pathway of glia-to-neuron communication. 4th International Conference on Purinergic Drugs and Targets, Bonn. July 22-25 2011
(invited speaker);
Verderio C. Microvesicles in the cerebrospinal fluid reflect microglia/macrophage activation in rodent and human neuro-inlammation.10th European meeting on Glial Cells in health and disease
Prague. September 13-17 2011
Verderio C. Microvesicles shed from microglia represent a new pathway of glia-to-neuron communication. 10th European meeting on Glial Cells in health and disease Prague. September 13-17
2011
Verderio C. Microvesicles shed from microglia represent a new pathway of glia-to-neuron communication. 8th World congress of Neuroscience. Florence July 14-18 2011
Verderio C. Secretory pathways in astrocytes . ISN Satellite meeting Glial cells in (patho) physiology Ljubljana, Slovenia, August 24-27, 2011 (invited speaker)
Verderio C. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Ectrims 2011, Amsterdam, 19-22 October 2011
Verderio C. Microglia-derived microvesicles represent a new mechanism of microglia-to-neuron communication and a novel biomarker of microglia activation. ISEV 2012 , Goteborg, April 2012
(selected oral communication)
Verderio C. Microvesicles shed upon P2X7 receptor activation represent a new mechanism of microglia-to-neuron communication and a novel biomarker of microglia activation. International
Purine Meeting 2012 , Fukuoka , 31 May-2 June 2012
..................................................................................................................................................
50
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
Il ruolo del gene ACCN1 nella suscettibilità e patogenesi
della sclerosi multipla
Luisa Bernardinelli
Dipartimento di Brain and Behavioral Science, Università di Pavia, Pavia
Collaboratori
Carlo Berzuini, Luisa Foco, Roberta Pastorino, Alessandra Bianchi, Roberto Zanotti
Michael J Welsh, Margaret P Price, Huiyu Gong, Carver College of Medicine, University of Iowa, US
Tamas Dalmay, Guy Wheeler, School of Biological Science, University of East Anglia, UK
Kate Rice, Anton Enright, The Wellcome Trust Sanger Institute, “European Bioinformatics Institute”, UK
Stephen Sawcer, Department of Clinical Neurosciences, Addenbrooke’s Hospital, University of Cambridge, Cambridge, UK
Anna Ticca, Pierpaolo Bitti, Ospedale San Francesco, Nuoro
Lars Fugger, Department of Clinical Neurology, University of Oxford, UK
Giuseppe Battaglia, Dipartimento di Neuroscienze, I.R.C.C.S. Neuromed, Pozzilli, Isernia
Gli esperimenti sul modello animale di SM, l’encefalite sperimentale autoimmune (ESA), in topi con geni
ACCN1 e ACCN2 normali (WT) e in topi con i geni non
funzionanti (KO), hanno mostrato che i topi KO_ACCN1
e KO_ACCN2 tendono a mostrare una minore disabilità
rispetto a quelli WT. Inoltre i topi KO_ACCN2 presentano
una minor disabilità di quelli KO_ACCN1 nelle prime fasi
della malattia, ma maggiore nelle fasi più avanzate della
malattia. Esperimenti sul dolore hanno evidenziato che i
topi KO_ACCN1, ma non quelli KO_ACCN2, hanno una
soglia del dolore aumentata rispetto ai topi WT.
Gli esperimenti in vitro sui miRNA hanno mostrato che la
variante SNP (single-nucleotide polymorphism) rs28936
del gene ACCN1 ha un ruolo funzionale nel regolare l’espressione di ACCN1 e che il miR27 si lega a rs28936,
anche se non è tuttora chiaro se esso leghi l’allele A o
l’allele G.
Inferenza sul ruolo causale dello SNP rs28936: rs28936,
attraverso l’azione di un miRNA, controlla l’espressione
di ACCN1 e quindi il livello della proteina espressa da
questo gene. L’analisi dei dati si è basata su una assunzione di randomizzazione mendeliana rispetto allo SNP,
e sull’assunzione che l’effetto dello SNP sull’andamento
della malattia sia interamente mediato da ACCN1 e dalla
proteina da esso espressa. Tali assunzioni ci permettono
di giustificare un’analisi che mette insieme dati derivati da
esperimenti indipendenti: un esperimento in vitro sui miRNA (che dimostra un impatto di rs28936 sulla quantità di
proteina) e un esperimento sui topi (che mostra l’impatto
del KO_ACCN1 sull’andamento temporale dello score
clinico). Attraverso l’analisi integrata dei due set di dati è
possibile comprovare e quantificare l’effetto causale della
proteina espressa da ACCN1 sull’andamento temporale
dello score clinico (misura della malattia). La quantificazione dell’effetto causale ha richiesto un’ulteriore assunzione di linearità degli effetti in gioco.
Inoltre, un nostro studio genetico su dati da famiglie nucleari ha dimostrato l’esistenza di un’interazione quali-
I geni ACCN (“Amiloride-sensitive Cation Channel
Neuronal”, canali ionici neuronali sensibili all’amiloride), noti anche come ASIC (Acid Sensing Ion Channels) creano dei “pori molecolari”, i canali ionici, che si
inseriscono nella membrana delle cellule nervose e lasciano transitare gli ioni dentro e fuori le cellule, generando il segnale elettrico alla base della conduzione degli
impulsi nervosi. Questi canali si aprono in risposta ad
un abbassamento del pH, per esempio causato dall’infiammazione che accompagna la sclerosi multipla (SM).
L’apertura di questi canali ionici in queste circostanze è
anche, in parte, responsabile del dolore neuropatico che
affligge pazienti con SM.
Gli indizi del legame tra i geni ACCN con la SM provengono da studi indipendenti: uno genetico, da noi realizzato nella provincia di Nuoro, che ha dimostrato un’associazione tra la variante rs28936 del gene ACCN1 e
la SM, e uno studio inglese su un modello animale di
SM che ha mostrato un miglioramento dello score clinico dei topi in seguito al blocco del gene ACCN2 che
interagisce con ACCN1. La presente ricerca mira ad approfondire il legame ACCN1-SM effettuando una serie
di esperimenti su modelli animali e cellulari per capire se
e come ACCN1, in sinergia con ACCN2, contribuisca
all’insorgenza e modulazione del decorso della SM.
RISULTATI
Esperimenti sull’espressione di ACCN1 e di colocalizzazione di ACCN1/2 in cervelli di topi normali evidenziano
che questi geni sono coespressi nei neuroni e che i loro
livelli relativi variano sia fra diverse strutture cerebrali che
all’interno di esse, particolarmente nella corteccia cerebrale. I pattern di espressione di ACCN1/2 suggeriscono
un ruolo pleiotropico di questi canali in molti circuiti che
integrano una varietà di segnali, in particolare, quelli che
aumentano il comportamento di eccitazione in risposta
allo stress e a cambiamenti autonomici.
52
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
tativa tra gli effetti dello SNP rs28936 in ACCN1 e dello
SNP rs3890137 in PRKCA (PRKCA protein kinase C,
alfa) sulla SM. È noto che, in condizioni non patologiche,
ACCN1 e PRKCA interagiscono attraverso PICK1, la
nostra analisi mostra che la presenza/assenza dell’allele
G in rs3890137 modifica l’effetto di rs28936 sulla SM.
Questo evidenzia che rs28936 attraverso ACCN1 ha un
effetto causale sulle SM.
CONCLUSIONI
Abbiamo per la prima volta individuato in ACCN1 un
gene di suscettibilità per la SM coinvolto nella neurodegenerazione, e dimostrato che lo SNP rs28936, situato nel 3’ non tradotto del gene ACCN1, influenza
l’espressione di quest’ultimo (e della corrispondente
proteina) e, attraverso tale proteina, esercita un effetto
causale sulla SM. Metodi di inferenza causale (basati su un’assunzione di assenza di fattori di confondimento, giustificata da argomenti di randomizzazione
mendeliana) ha permesso di unire la forza derivante
dal nostro studio genetico nella provincia di Nuoro con
quella fornita dai nostri studi su modelli animali e cellulari. Questi risultati potrebbero avere importanti ricadute in termini di cura dei pazienti con SM attraverso
la scoperta di farmaci, più specifici dell’amiloride che
blocchino gli ACCN. ACCN1 potrebbe anche giocare
un ruolo importante nel determinare il dolore in pazienti con SM.
The role of ACCN1 gene in multiple sclerosis susceptibility and pathogenesis
ACCN (Amiloride sensitive Cation Channel Neuronal) genes, also known as ASIC (Acid Sensing Ion Channels)
code for ion channels. These are intrinsic membrane
proteins that act as gated pores and regulate the movement of ions across all cell membranes thus creating
the electrical signal at the basis of the nervous impulse
transmission. These ion channels open in response to
a pH decrease, such as caused by inflammatory processes associated with MS. The opening of these ion
channels is also, at least in part, responsible for the neuropathic pain that affects many MS patients. Clues about
the relationship between ACCNs-MS originate from independent studies: our genetic study in the Nuoro population that found an association between the rs28936 variant of ACCN1 and a British study on the animal model
for MS that showed an improvement of the clinical score
of the mice in which ACCN2 activity (a gene known to
interact with ACCN1) is blocked. This research aims at
investigating the relationship between ACCN1 and MS
via a series of experiments on animal and cellular models to understand if and how ACCN1, in synergism with
ACCN2, contributes to the MS onset and modulation of
the disease course.
RESULTS
Experiments on ACCN1 expression and on colocalization of ACCN1/2 in the brain of normal mice show that
these two genes are coexpressed in neurons, and that
their relative levels vary widely both within and between various brain structures (particularly in the cerebral
cortex). The expression pattern of ACCN1/2 suggests
a pleiotropic role for these channels in many circuits
that integrate a variety of signals, especially those in-
53
creasing behavioral arousal in response to stress and
autonomic changes. Experiments on the EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) model
for MS in mice with functioning (WT: wild type) and
non-functioning (KO: knock out) ACCN1/2, show that
KO_ACCN1 mice tend to have a less severe disability
than WT mice. Furthermore, KO_ACCN2 mice show
a less severe disability than KO_ACCN1 ones at disease onset, but a more severe disability at later stages
of the disease. Experiments on pain show a higher
pain threshold for KO_ACCN1 than WT mice, but no
difference in pain threshold between KO_ACCN2 and
WT mice.In vitro experiments on micro RNA (miRNA)
show that the rs28936 SNP has a functional role in regulating ACCN1 expression, and that the miR27 binds
rs28936, although it is not clear if it binds the allele A
or the allele G.
Inference on the causal role of rs28936: as reported
above, the rs28936 SNP, regulates via miRNA the expression of ACCN1 and hence the level of the corresponding protein. Under a “mendelian randomization” assumption that the SNP is chosen (by Nature)
at random and that the effect of the SNP on disease
is entirely mediated by ACCN1 and its corresponding
protein, the existence of a causal effect of the protein
expressed by ACCN1 on the evolution of the clinical
score (a measure of disease severity) can be validly
assessed by an analysis that combines data from an
in vitro experiment on miRNA (showing the impact of
rs28936 on protein quantity) and an experiment on
mice (showing the impact of KO_ACCN1 on the temporal pattern of the clinical score). Quantification of the
causal effect requires a further assumption on linearity
of the effects. In our genetic study on MS trios, a qua-
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
litative interaction effect between rs28936 in ACCN1
and rs3890137 in PRKCA (PRKCA protein kinase C,
alpha) emerged. It is known that in non pathological
conditions ACCN1 e PRKCA physically interact via
PICK1. Our analysis shows that the presence/absence of the G allele in rs3890137 modifies the effect of
rs28936 on MS. This shows that rs28936 via ACCN1
has a causal effect on MS.
CONCLUSIONS
We have, for the first time, identified in ACCN1 an MS
susceptibility gene involved in neurodegeneration,
and we have shown that the SNP rs28936, located in
the 3’ untranslated region of ACCN1, influences the
expression of this gene and that of the corresponding protein. Moreover, we have shown evidence of
the protein coded by ACCN1 exerting a causal effect
on MS. This has been possible by adopting methods
of causal inference under an assumption of absence of confounding which is typically accepted in this
context via mendelian randomization arguments. The
method allowed the strength of our genetic study
in the Nuoro population and that of our studies on
animal and cellular models to be combined. These
results could be important for patient treatment via
the discovery of drugs, more specific than amiloride,
which can block ACCNs genes. ACCN1 could also
play a role in determining pain in MS patients.
...................................................................................................................................................
Price MP, Gong H, Parsons MG, Kundert J, Reznikov LR, and Welsh MJ - Acid Sensing Ion Channel Localization and Behaviors in Null Mice Suggest a Role in Modulating Responses to Emotional Stressors. Society for Neuroscience meeting, San Diego, 16th November 2010.
Foco L, Pastorino R, Vergo S, Molina F, Saddi V, Van Dongen S, Bitti P, Piras,ML Ticca A, Berzuini C, Rice C, Dalmay T, Craner M, Fugger Welsh M, Price, Bernardinelli L,. The role of ACCN1
gene MS susceptibility and pathogenesis/Il ruolo del gene ACCN1 nella suscettibilità e patogenesi della SM. Congresso Scientifico Annuale FISM. Roma, Maggio 2010.
Bernardinelli L, Foco L, Pastorino R, Vergo S, Molina F, Saddi V, Van Dongen S, Bitti P, Piras,ML Ticca A, Berzuini C, Rice C, Dalmay T, Craner M, Fugger Welsh M, Price. M. The role of ACCN1
gene MS susceptibility and pathogenesis. Convegno “Genomics of Common Diseases”, Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, UK, 2011
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Foco L, Pastorino R, Vergo S, Molina F, Saddi V, Van Dongen S, Bitti P, Piras,ML Ticca A, Berzuini C, Rice C, Dalmay T, Craner M, Fugger Welsh M, Price, Bernardinelli L. The role of ACCN1 gene
MS susceptibility and pathogenesis/Il ruolo del gene ACCN1 nella suscettibilità e patogenesi della SM. Congresso Scientifico Annuale FISM. Roma, Maggio 2011.
Bernardinelli L, Foco L, Pastorino R, Vergo S, Molina F, Saddi V, Van Dongen S, Bitti P, Piras,ML Ticca A, Berzuini C, Rice C, Dalmay T, Craner M, Fugger Welsh M, Price. M Battaglia. G. The
role of ACCN1 gene MS susceptibility and pathogenesis/Il ruolo del gene ACCN1 nella suscettibilita’ e patogenesi della SM. Congresso Scientifico Annuale FISM. Roma, Maggio, Maggio 2012.
Bernardinelli L, Berzuini C, Foco L, and Pastorino R. Ion channels as a possible mechanism of neurodegeneration in multiple sclerosis in Causality. Statistical Perspectives and Applications”, pp
208-217 in L. Ed. Dawid P Berzuini C Bernardinelli Wiley, 2012,
Price MP, Gong H, Parsons MG, Kundert J, Reznikov LR, Bernardinelli L, Buchanan GF, Wemmie JA, Richerson GB, Cassell MD, and Welsh MJ. Localization and Behaviors in Null Mice Suggest
that ASICs Modulate Responses to Aversive Stimuli. Submitted to Genes, Brain, and Behavior (April, 2013)
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54
Correlazione tra neurodegenerazione e infiammazione
nella sclerosi multipla: NR4A2 come modulatore
di infiammazione
Antonio Bertolotto
Azienda Ospedaliero Universitaria (AOU) S. Luigi Gonzaga, Orbassano
Collaboratori
Simona Perga, Nicole Navone, Marzia Caldano, Simona Malucchi
L’infiammazione è uno dei meccanismi responsabili della
neurodegenerazione in diverse malattie neurodegenerative tra cui la sclerosi multipla (SM). NR4A2, fattore di trascrizione appartenente alla famiglia dei recettori nucleari
orfani, rappresenta un collegamento tra infiammazione e
neurodegenerazione. È stato infatti dimostrato che, oltre
ad un ruolo essenziale nello sviluppo e mantenimento dei
neuroni dopaminergici, NR4A2 gioca un ruolo chiave nel
proteggere i neuroni dalla neurotossicità indotta da infiammazione attraverso la via di segnalazione di NF-kB.
Dati prodotti in precedenza nel nostro laboratorio mostrano una significativa riduzione dell’espressione genica
di NR4A2 nel sangue periferico di pazienti affetti da SM
rispetto a controlli sani. In particolare, è stato osservato
che il livello di trascritto correla con il grado di aggressività
della malattia e con parametri clinici quali il Relapse Rate
e la progressione dell’EDSS. Obiettivo di questo studio
è determinare se malattie neurodegenerative come il
morbo di Parkinson (PD), l’Alzheimer (AD) e la Sclerosi
Laterale Amiotrofica (SLA) sono caratterizzate da una
deregolazione del gene NR4A2 e paragonarne il livello
di espressione con quello di pazienti SM non in terapia
e controlli sani della stessa età. Infine, per analizzare il
ruolo di NR4A2 nella patogenesi della SM, abbiamo deciso di studiare l’effetto della riduzione dell’espressione
di NR4A2 in un modello murino di SM, ottenuto tramite
immunizzazione con il peptide MOG 35-55, valutando
l’incidenza e la severità dell’Encefalomielite Sperimentale Autoimmune (ESA) in topi NR4A2-deficitari. Il modello
scelto permette di valutare il coinvolgimento del gene a
livello sistemico sia nelle fasi di infiammazione acuta che
cronica. Allo stesso tempo, per meglio indagare il ruolo
di NR4A2 nella SM abbiamo analizzato la variazione dell’
espressione del gene nel modello murino e gli effetti che
la somministrazione dell’attivatore di NR4A2, l’isoxazolopyridinone7e (Novartis, Svizzera), induce nel modello.
RISULTATI
Per indagare il ruolo di NR4A2 nelle patologie neurodegenerative, sono stati raccolti campioni di sangue ottenuti da 11 pazienti affetti da AD, 36 da SLA e 22 da PD
e sono stati paragonati con 19 pazienti SM non trattati
e 15 controlli sani di corrispondente età (maggiore di 50
anni). A differenza di quanto osservato in precedenza
55
nel nostro laboratorio su individui più giovani, questi risultati non rivelano una sottoespressione del gene nei
pazienti SMRR rispetto ai controlli. Possiamo ipotizzare
che questa condizione sia dovuta a diversi fattori tra cui
una fisiologica riduzione di espressione del gene nella
popolazione sana più anziana e/o ad un più alto livello di espressione nei pazienti SM maggiori di 50 anni,
caratterizzati da una forma di malattia meno aggressiva, dimostrata dal fatto che hanno iniziato una terapia
farmacologica dopo i 50 anni di età. Inoltre, questi dati
mostrano una sovraespressione del gene in pazienti con
malattia di Alzheimer e Parkinson rispetto a controlli sani.
Quest’ultimo dato è in disaccordo con dati pubblicati in
letteratura ma queste differenze potrebbero essere dovute a fattori quali la nostra casistica limitata, il diverso
materiale analizzato (RNA da sangue intero contro RNA
da linfo/monociti) e il differente trattamento terapeutico
che la malattia richiede.
Recentemente il nostro laboratorio ha ottenuto un modello murino deficitario del gene NR4A2 (Prof. Conneely,
Baylor College Medicine, USA) e attualmente la colonia
è in espansione per raggiungere un numero sufficiente
di animali per la sperimentazione. Nel frattempo, sono
stati raccolti dati preliminari sull’espressione di NR4A2
e sull’effetto dell’attivatore del gene nel modello murino
di SM. Questi dati rivelano una riduzione di espressione
del gene nella fase cronica della malattia a livello del midollo spinale e della milza, supportando la teoria di una
duplice funzione di NR4A2 sia a livello neuronale che
immunitario. Inoltre, nei topi ESA, la somministrazione
dell’attivatore preventiva all’immunizzazione, induce un
miglioramento clinico dovuto ad un recupero del danno
neuronale come appare dall’analisi delle lesioni mieliniche e assonali. Dalla nostra analisi di espressione genica
risulta inoltre che questo effetto potrebbe essere mediato dalla via di segnalazione dell’ NF-kB.
CONCLUSIONI
Questo lavoro suggerisce che l’espressione di NR4A2
in pazienti con SM potrebbe essere modulata in modo
dipendente dell’età del paziente e dalla forma di malattia e che l’attivazione del gene nel modello murino di
SM riduce la severità della patologia . Da queste evidenze si potrebbe pensare ad applicazioni terapeutiche mirate alla riduzione della componente infiamma-
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
toria agendo su questo gene. Infine, dal momento che
l’espressione del gene risulta alterata anche in pazienti
con morbo di Alzheimer e Parkinson, si può conside-
rare valida l’idea che il gene abbia un ruolo anche nei
processi neurodegenerativi e non solo infiammatori.
.
The relation between neurodegeneration and inflammation
in multiple sclerosis: NR4A2 puts a dampener on inflammation
in EAE induced mice.
Inflammation, a common denominator among the diverse list of neurodegenerative diseases, including multiple
sclerosis (MS), has been implicated as a critical mechanism responsible for the progressive nature of neurodegeneration. NR4A2 (also called Nurr1), a transcription
factor belonging to the superfamily of orphan nuclear receptors, may represent an important link between
neurodegeneration and inflammation. In fact, it has
recently been demonstrated that in addition to its
essential roles in the development and maintenance of dopaminergic neurons, NR4A2 plays a unexpected role in protecting neurons from inflammation-induced neurotoxicity by a negative feedback
regulation of the NF-kB pathway. Previous data
produced in our laboratory showed a significant
down-regulation of NR4A2 gene expression in peripheral blood cells of MS patients respect to healthy controls (HC). In particular, has been observed that gene expression level correlated with the
aggressiveness of the pathology and the clinical
parameters as the relapse rate and the Expanded
Disability Status Scale progression. The aims of
this study are to determine whether neurodegenerative diseases as Parkinson (PD), Alzheimer (AD)
and Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) disease,
are characterized by NR4A2 deregulation in peripheral blood and to compare the expression level
with those in MS and HC age-matched groups. At
last, to investigate the potential role of NR4A2 in
MS pathogenesis, we have chosen to evaluate the
impact of reducing NR4A2 expression in a mouse
model of MS. Particularly, we seek to investigate
the incidence and severity of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) obtained whit Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) (35-55) in
NR4A2-deficient mice. The chosen mouse model
allows an evaluation of the systemic involvement
of NR4A2 in both acute and chronic inflammation
stage. At the same time, to better characterize the
role of NR4A2 in MS pathology, we analyzed first
NR4A2 expression in EAE mice and then the effects of the administration of NR4A2 activator (isoxazolo-pyridinone 7e; Novartis, Basel, Switzerland)
56
RESULTS
To investigate the involvement of NR4A2 gene expression in neurodegenerative diseases, human
whole blood samples had been collected from 11
AD, 36 ALS, 22 PD patients and compared to 19
Relapsing Remitting MS treatment-naïve patients
and to 15 HC. To avoid age related differences,
MS and HC were selected from a population older
than fifty year old. Differently from what observed
in our previous studies on younger individuals,
present data doesn’t reveal a down-regulation of
NR4A2 gene in MS patients compared to HC. We
can hypothesize that this condition could be due
to a physiological decrease in NR4A2 peripheral
expression during aging in the healthy population.
Otherwise, a higher basal expression level of this
gene could be explain by the low aggressiveness
of the disease form in MS patients that until 50
years old or later did not require pharmacological
treatment. Moreover, these data showed an upregulation of NR4A2 gene in AD and PD patients
respect to HC. This last result on PD population
seems to be in contrast with published data, this
difference can be due to different factors: the
small cases, the different material analyzed (total
whole blood cells instead of PBMCs RNA) and the
pharmacological treatment administered to the
patients.
Recently our laboratory obtained the heterozygous
NR4A2-deficient mouse model by Prof. Conneely
(Baylor College Medicine, Houston, USA). Currently our staff is spending time to expand the colony
of animals and to purify the genetic background.
Moreover, preliminary data were collected on the
regulation of NR4A2 expression in mice following
EAE induction and on the effects of the administration of NR4A2 activator in EAE mice. These
data show a NR4A2 expression down-regulation
in spinal cord and spleen of immunized mice, supporting the idea of a double role of this transcription factor in nervous system and in immunity. In
addition, the preventive administration of NR4A2
activator induce an improvement of disease condition in EAE mice, due to neuronal damage rescue
as appears by myelin and axonal injury analysis.
This effects could be mediated by NR4A2 dependent regulation of NF-kB pathway. These data has
been corroborated by the gene expression analysis
of NF-kB targets.
CONCLUSIONS
This work suggests that NR4A2 expression in MS patients could be modulated in an age- and disease
form- dependent manner. Furthermore, data obtained in murine model of MS show that the activation
of NR4A2 reduces the severity of the pathology. Therefore, the therapeutic implication is that the activity
of NR4A2 or its transcriptional cofactors could be
boosted to tone down the inflammatory component
of MS. In addition, NR4A2expression seems to be
altered in other neurological diseases like AD and
PD, supporting a role of the gene also in neurodegeneration.
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Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di 30.000€
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Uno studio elettrofisiologico dei meccanismi di alterata
plasticità sinaptica in modelli sperimentali di sclerosi multipla
Paolo Calabresi
Clinica Neurologica, Università di Perugia, Perugia
Collaboratori
Massimiliano Di Filippo, Paola Sarchielli, Cinzia Costa, Davide Chiasserini, Alessandro Tozzi, Michela Tantucci,
Antonio de Iure, Cristiano Spaccatini
Monica Di Luca, Fabrizio Gardoni, Barbara Viviani, Dipartimento di Farmacologia, Università di Milano, Milano
rie, quali l’IL1ß ed il TNFα, hanno la capacità di influenzare la plasticità sinaptica, sono state utilizzate
metodiche ELISA e di Western-blot per analizzarne
i livelli.
Un ruolo sempre più cruciale è attribuito ai processi di plasticità sinaptica in corso di sclerosi multipla
(SM). Infatti, la plasticità cerebrale ha l’enorme potenziale di limitare le conseguenze funzionali delle lesioni della SM, in tal modo prevenendo o riducendo
l’espressione clinica dei sintomi. In corso di SM la
neuroplasticità cerebrale può essere mediata da differenti meccanismi, quali forme di plasticità sinaptica
a lungo termine, formazione di nuove sinapsi e ridistribuzione di canali ionici. Il potenziale plastico del
cervello si basa sull’abilità delle sinapsi di esprimere
cambiamenti a lungo termine dell’efficacia della trasmissione nervosa, chiamati long-term potentiation
(LTP) e long-term depression (LTD). Recenti studi
dimostrano che esiste un’attiva interazione tra il sistema nervoso centrale ed il sistema immunitario e
che le molecole immuni solubili hanno la capacità di
influenzare le principali forme di plasticità sinaptica,
incluse LTP e LTD. Questo effetto modulatorio potrebbe influenzare negativamente l’abilità del cervello
di adattarsi all’insulto infiammatorio in corso di SM,
causando un progressivo esaurimento del potenziale plastico del cervello con effetti negativi sui processi di recupero sintomatologico, sulla progressione di
malattia e sulle performances cognitive delle persone con SM.
Lo scopo del progetto è stato di analizzare, utilizzando tecniche di elettrofisiologia sperimentale (registrazioni extracellulari), la capacità delle sinapsi di
esprimere LTP in un modello sperimentale di SM,
ESA (encefalomielite sperimentale autoimmune). L’abilità delle sinapsi di esprimere tale forma di plasticità
è stata studiata nella fase di ricaduta della malattia
sperimentale a livello dell’ippocampo, struttura cerebrale nota per la sua importante funzione nei processi mnesici. Sono stati, inoltre, indagati i meccanismi
possibilmente alla base di un’alterazione della plasticità sinaptica in corso di SM sperimentale. In particolare, data l’importanza dei recettori ionotropici del
glutammato (AMPA ed NMDA) nell’ induzione della
plasticità sinaptica, è stata studiata con esperimenti di Western-blot, la composizione di tali recettori.
Inoltre, dato che diverse citochine proinfiammato-
RISULTATI
I risultati ottenuti indicano che nel modello sperimentale di SM utilizzato è presente un’alterazione dell’LTP
a livello dell’ippocampo, una struttura neuronale essenziale per le fisiologiche funzioni cognitive, durante
la fase acuta della malattia sperimentale. L’alterazione
dell’LTP in corso di ESA è risultata associata ad un alterato assemblaggio dei recettori NMDA del glutammato,
in particolare ad un ridotto livello della subunità NR2B.
Potenzialmente, questo meccanismo può contribuire
all’alterazione dell’LTP osservata negli animali affetti da
ESA. L’induzione dell’LTP richiede infatti l’attivazione del
recettore NMDA e la conseguente cascata di eventi innescata dall’aumento delle concentrazioni intracellulari
di ioni calcio e diverse evidenze scientifiche supportano l’ipotesi che i recettori NMDA contenenti la subunità
NR2B siano più proni a favorire l’induzione dell’LTP, se
confrontati con i recettori contenenti le subunità NR2A.
Infine, i risultati sperimentali hanno dimostrato la presenza, a livello dell’ippocampo, di incrementati livelli della citochina pro-infiammatoria IL1ß, potenzialmente capace
di alterare i meccanismi di neuroplasticità sinaptica.
CONCLUSIONI
In conclusione, il progetto è stato in grado di dimostrare che in corso di SM sperimentale è presente un’alterazione della plasticità sinaptica a livello ippocampale e che tale alterazione è associata ad un anomalo
riarrangiamento del recettore NMDA del glutammato
ed alla presenza di aumentati livelli della citochina
proinfiammatoria IL1ß. Dato che l’LTP rappresenta il
correlato sinaptico dei meccanismi di apprendimento
è possibile ipotizzare che l’alterazione dell’LTP possa
contribuire alla base sinaptica dei deficit cognitivi in
corso di SM. Inoltre, data l’importanza che i meccanismi di plasticità potrebbero avere nel mediare il recupero funzionale a seguito di ricadute di malattia, l’evidenza di una alterazione dell’LTP potrebbe essere di
fondamentale importanza allo scopo di comprendere i
58
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
meccanismi alla base del mancato recupero funzionale
e quindi della disabilità in corso di SM. Lo studio della
plasticità sinaptica nella SM potrebbe aiutare a comprendere i meccanismi per cui il danno infiammatorio
correlato alla SM progressivamente esaurisce il potenziale plastico del cervello causando effetti negativi sui
processi di recupero dai sintomi, sulla progressione
di malattia e sulle capacità cognitive. Questo studio,
inoltre, potrebbe permettere di comprendere meglio i
complessi effetti esercitati dalle molecole immunitarie
nella funzionalità sinaptica in corso di SM, con implicazioni sullo sviluppo di nuove strategie neuroprotettive e sintomatiche. La possibilità di comprendere
i meccanismi alla base della plasticità sinaptica nella
SM potrebbe aprire nuovi orizzonti per lo sviluppo di
agenti farmacologici disegnati per favorire forme adattative di plasticità nel cervello, per migliorare i processi
neuroriabilitativi e per trattare le disfunzioni cognitive
nella SM.
An electrophysiological study of synaptic plasticity in experimental
models of multiple sclerosis
A large amount of evidence suggests the potentially
crucial role of neuroplasticity processes in multiple scleroosis, MS. During MS, functional brain plasticity may
be mediated by various processes, such as long-term
forms of synaptic plasticity, new synapses formation and
ion channel redistribution and may reduce the functional
consequences of MS lesions, preventing or limiting the
clinical expression of the symptoms. The plastic potential
of the brain is based on the ability of the synapses to
undergo long-term changes in the efficacy of synaptic
transmission, named long-term potentiation (LTP) and
long-term depression (LTD). It is now well accepted that
an active cross-talk occurs between the immune and the
nervous system and that immune molecules directly influence the main forms of synaptic plasticity in the CNS,
including LTD and LTP. The modulation exerted by inflammatory mediators on synaptic plasticity might negatively influence the ability of brain neuronal networks to
adapt after the MS-related inflammatory injury, progressively exhausting the plastic potential of the brain with
detrimental effects on symptoms recovery processes,
disease progression and cognitive performances.
The aim of the present project has been to investigate,
by utilising electrophysiological techniques (extracellular
recordings), the ability of excitatory synapses to undergo LTP, in an experimental model of MS (experimental
autoimmune encephalomyelitis, EAE). The ability of excitatory synapses to undergo synaptic plasticity has been
investigated during the acute phase of the experimental
disease in the hippocampus. The molecular mechanisms
potentially underlying neuroplasticity abnormalities have
been also investigated. In particular, since ionotropic glutamate receptors (AMPA and NMDA) are crucial for LTP
induction we have studied, by utilising Western-blot experiments, the subunit composition of these receptors.
Moreover, since proinflammatory cytokines, such as
interleukin-1ß and tumour necrosis factor α are known
59
to influence synaptic plasticity, we have analysed, by utilising ELISA techniques and Western blot analyses, the
role played by these cytokines and the status of the IL-1
receptor complex.
RESULTS
A significant impairment of hippocampal LTP has been
demonstrated in the hippocampus of mice with acute EAE. This evidence shows that the main form of
synaptic plasticity in the brain is altered in an experimental model of MS. Induction of hippocampal LTP is
known to require synaptic activation of post-synaptic
NMDA receptors, subsequent post-synaptic Ca2+
entry, several signal transductions systems and, in the
late phases, gene transcription, new protein synthesis
and changes in the number of single-channel conductance of AMPA glutamate receptors. Interestingly, in EAE mice, we found a significant decrease of
the NR2B subunit of the NMDA receptor in the postsynaptic compartment compared to control mice. The
subsequent modification of the NR2A/NR2B ratio in
the hippocampus might represent a contributing factor explaining the impairment of LTP in mice with EAE.
Pro-inflammatory cytokines may play a central role in
neuronal-network functioning and during the induction
of synaptic LTP. In EAE mice we also found increased
levels of the pro-inflammatory cytokine IL1ß while undetectable levels of the same cytokine were observed
in control animals. Interestingly, this cytokine has been
demonstrated to modulate synaptic transmission and
to inhibit the induction of synaptic plasticity in the hippocampus through several potential mechanisms.
CONCLUSIONS
During the clinical phase of experimental MS, the inflammatory response in the CNS results in the impairment of long-term plasticity, in the over-expression
of the proinflammatory mediator IL1ß and in the re-
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
arrangement of glutamate NMDA receptors in the hippocampus. Inflammation-triggered mechanisms may
negatively influence the ability of central nervous system synapses to express long-term forms of plasticity
in specific brain areas during the course of MS. The
possibility to understand the complex mechanisms
underlying synaptic plasticity alteration in experimental
MS might have profound implications in understanding
the mechanisms underlying symptoms onset and disease progression in this neurological disease. The
potential effects of experimental therapies to reverse
pathological alterations of synaptic plastic processes
in MS could represent a promising working hypothesis
for the development of drugs with neuroprotective and
symptomatic effects.
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Di Filippo M, Chiasserini D, Gardoni F, Viviani B, Tozzi A, Giampà C, Costa C, Tantucci M, Zianni E, Boraso M, Siliquini S, de Iure A, Ghiglieri V, Colcelli E, Baker D, Sarchielli P, Fusco FR, Di
Luca M, Calabresi P. Effects of central and peripheral inflammation on hippocampal synaptic plasticity. Neurobiology of Disease 2013 Jan 4. pii: S0969-9961(12)00401-9. Epub ahead of print
Di Filippo M, Chiasserini D, Gardoni F, Viviani B, Tozzi A, Costa C, Tantucci M, Zianni E, Boraso M, Siliquini S, De Iure A, Baker D, Di Luca M, Sarchieli P, Calabresi P Titolo della presentazione:
Hippocampal synaptic plasticity is impaired in both experimental multiple sclerosis and systemic inflammation XLIII Congresso della Società Italiana di Neurologia, Rimini, Italia, 2012.
Di Filippo M, Chiasserini D, Tozzi A, Costa ., Siliquini S, Tantucci M, De Iure A, Gardoni F, Viviani B, Pryce G, Baker D, Di Luca M, Sarchielli P, Calabresi P. Titolo della presentazione: Hippocampal
synaptic plasticity is impaired during acute experimental autoimmune encephalomyelitis relapses: implications for multiple sclerosis congress on treatment and research in multiple sclerosis 26th
Congress of the European Committee for Treatment and Research in Multiple Sclerosis (ECTRIMS) and the 15th Conference of Rehabilitation in Multiple Sclerosis (RIMS), Gothenburg, Svezia,
2010.
Di Filippo M. Plasticity in experimental models of multiple sclerosis. 1st International Workshop on “Synaptic plasticity: from bench to bedside.” Taormina, Italy, 2010.
..................................................................................................................................................
60
Ruolo dell’autofagia nella regolazione delle cellule T associata
alla sclerosi multipla
Francesco Cecconi
Università IRCCS Fondazione Santa Lucia, Roma
Collaboratori
Juliane Becher, Flavie Strappazzon, Francesca Nazio
Luca Battistini, Giovanna Borsellino, Diego Centonze, IRCCS, Fondazione Santa Lucia, Roma
L’omeostasi dei linfociti T è di grande importanza nel
proteggere l’organismo da eccessiva infiammazione. Le
cellule T helper possono essere suddivise in due tipi principali, le cellule T effettrici pro-infiammatorie e le cellule
T regolatorie, che esercitano una funzione soppressiva
sulle cellule T effettrici. Lo sviluppo delle cellule T effettrici autoreattive correla, inoltre, con l’incidenza di malattie
autoimmuni, quali la sclerosi multipla. Per questo motivo,
lo studio dei meccanismi alla base del differenziamento
delle cellule T è della massima importanza. In effetti, è
stato descritto un ruolo centrale della proteina chiamata
mTOR nel dirigere il differenziamento delle cellule T. Un
ambiente infiammatorio è associato ad una forte attivazione di mTOR che attiva le cellule T effettrici ma non le
cellule T regolatorie. Pertanto, stiamo studiando il ruolo
del processo degradativo chiamato autofagia che, durante il differenziamento delle cellule T viene, al contrario,
attivato in seguito ad inibizione di mTOR.
RISULTATI
Abbiamo dimostrato che cellule T regolatorie acquisiscono elevati livelli di autofagia in seguito ad inibizione
di mTOR. È importante sottolineare come alcuni fattori
chiave dell’autofagia, come la molecola di attivazione
dell’autofagia regolata da Beclin 1 (Ambra1), si trovino a
monte della via autofagica e possano essere regolati direttamente da mTOR mediante fosforilazione. Abbiamo
anche dimostrato che la proteina AMBRA1 viene modulata durante il differenziamento delle cellule T e che
la sua espressione è coerente con l’attività del fattore di
trascrizione FOXP3, un marcatore specifico delle cellule
T regolatorie. Inoltre, l’induzione di autofagia in un modello animale di sclerosi multipla attenua il corso della
malattia grazie ad un aumento della popolazione di cellule T regolatorie.
CONCLUSIONI
Proponiamo pertanto che le molecole dell’autofagia
siano determinanti per il differenziamento e l’omeostasi delle cellule T regolatorie. Possiamo anche concludere che l’autofagia è un processo citoprotettivo
e utile a contrastare l’autoimmunità. Poiché l’attività
delle cellule T regolatorie è importante nel bilanciare
la tossicità delle cellule T effettrici nella sclerosi multipla, il nostro lavoro consente di proporre una serie di
bersagli molecolari per il trattamento farmacologico di
questa malattia.
Role of autophagy in the regulation of T cells associated
with multiple sclerosis
T cell homeostasis is of particular importance to protect the organism from excessive inflammation. Helper T cells can be divided into two major types, proinflammatory effector T cells and regulatory T cells,
which exert a suppressive function on the effector T
cell population. Further, the development of autoreactive effector T cells correlates with the incidence
of autoimmune disease, such as multiple sclerosis.
For this reason, studying the mechanisms underlying
61
regulatory T cell differentiation is of the highest importance. A central role of the sensor protein mTOR
in directing T cell differentiation has been widely described. A predominantly inflammatory environment
is associated with enhanced mTOR activation and
triggers effector T cell but non regulatory T cell differentiation. Thus, we are investigating the role of the
degradative process of autophagy, which, in contrast, is activated upon mTOR inhibition, during T cell
differentiation.
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
RESULTS
Our results show that regulatory T cells exhibit elevated
levels of autophagy upon mTOR inhibition; Of note, a
few key autophagy factors, such as the activating molecule in Beclin 1-regulated autophagy (Ambra1) are
placed very upstream of the autophagy pathway and
can be regulated directly by m-TOR mediated phosphorylation. We showed that Ambra1 is modulated
during T cell differentiation and its expression is coherent with the activity of a specific marker of regulatory
T cells, the transcription factor FOXP3. Furthermore,
induction of autophagy in an animal model of multiple
sclerosis attenuates the course of the disease due to
an increase in the regulatory T cell population.
CONCLUSIONS
Therefore, we propose that autophagy and autophagy-regulated molecules are required for differentiation and homeostasis of regulatory T cells. We can
also conclude that autophagy is cytoprotective and
counteract autoimmunity: since regulatory T cell activity is important in balancing the effector T cell toxicity
in multiple sclerosis, our work has the potential to propose a number of molecular targets for the treatment
of this disease.
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Nazio F, Strappazzon F, Antonioli M, Bielli P, Cianfanelli V, Bordi M, Gretzmeier C, Dengjel J, Piacentini M, Fimia GM, and Cecconi F. (2013) mTOR inhibits autophagy by controlling ULK1 ubiquitination, self-association and function via AMBRA1 and TRAF6. (Nature Cell Biol., 15,406-416).
Strappazzon F, Vietri-Rudan M, Campello S, Nazio F, Florenzano F, Fimia GM, Piacentini M, Levine B and Cecconi F. (2011) Mitochondrial BCL-2 inhibits AMBRA1-induced autophagy. The
EMBO J., 30, 1195-1208.
Becher J, Cecconi F (2013) AMBRA1 is Upregulated during T Cell Stimulation to Avoid Excessive Proliferation and Stabilizes the Regulatory T Cell Phenotype. Keystone Symposium on Autophagy, Inflammation and Immunity (B4) February 17—22, 2013 Montreal, QC, Canada.
..................................................................................................................................................
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Cellule dendritiche plasmacitoidi: ruolo nel controllo
della risposta immunitaria nei pazienti trattati con IFN-beta
Eliana Marina Coccia
Dipartimento di Malattie Infettive, Parassitarie ed Immuno-mediate, Istituto Superiore di Sanità, Roma
Collaboratori
Martina Severa, Elena Giacomini, Fabiana Rizzo
Marco Salvetti, Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS) Ospedale Sant’Andrea,
Sapienza Università di Roma, Roma
Luca Battistini, Istituto Scientifico Fondazione Santa Lucia, Roma
L’interferone-β (IFN-β) è il trattamento di scelta per i pazienti con sclerosi multipla (SM). Tuttavia, il meccanismo
esatto mediante il quale questo farmaco esercita i suoi
effetti terapeutici rimane ancora non completamente
chiaro. Nell’ambito dei nostri studi, ci siamo interessati
delle cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC), una sottopopolazione di DC implicate in diverse malattie autoimmuni, poiché abbiamo osservato che queste cellule si
concentrano a livello cerebrale in stretta vicinanza con le
cellule B infettate da Epstein-Barr virus (EBV), suggerendo l’esistenza di un crosstalk tra questi tipi cellulari che
potrebbe rappresentare un nuovo aspetto dell’immunopatogenesi della SM. Attraverso esperimenti in vitro
abbiamo infatti dimostrato che le pDC sono un nuovo
bersaglio dell’infezione da parte di questo virus. Successivamente alla stimolazione dei Recettori Toll-Like (TLR)7
e 9 attraverso intermedi replicativi virali, le pDC rilasciano
elevate quantità di IFN favorendo, in tal modo, la latenza del virus e consequenziale evasione dall’attacco del
sistema immunitario. Oltre a questo meccanismo, EBV
blocca la capacità delle pDC di espandere ed attivare la
risposta immunitaria specifica dei linfociti T effettori. Alterando le proprietà delle pDC, EBV regola il suo potenziale
replicativo e, così facendo, instaura una pacifica coesistenza con l’ospite. Questo equilibrio potrebbe essere
“rotto” e contribuire all’insorgenza di malattie autoimmuni, quali la SM. Abbiamo inoltre esteso i nostri studi anche ai linfociti B che rappresentano il principale reservoir
di EBV, nel tentativo di caratterizzare la loro risposta al
trattamento con IFN-β.
RISULTATI
Il progetto si è inizialmente concentrato sullo studio della
risposta delle pDC agli agonisti del TLR7 in quanto dati
ottenuti negli scorsi anni, avevano indicato la capacità
dell’IFN-β di modulare la risposta a questo TLR. Durante i nostri studi abbiamo osservato che il trattamento in
vivo con IFN-β riduce le capacità delle pDC di maturare
e di produrre IFN di tipo I in risposta alla stimolazione con
agonisti di TLR7. Per definire i meccanismi che sottendono questo fenomeno, abbiamo analizzato alcune molecole espresse sulla superficie delle pDC note per la loro
63
capacità di controllare la risposta ai TLR, quali BDCA2,
ILT7 and FcγRIIα. Non avendo trovato modificazioni significative nell’espressione di queste molecole inibitorie,
ci siamo pertanto chiesti se gli effetti indotti dall’IFN-β
potessero influenzare l’espressione delle molecole coinvolte nel pathway di attivazione dei TLR, quali MyD88,
IRF7 e IRF5. L’analisi attraverso real time PCR non ha
mostrato alterazioni nell’espressione di queste molecole
che potessero giustificare gli effetti inibitori indotti dalla terapia. Questi risultati ci hanno spinto a perseguire
una strategia alternativa ovvero condurre esperimenti
con pDC purificate da pazienti con SM prima e dopo
trattamento con IFN-β. In questo contesto sperimentale
abbiamo osservato che, successivamente alla terapia,
le pDC producevano più IFN di tipo I in risposta al trattamento in vitro con agonisti del TLR7. La spiegazione
dei risultati, apparentemente in contrasto con quanto
osservato nel contesto dei PBMC totali, è scaturita dallo studio della IL-10, una citochina con proprietà antiinfiammatorie che, una volta rilasciata dai monociti, è in
grado di regolare la risposta delle pDC al TLR7.
Nell’ambito di questo studio, il nostro interesse si è anche rivolto ai linfociti B, anch’essi capaci di rispondere
agli agonisti del TLR7. Nel tentativo di chiarire se anche questa popolazione linfocitaria fosse sensibile agli
effetti immunomodulatori dell’IFN-β, in particolare sulla
loro responsività alla stimolazione del TLR7, abbiamo
condotto esperimenti mirati allo studio del loro differenziamento e maturazione. In questo contesto abbiamo
osservato che i linfociti B dei pazienti producono meno
IgM ed IgG in risposta alla stimolazione con agonisti del
TLR7 rispetto a quanto osservato nei donatori di controllo. Questo dato è in sintonia con quanto riscontrato
nei livelli di espressione del TLR7 attraverso real time
PCR, ovvero bassi livelli nei pazienti rispetto ai controlli.
La somministrazione di IFN-β era in grado di ripristinare
la risposta al TLR7 attraverso il potenziamento del rilascio di citochine che sostengono il differenziamento dei
linfociti B in cellule producenti Ig, quali IL-6 e BAFF. Uno
studio comparativo tra PBMC totali o depleti dei monociti, principali produttori di questi due fattori, ha messo in
evidenza che questa popolazione svolge un ruolo chiave nel recupero della responsività al TLR7 da parte dei
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
linfociti B successivamente alla terapia.
In base a questi risultati possiamo concludere che gli
obiettivi che ci eravamo prefissati sono stati raggiunti anche grazie all’estensione di un anno del progetto che ha
consentito l’arruolamento di un numero sufficiente di pazienti per poter condurre a termine questo studio su una
popolazione leucocitaria molto rara, quale sono le pDC.
CONCLUSIONI
Le pDC sono considerate uno dei principali effettori della
risposta innata anche se la loro attivazione è anche fondamentale per lo sviluppo di una corretta risposta adat-
tativa che prevede il coinvolgimento dei linfociti T e B.
L’insieme di risultati ottenuti durante questo studio indica
che una disregolazione della loro attivazione può risultare critica per lo sviluppo di alcune malattie autoimmuni,
quali la SM. Partendo da questo presupposto, il nostro
studio suggerisce che il trattamento con IFN-β esercita
alcuni dei suoi effetti terapeutici agendo sulla modulazione della risposta al TLR7 delle pDC e dei linfociti B.
Queste informazioni possono essere importanti per il miglioramento e/o definizione di strategie terapeutiche per
il trattamento della SM.
Plasmacytoid DC in multiple sclerosis: role in the control
of immune response in patients under IFN-ß therapy
Interferon-β (IFN-β) impacts on disease activity in multiple
scelrosis (MS). However, the precise mechanisms through
which this compound exerts its therapeutic effect remain
uncertain. Along our studies we have shown that plasmacytoid DC (pDC), a rare population of DC with important
implications in several autoimmune diseases, can be detected in highly inflamed MS brains in the close proximity
of EBV-infected B cells suggesting a crosstalk between
these two cell types, which could unveil novel aspects
of MS immunopathogenesis. By in vitro experiments we
recently demonstrated that pDC are novel target of EBV
infection. Through the stimulation of Toll-like Receptor 7
(TLR7) and TLR9 by this virus, pDC release high level of
IFN promoting, in this way, EBV latency, a viral stage by
which EBV can escape host immune surveillance. EBV
can also subvert pDC functions blocking T cell specific
responses and favoring its own persistence in the host.
The dysregulation of EBV-driven immune responses might
have a role, in particular individuals, in the development of
autoimmune disease including MS.
In this project, we also analyzed the phenotype and functions of B cells, the main reservoir of EBV in the host, in
MS patients undergoing IFN-β therapy to evaluate whether this drug could modulate B cell responses.
RESULTS
As previously stated, pDC selectively express TLR7
and TLR9, two endosome-lysosome resident pattern
recognition receptors able to specifically sense microbial or self-derived nucleic acids. Along this project we
characterized pDC response to TLR7 stimulation since in
the past our evidences showed how IFN-β can regulate
TLR7 transcription and intracellular pathways. In particular, we observed that in vivo IFN-β treatment modifies
64
the ability of pDC derived from MS patients to mature
and secrete type I IFN when stimulated by TLR7 in the
context of unseparated PBMCs. To define the mechanisms regulating this phenomenon, we firstly analyzed the
expression of activating or inhibitory molecules known to
regulate in pDC the amplitude of type I IFN responses
to TLR ligands. These receptors include BDCA2, ILT7
and FcγRIIα. Flow cytometry analysis failed to find any
important modification by in vivo IFN-β treatment of these receptors on pDC surface. Thus, we next evaluated
whether IFN-β could regulate the expression of several
molecules involved in activation and modulation of TLR
signaling, such as MyD88, IRF7 and IRF5. Quantitative
real-time PCR analysis of these molecules, however, did
not highlight a profile of expression that could justify the
inhibitory action of IFN-β on pDC.
These findings led us to isolate pDC to characterize their
cell responses singularly and not in the context of PBMC.
In this experimental setting, isolated pDC from IFN-βtreated MS patients show not a reduced but rather an
enhanced capacity to release IFN-β upon TLR7 stimulation. A key step in the comprehension of this contrasting
scenario came from our results indicating a central role
of IL-10, a cytokine known to perform an irreplaceable
action in negatively regulating inflammation and produced
by different leukocyte populations, in the modulation of
TLR7-induced pDC responses.
Among the cell types that in the peripheral blood express
TLR7, we find also B cells. For this reason, we extended our analysis to this cell population to understand
whether the effects induced by IFN-β on TLR7-mediated
responses would be pDC-specific or shared also with
B lymphocytes. We highlighted for the first time a clear deficiency in TLR7-mediated B cell differentiation into
Ig-secreting cells in MS patients as compared to healthy
donors (HD). These findings are in tight connection with
our observation that MS-derived PBMC show a significant reduction in the expression of TLR7 gene. In
vivo administered IFN-β is able to replenish in MS
patients the low TLR7-induced Ig production to the
level observed in HD, by the induction of IL6 and
BAFF release, two cytokines with a pivotal role in B
lymphocyte differentiation into Ig-secreting cells.
A comparative analysis of total PBMC derived from
IFN-β-treated patients or PBMC depleted of monocytes, main producers of both IL6 and BAFF,
strongly demonstrated how this cell type have a key
role in the TLR7-induced B cell differentiation and Ab
production upon IFN-β therapy.
All the objectives of the project were fulfilled also
because of the extension of one year that allowed
us to enroll a sufficient number of patients to have
relevant results in such a rare and difficult to study
cell population as pDC.
CONCLUSIONS
pDC are considered key players in driving innate immune responses but they are also very important for the
development of a correct adaptive immunity influencing
both T and B cell responses. For all these reasons, it
is clear how dysregulated pDC-driven immune responses can lead to the development of autoimmune diseases, including MS. In particular, our results suggest that
IFN-β treatment can exert its therapeutic effects regulating TLR7-mediated pDC and B cell responses.
This view could help improve existing therapies or define
new therapeutic strategies for MS.
...................................................................................................................................................
Serafini B, Severa M, Columba-Cabezas S, Rosicarelli B, Veroni C, Chiappetta G, Magliozzi R, Reynolds R, Coccia EM, Aloisi F. Epstein-Barr virus latent infection and BAFF expression in B cells
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Rizzo F, Severa M, Giacomini E, Mechelli R, Gafa V, Vittori D, Giulia C, Salvetti M, Coccia EM. Interferon-β therapy influences the response of plasmacytoid Dendritic Cells to Toll-like receptor
stimulation in patients with Multiple Sclerosis. 2012 CFCD Annual Meeting “Diversity and Plasticity of Dendritic Cells”, 13-14/12 2012 Paris (France).
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2009 per il periodo di due anni (prorogato di 12 mesi) e l’ammontare di 105.000 €
65
Caratterizzazione della parete venosa nella sclerosi multipla
Matteo Coen
Dipartimento di Patologia ed Immunologia, Facoltà di Medicina, Università di Ginevra, Ginevra, Svizzera
Mentore
Marie-Luce Bochaton-Piallat
bidimensionale (2D-gel electrophoresis, in collaborazione con la Proteomics Core Facility della facoltà di medicina di Ginevra), applicata alle CML, ha
permesso l’identificazione di spot espressi in modo
diverso nei due fenotipi (collaborazione con lo Swiss
Institute of Bioinformatics). Uno degli spot esclusivamente presente nei gel ottenuti dalle CML small
è stato sottoposto a sequenziamento tramite spettrometria di massa tandem (MS/MS spectrometry)
ed è stato identificato come la calmodulina (CaM,
proteina legante il calcio, ubiquitaria negli eucarioti, associata a contrazione e proliferazione).
Tramite immunofluorescenza e western blotting, è
stata dimostrata la predominante espressione della CaM nelle CML small. Un articolo che riassume
i risultati delle ultime fasi del programma di addestramento è stato sottomesso per la pubblicazione alla rivista scientifica The American Journal of
Pathology.
Alla luce del recente dibattito sull’esistenza di un insufficiente ritorno venoso nelle vene cerebrali dei pazienti con sclerosi multipla (SM), lo scopo principale
del mio programma di addestramento è stato l’acquisizione di un know-how nel campo nella biologia
vascolare finalizzato allo studio della morfologia delle
vene giugulari interne nei pazienti con SM e, in un
secondo momento, della biologia delle cellule muscolari lisce (CML), le maggiori costituenti dei vasi.
RISULTATI
Sono riuscito a realizzare tutti gli scopi previsti dal
mio programma di addestramento. Per prima cosa
ho raccolto una serie di vene giugulari provenienti
da pazienti con SM (interventi chirurgici di ricostruzione giugulare dopo angioplastica) e da autopsie di
soggetti di “controllo”. Tramite tecniche istologiche
(colorazione con ematossilina-eosina, tricromica di
Masson, soluzione di Miller per fibre elastiche, Sirius
red) e immunoistochimiche, ho investigato la distribuzione ed l’arrangiamento del collageno, il differenziamento delle CML (tramite anticorpi per le proteine
citoscheletrice) e la presenza di cellule infiammatorie
(macrofagi e linfociti T) nelle vene. Si è riusciti, in
tal modo, a dimostrare la presenza di ispessimenti
ricchi in collagene di tipo III nelle giugulari dei pazienti con SM. Per sormontare il problema dell’indisponibilità di tessuti venosi “freschi” da pazienti con
SM per allestire delle colture cellulari, abbiamo collaborato con l’Unità Operativa di Chirurgia Vascolare ed Endovascolare di Ferrara (Dr F. Mascoli) ed il
Dipartimento di Biochimica e Biologia dell’Università
di Ferrara (Proff. G. Marchetti, e F. Bernardi). Abbiamo così collezionato un congruo numero di placche
aterosclerotiche carotidee (rimosse durante interventi di chiurgia carotidea), che sono state utilizzate
per la costituzione di colture cellulari. Mediante la
tecnica dell’espianto tissutale (messa a punto sulle
coronarie di maiale provenienti da un vicino mattatoio) sono riuscito ad ottenere colture di CML e
ad identificare due tipi cellulari distinti: cellule con
fenotipo large (appiattite, con crescita a monostrato), e small (piccole, con crescita in multistrato). Le
CML sono state caratterizzate per morfologia, livello
di differenziazione (tramite immunofluorescenza e
western blotting) e proprietà biologiche (attività proliferativa e migratoria). La tecnica dell’elettroforesi
CONCLUSIONI
I risultati ottenuti nella prima parte del programma
di addestramento, mirata ad indagare le caratteristiche morfologiche e biologiche delle giugulari
nei pazienti con SM, ha dimostrato che tali vasi
presentano degli ispessimenti caratterizzati da
un’alterata distribuzione di collagene nell’avventizia (rapporto collagene di tipo I/tipo III inferiore
rispetto alle vene normali). L’analisi di queste lesioni, sprovviste di cellule infiammatorie, suggerisce una patogenesi su base malformativa locale.
L’alterato rapporto fra il collagene di tipo I (forza
tensile e rigidità) e quello di tipo III (elasticità) è
verosimilmente responsabile di un’alterata stabilità e di una ridotta forza meccanica del connettivo
(avventiziale): questo può contribuire a spiegare le
anomalie di flusso descritte nella SM. Gli approcci
e le metodologie tipici della biologia vascolare, appresi nella seconda e terza parte del programma
di addestramento, sono state applicate alle lesioni
aterosclerotiche carotidee umane, ed hanno permesso di acquisire delle nuove conoscenze sullo sviluppo dell’aterosclerosi nell’uomo. Pur non
avendo delle ripercussioni dirette sullo studio della
patogenesi della SM, queste ultime fasi mi hanno
dotato di una conoscenza e di un know-how che
potrà essere facilmente applicato a tessuti vascolari provenienti da pazienti con SM.
66
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
Characterization of venous wall in multiple sclerosis
In view of the recent and on-going debate regarding
the existence of cerebral venous outflow impairment
in multiple sclerosis (MS), the main goal of my training
program was to acquire a formal training in vascular
basic science aimed at investigating the morphological features of the internal jugular veins (IJVs), as well
as the biological feature of IJV smooth muscle cells
(SMCs, the main component of vessels) in MS patients.
RESULTS
All the goals of my training program have been fulfilled. I collected IJV specimens both from MS patients
and control patients. Having learnt the basic histochemical (hematoxylin and eosin, Masson’s trichrome, Miller’s, and Sirius red stains) and immunohistochemical techniques I could investigate the different
collagen types, their distributions and arrangement in
the different vein specimens. Moreover, I studied the
distribution and the level of differentiation of the SMCs
in the IJV wall by using a palette of cytoskeletal markers (α-smooth muscle actin, smooth muscle myosin heavy chains). The presence of inflammatory cells
(macrophages and T lymphocytes) was also tested.
The results, showing that the IJVs of MS patients present a focal thickening of the vein wall characterized
by the prevalence of loosely packed type III collagen
fibers in the adventitia, have been published in the
journal Cardiovascular Pathology.
In order to overcome the unavailability of fresh IJV
samples from MS patients, we took advantage of
collaboration with the Operative Unit of Vascular and
Endovascular Surgery, University Hospital of Ferrara,
Ferrara, Italy (Dr F. Mascoli) and the Department of
Biochemistry and Molecular Biology, University of Ferrara, Ferrara, Italy (Profs. G. Marchetti, and F. Bernardi). Thank to this collaboration, I could collect human
atherosclerotic plaque specimens obtained at surgery
(carotid endarterectomy for carotid artery stenosis).
Having learnt cell culture techniques on porcine arteries collected on a nearby slaughterhouse, I could set
up cultures of human SMCs. By means of tissue explantation two SMC phenotypes could be identified:
large SMCs, flat with a monolayered growth pattern,
and small SMCs, fusiform with a multilayered growth
pattern. The cells were thoroughly characterized by
means of morphology, level of differentiation (immunofluorescence and western blotting), and biological
properties (proliferative and migratory activities); the
67
small SMCs displayed the characteristics of a low differentiated, highly invasive and proliferative cell type.
I have learnt to perform 2D-gel electrophoresis on
human SMCs (in collaboration with the Proteomics
Core Facility at the Faculty of Medicine, Geneva). Finally, the 2-D gel samples were subjected to image
analysis and differentially expressed spots were identified (in collaboration with the Swiss Institute of Bioinformatics). One of the spots exclusively present in
the gels from small SMCs exhibited one the highest
relative expression. The spot was sequenced by tandem mass spectrometry and identified as calmodulin
(CaM), a Ca2+-binding protein ubiquitous in eukaryotes that plays important roles in cell contraction
and proliferation. By means of immunofluorescence
and western blotting I confirmed the predominance
of CaM in small SMCs. The results obtained during these two last phases of the training program
have been included in a paper sent to the American
Journal of Pathology. In addition, these two last phases have shown the feasibility of isolating SMC from
human vascular samples in a reproducible manner.
CONCLUSIONS
The results obtained during the first phase of the training program, aimed at investigating the morphological and biological features of the IJVs in MS patients,
demonstrate that the vein lesions of MS patients
are characterized by an altered collagen distribution
in the adventitia (lower collagen type I/III ratio in MS
veins compared to controls). These lesions, devoid
of inflammatory cells, suggest the existence of a local malformative pathogenesis. Because type I collagen is known to provide mainly tensile strength and
rigidity, whereas collagen type III provides elasticity,
the reduced collagen type I/III ratio allegedly alters
the mechanical stability and reduces the mechanical
strength of connective tissue. This can contribute to
shed a light on the flow abnormalities described in
MS. The approaches and methodologies typical of
the vascular basic science acquired during the second and third phase to the training program have
been applied to human carotid plaque samples and
provide new insights on atherogenesis in the human.
Although not having a direct repercussion on MS pathology, this knowledge can be easily applied to vein
specimens obtained from MS patients.
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
...................................................................................................................................................
Coen M, Menegatti E, Salvi F, Mascoli F, Zamboni P, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Altered collagen expression in jugular veins in multiple sclerosis. Cardiovasc Pathol. 2013 Jan;22:33-8.
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Coen M, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Characterization of vein wall in multiple sclerosis.Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma 30-31 Maggio 2012.
..................................................................................................................................................
68
Ruolo di T-cell immunoglobulin and mucin domain (Tim)-1
nel traffico linfocitario nel sistema nervoso centrale infiammato
Gabriela Constantin
Dipartimento di Patologia e Diagnostica, Sezione di Patologia Generale, Università di Verona, Verona
Collaboratori
Stefano Angiari, Tiziano Donnarumma, Simona Luciana Budui, Barbara Rossi
Sheng Xiao, Vijay K Kuchroo, Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women’s Hospital,
Harvard Medical School, Boston, MA, USA
Il reclutamento di linfociti T patogenici nel sistema
nervoso centrale (SNC), mediato da molecole di adesione altamente glicosilate, rappresenta un evento
critico nello sviluppo della sclerosi multipla (SM) e del
suo modello animale, l’encefalomielite sperimentale
autoimmune (ESA). La proteina T-cell immunoglobulin and mucin domain (Tim)-1 è una glicoproteina espressa sulla superficie di linfociti T attivati, che
presenta nella porzione extra-cellulare un dominio
mucinico altamente glicosilato; inoltre, la struttura di
Tim-1 è simile a quella di altre molecole di adesione
implicate nel traffico leucocitario. Queste informazioni
strutturali suggeriscono un possibile ruolo per Tim-1
nel traffico linfocitario nel corso di patologie infiammatorie. L’obiettivo principale del nostro progetto è
stato lo studio di un possibile ruolo per Tim-1 nella
migrazione di linfociti T attivati nel SNC durante la patogenesi dell’ESA.
RISULTATI
Abbiamo inizialmente ipotizzato che Tim-1 fosse in
grado di legare le selectine, classiche molecole di adesione che interagiscono con recettori altamente glicosilati simili a Tim-1, ed abbiamo osservato che, in
condizioni statiche, Tim-1 è effettivamente in grado
di legare in vitro P-, E- ed L-selectin, le tre selectine
conosciute. Fisiologicamente, l’interazione selectinaligando avviene a livello dell’endotelio vascolare, ed
è favorita dallo stress meccanico causato dal flusso
sanguigno. Sono stati perciò eseguiti saggi di legame
Tim-1-selectine sotto flusso, e i nostri risultati indicano che microsfere ricoperte con Tim-1 interagiscono
con P- o E-selectin in condizioni di flusso, mentre
nessuna interazione è stata osservata con L-selectin.
Questi dati suggeriscono che Tim-1 potrebbe essere
cruciale per l’iniziale cattura dei linfociti T sull’endotelio vascolare, evento mediato dalle selectine in condizioni infiammatorie.
Per verificare tale ipotesi, abbiamo utilizzato un ceppo di topi mutanti (Tim-1Δexon3) che mancano del dominio mucinico di Tim-1, mentre il resto della proteina
è espresso sulla superficie cellulare. Linfociti T helper
69
(TH)1 e TH17 patogenici e pro-infiammatori ottenuti
da animali Tim-1Δexon3 hanno una ridotta capacità di
interagire in condizioni di flusso con P-selectin, ma
non E-selectin, in vitro ed in vivo, come osservato in
esperimenti di microscopia intravitale in vasi mesenterici, confermando un ruolo per il dominio mucinico
di Tim-1 nella cattura di linfociti T attivati sull’endotelio vascolare. Linfociti T mutanti presentano, inoltre, una ridotta capacità di accumulo nella cute, in
un modello di infiammazione fortemente dipendente
dall’espressione di P-selectin da parte dell’endotelio vascolare infiammato, confermando un ruolo per
Tim-1 come recettore adesivo espresso dai linfociti
T attivati.
Successivamente, abbiamo osservato che linfociti
TH1 e TH17 da animali Tim-1Δexon3 hanno una ridotta
capacità di aderire su vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1, molecola di adesione presente sull’endotelio vascolare in condizioni infiammatorie. Essendo
tale molecola il contro-ligando dell’integrina very late
antigen (VLA)-4, molecola implicata nella SM e target
dall’anticorpo natalizumab (Tysabri) usato per la cura dei
pazienti SM, è stata valutata la correlazione tra Tim-1
e VLA-4 sulla superficie cellulare delle cellule T attivate. Dati ottenuti con studi di immunoprecipitazione ed
imaging con tecnologia ImageStream® mostrano che
Tim-1 e VLA-4 co-localizzano sulla superficie di cellule
T attivate, suggerendo che Tim-1 potrebbe regolare la
funzionalità di VLA-4 nei linfociti T patogenici.
Infine, abbiamo analizzato l’impatto di Tim-1 sul reclutamento di cellule T attivate nel SNC infiammato.
In esperimenti di microscopia intravitale in vasi cerebrali infiammati, è stato osservato che cellule TH1 e
TH17 ottenute da animali Tim-1Δexon3 presentano una
ridotta capacità di adesione sull’endotelio vascolare
infiammato; inoltre, linfociti T mutanti hanno una ridotta capacità di migrazione nel SNC durante lo sviluppo
dell’ESA, e conseguentemente inducono una malattia
meno grave rispetto a cellule wilde type (WT). In accordo, in un modello di ESA attiva, animali Tim-1Δexon3
sviluppano una patologia meno grave rispetto ad animali WT, suggerendo un ruolo cruciale per Tim-1 nello
sviluppo della malattia.
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
CONCLUSIONI
I nostri risultati dimostrano che Tim-1 è un nuovo recettore adesivo importante per la cattura di linfociti
T attivati su P-selectin in condizioni di flusso, e che
Tim-1 controlla la funzionalità dell’integrina VLA-4 sui
linfociti T attivati. I nostri dati mostrano inoltre l’importanza di Tim-1 nel reclutamento dei linfociti T attivati
nel sito di infiammazione, in particolare nel SNC durante la patogenesi dell’ESA. Il blocco di Tim-1 e del
reclutamento da esso mediato potrebbe diventare
un nuovo target terapeutico per il trattamento di patologie infiammatorie ed autoimmunitarie, in particolare per la cura della SM.
Role of T-cell immunoglobulin and mucin domain (Tim)-1 in lymphocyte
trafficking in the inflamed central nervous system
Emigration of T lymphocytes into the central nervous
system (CNS), mediated by highly glycosylated adhesion molecules, represents a critical event in the pathogenesis of multiple sclerosis (MS) and its animal
model, experimental autoimmune encephalomyelitis
(EAE). The protein T-cell immunoglobulin and mucin
domain (Tim)-1 is a glycoprotein expressed on the
surface of activated T lymphocytes, which present in
the extra-cellular portion a highly glycosylated mucinlike domain; moreover, the structure of Tim-1 is similar
to those of other adhesion molecules involved in leukocyte trafficking. All these structural information suggest a possible involvement for Tim-1 in lymphocyte
trafficking during inflammatory pathologies. The main
goal of our project was to study a possible novel role
for Tim-1 in the control of lymphocyte migration into
the inflamed CNS during the pathogenesis of EAE, the
mouse model of human MS.
RESULTS
We initially hypothesized that Tim-1 may be able to
bind members of the selectin family, classical adhesion molecules that interact with highly glycosylated
receptors similar to Tim-1. We found that, indeed,
Tim-1 protein is able to bind all three known selectins, P-, E-, and L-selectin. Physiologically, interaction between selectins and their ligands take place
on the vascular endothelium, and is optimized by
the shear stress caused by blood flow. For this reason, we performed Tim-1-selectin binding assays
under flow conditions, and our results indicate that
Tim-1-covered microbeads efficiently interact with
P- and E-selectin under flow conditions, while no
interactions were found with L-selectin. These data
suggest that Tim-1 may be important for the initial
capture of T lymphocyte on the vascular bed, which
is mediated by selectins under inflammatory conditions.
To investigate this hypothesis, we took advantage
70
from mutant mice (Tim-1Δexon3 mice) lacking the
Tim-1 mucin domain, while the rest of the protein is
still expressed on the cell surface. Pathogenic, proinflammatory T helper (TH)1 and TH17 lymphocytes
obtained from Tim-1Δexon3 mice have a reduced ability to interact with P-selectin, but not E-selectin, under flow conditions, both in vitro and in vivo, as observed in intravital microscopy experiments in mesenteric
venules, confirming a role for the Tim-1 mucin domain
in the capture of activated T lymphocytes on the vascular endothelium. Consequently, Tim-1 mutant activated T cells have a reduced ability to accumulate in
the skin, in an inflammation model strongly dependent
on P-selectin expression by the inflamed vascular endothelium, confirming a role for Tim-1 as adhesive receptor expressed by activated T lymphocytes.
We next found that TH1 and TH17 lymphocytes from
Tim-1Δexon3 mice have a reduced ability to adhere on
the vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1, an
adhesion molecule expressed by the vascular bed
under inflammatory conditions. As this receptor is the
counter-ligand for the integrin very late antigen (VLA)4, a molecule involved in MS and targeted by the antibody natalizumab (Tysabri) used for the treatment
of MS patients, we investigated the relation between
Tim-1 and VLA-4 on the surface of activated T cells.
Our data, obtained by immunoprecipitation studies
and ImageStream® imaging, show that Tim-1 and
VLA-4 co-localize on the surface of activated T cells,
suggesting that Tim-1 may regulate VLA-4 functionality in pathogenic T lymphocytes.
We finally analyzed the role of Tim-1 in activated T
cell recruitment in the inflamed CNS. In intravital microscopy experiments performed in inflamed CNS
vessels, we found that TH1 and TH17 cells from Tim1Δexon3 mice have a reduced capacity to adhere on the
inflamed vascular endothelium; moreover, mutant T
lymphocytes have a reduced ability to migrate in the
CNS during the development of EAE, and, consequently, they induce a less severe disease when com-
pared to WT cells. Accordingly, in an active EAE model,
Tim-1Δexon3 mice develop a less severe disease when
compare to WT animals, suggesting a crucial role for
Tim-1 in the development of the disease.
CONCLUSIONS
Our data demonstrate that Tim-1 is a novel adhesion
receptor, important for activated T cell capture on Pselectin under flow conditions, and that Tim-1 controls
integrin VLA-4 functionality on activated T cells. Moreover, Tim-1 is important for activated T cell recruitment in the inflamed tissue, in particular in the inflamed CNS during the pathogenesis of EAE. Overall,
our results suggest that the blocking of Tim-1 and
Tim-1-controlled trafficking may be a new therapeutic
target for the treatment of inflammatory and autoimmune disease, in particular for the treatment of human
MS.
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“Multiple Sclerosis” – Big Sky, Montana, USA - January 11 - 15, 2013.
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010, per la durata di 1 anno e l’ammontare di 50.000 €
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71
Ruolo dell’acido abscissico nella sclerosi multipla:
studio dei livelli in vivo nei pazienti e degli effetti in vitro
su oligodendrociti e neuroni
Chiara Fresia
DIMES, sezione di Biochimica, Università di Genova, Genova
Mentore
Elena Zocchi
nel cervello e nel midollo spinale i livelli di ABA aumentano, del 40 e 95%, rispettivamente al 14° e 9° giorno
dopo l’immunizzazione.
È stata investigata l’espressione della proteina LANCL2, recettore per l’ABA, in diversi tessuti di topi
C57BL non trattati; la proteina è risultata più abbondante nel cervello rispetto a tutti gli altri tessuti (tranne
i testicoli), e nel midollo spinale è risultata meno presente che nel cervello.
Per poter studiare il ruolo dell’ABA nella ESA, abbiamo
deciso di creare una linea di topi transgenici senza il
recettore dell’ABA, LANCL2: sono in corso le fasi finali
per la creazione di questi topi knock-out (KO). Il topo
KO condizionale sarà privo di LANCL2 solo a seguito
di induzione (il gene di LANCL2 sarà funzionale fino
alla somministrazione di un agente appropriato), ed il
transgene potrà essere inattivato solo nei tessuti del
sistema nervoso centrale (SNC), per non colpire l’azione dell’ABA al di fuori del SNC.
Gli effetti dell’ABA su oligodendrociti e neuroni
Sono stati esplorati gli effetti dell’aggiunta di ABA esogeno su una linea cellulare di astrocitoma umano (il
glioma 1321N1, un tipo di cancro al cervello), e su una
linea cellulare di feocromocitoma di ratto (linea PC12,
utile come sistema modello per il differenziamento
neuronale).
I risultati ottenuti indicano che l’ABA ha avuto poco
effetto sulla proliferazione delle cellule di astrocitoma,
ma ha agito come chemioattrattore per le cellule, aumentando anche i livelli del secondo messaggero intracellulare AMP ciclico.
L’ABA ha lievemente stimolato la proliferazione delle
cellule PC12 (aumento del 30% quando trattate con
ABA 30 μM), ma non ha avuto effetto sulla crescita di
nuovi neuriti.
L’ormone vegetale acido abscissico (ABA) è stato
dimostrato agire come ormone endogeno umano
pro-infiammatorio, capace anche di stimolare il rilascio di insulina e l’uptake di glucosio. Questo nuovo
ruolo scoperto per l’ABA come attivatore delle cellule dell’immunità innata così come dei linfociti ha suggerito di investigare se avesse un ruolo nella sclerosi
multipla (SM).
L’obiettivo è stato perseguito:
-misurando la concentrazione dell’ABA nel plasma e
nel liquido cerebrospinale (liquor) di pazienti con SM
e controlli, e nel cervello e midollo spinale di topi con
Encefalomielite Sperimentale Autoimmune (ESA), un
modello sperimentale di SM;
-valutando l’espressione del recettore dell’ABA,
LANCL2, nel cervello e midollo spinale murini;
-studiando l’effetto dell’ABA su oligodendrociti e
neuroni in vitro.
RISULTATI
Livelli di ABA nel siero e nel liquor
Abbiamo estratto l’ABA da siero e liquor prelevati da
pazienti con SM al momento della prima diagnosi, e
da volontari sani o pazienti non-SM, e misurato il contenuto di ABA.
I livelli di ABA nel siero dei soggetti di controllo (1.05+/0.29nM, n=8) erano all’interno della finestra di valori già riportata dal nostro gruppo (1.08+/-0.46nM,
n=17), e quelli dei pazienti con SM sono risultati simili
(1.09+/-0.51nM, n=5). I livelli di ABA nel liquor dei pazienti con SM sono risultati leggermente più bassi di
quelli misurati nel siero (0.88+/- 0.58nM), e più alti di
quelli dei pazienti non-SM (0.77+/-0.15nM). È necessario analizzare un numero maggiore di campioni per
valutare la possibilità di una differenza significativa tra
i due gruppi.
I livelli di ABA aumentano nel SNC di topi ESA
È stato misurato il contenuto di ABA nel cervello, midollo spinale e milza di 15 femmine di topo C57BL
sacrificate 9, 20 e 26 giorni dopo l’induzione della ESA
(prima della comparsa, picco, e fase cronica della malattia); cinque animali di controllo sono stati sacrificati
agli stessi time points di quelli immunizzati.
I risultati ottenuti indicano che il contenuto totale di
ABA nella milza non si modifica durante la malattia,
nonostante le variazioni di volume dell’organo; invece
CONCLUSIONI
I risultati ottenuti indicano che l’ABA potrebbe avere
un ruolo nella SM:
-in un modello murino di SM, i livelli di ABA aumentano nel cervello e nel midollo spinale durante la progressione della malattia, e ritornano ai valori basali
durante la fase cronica; l’aumento maggiore si osserva nel midollo spinale, il tessuto più colpito dalla
ESA;
-nei pazienti con SM, i livelli dell’ABA nel liquor sembrano lievemente più alti che nei pazienti non-SM,
72
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
sebbene un maggior numero di soggetti sia necessario per giungere a conclusioni significative;
-la proteina recettore dell’ABA è molto più espressa
nel SNC murino rispetto agli altri tessuti;
-gli astrociti migrano verso l’ABA e rispondono
all’ormone con un incremento del cAMP, coinvolto
nell’attivazione di specifiche funzioni cellulari, tra cui
il supporto trofico e la stimolazione della riparazione
tissutale nel SNC.
Per stabilire se l’ABA eserciti un’attività positiva o
un ruolo patogenetico nella SM, abbiamo sviluppato
una linea di topi carente del recettore dell’ABA: è in
corso lo studio dell’influenza dell’eliminazione genetica del segnale dell’ABA nel SNC sulla progressione
della malattia.
Role of abscisic acid in multiple sclerosis: study of the in vivo levels
in patients and of the in vitro effects on oligodendrocytes and neurons
Recently, the plant hormone abscisic acid (ABA) was demonstrated to behave as an endogenous human pro-inflammatory hormone also stimulating insulin release and
peripheral glucose uptake. The newly discovered role of
ABA as a functional activator of innate immune response cells and of lymphocytes suggested to investigate its
possible role in multiple sclerosis (MS).
The specific tasks of this project were the following:
- to measure the concentration of ABA in plasma and
in the cerebrospinal fluid (CSF) from patients with multiple sclerosis (MS) or with non-inflammatory neurological disorders (controls) and in the brain and spinal cord
(SC) from mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of MS
- to evaluate the expression of the ABA receptor, LANCL2, in murine brain and SC
- to investigate the effect of ABA on oligodendrocytes
and neurons in vitro.
RESULTS
ABA levels in serum and CSF from MS patients
ABA levels in the serum from the control subjects
(1.05+/-0.29nM, n=8) were within the range of values
already reported by our group (1.08+/-0.46nM, n=17),
and ABA levels from MS patients (at diagnosis) were
similar (1.09+/-0.51nM, n=5).
ABA levels in the CSF from MS patients were slightly
lower than those in the serum (0.88+/- 0.58 nM), and
slightly higher than those in the CSF from non-MS patients (0.77+/-0.15nM). A higher number of samples
needs to be evaluated in order to ascertain a possible statistically significant difference between the two
groups.
ABA levels increase in the brain and SC from EAE
mice
ABA content was measured in the brain, spinal cord,
and spleen of fifteen C57BL female mice sacrificed 9,
20 and 26 days after induction of EAE (corresponding
to pre-disease onset, peak and chronic phase of EAE,
73
respectively); five untreated, control animals were
sacrificed at the same time points. Results obtained
indicate that ABA content in the spleen was not modified during disease progression, despite the change
in organ volume; conversely, in the brain and SC, ABA
levels increased significantly (40 and 95 % of increase)
at the 14th and 9th day post-immunization, respectively.
Expression of the ABA receptor LANCL2 was investigated in several tissues from untreated C57BL mice,
and it proved to be highest in the brain, compared to
all other organs (except for testis), whereas in the SC
it was less abundant than in the brain.
To investigate the role of ABA in EAE, we decided to
create a transgenic mouse strain defective in the expression of the ABA receptor: the final mating steps
for the generation of the knock-out (KO) mouse are in
progress. The conditional KO mouse will lack LANCL2
only upon induction (i.e LANCL2 will be a functional
gene until an inducing agent is administered), and the
transgene will be located in the central nervous system, CNS, only, in order not to affect the action of
ABA outside the CNS.
Effect of ABA on oligodendrocytes and neurons
The effect of exogenously added ABA was explored
on a human astrocytoma cell line (1321N1) and on a
rat pheochromocytoma cell line (PC12, a model system for neuronal differentiation).
Results obtained indicate that ABA had little effect on
the proliferation of astrocytoma cells, but it behaved
as a chemoattractant for the cells and also induced an
increase of the intracellular levels of the second messenger cyclic AMP.
ABA slightly stimulated the proliferation of PC12 cells
(30% of increase when treated with 30 μM ABA) but
had no effect on neurite outgrowth.
CONCLUSIONS
The following results suggest that ABA may indeed
play a role in MS:
- in a murine model of MS, ABA levels increase in the
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
brain and SC during disease progression and return to
basal values during the chronic phase; the highest increase is observed in the SC, the tissue most affected
in the murine disease;
- in MS patients, ABA levels in the central nervous system appear to be slightly higher than those recorded
in non-MS patients, although more subjects need to
be evaluated before a statistically significant result can
be obtained;
- the ABA receptor protein is highly expressed in the
murine CNS compared to other tissues
- astrocytes migrate towards ABA and respond to
the hormone with an increase of a pivotal intracellular
second messenger, involved in the activation of cellspecific functions, which include trophic support and
stimulation of tissue repair in the CNS.
To establish whether ABA exerts a beneficial or, conversely, a pathogenetic role in MS we developed a
mouse strain lacking expression of the ABA receptor
in the CNS: work is in progress to evaluate how the
genetic disruption of ABA signaling in the CNS affects
disease progression.
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74
Insuccesso della rimielinizzazione in sclerosi multipla:
un caso di ipotiroidismo tissutale indotto dall’infiammazione?
Luciana Giardino
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie (DIMEVET), Università di Bologna, Bologna
Collaboratori
Mercedes Fernandez, Lorenzini Luca, Alessandri Marco, Giuliani Alessandro, Sivilia Sandra, Laura Calzà
La sclerosi multipla (SM) è una malattia che comprende
diverse fasi e diversi meccanismi patogenetici. Accanto
all’infiammazione e al disordine immunitario, un evento
critico nel determinare l’andamento di malattia è la capacità riparativa della mielina del singolo soggetto. Questa
capacità è fortemente limitata nel corso della progressione della malattia. Scopo di questo progetto è indagare
un possibile maccanismo alla base di questa incapacità riparativa, partendo dai risultati positivi ottenuti dal
nostro e da altri laboratori nel correggere questo difetto
attraverso la somministrazione di ormone tiroideo. Ipotizziamo che possa esistere un difetto nella produzione
della forma attiva dell’ormone, produzione che avviene
direttamente nei tessuti. Anche in soggetti con normali
livelli circolanti di ormoni tiroidei, un’eccessiva concentrazione tissutale di citochine proinfiammatorie potrebbe ridurre la disponibilità locale della forma attiva dell’ormone,
triiodotironina T3. Ne conseguirebbe che tutti i processi
cellulari dipendenti da T3 sono deficitari. La rimielinizzazione è un processo che dipende dalla disponibilità di T3,
come ampiamente dimostrato da studi in vitro e in vivo.
T3 è infatti una molecola chiave nella progressione del
precursore dell’oligodendrocita (OPC), in oligodendrocita
mielinizzante.
Scopi specifici dello studio sono quindi:
-misurare i livelli degli ormoni tiroidei T4, T3, e di T3 inversa (rT3), non biologicamente attiva, a diversi intervalli
temporali nel modello sperimentale di SM, l’Encefalite
Sperimentale Allergica (ESA), e durante demielinizzazione indotta da cuprizone;
-misurare il livello di mRNAs degli enzimi degli ormoni tiroidei D2, D3 e dei recettori nucleari dell’ormone tiroideo
TRalpha1,2 e TRbeta1,2 in aree demielinizzate e non, a
diversi intervalli temporali in ESA e durante demielinizza-
zione (microdissezione e cattura laser e real time PCR);
-correlare i livelli tissutali di T4, T3, rT3 con la concentrazione tissutale di citochine proinfiammatorie e con indici
molecolari e morfologici di mielinizzazione;
-qualora esista un difetto di conversione T4-T3, tentare
la sua correzione mediante somministrazione di T3.
RISULTATI
Abbiamo eseguito tutte le prove previste nel piano
di progetto, dimostrando che esiste una mancata regolazione del metabolismo dell’ormone tiroideo a livello
tissutale (midollo spinale) in animali ESA. In particolare:
si osserva una riduzione di T4 circolante ed incremento
nel midollo spinale in ESA cronica. Si osserva una drastica riduzione dell’espressione di tutte le isoforme dei
recettori nucleari degli ormoni tiroidei nel midollo spinale
in ESA acuta e cronica e una drastica up-regolazione
dell’espressione di D3, l’enzima che trasforma T4 nella
forma inattiva rT3. Il trattamento con l’ormone tiroideo
alla dose e schema di somministrazione utilizzato ha un
effetto parziale ma non totale sui componenti molecolari
che regolano l’azione dell’ormone tiroideo. Il trattamento
con T3 non è in grado di contrastare l’over-espressione
di citochine infiammatorie nel midollo spinale dovuta
all’induzione dell’ESA.
CONCLUSIONI
I risultati potrebbero indirizzare lo sviluppo di terapie adiuvanti per la fase acuta della malattia, con l’obiettivo di
correggere il distiroidismo tissutale. Futuri studi saranno
realizzati per testare se la componente infiammatoria influisce: 1) sull’espressione degli enzimi coinvolti nel metabolismo dell’ormone tiroideo, utilizzando colture primarie
di astrociti; 2) sull’espressione dei recettori nucleari dell’ormone tiroideo utilizzando colture primarie di OPC.
Remyelination failure in multiple sclerosis: a case of inflammation-induced
tissue hypothyroidism?
Multiple sclerosis is a disease involving several stages
and different pathogenetic mechanisms. Besides inflam-
75
mation and immune disorder, individual myelin repair capability is a critical event in determining the course of the
disease. This ability could strongly limited in the course
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
of the disease. The aim of this project is to investigate
a possible mechanism for this inability, starting from the
positive results obtained by our and other laboratories in
correcting this defect by thyroid hormone administration.
We assume that the production of the active form of the
hormone, that takes place directly in the tissues, could
be altered in EAE. In fact, even in subjects with normal
circulating levels of thyroid hormones, excessive tissue
concentration of proinflammatory cytokines could reduce the local availability of the active form of the hormone,
i.e. triiodothyronine T3. It follows that all cellular processes depending on T3 are insufficient. Remyelination is a
process that depends on the availability of T3, as amply
demonstrated by studies in vitro and in vivo. T3 is in fact
a key molecule in the progression of oligodendrocyte
precursor cell toward myelinating oligodendrocyte.
Specific aims of the study are the following: to measure
the thyroid hormonesT4, T3 and the inactive forms rT3
levels, in plasma, cerebrospinal fluid, white matter, gray
matter during EAE and cuprizone-induced demyelination
at different time-points; to measure the enzyme D2, D3,
the thyroid receptor TR-alpha1,2, TR-beta1,2, MTC8
mRNAs expression levels in demyelinated versus intact
CNS areas (laser capture microdissection and real time
PCR); to correlate T4, T3, rT3 tissue levels with proinflammatory cytokines tissue levels; to correlate T4, T3,
rT3 tissue levels with OPCs, oligodendrocyte and myelination markers at mRNA, protein and morphological level; in case of T4 to T3 conversion defect, to correct it by
T3 administration.
RESULTS
We have completed the project program. Our results indicate that there is a severe deregulation of
the thyroid hormone metabolism at tissue level (spinal cord) during EAE. In particular: there is a reduction
of circulating T4 and an increase in the spinal cord in
chronic EAE; there is a drastic reduction in the expression of all isoforms of nuclear receptors in the spinal
cord in acute and chronic EAE; there is a dramatic upregulation of the expression level of D3, the enzyme
that inactivates T4 to rT3. The treatment with thyroid
hormone, at the dosage and administration scheme
used in this study, partially, but not completely restores
the molecular mediators of the cellular action of thyroid
hormone. The T3 treatment is ineffective in controlling
the EAE-induced up-regulation of inflammatory cytokines expression in the spinal cord.
CONCLUSIONS
These results could suggest the development of adjuvant therapies for the acute phase of the disease, aimed
correcting is dysthyroidism tissue. To directly test the
hypothesis that neuroinflammation alters the molecular
machinery of thyroid hormone action at cell level, we will
test if the exposure to a mixture of proinflammatory cytokines modify the expression of thyroid hormone metabolism enzymes in primary culture of astrocytes, and
the expression of thyroid hormone nuclear receptors in
primary culture of OPCs.
...................................................................................................................................................
Calzà L, Fernandez M, Giardino L, Cellular approaches for stimulating cns remyelination: thyroid hormone to promote myelin repair via endogenous stem and precursor cells. J. Mol. Endocrinol.,
2010, 44:13-23
Dell’Acqua ML, Lorenzini L, D’intino G, Sivilia S, Pasqualetti P, Panetta V, Paradisi M, Filippi MM, Baiguera C, Pizzi M, Giardino L, Rossini PM, Calzà L. Functional and molecular evidence of myelinand neuro-protection by thyroid hormone administration in experimental allergic encephalomyelitis. neuropathology and applied neurobiology, 2012, 38:454-470
Fernandez M, Lorenzini L, Sivilia S, Giuliani A, Giardino L, Calzà L. Thyroid hormone and myelination: prenatal 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, from development to pathology. xiv Congresso
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Calzà L, Fernandez M, Giardino L. The differentiation block of oligodendocyte precursor cells in multiple sclerosis. Neurotalk 2011, Dalian, China, 22-25 maggio 2011
..................................................................................................................................................
76
Analisi del network proteolitico nella sclerosi multipla: una breccia
significativa verso la comprensione dei meccanismi patogenetici
e la valutazione laboratoristica dell’efficacia della terapia
Grazia Maria Liuzzi
Dipartimento di Bioscienze, Biotecnologie e Biofarmaceutica, Università degli Studi di Bari “A. Moro”, Bari
Collaboratori
Tiziana Latronico, Anna Fasano, Maria Teresa Branà, Pasqua Gramegna, Gaetano Di Bari
Paolo Riccio, Rocco Rossano, Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali,
Università della Basilicata, Potenza
Gabriella Coniglio, Centro Sclerosi Multipla, Dipartimento di Neurologia, Ospedale Madonna delle Grazie, Matera
I più importanti enzimi proteolitici coinvolti nella patogenesi della sclerosi multipla (SM) sono le metalloproteinasi
di matrice (MMPs), le calpaine (CANP) e gli attivatori del
plasminogeno (PA). Insieme con i loro inibitori tissutali naturali e i loro recettori, essi formano una rete strettamente
interconnessa che deve essere studiata nella sua integrità per comprendere appieno i meccanismi patogenetici
della SM, anche in relazione all’effetto del trattamento.
L’obiettivo finale di questo progetto è stato quello di ottenere informazioni sul ruolo degli enzimi proteolitici sopra menzionati nella patogenesi della SM e di studiare se
proteinasi che agiscono a sia a livello centrale che periferico possano rappresentare un bersaglio per i farmaci
attualmente utilizzati per la cura della SM.
RISULTATI
Per le esigenze del presente progetto di ricerca le
risorse economiche sono state impiegate principalmente per finanziare in parte un assegno di ricerca e
per l’acquisto di materiale di consumo.
Nella prima parte di questo progetto, utilizzando un
sistema in vitro, abbiamo dimostrato che differenti attività proteolitiche extra- ed intracellulari, attive nei confronti della proteina basica della mielina (MBP), uno dei
principali costituenti della guaina mielinica, vengono rilasciate sia da astrociti di ratto che dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di pazienti con
SM e sono inibite, rispettivamente, da interferone-beta
(IFN-β) o da farmaci immunomodulanti attualmente
utilizzati per il trattamento dei pazienti con SM. Utilizzando inibitori di proteinasi e la tecnica zimografica
abbiamo evidenziato che, nei nostri modelli di studio,
le principali attività proteolitiche extracellulari erano
rappresentate dalla metalloproteinasi-9 (MMP-9) e
dall’attivatore del plasminogeno di tipo urochinasico
(uPA). Al contrario, la calpaina-2 (CANP-2), che rappresentava la principale attività proteolitica intracellulare, era presente solo negli astrociti, suggerendo che
tale enzima svolge un ruolo importante all’interno del
sistema nervoso centrale (SNC), piuttosto che a livello
periferico. Studiando il sistema enzima/inibitore abbia-
77
mo anche dimostrato che l’IFN-β, a livello centrale, è
più efficace nel bloccare l’espressione della CANP-2
rispetto alla MMP-9.
Sulla base di questi risultati, nella seconda parte del
nostro studio abbiamo focalizzato la nostra attenzione sui sistemi extracellulari della MMP-9 e del suo inibitore tissutale naturale TIMP-1 e dell’uPA e del suo
recettore uPAR a livello sistemico. L’analisi dei PBMC
di una vasta popolazione di pazienti con SM ha dimostrato che la MMP-9 e l’uPA sono simultaneamente up-regolati in risposta alla stadio della malattia e,
pertanto, rappresentano indicatori affidabili di attività
della malattia. I livelli incrementati di uPAR solubile
(suPAR) in pazienti con SM recidivante-remittente
(SM-RR) in fase attiva di malattia suggerisce che suPAR può essere un indicatore prognostico di attivazione dell’uPA in corso di SM. L’inibizione dei livelli
della MMP-9 e dell’uPA in pazienti con SM trattati con
farmaci immunomodulanti indica che questi enzimi
rappresentano sensibili target terapeutici nella SM e
che la loro inibizione è probabilmente un meccanismo
che contribuisce al miglioramento clinico dei pazienti
in seguito al trattamento.
Un altro approccio del nostro studio è stato finalizzato alla determinazione e identificazione degli isomeri
delle gelatinasi A (MMP-2) e B (MMP-9). Utilizzando
una nuova tecnica rappresentata dalla zimografia bidimensionale (2-DZ) abbiamo rilevato in campioni di
siero da pazienti con SM isomeri della MMP-2 e della MMP-9, dimostrando il loro incremento rispetto ai
donatori sani. Utilizzando sieri SM concentrati 8-10
volte, è stato possibile evidenziare la presenza di ulteriori spots che sono stati identificati come forme sialilate della MMP-9. La presenza di MMP-9 sialilata, che
non è mai stata descritta prima nel siero di pazienti
con SM, potrebbe correlare con i processi infiammatori coinvolti nella SM.
CONCLUSIONI
I risultati ottenuti in questo progetto supportano l’ipotesi
che il danno neuroinfiammatorio in corso di SM coinvolge un alterato bilancio tra più sistemi proteolitici extra- ed
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
intracellulari che agiscono a vari livelli. In particolare, i nostri
risultati indicano che tra gli enzimi studiati, le calpaine sono
prevalentemente rilasciate dalle cellule residenti del SNC
suggerendo un ruolo principale nei meccanismi di demielinizzazione, mentre la MMP-9 e l’uPA sembrano essere
coinvolti a più livelli nella patogenesi della MS. L’induzione
coordinata della MMP-9 e dell’uPA nella fase attiva della
SM e la loro inibizione da parte dei farmaci immunomodulanti indica l’interconnessione tra questi importanti sistemi
di proteolisi extracellulare e suggerisce che sia la MMP-9
che l’uPA possono rappresentare affidabili marker per valutare l’attività della malattia e l’efficacia terapeutica.
Analysis of the proteolytic network in multiple sclerosis: a hard breakthrough
towards the understanding of pathogenesis and laboratory evaluation
of therapy effectiveness
The most important proteolytic enzymes involved in
multiple sclerosis (MS) pathogenesis are matrix metalloproteinases (MMPs), calpains (CANP) and plasminogen
activators (PA). Together with their natural tissue inhibitors and their receptors, they form a strictly interacting
network that needs to be studied in its integrity to fully
understand the pathogenic mechanisms in MS and the
action of treatment.
The ultimate objective of this project was to gain insight
into the role of the above mentioned proteolytic enzymes
in MS pathogenesis and to study whether proteinases
acting at central and peripheral level may represent a target for the used MS drugs.
RESULTS
Funding for the present research project were mainly
used to support in part a a post-graduate fellowship and
for the purchase of consumables.
In the first part of this project, by using an in vitro system
we demonstrated that different extracellular and intracellular proteolytic activities acting towards myelin basic
protein (MBP), one of the most important constituents
of the myelin sheath, are released from both rat cultured astrocytes and peripheral blood mononuclear cells
(PBMC) from MS patients and are inhibited, respectively,
by interferon-beta (IFN-β) or by different immunomodulant drugs currently used for the treatment of MS patients. By using proteinase inhibitors and zymography we
demonstrated that, in our models, the major extracellular
proteolytic activities were represented by matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and urokinase-type plasminogen
activator (uPA). Calpain II (CANP-2), which represented
the main intracellular proteolytic activity, was present only
in astrocytes, suggesting that it plays an important role
within the central nervous system (CNS), rather than at
peripheral level. By studying the systems enzyme/inhibitor, we assessed that IFN-β is more effective in blocking
the expression of CANP-2 rather than MMP-9.
Based on these results, in the second part of this project
we focused our attention on the study of the extracellular
78
systems of MMP-9 and its natural tissue inhibitor TIMP1 and uPA/uPA receptor (uPAR) at systemic levels. The
analysis of PBMC from a large cohort of MS patients
demonstrated that MMP-9 and uPA are concurrently
up-regulated in response to disease stage and therefore represent reliable markers of disease activity. The
increased levels of the soluble uPAR (suPAR) in active
RR-MS patients in comparison with inactive RR-MS
patients and HD suggests that suPAR can be a prognostic marker of uPA activation in course of MS. The
inhibition of MMP-9 and uPA in MS patients treated with
immunomodulant drugs suggests that these enzymes
represent therapeutic target in MS and that their inhibition is probably a mechanism which contributes to the
clinical recovery of MS patients following treatment. This
hypothesis is also supported by the increase of TIMP-1
in PBMC from active RR-MS patients treated with immunomodulant drugs. Another approach of our study
has been aimed at the detection and identification of
isoforms and isomers of gelatinases A (MMP-2) and B
(MMP-9). By using 2-D zymography (2-DZ) we detected
in serum samples from MS patients MMP-2 and MMP9 isomers demonstrating their increase in comparison to
HD. By using MS sera concentrated 8-10 fold, we were
able to detect additional spots which were identified as
sialylated MMP-9. The presence of sialylated MMP-9,
which has been never described before in the sera of
MS patients, might correlate with the inflammatory processes involved in MS.
CONCLUSIONS
The results obtained in this project support further the
hypothesis that the neuroinflammatory damage during MS involves altered balance between multiple extracellular and intracellular proteolytic systems acting
at various levels. In particular, our results suggest that
among the studied enzymes, calpains are predominantly released by LPS-activated astrocytes and therefore
their main role seems to be confined to mechanisms of
demyelination. By contrast, MMP-9 and uPA are increased in culture supernatants from both LPS-activated
astrocytes and PBMC from MS patients, suggesting their
involvement in different steps of MS pathogenesis, such
as blood brain barrier (BBB) disruption, invasion of brain
tissue by inflammatory cells, demyelination and axonal
damage. The coordinated induction of MMP-9 and uPA
in the active phase of MS and their inhibition by the used
MS drugs indicate the interconnection between these
important systems of extracellular proteolysis and suggest that both MMP-9, the main MMP produced by
PBMC from MS patients, and uPA may represent reliable markers of disease activity and therapeutic efficacy.
...................................................................................................................................................
Latronico T, Branà MT, Gramegna P, Fasano A, Di Bari G, Liuzzi GM. Inhibition of myelin-cleaving proteolytic activities by interferon-beta in rat astrocyte cultures. Comparative analysis between
gelatinases and calpain-II. Plos One, 2013; 8:e49656
Latronico T, Coniglio, Branà MT, Fasano A, Liuzzi GM. Coordinated inhibition of matrix metalloproteinase-9 and G urokinase plasminogen activator by immunomodulant therapies in peripheral
blood mononuclear cells from MS patients. XXII AINI Congress, Catania, 26-29 September 2012.
Riccio P, Rossano R, Liuzzi GM. May diet and dietary supplements improve the wellness of multiple sclerosis patients? A molecular approach. Autoimmune Dis. 2011; 2010:1-12. doi:
10.4061/2010/249842.
Liuzzi GM, Latronico T, Branà MT, Gramegna P, Coniglio MG, Rossano R, Larocca M, Riccio P. Structure-dependent inhibition of gelatinases by dietary antioxidants in rat astrocytes and sera of
multiple sclerosis patients. Neurochem Res. 2011;36:518-27. doi: 10.1007/s11064-010-0373-2.
Rossano R, Larocca, Riccio P, Coniglio G, Latronico T, Liuzzi G. Detection of MMP-9 sialylated isotypes in sera of patients with relapsing/remitting multiple sclerosis. 20th ARSEP Meeting on
Multiple Sclerosis, Parigi, 12-13 May, 2011.
Latronico T, Branà M.T, Merra E, Fasano A, Di Bari G, Casalino E, Liuzzi GM.
Impact of manganese neurotoxicity on gelatinase production and superoxide dismutase activity in rat primary astrocytes. Effect of resveratrol and therapeutical implications for the treatment of
CNS diseases.(submitted)
Latronico T, Coniglio G, Branà MT, Fasano A, Liuzzi GM. Coordinated induction of MMP-9 and uPA in peripheral blood mononuclear cells from MS patients. Inhibitory effect of immunomodulant
therapies. (in preparation)
Progetto di ricerca finanziato con il bando 2009 per un periodo di 2 anni (prorogato di 3 mesi) e l’ammontare di 50.000 €
...................................................................................................................................................
79
Regolazione oligodendrocitaria del potenziale intrinseco
di crescita neuritica
Gianluca Menichetti
NICO, Università di Torino, Torino e Dipartimento Scienze Farmacologiche e Biomolecolari, Università di Milano, Milano
Mentore
Ferdinando Rossi, Maria Pia Abbracchio
processo di arborizzazione. Le differenti modalità sono
determinate da proprietà età specifiche e da proprietà
intrinseche dei neuroni. Subentrano poi segnali contatto
mediati derivanti dalle cellule dei granuli che inducono
la crescita dell’albero terminale. Gli oligodendrociti sono
degli ottimi candidati per la modulazione del processo
di crescita assonale, influendo anche sulla regolazione
delle competenze intrinseche neuronali. Per valutare la
rilevanza del rapporto oligodendrocita-assone nella regolazione della crescita assonale e nella maturazione
gliale abbiamo esaminato il pattern di espressione del
recettore GPR17 nel cervello post natale di topo durante
lo sviluppo fisiologico. In analogia con il ruolo delle purine noi ipotizziamo che l’uracil nucleotide e i loro zucchero-coniugati possano partecipare nella comunicazione
pirimidinergica tra assoni e oligodendrociti. GPR17 è
prodotto da un subset di cellule post mitotiche oligodendrocitarie. Queste cellule in un primo momento appaiono
collocate nella regione dei nuclei profondi del cervelletto,
corrispettiva della futura sostanza bianca. La distribuzione delle cellule GPR17 positive appare differente nelle
diverse aree del cervelletto a tempi diversi, indicando
una correlazione tra il recettore e il processo di mielinizzazione. I primi dati suggeriscono un coinvolgimento
del GPR17 nell’inizio del processo di mielinizzazione e le
GPR17 positive precedono l’espressione delle proteine
della mielina matura. La massima espressione avviene
intorno al settimo giorno post natale e nel decimo giorno
raggiunge, tramite un gradiente di espressione, gli apici
dei lobuli cerebellari, in parallelo con la maturazione mielinica. Successivamente, l’espressione di GPR17 decresce in parallelo con l’aumento dei marker della mielina
matura. La modalità di espressione del recettore è indicativa del livello e del grado di maturazione. Dopo la
nascita, il GPR17 appare situato nelle cellule a livello somatico ed esattamente nell’apparato del Golgi (Gpi) per
poi essere espresso a livello degli interi processi (Grm).
Alcuni progenitori oligodendrocitari GPR17-positivi rimangono anche nel cervelletto adulto, sparsi sia nella
sostanza grigia e sia in quella bianca e mai co-espressi
con proteine della mielina. Questa distribuzione potrebbe suggerire una maturazione precoce di alcuni OPC.
I neuroni, includendo le PCs, potrebbero attivamente
essere coinvolti nella maturazione degli OPC. Nello specifico si può dedurre che la popolazione esprimente il recettore nel soma e nel Golgi sia una popolazione distinta
di OPC già presenti sul territorio e che, tuttavia, richiede
Gli oligodendrociti sono coinvolti nella regolazione delle proprietà di crescita intrinseche, nella maturazione e
funzionalità dei neuroni. Il principale obbiettivo di questo
studio è quello di contribuire a capire le basi biologiche
e i meccanismi dell’interazione assone-oligodendrocita
coinvolti nella regolazione delle proprietà intrinseche di
crescita neuronale e nelle maturazione degli oligodendrociti stessi. In questo contesto, lo studio ha previsto
due differenti parti. La prima si è focalizzata sull’osservazione e la descrizione delle differenti modalità di crescita
assonale dei neuroni Purkinje (PCs) durante le differenti
età cercando di valutare le proprietà di crescita intrinseche dei neuroni. Abbiamo valutato ed esaminato come
le interazioni tra assoni di Purkinje e oligodendrociti modificano la modalità di crescita neuritica. Particolare attenzione è stata posta sul recettore GPR17, espresso
nello sviluppo e dopo danno nelle fasi che precedono il
processo di mielinizzazione.
Esso infatti è espresso dai precursori degli oligodendrociti (OPCs). L’espressione del GPR17 è massima nelle
cellule pre-oligodendrocitarie post-mitotiche uscite dal
ciclo cellulare e che hanno iniziato a differenziarsi. Il recettore non colocalizza nelle cellule mature con marker
oligodendrogliali come CNPase, MAG o MBP. L’esposizione degli OPCs a molecole agoniste endogene del
GPR17, come l’UDP glucosio, promuove la progressione e la maturazione verso cellule mielinizzanti. Al contrario, l’esposizione ad antagonisti del recettore o il silenziamento compromette il programma di differenziamento
delle cellule oligodendrocitarie. Successivamente, ad un
insulto ischemico, ad un trauma o ad una demielinizzazione all’interno del CNS le cellule esprimenti GPR17 si
attivano e proliferano iniziando un tentativo di riparazione. GPR17 quindi è un regolatore fisiologico di oligodendrogenesi e partecipa al riparo dopo danno e demielinizzazione. Questo studio infine cerca di mettere in luce e
svelare i meccanismi cellulari e molecolari che intercorrono tra oligodendrociti e neuroni e punta alla scoperta di
potenziali target molecolari per le malattie caratterizzate
dalla perdita di oligodendrociti.
RISULTATI
Il nostro lavoro ha mostrato come i neuroni PCs piastrati
a diverse età accrescono gli assoni in maniera differente. L’allungamento assonale prevale nell’età embrionale mentre i neuriti post natali vanno incontro ad un
80
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
specifici segnali per la maturazione. Queste cellule potrebbero, quindi, maturare secondo un onda che parte
dalle zone più centrali o proliferare in una regione e poi
migrare nel resto del territorio, sia come OPC o cellule
già mature. I dati indicano l’esistenza di un’onda di maturazione anche se le cellule GPR17 non sembrano avere
caratteristiche migratorie. L’ipotesi è che esistano segnali
che provengono da altri elementi cellulari come i neuroni
stessi. L’espressione del recettore segue la maturazione degli assoni in modo molto caratteristico e precede il
processo di mielinizzazione. Quindi possiamo ipotizzare
un coinvolgimento di un sistema molecolare che include
più elementi cellulari ed uno specifico meccanismo di comunicazione tra gli oligodendrociti e neuroni, attraverso
un percorso di segnalazione purinergico. Inoltre, lo studio
rivela che GPR17 provoca il passaggio da uno stadio di
proliferazione degli OPC ad uno di differenziazione, non
essendo più presente negli oligodendrociti maturi.
CONCLUSIONI
Le cellule Purkinje in coltura mostrano durante la crescita un programma neuritogenico intrinseco coinvolto
nella iniziale navigazione assonale, importante per il
raggiungimento dei target e per la successiva espansione dell’albero terminale. L’esecuzione di questo pro-
gramma intrinseco è regolato da segnali provenienti
dall’ambiente circostante che modificano le competenze di crescita delle cellule neuronali adattando le
loro proprietà endogene alle differenti fasi della morfogenesi dei neuriti. Il contatto con le cellule dei granuli induce i neuroni di Purkinje ad accrescere l’albero
terminale. Altre cellule potrebbero contribuire, dunque,
allo sviluppo dell’intera struttura assonale. Le cellule
oligodendrocitarie possono essere degli ottimi candidati per la modulazione della crescita assonale e
la regolazione di competenze neuronali intrinseche.
L’interazione oligodendrocita-assone è di elevata rilevanza al fine della funzionalità neurale. Abbiamo dunque esaminato il pattern di espressione del recettore
GPR17 nel cervelletto post natale, nelle differenti fasi
di sviluppo. Il GPR17 ha un ruolo di primaria importanza nella maturazione degli oligodendrociti, nella oligodendrogenesi ed è un probabile nuovo target per il
processo di rimielinizzazione. Dati preliminari suggeriscono che GPR17 potrebbe essere sovra regolato in
SM. Se questa ipotesi si dimostrasse vera, il legame
di GPR17 con molecole specifiche potrebbe aiutare
il recettore a normalizzare il turn-over nei tessuti demielinizzati e contribuire in modo efficace a ristabilire il
normale processo di rimielinizzazione.
Oligodendrocyte regulation of intrinsic neuritic growth properties
The main goal of the study is to contribute to unravel
basic biological mechanisms of axon-oligodendrocyte
interactions involved in regulating the intrinsic neuritic
growth properties of CNS neurons and oligodendrocyte
maturation. This study demonstrated the existence of
an intrinsic program which is finely regulated by extrinsic
factors. It is known however that an important role is played by extrinsic factors of the surrounding environment.
Oligodendrocytes are good candidates to modulate the
pattern of axon outgrowth. Not only extrinsic regulators
affect intrinsic neuronal competence. For this instance we focused our attention on the GPR17 receptor.
GPR17 could have an important role in the promotion of
physiological myelination and remyelination upon myelin
disruption. GPR17 is expressed on oligodendrocyte precursors (OPCs), the cells that give raise to mature myelinating oligodendrocytes both during development and
throughout adulthood. GPR17 expression is maximal in
post-mitotic pre-oligodendrocytes that have just exited
the cell cycle to become irreversibly committed to diffe-
81
rentiation. There is, instead, no colocalization of GPR17
with more mature myelinating oligodendroglial markers
like CNPase, myelin-associated glycoprotein MAG or
myelin basic protein MBP. Exposure of OPCs to GPR17
endogenous agonists (eg, UDPglucose) promotes progression to more mature myelinating cells. GPR17 inhibition by either receptor antagonists or specific silencing
RNAs markedly impaired OPCs differentiation program.
Importantly, after either an ischemic, a traumatic, or a
demyelinating insult to the CNS, GPR17-expressing
cells in the lesioned tissue undergo activation and start
proliferating, suggesting a repair attempt. Thus, GPR17
is a physiological regulator of oligodendrogliogenesis
and, upon injury, it participates to repair of demyelinated
lesions.
RESULTS
Our work showed that Purkinje (PCs) neurons plated
at distinct developmental ages grow axons according
to different patterns. Our experiments show that the
growth pattern of embryonic or postnatal PCs in vi-
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
tro is determined by the contribution of age-specific
properties and mode-associated mechanisms. The
contact-mediated signals derived from granule cells
specifically induce arbour growth. Hence, oligodendrocytes are good candidates to modulate the pattern
of axon outgrowth. With the long-term aim to define
the relevance of axon-oligodendrocyte interactions in
regulating PC axon growth mode, here we examined
the pattern of expression of GPR17 in the postnatal
cerebellum during physiological development. In analogy with the role of purine nucleotides and nucleosides, we hypothesise that uracil nucleotides and their
sugar-coniugates participate in a pyrimidinergic communication between axons and oligodendrocytes.
Furthermore, GPR17 is produced by a subset of
postmitotic oligodendrocytes. At first, these cells are
located in the deep cerebellar regions, corresponding to the prospective white matter. The distribution
of the expression of GPR17 is different in distinct
areas of the cerebellum at different times indicating
a correlation between the GPR17 and the process
of myelination. The first data and result suggest an
hypothetical involvement of GPR17 in the beginning
of myelination and that GPR17-expressing oligodendrocyte progenitors appear in the cerebellum before
myelin proteins are produced. Early after birth virtually all GPR17+ cells display a somatic positivity cells
(gpi). This type of labelling, defined “gpi” (GPR17
protein intracellular, henceforth mentioned as ‘‘Gpi’’
cell) likely reveals the activation of the biosynthetic
pathway of the receptor at the level of the Golgi
complex. Later on, GPR17 is mostly expressed on
all the processes of OPC. These latter GPR17+ cells
exhibit a higher and broader GPR17 expression,
extended to both somata and processes and indicative of receptor localization to the cell membrane (GPR17 receptor on cell membrane, henceforth
mentioned as ‘‘Grm’’ cells). Gpi cells are thus more
immature than Grm cells. Moreover, receptor upregulation and distribution to cell processes occurs initially in deep regions and subsequently in superficial
regions. Some GPR17-positive oligodendrocytes
progenitors remain also in the adult cerebellum where they are scattered in both grey and white matter
and never co-express myelin proteins. This pattern
of expression is consistent with an involvement of
the receptor in the maturation of oligodendrocytes
and with former data on the postnatal maturation
of oligodendroglia of the cerebral cortex. Neurons
including Purkinje cells may be actively involved in
of the maturation of OPC. The observation finally indicate a particular distribution at P0 of GPR17 cells
near the cerebellar peduncles. This distribution might
suggest a precocious maturation of some OPC. Or it
can be deduced that the “gpi” population at this age
express the receptor only in the Golgi apparatus is a
distinct population of OPC that are already present
82
in the territory and that, however, require specific
signals to mature. The “grm” seems that enter in
the cerebellum and derived from brainstem. During
development of the cerebellum appears also a zone
of proliferation visible in the tissue placed around
the deep nuclei. This might suggest that there are
OPC proliferating in very circumscribed and specific area that constitute probable niches of distinct
proliferation populations of OPC. The data indicate
the existence of a wave of maturation which can
be seen in the progenitor antecedent the formation
of myelin. GPR17 cells don’t seem to have migratory characteristics. We can think of the existence
of signals that originate from other cell maturing
components. The expression the receptor follows
the maturation of the axons in a very characteristic
manner and precedes the process of myelination.
Therefore we can think to the involvement of a molecular system that includes more cellular elements
and a specific mechanism of communication and
interaction between oligodendrocytes and neurons
through a purinergic signaling pathway.
CONCLUSIONS
Cultured Purkinje cells recapitulate an intrinsically coded neuritogenic program, involving initial navigation
of the axon towards the target field and subsequent
expansion of the terminal arborisation. The execution of this program is regulated by environmental
signals that modify the growth competence of Purkinje cells, so to adapt their endogenous properties
to the different phases of neuritic morphogenesis.
Contact-mediated signals derived from granule
cells specifically induce arbour growth. Hence, oligodendrocytes are good candidates to modulate
the pattern of axon outgrowth. Not only extrinsic
regulators affect intrinsic neuronal competence, but
defined components of the neuronal machineries
can change the modality of neurite interplay with
oligodendrocytes. With the long-term aim to define
the relevance of axon-oligodendrocyte interactions
in regulating PC axon growth mode, here we examined the pattern of expression of GPR17 in the postnatal cerebellum. GPR17 is a key player in oligodendrogenesis and a new target for remyelination.
Furthermore, the study reveals that GPR17 controls
the transition of proliferating to differentiating OPCs
but is no longer present in mature myelinating oligodendrocytes.
...................................................................................................................................................
De Luca A, Vassallo S, Benitez-Temino B, Menichetti G, Rossi F, Buffo A. “Distinct modes of neuritic growth in purkinje neurons at different developmental stages: axonal morphogenesis and cellular regulatory mechanisms” PLoS One. 2009 Aug 31;4(8)
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...................................................................................................................................................
83
Ruolo dello stress ossidativo nella sclerosi multipla.
Un’analisi proteomica e red-ox proteomica
Marzia Perluigi
Dipartimento di Scienze Biochimiche “A. Rossi Fanelli”, Sapienza Università di Roma e Laboratorio di Virologia,
Istituto Regina Elena, IRE, Roma
Collaboratori
Federico De Marco Aldo Venuti, Elona Bucaj, Tatiana Koudriavtseva, Manuela Onesti, Francesca Sperati
presenti in letteratura, a validazione del nostro approccio sperimentale. È interessante notare che molte di
queste proteine sono risultate maggiormente espresse nei pazienti con SM rispetto ai controlli sani: ceruloplasmina, antitrombina III, clusterina, apolipoproteina
E e complemento C3. In particolare, la clusterina ha
mostrato un interessante trend, poiché i suoi livelli di
espressione si sono mostrati aumentati già nella fase
remittente rispetto ai controlli, e si sono mantenuti upregolati nella fase di ricaduta.
Per chiarire ancor meglio le variazioni del proteoma
del siero, abbiamo inoltre eseguito l’analisi redox proteomica, allo scopo di identificare specifiche proteine
modificate ossidativamente la cui alterazione potrebbe potenzialmente portare a disfunzioni collegate al
decorso patologico della malattia.
Tra i risultati dell’analisi redox proteomica, un dato particolarmente interessante è quello relativo alla “vitamin
D-binding protein” (DBP), il maggior carrier plasmatico
della vitamina D. Molti studi condotti sul CSF di pazienti affetti da SM hanno mostrato un link tra i livelli
di DBP e il decorso della malattia e una correlazione
inversa tra livelli di vitamina D circolante e rischio di
SM. Abbiamo trovato che la DBP è maggiormente
ossidata nei pazienti SMRR rispetto ai controlli e, tra
i pazienti, più ossidata in quelli nella fase di ricaduta
rispetto a quelli in remissione, mostrando perciò una
piena concordanza con il corso della malattia.
Analogamente, abbiamo trovato un progressivo aumento di ossidazione dell’Apolipoproteina A-IV, che
conferma che i livelli di SO aumentano con la progressione della malattia.
Esistono prove significative che il meccanismo patogenetico delle malattie neurodegenerative, compresa la
sclerosi multipla (SM), sia mediato dallo stress ossidativo (SO) e dalla eccitotossicità. Tuttavia, allo stato
attuale, i pochi dati biochimici e molecolari disponibili
fanno emergere uno scenario incoerente e contraddittorio. I metodi di “redox proteomica”, recentemente
sviluppati, accoppiano l’abilità della proteomica di descrivere l’intero pattern delle proteine in un campione
specifico con l’elevata capacità dei metodi immunochimici di evidenziare le loro modificazioni ossidative.
Tali modificazioni possono svolgere un ruolo regolatorio cruciale nella cellula, ma quando sovrastano la capacità di scavenging della cellula il loro accumulo può
causare l’alterazione dell’omeostasi cellulare. Perciò
l’approccio redox proteomico rappresenta una strategia emergente e potenzialmente premiante per chiarire
a fondo il ruolo dello SO nella SM e comprendere la
patogenesi e la fisiopatologia della SM.
Allo scopo di indagare sul coinvolgimento del danno
ossidativo nei meccanismi della SM, abbiamo utilizzato un duplice approccio proteomico per analizzare il
profilo di espressione delle proteine ed identificare le
proteine modificate ossidativamente nei pazienti affetti
da SM in confronto con controlli sani.
RISULTATI
Abbiamo confrontato il siero di tre gruppi di soggetti, 18
pazienti con SM recidivante remittente (SMRR) stabile (senza episodi di ricadute nei tre mesi precedenti)
(REM), 18 pazienti con SMRR attivo (durante una ricaduta clinica) (REL) e 7 controlli sani (CTR), per investigare le modificazioni dell’espressione e dei profili di
ossidazione delle proteine tra i tre gruppi.
Tramite la valutazione dei livelli di carbonili proteici totali
nel siero, abbiamo confermato che il danno ossidativo
è aumentato nei pazienti SM in fase di ricaduta. Infatti,
abbiamo trovato livelli di carbonili più alti nel gruppo di
pazienti REL, rispetto sia al gruppo di pazienti REM,
sia rispetto ai controlli sani.
Per meglio comprendere questo trend, abbiamo eseguito l’analisi proteomica e redox proteomica. Tramite la proteomica abbiamo identificato le proteine che
mostravano differenze di espressione tra i tre gruppi,
ottenendo risultati in gran parte coerenti con dati già
CONCLUSIONI
In conclusione, i risultati della nostra ricerca supportano
l’ipotesi che lo SO gioca un ruolo centrale nella MS. Infatti, le proteine che risultano più ossidate nei pazienti
SM rispetto ai controlli sani correlano con il decorso
clinico e con la patologia della malattia, e possono
perciò essere considerate degli specifici marker del
sangue, diagnostici e prognostici. È importante sottolineare che la remissione appare come una condizione “sana”, apparentemente senza un significativo
accumulo di danno ossidativo. È ragionevole ipotizzare che in questa condizione lo SO sia ad un livello
sub-ottimale e che inizi una cascata di reazioni influen-
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CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
zanti le funzioni di parecchie proteine, alterandole progressivamente e portando alla ricaduta. In questa fase,
avvengono eventi infiammatori ed il danno ossidativo
va ad alterare molte vie metaboliche. Sono comunque
necessari ulteriori studi per confermare questi risultati,
includendo un gran numero di pazienti ed anche eventualmente correlando questi risultati con le caratteristiche delle diverse fasi e forme della SM.
Role of oxidative stress in multiple sclerosis.
A proteomic and red-ox proteomic analysis
There is significant evidence that the pathomechanism
of neurodegenerative diseases, including MS, is basically mediated by OS and exicitotoxicity. However, very
little biochemical and molecular data on oxidative alterations are presently available and the limited number of published works depicts an inconsistent and
contradictory scenario. The recently developed redox
proteomics methods combine the ability of proteomics
to describe the entire pattern of proteins in a specific
sample with the powerful detection, by immunochemical methods, of oxidative modification of proteins.
Oxidative modifications of proteins may play a crucial
regulatory role within the cell. However once oxidative modifications overload the cell scavenging capacity, their accumulation may cause alteration or cellular
homeostasis. Thus Redox proteomic approach represents an emerging and potentially rewarding strategy
to gain insight into the role of OS in MS and to comprehend the pathogenesis and physiopathology of
MS. In order to investigate the involvement of oxidative
damage into the mechanisms of MS we used a parallel
proteomic approach to analyse the protein expression
profile and to identify oxidatively modified proteins in MS
patients compared with healthy controls.
RESULTS
We have compared serum from three groups of
subjects consisting in 18 stable relapsing remitting
RRMS patients (relapse free within the previous 3
months) (REM), 18 active relapsing remitting RRMS
patients (during the clinical relapse) (REL) and a group
of 7 healthy controls (CTR) to investigate the modifications of protein expression and proteome oxidation
profiles among the named groups.
By evaluating total protein carbonyl levels in serum,
we confirmed that oxidative damage is increased in
relapse phase of MS patients. Indeed, we have found
higher protein carbonyl levels in relapsing phase compared with both remitting and healthy groups.
In order to better understand this trend, we performed
both proteomics and redox proteomics approaches.
By comparing serum proteome profile of three groups
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of analysis, CTR, REM and REL, we identified differently expressed proteins, that are in part consistent with
data already showed in literature, thus validating our
experimental approach. Interestingly, many of these
proteins are up-regulated in MS patients compared to
healthy controls: ceruloplasmin, antithrombin III, clusterin, apolipoprotein E, and complement C3. In particular clusterin showed an intriguing trend, since its
expression levels increased already in remitting phase
compared with controls, and kept up-regulated in relapse compared to controls.
To investigate more deeply changes in serum proteome, we also performed a redox proteomics analysis
to reveal oxidative stress-modified specific proteins
which could be potentially dysfunctional and linked to
the pathological course of the disease
Among our results, particularly intriguing appear the
modifications shown by vitamin D-binding protein
(DBP), the major plasma carrier of vitamin D metabolities. Several studies performed in CSF of MS patients
showed a link between DBP levels and MS course
and indicated an inverse correlation between circulating vitamin D level and MS risk. DBP was found to be
more oxidized in RRMS patients than in controls and,
among patients, more oxidized during relapses than
during remission phases thus showing a full concordance with the course of the disease. Similarly, the increased of oxidation of Apolipoprotein A-IV confirmed
that levels of OS are elevated with the progression of
the disease.
CONCLUSIONS
In conclusion, our findings support the hypothesis
that OS plays a central role in MS. Indeed, the proteins identified to be more oxidized in MS compared
with healthy controls correlate with the clinical course
and the pathology of this disorder, and thereby may
be considered specific blood-based diagnostic and
prognostic markers. It is interesting to underlie that
remission seems to a “healthy” condition apparently
without significant accumulation of oxidative damage.
It is reasonable to hypothesize that in this stage OS
occurs at sub-optimal level initiating a cascade of re-
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CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
action which affect the function of several proteins that
progressively become impaired and which culminates
in relapse. At this level, inflammatory events occur and
oxidative damage seems to affect multiple pathways.
However, further studies are needed to confirm our re-
sults by including a large cohort of patients and also
eventually correlating these results with characteristics
of different phases and forms of MS.
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Fiorini A, Koudriavtseva T, Bucaj E, Coccia R, Foppoli C, Giorgi A, Schinina ME, Di Domenico F, De Marco F and Perluigi M Involvement of oxidative stress in occurrence of relapses in Multiple
Sclerosis: the spectrum of oxidatively modified serum proteins detected by proteomics and redox proteomics analysis PlosOne. 2013, in press.
Koudriavtseva T, Onesti E, Bucaj E, Fiorini A, Sbardella E, Mingoia M, De Marco F, Perluigi M. Proteomic and red-ox proteomic analysis of serum proteins in relapsing remitting multiple sclerosis
patients ECTRIMIS 10-13 Ocotber Lyon (FR) 2012
Perluigi M, Fiorini A, Bucaj E, Di Domenico F, De Marco F, Koudriavtseva T, Onesti E, Schininà ME, Coccia R. Role of oxidative stress in multiple sclerosis: a redox proteomics analysis
Congresso Scientifico Annuale FISM, 2012
Perluigi M, De Marco F, Koudriavtseva T. Role of oxidative stress in multiple sclerosis: a redox proteomics analysis 36th FEBS Meeting, Torino 25-30 Giugno 2011
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Caratterizzazione del repertorio TCR dei linfociti Th17
autoreattivi nella sclerosi multipla
Simona Rolla
Dipartimento Biotecnologie Molecolari e Scienze della Vita, Università di Torino, Torino
Mentore
Francesco Novelli
Recentemente abbiamo dimostrato che l’espansione
dei linfociti T helper (Th) 17 nel sangue periferico è associata con la fase attiva della sclerosi multipla (SM).
Studi longitudinali hanno dimostrato che l’aumento dei
Th17 è strettamente associato con il passaggio dalla
fase inattiva a quella attiva. Al contrario dei Th17, i Th1
non aumentano nei pazienti in nessuna delle fasi della SM, ma rimangono a livelli simili a quelli riscontrati
nei soggetti sani. Inoltre i Th17 sono molto più sensibili all’effetto anti-proliferativo dell’IFN-beta suggerendo
che i Th17 coinvolti nella patogenesi della sclerosi multipla possano essere un bersaglio selettivo dell’IFN-beta.
Per caratterizzare ulteriormente i linfociti Th17 e studiare le relazioni che intercorrono tra i Th17 e i Th1 nel danneggiamento tissutale, la loro distribuzione nelle lesioni
cerebrali dei pazienti con SM e gli effetti dell’IFN-beta
su queste cellule, ci siamo proposti di studiare l’autoreattività dei Th17 e il repertorio del recettore dei linfociti
T (TCR) specifico per la proteina basica della mielina
(MBP), uno degli antigeni verso cui è rivolta la risposta
autoimmune, mediante “immunoscope”, una tecnica
di biologia molecolare che mediante PCR permette di
suddividere le popolazione dei linfociti T che rispondono
ad un determinato antigene sulla base della lunghezza
della regione CDR3 della catena beta del TCR.
Lo scopo di questo progetto era quello di definire la
patogenicità dei linfociti Th17 nella SM, studiando se
questi fossero auto-reattivi e quindi in grado di riconoscere gli antigeni della mielina e seguendo , grazie allo
studio del loro recettore TCR, queste cellule durante le
fasi attive e inattive della malattia e durante la terapia
con l’IFN-beta.
RISULTATI
In questi due anni abbiamo svolto esperimenti, in stretta collaborazione con il gruppo del Prof. Francesco Ria
all’Università Cattolica di Roma, che ci hanno permesso di caratterizzare funzionalmente i linfociti Th17 e di
descrivere il repertorio TCR dei linfociti T specifici per
il peptide immunodominante MBP85-99 nei pazienti con
SM recidivante remittente (SMRR). Per fare questo,
abbiamo studiato le cellule mononucleate del sangue
periferico ottenute da dieci pazienti HLA-DR2+ (l’aplotipo HLA che conferisce suscettibilità alla malattia) con
SMRR e tre volontari sani HLA-DR2+ appartenenti allo
stesso range di età. I principali risultati ottenuti da que-
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sta ricerca sono i seguenti:
i) sia linfociti Th17 che Th1 specifici per l’MBP si
espandono nel sangue periferico dei pazienti con
SMRR durante le fasi attive della malattia, supportando il ruolo encefalitogenico dei Th17 nella SM.
ii) alcuni repertori TCR sono condivisi dai 10 pazienti con SMRR e sono specifici dei pazienti con SM in
quanto non si riscontrano nei soggetti sani. Quando
abbiamo studiato il repertorio TCR utilizzato in risposta all’MBP85-99 in dieci pazienti con SM, abbiamo
osservato che 20 riarrangiamenti TCR si espandevano
in maniera antigene specifica; tra questi uno era utilizzato da tre pazienti e uno da tutti i pazienti con SM.
iii) il repertorio TCR specifico per l’ MBP85-99 utilizzato
dai Linfociti Th17 è differente da quello utilizzato dai
linfociti Th1. Tra i riarrangiamenti TCR identificati, solo il
TRBV28-BJ2.1 viene utilizzato dai linfociti Th17, mentre 5 appartengono al fenotipo Th1. Questa osservazione indica una diversa origine delle cellule Th17 e
Th1.
iv) durante la fase di remissione il repertorio TCR specifico per MBP85-99 si riduce complessivamente, mentre prima della fase di relapse il repertorio TCR specifico dei Th17 riappare e diventa misurabile.
v) la terapia con IFN-beta riduce la maggior parte del
repertorio TCR circolante, specialmente quello appartenente ai linfociti Th17. Abbiamo studiato gli effetti
della terapia con IFN-beta sui linfociti Th17 e sui Th1
mediante tecnica immunoscope, raccogliendo il sangue periferico dei pazienti a sei e dodici mesi dall’inizio
della terapia. Solo tre dei dieci riarrangiamenti utilizzati
nella fase acuta erano ancora espansi durante la terapia con IFN-beta e tutti erano specifici dei linfociti Th1.
Questa osservazione supporta le precedenti osservazioni che i linfociti Th17 siano un bersaglio selettivo
dell’IFN-beta.
CONCLUSIONI
I dati ottenuti in questo programma di ricerca insieme
alle nostre precedenti osservazioni chiariscono il ruolo
dei linfociti Th17 nella patogenesi della SM e gli effetti
della terapia con IFN-beta nel miglioramento dei sintomi. Inoltre l’identificazione e la caratterizzazione di
repertori TCR comuni potrà portare alla scoperta di
nuovi bersagli terapeutici focalizzati sulle cellule T antigene specifiche senza la necessità di inibire l’intero
repertorio auto-reattivo.
compendio 2013
compendio 2013
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
Characterization of autoreactive Th17 T Cell Receptor repertoire
in multiple sclerosis
Recently data obtained in our lab provided, for the first
time, evidence that an expansion of peripheral T helper
(Th)17 cells is associated with disease activity in MS.
Longitudinal analysis showed that the increase in Th17
cells was always associated with the shift from inactive
to active disease. In contrast to Th17 cells, Th1 cells
did not increase in patients with MS. Moreover Th17
cells are much more sensitive than Th1 to the anti-proliferative effect of IFN-beta, suggesting that Th17 involved in the pathogenesis of MS could be a selective
target for IFN-beta.
To further characterize Th17 cells and to investigate the
possible interplay between Th17 and Th1 cells in tissue
damage, their distribution in active brain lesions in MS
patients and the effects on these cells of IFN-beta therapy, we proposed to study the auto-reactivity of Th17
cells against the myelin basic protein (MBP), one of the
antigen recognized by the autoimmune response, and
the specific T cell receptor (TCR) repertoire by using
the immunoscope, a molecular biology technique based on PCR that allow to divide the antigen-specific T
cell population on the basis of the CDR3 region of the
TCR beta chain.
The aim of this project was to define the pathogenicity
of Th17 lymphocytes in MS, by studying their autoreactivity against the myelin antigen and following these
cells, through the study of their TCR receptor, during
the active and inactive phases of the disease and during IFN-beta therapy.
ii) Some TCR repertoire are shared among the 10
RRMS patients that are characteristic of MS disease
as they were not founded in HS; when we studied by
immunoscope the TCR repertoire usage in the ten MS
patients, 20 TCR rearrangements were identified to be
expanded in a MBP85-99 specific manner; among the
identified 20 Vβ-Jβ rearrangements, one was shared
between three patients and one by all MS patients.
iii) Th17 cells display a different specific-MBP85-99 TCR
repertoire usage from Th1 cells. Among the identified TCR rearrangements, only the TRBV28-BJ2.1 is
exclusively expanded by Th17 cells. On the contrary,
five TCR rearrangements belong to Th1 cells. These
observation could account for a different lineage precursors between Th17 and Th1 cells.
iv) the remission phase seems to associate with a reduction of the total circulating MBP85-99 specific TCR
repertoire, whereas before the relapse the Th17 specific MBP85-99 TCR repertoire reappeared and become
detectable.
v) IFN-beta therapy reduced the overall circulating
MBP85-99 specific TCR repertoire especially that one
belonging to Th17 phenotype; we studied the effects
of IFN-beta on Th17 and Th1 cells by immunoscope
on PBMC collected six and twelve month of IFN-beta
therapy. We observed that only three out of ten TCR
rearrangements used in the acute phase were still expanded during IFN-beta therapy and all belongs to
Th1 subset. This observation support the notion that
Th17 cells may be a selective target for IFN-beta.
RESULTS
CONCLUSIONS
In this two-years research project we carried out experiments, in strict collaboration with Prof. Francesco Ria
at the catholic University in Rome, that allowed us to
functional characterize human Th17 cells and to depict
the TCR repertoire of T cells specific for the immunodominant epitope MBP85-99 in Relapsing Remitting Multiple Sclerosis (RRMS) patients. We collected peripheral
blood mononuclear cells from ten patients HLA-DR2+
(the human leukocyte antigen allele strongly linked to
T cell mediate auto-reactivity in MS) with RRMS and
three HLA-DR2+ age- and gender-matched healthy
volunteer subjects (HS).
The main results of this research are:
i) Th17 and Th1 MBP-self-reactive cells expand in the
peripheral blood of RRMS during the active phase of
the disease, supporting the hypothesis of an encephalitogenic role of Th17 cells in MS.
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Overall, the data obtained from this research program
together with our previous results clarify the role of
Th17 in MS pathogenesis and better illustrate the
unknown effects of IFN-beta therapy in amelioration
of MS symptoms. Moreover the identification and the
characterization of shared TCR repertoire could bring
to the discover of critical targets that would be crucial
in the design of therapies for MS diseases focused on
these specific T cells without the need to deplete the
entire self-reactive repertoire.
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Rolla S, Di Sante G, Clerico M, Nicolò C, Patanella AK, Amoroso A, Fasano ME, Batocchi AP, Ria F and Novelli F. Characterization of autoreactive TCR repertoire in patients affected by multiple
sclerosis.
Joint Annual Meeting SIICA DGfl, Sept 28-Oct 1 2011, Riccione
Di Sante G, Patanella AK, Rolla S, Nicolò C, Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Novelli F, Batocchi AP, Ria F. MBP 85-99-specific TCR repertoire in DR2+ patients affected by multiple sclerosis.
ECTRIMS, 19 – 22 October 2011, Amsterdam, NL, published on Multiple Sclerosis Journal, 17(Suppl.10), 128
Durelli L, Clerico M, Rolla S, Contessa G, De Mercanti S, Uccelli A, Zaffarono M, Cavalla P, Rinaldi L, Comi C, Cavallo R, Sosso L, Novelli F. Can the increase of T-helper 17 lymphocyte percentage
in peripheral blood anticipate a relapse in relapsing remitting multiple sclerosis?, Neurology 2010; 74; 9 (supplement 2)
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Meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione
dell’apoptosi di cellule Th17 nella sclerosi multipla
Elisabetta Volpe
Unità di Neuroimmunologia, Fondazione Santa Lucia, Roma
Collaboratori
Maria Teresa Cencioni, Gabriella Ruocco, Marco De Bardi, Adamo Diamantini, Luca Battistini,
Giovanna Borsellino
Collaboratori
Simonetta Santini, Daniela Barilà, Diego Centonze, Università degli Studi di Roma “Tor Vergata”, Roma
Maria Grazia Grasso, Fondazione Santa Lucia, Roma
Serena Ruggieri, Claudio Gasperini, Ospedale San Camillo, Roma
durre la morte cellulare. Tale fenomeno contribuisce
alla persistenza di queste cellule nei pazienti con SM.
Per studiare i potenziali meccanismi coinvolti nella
resistenza alla morte cellulare delle Th17, abbiamo
anche analizzato l’espressione di molecole note per
prevenire la morte cellulare. Abbiamo trovato che la
caspasi-8 (FLICE)-like proteina inibitoria (FLIP), noto
inibitore di morte cellulare mediata da Caspasi-8, è
più espressa nelle Th17 rispetto alle cellule Th1, indicando che FLIP in cellule Th17 contribuisce alla loro
sopravvivenza. Inoltre, il confronto diretto della morte
cellulare di Th in donatori sani e pazienti con SM non
ha evidenziato differenze significative. In effetti, abbiamo confermato che in pazienti con SM, la sensibilità
alla morte è maggiore nelle cellule Th1 rispetto alle
cellule Th17, ma i meccanismi individuati in donatori
sani come responsabili della morte delle cellule Th1
e della resistenza alla morte delle cellule Th17 sono
comuni a quelli di pazienti con SM.
La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune
caratterizzata da una risposta esagerata dei linfociti
T. La morte cellulare è un meccanismo utilizzato per
controllare la risposta di linfociti attivati. Abbiamo ipotizzato che nella SM questo meccanismo di controllo
sia alterato causando la proliferazione incontrollata di
cellule attivate. Recentemente un nuovo tipo di linfociti è stato scoperto come responsabile d’infiammazione nella SM. Questi linfociti si chiamano cellule T
helper (Th)17.In questo progetto abbiamo studiato la
morte delle cellule Th attivate, con particolare riguardo
alle cellule Th17. In particolare, abbiamo analizzato i
meccanismi coinvolti nel processo di morte cellulare
delle Th. Infine, abbiamo confrontato la morte cellulare delle cellule Th ottenute da donatori sani e pazienti
affetti da SM.
RISULTATI
Questo studio ci ha permesso di analizzare tutti gli
obiettivi proposti nel progetto. A questo punto dello
studio possiamo concludere che: le cellule Th17 attivate sono particolarmente resistenti alla morte cellulare, rispetto ad un altro tipo di cellule Th, chiamate
cellule Th1.
In accordo con questi dati, abbiamo scoperto che
le Th1, e non le cellule Th17, esprimono alti livelli di
molecole coinvolte nel processo di morte cellulare: la
Caspasi-8 e la Caspasi-3
L’analisi di tutte le possibili vie di morte cellulare delle
Th ci ha permesso di capire il meccanismo responsabile della morte delle cellule Th1. Questo meccanismo coinvolge due molecole: FAS e FAS-ligando
(FAS-L), la cui interazione provoca la morte cellulare.
È stato interessante scoprire che FAS è espresso in
entrambi i tipi di linfociti, cellule Th1 e Th17, mentre
FAS-L è espresso esclusivamente su cellule Th1. Le
cellule Th1 dopo l’attivazione esprimono FAS-L, che
interagisce con il recettore FAS, causando la morte
cellulare mediata da caspasi-8 e 3.In contrasto, le
cellule Th17, che sono più patogenetiche nella SM,
esprimono livelli bassi di FAS-L, insufficiente per in-
CONCLUSIONI
I risultati ottenuti in questo studio mostrano un importante meccanismo patogenetico: nella SM, dove
le cellule Th17 predominano, vi è un ulteriore accumulo di cellule Th17, a causa della loro resistenza alla
morte cellulare. Tuttavia, abbiamo anche individuato
le molecole responsabili della morte di altre cellule Th,
che non sono espresse nelle cellule Th17, e alcune
molecole responsabili della resistenza alla morte delle
cellule Th17.
Questa ricerca ha bisogno di ulteriori studi volti a modulare le molecole identificate e forzare l’induzione
della morte nelle cellule Th17.In seguito, la modulazione della morte cellulare delle Th17 potrà portare anche
allo sviluppo di nuove terapie, volte a indurre la morte
delle cellule patogenetiche Th17 nei pazienti con SM.
90
CONOSCERE LE CAUSE
DELLA MALATTIA
Molecular mechanisms regulating Th17 cell apoptosis in multiple sclerosis
Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease characterized by an exaggerated response of lymphocytes.
Cell death is a mechanism to control the response of
activated lymphocytes. We hypothesised that in MS
this mechanism is altered causing the uncontrolled proliferation of activated cells. Recently a new type of lymphocytes has been discovered as responsible of the inflammation in MS. This subset of lymphocytes is called
Thelper (Th)17 cells.
In this project we studied the death of activated Th cells,
with particular regard to Th17 cells. We analysed mechanisms involved in Th cell death process. Finally, we compare cell death of Th cells obtained from healthy donors
and MS patients.
RESULTS
This study allowed us to analyse all the objectives proposed in the project. At this point of the study we can
conclude that activated Th17 cells are particularly resistant to cell death, compared to another type of Th
cells, called Th1 cells.
Consistent with these data, we found that Th1, and
not Th17 cells, express high levels of molecules that
are involved in cell death process: Caspase-8 and Caspase-3.
The analysis of all potential pathways involved in Th cell
death reveals the mechanism responsible of Th1 cell
death. This mechanism involves two molecules: FAS
and FAS-ligand (FAS-L), which interaction causes cell
death.
Interestingly, FAS is expressed in both types of lymphocytes: Th1 and Th17 cells, while FAS-L is exclusively expressed on Th1 cells. Th1 cells after activation
express FAS-L, which interacts with FAS receptor,
causing cell death mediated by Caspase-8 and 3.
In contrast, Th17 cells, which are more pathogenic in
MS, express low levels of FAS-L, insufficient to induce
their cell death. Thus, this phenomenon contributes to
the persistence of Th17 cells in MS.
In order to study potential mechanisms involved in
Th17 cell death resistance, we also analysed the expression of molecules known to prevent cell death.
We found that caspase-8 (FLICE)-like inhibitory protein (FLIP), known to inhibits Caspase-8-mediated cell
death, is more expressed in Th17 compared to Th1
cells, indicating that FLIP in Th17 cells contributes to
cell death resistance.
Moreover, the direct comparison of Th cell death in healthy donors and MS patients did not revealed significant differences. In fact, we confirmed in MS patients
the major sensitivity to death of Th1 cells compared
to Th17 cells. The mechanisms identified in healthy
donors as responsible of Th1 cell death and Th17 cell
death resistance are also involved in MS patients.
CONCLUSIONS
The results obtained by this study reveal an important pathogenic mechanism: in MS, where Th17 cells
predominate, there is a further accumulation of Th17
cells, due to their resistance to cell death.
However, we have also identified some molecules responsible of the resistance to Th17 cell death. This
research needs further studies aimed to modulate the
molecules identified and to force the induction of Th17
cell death. Then, modulation of Th17 cell death may
lead to the development of new therapy, aimed to induce death of pathogenic Th17 cells in MS patients.
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Ruocco G, Santini S, Cencioni MT, Borsellino G, Diamantini A, De Bardi M, Grasso MG, Ruggieri S, Gasperini C, Centonze D, Barilá D, Battistini L, Volpe E. XXI AINI Congress. Pollenzo, Italy
22-25 September 2011
Volpe E, Santini S, Cencioni MT, Ruocco G, Borsellino G, Diamantini A, De Bardi M, Grasso MG., Ruggieri S, Gasperini C, Centonze D, Barilá D, Battistini L. 2011 Joint Annual Meeting SIICA
DGFI. Riccione, Italy, 28 Sepetember-1 October 2011
Volpe E, Santini S, Cencioni MT, Ruocco G, Borsellino G, Diamantini A, De Bardi M, Grasso MG, Ruggieri S, Gasperini C, Centonze D, Barilá D, Battistini L.9th Joint Meeting of ICS-ISICR Cytokines and Interferons: from bench to the bedside. Firenze, Italy, 9-12 October 2011
Volpe E, Santini S, Cencioni MT, Ruocco G, Borsellino G, Diamantini A, De Bardi M, Grasso MG, Gasperini C, Centonze D, Barilá D, Battistini L. Congresso annuale scientifico FISM. Rome, Italy
25-26 May 2011
Volpe E, Santini S, Cencioni MT, Ruocco G, Borsellino G, Diamantini A, De Bardi M, Grasso MG, Ruggieri S, Gasperini C, Centonze D, Barilá D, Battistini L. Congresso annuale scientifico FISM.
Rome, Italy 30 May 2011
Ruocco G, Santini S, Cencioni MT, Borsellino G, Diamantini A, Marco De Bardi M, Grasso MG, Ruggieri S, Gasperini C, Centonze D, Barilá D, Battistini L, Volpe E. 11th ISNI Congress. Boston,
MA , USA 4-8 November 2012
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VALIDAZIONE DI NUOVI
TARGETS-PATHWAYS
Progettazione, sintesi e studio dell’efficacia terapeutica
di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide
nella sclerosi multipla
Bifulco Maurizio
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche, Università di Salerno, Fisciano, Salerno
Collaboratori
Patrizia Gazzerro, Chiara Laezza, Anna Maria Malfitano, Simona Pisanti, Elena Ciaglia, Maria Chiara Proto
Adriano Martinelli, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Pisa, Pisa
Bonnie Dittel, Blood Research Institute, Milwaukee (WI), USA
Recenti studi hanno evidenziato il ruolo chiave del sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla (SM). Questo sistema comprende i recettori dei cannabinoidi (CB1,
CB2), gli endocannabinoidi e gli enzimi responsabili della
loro sintesi ed inattivazione. Il recettore CB2 è espresso
quasi esclusiavemente dalle cellule del sistema immunitario e può avere un ruolo funzionale importante nel sistema nervoso centrale con il vantaggio di non causare
gli effetti psicoattivi dovuti al recettore CB1. Il sistema
endocannabinoide esercita un ruolo protettivo durante la
neuroinfiammazione dovuto almeno in parte alla ridotta
attivazione ed infiltrazione delle cellule immuni. Gli agonisti dei recettori dei cannabinodi migliorano il decorso
della sclerosi multipla (SM) sia nell’uomo che nei topi con
Encefalite Sperimentale Autoimmune (ESA) e hanno un
profilo farmacologico di sicurezza favorevole. Per chiarire l’importanza dell’attivazione del recettore CB2 nella
patogenesi della SM, nuovi agonisti del recettore CB2,
derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici sono stati
progettati al fine di aumentare la selettività per questo recettore. Inoltre, studi in silico ADMET sono stati effettuati
per determinare il profilo farmacologico di questi composti. Con studi in vitro abbiamo esaminato gli effetti immunomodulatori ed antiinfiammatori di queste sostanze
RISULTATI
La sintesi di nuovi agonisti del recettore CB2 è stata
effettuata e studi in silico ADMET hanno dimostato
un buon profilo farmacologico confermato da studi
di permeabilità.
Gli effetti immunomodulatori e antiinfiammatori di derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici
[N-ciclopentil-7-metil-1-(2-morfolin-4-iletil)-1,8naftiridin-4(1H)-one-3-carbossiammide
(CB13),
N-(4-metilcicloesil)-1-benzil-1,8-naftiridin-2(1H)-one3-carbossiammide (CB74) N-cicloesil-1-benzil-7-metossi-1,8-naftiridin-4(1H)-one-3-carbossiammide
(CB82) N-(4-metilcicloesil)-1-(p-fluorobenzil)-1,8-naftiridin-2(1H)-one-3-carbossiammide (CB91), N-cicloeptil-4-idrossi-1-(2-morfolin-4-iletil)-2-osso-1,2diidro-1,8-naftiridin-3-carbossiammide (VL15),
N-cicloeptil-1-(2-morfolin-4-iletil)-chinolin-2(1H)-
93
one-3-carbossiammide (VL23), N-cicloeptil-1-(pfluorobenzil)-1,2-diidro-2-osso-piridin-3-carbossiammide
(AF4), N-(4-metilcicloesil)-1-(2-morfolin-4-iletil)-chinolin-2(1H)-one-3-carbossiammide (VL8), N-(4metilcicloesil)-1-(p-fluorobenzil)-4-idrossi-2-osso1,2-diidro-1,8-naftiridin-3-carbossiammide
(LV8),
N-cicloeptil-1-butyl-1,8-naftiridin-2(1H)-one3-carbossiammide
(LV24),
N-(4-metilcicloesil)1-pentil-chinolin-2(1H)-one-3-carbossiammide
(CF6trans) and N-cicloeptil-5-(p-metossifenil)-1-(pfluorobenzil)-1,2-diidro-2-osso-piridin-3-carbossiammide (MC21)] sono stati valutati sui linfociti isolati dal sangue periferico (PBMC) di donatori sani e
di pazienti con SM.
Nei PBMC di donatori sani questi composti bloccavano la proliferazione indotta con proteina mielina basica, la produzione di TNF-α e di IL-10, l’espressione di marcatori di attivazione, CD69, CD25,
CD54 e CD49d, in alcuni casi la migrazione e la
transizione di fase G1/S del ciclo cellulare. L’effetto antiproliferativo di molti composti era mediato dal
recettore CB2. È stata osservata anche una ridotta
espressione di proteine fosforilate NF-kB, IKKαβ,
ERK, Akt e dell’enzima Cox-2. Alcuni composti,
selezionati per l’efficacia sono stati usati su PBMC
isolati da pazienti con SM non in trattamento con
farmaci immunosoppressori. Il CB74 è stato selezionato per l’attività agonista dimostrata anche da
altri studi, il VL23 come derivato chinolinico e l’AF4
come composto piridinico con affinità paragonabile
per i recettori CB1 e CB2. Gli effetti sulla proliferazione e sull’espressione di Akt e Cox-2 sono stati
confermati, in più il CB74 riduceva l’espressione di
Cox-2. Il CB74 e il VL23 erano più efficaci nel ridurre
l’attivazione nei PBMC dei pazienti rispetto ai donatori sani, l’AF4 non aveva effetto sull’attivazione,
quindi una maggiore selettività per il recettore CB2
determinava una maggiore riduzione dell’attivazione
nei PBMC dei pazienti. Inoltre, alcuni composti sono
stati utilizzati in cellule derivate da topi deficienti del
CB2 per determinare la specificità sia in saggi di migrazione di splenociti che di blocco di proliferazione.
Alcuni composti bloccavano la proliferazione delle
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
cellule T attraverso un meccanismo mediato dal CB2
e non avevano effetto sulla proliferazione delle cellule
B. Esperimenti in corso stabiliranno l’efficacia di questi composti sull’ESA.
CONCLUSIONI
Questi risultati suggeriscono il potenziale utilizzo dei
derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici nella
terapia della SM. Questi composti altamente selettivi per il recettore CB2, hanno effetti immunomodulatori e bloccano l’attivazione linfocitaria soprattutto
nei linfociti di pazienti con SM.
Questi risultati costituiscono la base per potenziali
studi clinici che potrebbero portare alla sviluppo di
una nuova terapia per la SM.
Design, synthesis and study of the therapeutic efficacy
of novel modulators of the endocannabinoid system in multiple sclerosis
Recent studies have highlighted the key role of the endocannabinoid system in multiple sclerosis (MS). This
system includes cannabinoid receptors (CB1, CB2),
endocannabinoids and enzymes for their production
and inactivation. The CB2 receptor is almost exclusively expressed by the immune cells and may play a
functionally relevant role in the central nervous system
with the advantage to be unrelated to psychoactive effects due to the CB1 receptor. The endocannabinoid
system has a protective role during neuroinflammation
exerted, at least in part, by decreasing immune cell activation and infiltration. Cannabinoid receptor agonists
improve clinical disease in humans with MS and in rodents with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and have a favorable drug safety profile. In
order to better clarify the relevance of the CB2 receptor
activation in MS pathogenesis, novel CB2 agonists, in
particular 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives were designed with the aim to enhance CB2
receptor selectivity. In silico ADMET studies were carried ahead with the aim to obtain ligands with good
drug-like properties. In vitro studies investigated the
immunomodulatory and anti-inflammatory effects of
these compounds.
RESULTS
The synthesis of new CB2 agonists has been performed
and in silico ADMET studies demonstrated the drug ability of these compounds confirmed also by permeability
assays.
The immunomodulatory and antiinflammatory effects of
novel CB2 agonists, in particular
1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives,
N-cyclopentyl-7-methyl-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-1,8naphthyridin-4(1H)-on-3-carboxamide
(CB13),
N-(4-methylcyclohexyl)-1-benzyl-1,8-naphthyridin2(1H)-on-3-carboxamide (CB74) N-cyclohexyl-1-benzyl-
94
7-methoxy-1,8-naphthyridin-4(1H)-on-3-carboxamide
(CB82) N-(4-methylcyclohexyl)-1-(p-fluorobenzyl)-1,8naphthyridin-2(1H)-on-3-carboxamide (CB91), Ncycloheptyl-4-hydroxy-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-2-oxo1,2-dihydro-1,8-naphthyridine-3-carboxamide (VL15),
N-cyclohepthyl-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-quinolin2(1H)-on-3-carboxamide (VL23), N-cyclohepthyl-1-(pfluorobenzyl)-1,2-dihydro-2-oxo-pyridine-3-carboxamide
(AF4), N-(4-methylcyclohexyl)-1-(2-morpholin-4-ylethyl)quinolin-2(1H)-on-3-carboxamide
(VL8),
N-(4methylcyclohexyl)-1-(p-fluorobenzyl)-4-hydroxy-2-oxo1,2-dihydro-1,8-naphthyridine-3-carboxamide (LV8),
N-cycloheptyl-1-butyl-1,8-naphthyridin-2(1H)-on3-carboxamide
(LV24),
N-(4-methylcyclohexyl)1-pentyl-quinolin-2(1H)-on-3-carboxamide (CF6trans)
and
N-cycloheptyl-5-(p-methoxyphenyl)-1-(pfluorobenzyl)-1,2-dihydro-2-oxo-pyridine-3-carboxamide (MC21) were investigated on peripheral blood lymphocytes (PBMC) isolated from healthy donors and MS
patients.
In PBMC of healthy donors, these compounds inhibited
the proliferation of myelin basic protein activated PBMC,
inhibited TNF-α and IL-10 production, the expression
of T cell activation markers CD69, CD25, CD54 and
CD49d, in some cases cell migration, blocked the G1/S
transition phase of the cell cycle and induced apoptosis. The antiproliferative effect of many compounds was
mediated by the CB2 receptor. Furthermore, we found
down-regulation of phosphorylated proteins NF-kB,
IKKαβ, ERK, Akt and the enzyme Cox-2. Some of these compounds, selected for their efficiency were used
on PBMC isolated from MS patients not in therapy with
currently administered immune-suppressive medicines.
CB74 was selected for its agonist activity showed also
by previous studies, VL23 was selected as quinoline derivative and AF4 as pyridine compounds with similar affinity at both the CB1 and CB2 receptor. The effects on
proliferation, vitality and the expression of Akt and Cox-2
were maintained, indeed CB74 inhibited Cox-2 expression. CB74 and VL23 were more efficient to inhibit activation in PBMC of MS patients than of normal subject,
AF4 did not inhibit activation in PBMC of patients, thus
suggesting that enhanced selectivity at the CB2 receptor
determines higher inhibition of activation in PBMC from
patients. Furthermore, selected compounds were tested
in cells from CB2-/- mice to determine CB2-specificity in
splenocyte migration assay and proliferation suppression
assay. We observed that some compounds suppress T
cell proliferation in a CB2-dependent manner and had
no effect on B cell proliferation. Ongoing experiments
are testing the efficacy of selected compounds in EAE.
CONCLUSIONS
These findings suggest the potential use of 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives in MS therapy.
These highly selective CB2 compounds exert immunomodulatory effects and inhibit activation in MS patient
derived lymphocytes. These results might be used in
future clinical studies to lead to the development of a
new therapy of MS.
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Manera C, Saccomanni G, Malfitano AM, Bertini S, Castelli F, Laezza C, Ligresti A, Lucchesi V, Tuccinardi T, Rizzolio F, Bifulco M, Di Marzo V, Giordano A, Macchia M, Martinelli A. Rational design,
synthesis and anti-proliferative properties of new CB2 selective cannabinoid receptor ligands: An investigation of the 1,8-naphthyridin-2(1H)-one scaffold. Eur J Med Chem. 2012; 52:284-94.
Malfitano A.M., Manera C, Laezza C, Larocca C, Matarese G, Martinelli A, Bifulco M. “Studio dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla
Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 2010
Malfitano AM, Manera C, Basu S, Laezza C, Larocca C, Matarese G, Martinelli A, Dittel B. Bifulco M. “Design, synthesis and study of the therapeutic efficacy of novel modulators of the endocannabinoid system in multiple sclerosis”. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 2010
Malfitano AM, Laezza C, Bifulco M. “Studio dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 2011
Malfitano AM, Manera C, Laezza C, Martinelli A, Dittel B. Bifulco M. “Design, synthesis and study of the therapeutic efficacy of novel modulators of the endocannabinoid system in multiple
sclerosis”. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 2011
Malfitano AM. Studio dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 2012
Malfitano AM, Manera C, Laezza C, Pisanti S, Gazzerro P, Martinelli A, Bifulco M. “Design, synthesis and study of the therapeutic efficacy of novel modulators of the endocannabinoid system in
multiple sclerosis”. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma, 2012
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2009 per il periodo di 2 anni (prorogato di 8 mesi) e l’ammontare di 140.000 €
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95
Un possibile ruolo della proteina motrice kif13B nella
mielinizzazione e ri-mielinizzazione del sistema nervoso centrale
Alessandra Bolino
DIBIT2-Divisione di Neuroscienze,Istituto Scientifico San Raffaele, Milano
Collaboratori
Roberta Noseda, Andrea Gorzanelli, Stefania Scarlino
Klaus A. Nave, Max-Planck-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Germany
di Dlg1, un noto regolatore negativo della mielinizzazione. Infatti, oltre a molecole promotrici del programma
esistono anche molecole inibitorie o che regolano negativamente la mielinizzazione in modo tale che, durante lo
sviluppo, la mielina raggiunga uno spessore corretto e
proporzionale al diametro dell’assone. Ci siamo perciò
chiesti se kif13B avesse un ruolo simile anche nel sistema nervoso centrale.
La sclerosi multipla è una malattia degenerativa caratterizzata da perdita della mielina e da degenerazione dell’assone che ha bisogno della mielina per il suo
supporto trofico. La mielina è l’involucro isolante degli
assoni, i prolungamenti dei neuroni. Essa permette la
conduzione saltatoria dell’impulso nervoso. Un possibile
approccio terapeutico per la sclerosi multipla potrebbe
consistere nel cercare di favorire e promuovere il processo di ri-mielinizzazione, cioè di ricostituzione della mielina, che è fisiologico almeno nelle fasi precoci di malattia.
Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dei processi
di mielinizzazione e di rimielinizzazione sono ancora in
gran parte sconosciuti.
La mielinizzazione è un processo complesso costituito
da diverse fasi quali il contatto tra la cellula gliale deputata a produrre mielina e l’assone; l’induzione del programma di mielinizzazione e il differenziamento della cellula gliale stessa; il trasporto di proteine e lipidi durante
la biogenesi della membrana e la compattazione della
mielina.
Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che nella cellula di Schwann, cellula gliale del sistema nervoso
periferico, la proteina motrice kif13B è coinvolta nella
regolazione della mielinizzazione. Kif13B esplica questa
funzione mediante interazione e regolazione dell’attività
RISULTATI
Per valutare il ruolo di kif13B, abbiamo generato un
modello animale in cui la proteina kif13B fosse assente
soltanto nell’oligodendrocita, la cellula gliale del sistema
nervoso centrale. Abbiamo così appurato che kif13B regola la mielinizzazione anche nel sistema nervoso centrale dato che la mancanza di kif13B provoca iper-mielinizzazione, cioè un aumento di mielina in diversi distretti.
Kif13B esplica la sua funzione attraverso Dlg1. Quando
kif13B è assente, l’espressione di Dlg1 è alterata e di
conseguenza anche la produzione di mielina.
CONCLUSIONI
In conclusione, il nostro progetto ha dimostrato l’esistenza di un complesso kif13B/Dlg1 in grado di regolare la quantità di mielina prodotta sia nel sistema
nervoso centrale che periferico.
A possible role for the kif13B motor protein in the CNS myelination
and remyelination
Multiple sclerosis (MS) is an acquired inflammatory and
neurodegenerative immuno-mediated disorder of the
CNS, characterized by inflammation, demyelination and
primary or secondary axonal degeneration. Myelin might
be lost as a result of a failure of the re-myelination that
normally occurs early in the disease, and axons could
then degenerate as they rely on myelin for long-term trophic support. Myelination is a multistep process which
96
includes axon recognition and contact; promotion of
myelination by several intrinsic and extrinsic signals;
membrane biosynthesis; compaction, and remodeling.
However, the molecular mechanisms that promote and
regulate myelin biogenesis during myelination and remyelination are at the present largely unknown.
We recently reported that the Kinesin 13B (kif13B) motor protein interacts with the Dlg1 scaffold and regulates
myelination in Schwann cells, the glial cells in the pe-
TARGETS-PATHWAYS
ripheral nervous system. Kif13B regulates the amount
of myelin produced in Schwann cells through interaction
with Dlg1, a negative regulator of myelination. Indeed,
during development, myelination is physiologically modulated by positive and negative factors, so that myelin
thickness is adjusted to the axonal diameter.
drocytes, the glial cells in the central nervous system.
This model displays hypermyelination, which is an increase in the amount of myelin produced in several
myelinated areas of the central nervous system. In
addition, we also found that following kif13B ablation,
Dlg1 expression is impaired.
RESULTS
CONCLUSIONS
To assess whether kif13B had a similar role in myelination in the central nervous system, we generated a
mouse model with kif13B specific ablation in oligoden-
This results suggest that kif13B regulates myelination
through the control of Dlg1 activity.
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Noseda R., Scarlino S., Triolo D., Sherman D., Feltri L., Wrabetz L., Nave KA, Huganir RL, Previtali SC, Bolino A. Kif13B motor protein regulates myelination in the peripheral and central nervous
system. The XI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease, Berlin July 2013.
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97
L’induzione dei trasportatori per il glutamato EAAT da parte
dei retinoidi: un approccio per la prevenzione del danno
eccitotossico degli oligodendrociti e dei loro precursori
Ovidio Bussolati
Unità di Patologia Generale Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali (SBiBiT),
Università degli Studi di Parma, Parma
Collaboratori
Renata Franchi-Gazzola, Roberto Sala, Jacopo Uggeri, Massimiliano G. Bianchi, Laura Reia, Martina
Chiu, Manfredi Allegri
Carlos Matute Almau, Department of Neurosciences, University of Basque Country, Bilbao, Spain
Hiroyuki Kagechika, Institute of Biomaterials and Bioengineering, Tokyo Medical and Dental University,
Tokyo, Japan
Sandra Amor, Department of Pathology, VU University Medical Center, Amsterdam, The Netherlands
FISM. Tramite tecniche di immunoistochimica, abbiamo valutato l’espressione di EAAT3 nella sostanza
bianca di pazienti SM, identificando le lesioni tramite
colorazione specifica per la mielina. Cellule positive
per EAAT3 sono state osservate in tutte le lesioni ed,
in particolare, in quelle parzialmente rimielinizzate.
L’utilizzo di marcatori specifici ha permesso di escludere che le cellule o gli elementi EAAT3-positivi fossero astrociti, assoni o oligodendrociti maturi. Pertanto,
nonostante l’identità di queste cellule resti da definire,
l’ipotesi più probabile è che si tratti di OPC. Un approccio simile è stato adottato per valutare l’espressione di EAAT3 nella sostanza bianca di midollo spinale ottenuto da topi ESA. In questi preparati è stato
possibile osservare cellule EAAT3-positive che esprimevano marcatori oligodendrocitari (Olig2 e CNPasi).
Le risorse disponibili sono state utilizzate anche per
sviluppare parzialmente la proposta originale. Abbiamo dimostrato che il trattamento con l’acido retinoico
aumentava sensibilmente l’espressione del trasportatore EAAT3 in colture di oligodendrociti ottenuti
da nervo ottico di ratti neonati. L’effetto stimolatorio
sull’espressione del trasportatore è stato successivamente riprodotto in tessuto (fettine di cervelletto di
ratto) sia con acido retinoico che con un analogo sintetico chiamato Am80, con migliori proprietà farmacologiche. In questi esperimenti, abbiamo dimostrato
che le cellule dove aumenta EAAT3 erano oligodendrociti MBP+ e Olig2+.
Per valutare la potenziale tossicità dei retinoidi in cellule umane, abbiamo infine effettuato alcuni esperimenti utilizzando la linea cellulare di oligodendroglioma umano Hs683. Alle concentrazioni utilizzate su
tessuto, i retinoidi non sono tossici; tuttavia in queste
cellule indifferenziate non si è osservata alcuna stimolazione dell’espressione di EAAT3. Questo risultato
negativo ci ha suggerito che i retinoidi possano indurre l’espressione di EAAT3 solo in cellule in un avanzato stato di differenziazione e che approcci diversi siano necessari per stimolare l’espressione di EAAT3 in
Uno dei meccanismi che causano la morte degli oligodendrociti e dei loro precursori OPC (Oligodendrocyte Precursor Cells,) nella sclerosi multipla (SM)
è l’eccitotossicità (tossicità neuronale). Questo meccanismo di danno è dovuto ad un aumento delle concentrazioni extracellulari del neurotrasmettitore glutamato, secreto da cellule dell’immunità. In condizioni
normali, la concentrazione extracellulare di glutamato
è mantenuta a livelli non tossici da trasportatori (denominati EAAT) che accumulano il neurotrasmettitore
all’interno delle cellule. Uno di questi è il trasportatore
EAAT3, presente negli oligodendrociti e, a livelli più
elevati, negli OPC. È quindi ipotizzabile che un aumento dell’espressione di EAAT3 migliori la resistenza
degli oligodendrociti e degli OPC alla eccitotossicità,
prevenendo il danno alla sostanza bianca osservato in
persone con SM. Purtroppo, i meccanismi che regolano l’espressione di EAAT3, durante il differenziamento
degli oligodendrociti, sono ad oggi sconosciuti.
Sulla base di alcuni risultati preliminari, abbiamo proposto di verificare se sia possibile stimolare l’espressione di EAAT3 con acido retinoico (vitamina A). In
particolare, proponevamo di verificare se l’acido retinoico aumenta l’espressione di EAAT3 in oligodendrociti ed OPC, ottenuti da tessuto cerebrale di ratto,
rendendoli più resistenti all’eccitotossicità. In caso di
risultati positivi, lo studio sarebbe stato esteso a topi
affetti da Encefalomielite Sperimentale Autoimmune
(ESA), un modello animale di SM. Inoltre, per migliorare le prospettive di applicazione clinica dei risultati,
proponevamo di compiere alcuni esperimenti per verificare la tossicità del trattamento su cellule umane.
Valutando il progetto, il Comitato Scientifico FISM ci
ha chiesto di dimostrare preliminarmente che EAAT3
è espresso in lesioni SM.
RISULTATI
Il finanziamento è stato prioritariamente utilizzato per
rispondere al quesito posto dal Comitato Scientifico
98
TARGETS-PATHWAYS
precursori immaturi. Studiando l’effetto di altri farmaci
ad attività differenziante, abbiamo così dimostrato che
l’acido valproico (VPA), un composto ampiamente utilizzato come antiepilettico, stimola sensibilmente l’espressione e l’attività del trasportatore nelle cellule di
oligodendroglioma umano.
CONCLUSIONI
In conclusione, i risultati ottenuti, oltre a dimostrare la
presenza del trasportatore per glutamato EAAT3 nelle
lesioni SM, indicano che la sua espressione in modelli
oligodendrocitari può essere stimolata da farmaci (acido retinoico e VPA) già in uso per patologie diverse da
SM. L’ipotesi originale del progetto esce, pertanto, notevolmente rafforzata anche se resta da verificare se
una maggiore espressione di EAAT3 abbia effettivamente un significato protettivo verso l’eccitotossicità
nel modello animale di SM. Se questo fosse dimostrato, farmaci induttori di EAAT3 potrebbero rappresentare una concreta opzione terapeutica nella SM.
Retinoid-dependent induction of EAAT glutamate transporters:
an approach for the prevention of excitotoxicity in oligodendrocytes
and oligodendrocyte precursor cells
Excitotoxicity has been repeatedly involved in the damage to oligodendrocytes and Oligodendrocyte Precursor
Cell (OPC) observed in MS. This phenomenon is due to
the increase of the extracellular concentration of the neurotransmitter glutamate, secreted by activated immune
cells. Under normal conditions, extracellular glutamate
concentration is kept low by the activity of a family of
amino acid transporters called EAAT, which accumulate the neurotransmitter into the cells. One of these
carriers, EAAT3, is expressed in oligodendrocytes and,
more abundantly, in OPCs. Thus, it is conceivable that
an increased EAAT3 expression could improve oligodendrocyte and OPC resistance to excitotoxicity, preventing
the white matter injury observed in patients with MS. Unfortunately, the mechanisms regulating EAAT3 expression during oligodendrocyte differentiation are completely unknown.
Based on preliminary results, our proposal was to determine whether EAAT3 expression is inducible by retinoic
acid (vitamin A). In particular, we proposed to assess if
retinoic acid increases EAAT3 expression in oligodendrocyte and OPCs derived from rat brain and if the induction is associated with an increased endurance to
excitotoxicity. In case of positive results, we proposed to
extend the study to mice affected by Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), an animal model of
MS. Moreover, to improve the applicative potential of the
results, we also proposed to carry out some preliminary experiments on human cell models so as to evaluate
treatment toxicity. During the reviewing process, AISM
Scientific Committee asked us to preliminarily demonstrate EAAT3 expression in MS lesions.
RESULTS
In order to address the task indicated by AISM Scientific Committee, the funds were used to evaluate EAAT3
99
expression in the white matter of MS patients through
an immunohistochemical approach. Remyelinating MS
lesions were identified through specific myelin staining.
EAAT3-positive cells were consistently observed in all
the lesions. Using specific markers, we excluded that
EAAT3-positive elements were astrocytes, axons, or
mature oligodendrocytes. Therefore, although these
cells still await a clear cut identification, they are likely
OPCs. A similar approach was used to evaluate EAAT3
expression in the spinal cord-white matter of EAE animals. Also in these samples EAAT3-positive cells were
consistently observed. In this case, however, it was possible to demonstrate that some of these cells express
the oligodendrocytic markers Olig2 and CNPase.
Funds were also used to partially address the objectives
of the original proposal. In particular, we showed that
retinoic acid significantly induced EAAT3 expression in
oligodendrocyte cultures obtained from optic nerve of
neonatal rats. The retinoic acid-dependent induction of
EAAT3 was also observed in tissue samples (rat cerebellum slices) treated with either retinoic acid or the synthetic retinoid Am80. EAAT3-induced cells were positive
for the oligodendrocytic markers MBP and Olig2.
To evaluate the potential toxicity of retinoids in human
cells, we performed some preliminary experiments on
the oligodendroglioma cell line Hs683. While the experiments indicated that no retinoid-dependent toxicity
was detectable at the doses used for EAAT3 induction,
no EAAT3 induction by retinoids was detected in these undifferentiated cells. This negative result suggested
us that retinoids may induce EAAT3 only in differentiated cells and that different approaches may be needed
for EAAT3-induction in immature precursors. Studying
other differentiating agents, we were thus able to demonstrate that valproic acid (VPA), a widely used antiepileptic drug, markedly stimulates EAAT3 expression
and activity in human oligodendroglioma cells.
compendio 2013
compendio 2013
CONCLUSIONS
TARGETS-PATHWAYS
In conclusion, the results obtained thus far demonstrate the presence of the glutamate transporter EAAT3 in
MS lesions and indicate that its expression in oligodendrocytic models is inducible by drugs already in clinical
use, such as retinoic acid and VPA. The original hypo-
thesis of the project is strongly supported by these
findings even if it remains to be assessed if increased
EAAT3 expression effectively plays a protective role in
animal models of MS. If this hypothesis will be validated, EAAT3 inducing agents may represent a novel
therapeutic option for MS patients.
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Bianchi MG, Franchi-Gazzola R, Reia L, Allegri M, Uggeri J, Chiu M, Sala R, Bussolati O. Valproic acid induces the glutamate transporter EAAT3 in human oligodendroglioma cells Neuroscience
2012, 227: 260–270
Bianchi MG, Reia L, Allegri M, Sala R, Franchi-Gazzola R, Uggeri J, Bussolati O.
Retinoid-dependent induction of EAAT glutamate transporters: an approach for the prevention of excitotoxicity in oligodendrocytes and oligodendrocyte precursor cells. Congresso Scientifico
Annuale FISM, Roma 2012
Bianchi MG, Reia L, Allegri M, Sala R, Chiu M, Franchi-Gazzola R, Uggeri J, Bussolati O. Valproic acid induces the EAAT3 glutamate transporter in human oligodendroglioma cells. EFNS
Stockholm2012, Abs. P1699 - European Journal of Neurology 19 (Suppl. 1): 90-457, 2012.
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di 1 anno (prorogato di 6 mesi) e l’ammontare di 30.000 €
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100
Inibizione del fenomeno dell’epitope spreading con farmaci
inibitori della PARP-1 e relative implicazioni terapeutiche
in modelli di R-ESA
Alberto Chiarugi
Dipartimento di Farmacologia Università di Firenze, Firenze
Collaboratori
Leonardo Cavone, Andrea Lapucci, Roberta Felici, Mirko Muzzi, Daniela Buonvicino
Questo progetto di ricerca ha voluto analizzare il suolo
dell’enzima PARP-1 e dei suoi inibitori nei processi di
diffusione dell’epitopo (epitope spreading) sottesi dalle
cellule dendritiche in modelli di sclerosi multipla. Numerose prove dimostrano come l’epitope spreading sia un
evento importante nella patogenesi delle ricadute sia
nei modelli sperimentali di R-ESA (Encefalomielite Sperimentale Autoimmune) che nella sclerosi multipla (SM).
Fondamentale per questo processo è la presentazione
da parte delle cellule dendritiche di nuovi antigeni derivanti dai detriti mielinici. La PARP-1 è un enzima nucleare
che sta assumendo un importante ruolo di regolatore
epigenetico nel corso di risposta immune e promuove
l’espressione di antigeni co-stimolatori e di importanti citochine pro-infiammatorie.
RISULTATI
I dati raccolti in modelli murini di risposta immune e
sclerosi multipla dimostrano che l’inibizione farmacologica di PARP-1 compromette la maturazione, differenziazione e funzionalità delle cellule dendritiche. In particolare, l’esposizione di cellule dendritiche ad inibitori PARP-1
non ne compromette la vitalità ma riduce la loro capacità
a indirizzare i linfociti T naive verso i linfociti Th17 favorendo invece la polarizzazione verso i linfociti T regolatori
chiamati Treg. Riteniamo che questo sia dovuto princi-
palmente alla capacità che hanno gli inibitori PARP di
favorire lo sviluppo di cellule dendritiche con un fenotipo
tollerante grazie alla alterata espressione di antigeni di
costimolazione. In linea con i dati sovraesposti, il trattamento con inibitori PARP di topi affetti da SM cronica
(C57Bl) o SM recidivante remittente (SJL), porta ad una
riduzione dell’infiltrato infiammatorio nel sistema nervoso centrale, SNC, con riduzione del rapporto Th17/Treg
nel midollo, nonché ad un notevole miglioramento della
sintomatologia neurologica. Inoltre, la caratterizzazione
della risposta umorale e cellulare nei topi SJL trattati o
meno con inibitori PARP dimostra che questi composti sono in grado di ridurre (e in alcuni animali prevenire)
l’epitope spreading con drammatica riduzione e prevenzione delle ricadute.
CONCLUSIONI
I nostri dati dimostrano che una nuova classe di farmaci, già in corso di sperimentazione clinica in campo
oncologico, sono in grado di ridurre le funzioni di presentazione dell’antigene delle cellule dendritiche, riducendo
l’epitope spreading e migliorando la compromissione
neurologica in modelli murini di SM. L’identificazione
di un meccanismo di azione di questi farmaci e il loro
sviluppo clinico avanzato sottolineano il potenziale terapeutico di questi composti nel trattamento di pazienti
con SM, soprattutto del tipo recidivante remittente.
Suppression of epitope spreading with inhibitors of PARP-1
and its relevance to R-EAE treatment
In this research proposal we aimed at investigating the
role of the nuclear enzyme PARP-1 and its inhibitors in
dendritic cell-dependent epitope spreading in models of
multiple sclerosis. A large body of evidence demonstrates that epitope spreading is crucial in the pathogenesis
of relapses in both R-EAE (Experimental Autoimmune
Encephalomyelitis) and MS. Of note, processing and
presentation by dendritic cells (DCs) of new antigens
originating from myelin debris to autoreactive T cells is
central for development of epitope spreading. PARP-1
is emerging as a key epigenetic regulator during the immune response and positively regulates transcription of
co-stimulatory antigens as well as several proinflammatory cytokines.
RESULTS
Data demonstrate that PARP inhibitors impair differentiation, maturation and Antigen-Presenting Cell (APC)
function of DCs during the immune response and in models of MS. Specifically, these drugs bias DC-dependent
T cell polarization towards Treg generation also reducing
101
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
Th17 infiltration in the spinal cord of RR-EAE SJL mice.
We reason that this polarization bias should be mainly
ascribed to the ability of PARP inhibitors of inducing a
tolerogenic phenotype of DCs by impairing costimulatory
antigen expression.
In keeping with this, both chronic EAE mice (C57Bl) and
RR-EAE mice (SJL) show marked improvement when
treated with PARP inhibitors and, remarkably, RR-EAE
mice experience reduced number of relapses compared to vehicle-treated animals. Lastly, our data show that
PARP inhibitors are able to reduce epitope spreading in
RR-EAE mice both at the humoral and cellular level, an
event that likely underpins relapse prevention.
CONCLUSIONS
For the first time, this study identifies PARP inhibitors as
molecules able to impair DC-dependent APC function
and epitope spreading in a model of MS. The advanced clinical development (oncology) of this class of
drugs and their safe profile, along with the identification of at least one mechanism through which they
act in MS models, underscore their therapeutic potential to treatment of MS patients, in particular those
with severe RR-MS.
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Formentini L, Macchiarulo A, Cipriani G, Camaioni E, Rapizzi E,. Pellicciari R,. Moroni F, and Chiarugi. A Poly(ADP-ribose) catabolism triggers AMP-dependent mitochondrial energy failure. J.
Biol. Chem 2009. 284, 17668-76.
Faraco G; Pittelli M; Cavone L; Fossati S; Porcu M;.Mascagni P; Fossati G; Moroni F and Chiarugi A Histone Deacetylase (HDAC) Inhibitors Reduce the Glial Inflammatory Response In Vitro and
In Vivo. Neurobiol. Disease 200936, 269-279.
Pittelli M, Formentini L, Faraco G, Lapucci A, Rapizzi E, Cialdai F, Romano G, Moneti G, Moroni F and Chiarugi A. Inhibition of nicotinamide phosphoribosyl transferase: cellular bioenergetics
reveals a mitochondrial insensitive NAD pool. J. Biol. Chem. 2010 285, 34106-34114.
Cavone L,. Aldinucci A, Ballerini C, Biagioli T, Moroni F and. Chiarugi A.
PARP-1 inhibition prevents CNS migration of dendritic cells during EAE, suppressing the encephalitogenic response and relapse severity. (2011) Multiple Sclerosis 17(5-6), 442-447.
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102
Mappatura funzionale dell’attività di osteopontina
nell’encefalomielite sperimentale e nella sclerosi multipla
Annalisa Chiocchetti
Dipartimento Scienze della Salute, Università del Piemonte Orientale, Novara
Collaboratori
Elisabetta Orilieri, Elena Boggio, Maria Felicia Soluri, Matteo Melensi, Daniele Sblattero
Collaboratori con altri gruppi
Antonio Uccelli, Dipartimento di Neuroscienze, Oftamologia e Genetica, Università di Genova, Genova
L’osteopontina (OPN) è una fosfoproteina che agisce
sia come citochina nei fluidi corporei sia come componente della matrice extracellulare. Lega diverse integrine e alcune isoforme del recettore CD44, espressi
sulla superficie dei linfociti, ed è espressa ad alti livelli
nelle placche demielinizzanti dei pazienti con sclerosi
multipla (SM) e dei topi con encefalomielite sperimentale autoimmune (ESA), il modello murino di SM. I topi
privi di OPN sviluppano un quadro ESA meno severo
rispetto ai topi normali e la somministrazione di OPN a
tali topi induce una ricaduta immediata con successiva
evoluzione verso la forma progressiva e la morte. Ciò
suggerisce un ruolo importante di OPN nella genesi e
nella evoluzione della SM. OPN è prodotta ad alti livelli
nella matrice extracellulare della barriera ematoencefalica: in questa sede potrebbe giocare un ruolo nel reclutamento dei linfociti attraverso il legame con un suo
recettore, l’integrina α4β1. Tale recettore è il bersaglio
del farmaco natalizumab, un anticorpo monoclonale
umanizzato utilizzato nella terapia della SM. OPN è in
grado di legare α4β1 solo dopo aver subito un taglio
proteolitico ad opera della Trombina, la quale permette
la formazione di due porzioni: l’N-terminale che contiene due siti di legame per α4β1 e la C-terminale che
contiene un sito di legame per CD44, recettore coinvolto nell’inibizione dell’apoptosi linfocitaria. L’obiettivo
di questo progetto era quello di valutare il ruolo di OPN
nella SM e nell’ESA attraverso lo studio funzionale dei
due frammenti generati dalla Trombina. Questo può
fornire informazioni per la produzione di nuovi farmaci
e garantire approcci terapeutici diversi.
RISULTATI
Abbiamo prodotto costrutti ricombinanti di OPN intera
sia umana che murina e dei suoi frammenti N- e C-terminale al fine di investigarne l’attività in vivo (nel topo) e
in vitro (in linee cellulari uomane). Inoltre, abbiamo prodotto un quarto mutante corrispondente a OPN intera
mancante del sito di taglio della Trombina e quindi incapace di generare i due frammenti e di esporre il sito
di legame all’integrina α4β1. Per aumentare il grado di
produzione delle molecole ricombinanti, ottimizzarne
la farmacocinetica e ridurne il grado di tossicità, tutte
le proteine sono state prodotte come immunoadesine, ovvero come molecole costituite dalla proteina di
interesse fusa al frammento Fc degli anticorpi.
In passato il nostro laboratorio ha dimostrato che
OPN gioca un ruolo nella produzione di IL-17 e TIMP1, due molecole coinvolte nella patogenesi della SM,
e che regola lo spegnimento della risposta immune inibendo la morte cellulare indotta da attivazione
(AICD). Pertanto i costrutti di OPN umana sono stati
testati in vitro per valutarne gli effetti sulla secrezione
delle citochine. I risultati ottenuti mostrano che la molecola OPN-Fc mantiene la funzionalità di OPN poiché
è in grado di indurre la secrezione di IL-17 e TIMP-1
e di proteggere dall’apoptosi. Inoltre, gli effetti delle
molecole corrispondenti a OPN intera-Fc (ovvero la
molecola wild-type e mutata) sono stati paragonati a
quelli ottenuti in presenza della molecola commerciale
indicando che la porzione Fc non interferisce con la
funzionalità delle molecole ricombinanti prodotte da
noi.
I saggi di secrezione di citochine e protezione dall’apoptosi sono stati utilizzati inoltre per caratterizzare
il ruolo dei due frammenti di taglio della Trombina. I
risultati ottenuti mostrano che entrambi i frammenti
esercitano effetti anti-apoptotici, anche se, mentre
i livelli di protezione dalla morte cellulare indotti dal
frammento C-terminale sono paragonabili a quelli indotti dalla molecola intera, il frammento N-terminale
ha mostrato effetti inferiori. Entrambi i frammenti sono
coinvolti nella secrezione di IFN-γ da parte di PBMC
e di TIMP-1 da parte di monociti. Al contrario, la secrezione di IL-17 da parte di linfociti T CD4+ è attribuibile alla sola porzione N-terminale della molecola.
Questi risultati supportano l’idea che le due porzioni
N- e C-terminale di OPN possano avere effetti diversi
nella patogenesi della SM, ma richiedono di essere
approfonditi in vivo. Sfortunatamente le molecole ricombinanti di OPN-Fc murine hanno mostrato difficoltà di purificazione. Per superare questo problema
abbiamo prodotto le stesse molecole sia umane che
murine fuse ad una coda (tag) di 6 istidine. I risultati
ottenuti negli studi in vitro confermano quelli precedentemente descritti. Gli studi in vivo sono attualmente in corso.
103
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
CONCLUSIONI
Studi ulteriori dovranno essere effettuati per caratterizzare meglio la funzione dei due frammenti di taglio della Trombina attraverso l’utilizzo in vivo delle
proteine murine. I due frammenti di OPN si presen-
tano come potenziali target per la messa a punto
di nuove strategie terapeutiche per la SM volti ad
antagonizzare gli effetti patogenetici di OPN. Tali
esperimenti sono in corso grazie ad un altro finanziamento FISM.
Functional mapping of osteopontin activity in experimental autoimmune
encephalomyelitis and multiple sclerosis
Osteopontin (OPN) is a phosphoprotein that functions
as a free cytokine in body fluids or an immobilized extracellular matrix molecule. It binds several integrins
and CD44 on the lymphocyte surface, and it is present
at high levels in demyelinating lesions of multiple sclerosis (MS) patients and in Experimental Autoimmune
Encephalomyelitis (EAE), the mouse model of MS.
OPN deficient mice develop milder EAE than wild type
animals, their administration of rOPN induce a sudden relapse followed by a progressive severe disease
leading to death. These evidences suggest that OPN
plays an important role in the pathogenesis and progression and of MS. OPN is produced at high levels
in the extracellular matrix of the blood-brain-barrier: at
this site, it may play a role in lymphocyte recruitment
into the MS lesion, by binding one of its receptors,
the α4β1 integrin. This receptor is the target of natalizumab, a humanized monoclonal antibody utilized
in the anti-MS therapy. OPN binds to α4β1 integrin
only upon cleavage by Thrombin which generates two
OPN fragments: the N-terminal, that contains two binding sites for α4β1 integrin, and the C-terminal, that
contains a binding site for another receptor, CD44, involved in the inhibition of lymphocyte apoptosis. The
aim of this project was to investigate the pathogenic
role of OPN in EAE and MS by mapping the functional
role played by the two OPN fragments derived from
Thrombin-cleavage. This information could address
the design of novel therapeutic approaches targeting
the individual fragment activities.
RESULTS
We generated recombinant constructs of the mouse
and human full-length OPN, and its N-terminal and Cterminal fragments to investigate their activity in vivo
(in mice) and in vitro (in mice and humans cell lines).
Furthermore, we generated a fourth mutant corresponding to the full-length OPN lacking the Thrombin cleavage site and thus unable to expose the α4β1
binding sites. To increase the successful rate of production of these recombinant molecules, optimize
their pharmacokinetics and decrease their systemic
toxicity, we produced these recombinant proteins as
immunoadhesins, i.e. proteins formed by the protein
of interest fused to the Fc fragment of an antibody.
In the past few years our laboratory showed that
OPN plays a role in the production of IL-17 and
TIMP-1: two molecules involved in the pathogenesis of MS. Moreover, we showed that OPN inhibits
activation-induced cell death (AICD), thus regulating
the switching-off of the immune response.
The human OPN constructs have been tested in vitro
for their effect on cytokine secretion. We found that
the OPN-Fc molecule maintains is functionality since
it is able to induce secretion of IL-17 and TIMP-1 and
to protect from apoptosis. Moreover the effects of
the full-length Fc proteins (i.e. wild-type and mutated
molecule) are comparable to those obtained by using
the commercial molecule indicating that the Fc portion does not interfere with OPN’s function.
In order to characterize the role of the two Thrombin fragments, we performed the same in vitro tests
stimulating cells with each of these molecules. We
found that both fragments exert antiapoptotic effects, even if the C-terminal fragment protects cells
from AICD at the same levels of the full-length molecule, whilst the N-terminal one showed lower effects.
Both fragments are involved in the secretion of IFN-γ
by PBMC and of TIMP-1 by monocytes. On the contrary the secretion of IL-17 by CD4+ T cells is exclusively ascribable to the N-terminal portion of the molecule. These results support the idea that the N- and
C-terminal half of OPN exert different effects in the
pathogenesis of MS, but should be further explored
in vivo. To this aim we produced the recombinant
molecules corresponding to murine OPN fused to
mouse Fc. Unfortunately we could not purify the recombinant murin OPN-Fc proteins. To overcome this
problem we produced the same human and murine
recombinant molecules as 6xHis tagged proteins.
The results obtained in the in vitro studies confirm
the ones described above. The in vivo studies are
on the way.
104
TARGETS-PATHWAYS
CONCLUSIONS
Further studies are necessary to better characterize
the function of the two Thrombin-cleaved fragments
of OPN through the use of the murine proteins in vivo.
Nevertheless, the two fragments seem to be possible
targets for the development of new therapeutic strategies for MS aimed to antagonize their individual pathogenetic effects. These studies are on the way thanks
to a another FISM funding.
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Regolazione degli interneuroni GABAergici da parte
delle GTPasi Rac: implicazioni per la sclerosi multipla
Ivan de Curtis
Università Vita-Salute San Raffaele e Istituto Scientifico San Raffaele, Milano
Collaboratori
Anna Falco, Valentina Vaghi, Roberta Pennucci, Diletta Tonoli
Studi post-mortem mostrano che gli interneuroni GABAergici positivi per la parvalbumina (PV+) sono diminuiti nella corteccia motoria di pazienti con sclerosi
multipla (SM). Il numero dei motoneuroni e degli interneuroni è ridotto anche nella spina dorsale di pazienti
con SM. Abbiamo prodotto linee di topi con knockout
(KO) neuronale di una o entrambe le GTPasi Rac1 e
Rac3. Questi topi hanno meno interneuroni PV+ corticali. In questo progetto pilota annuale abbiamo indagato due aspetti rilevanti per la comprensione del
difetto neuronale osservato nella SM. Abbiamo esaminato se topi con singolo KO dei geni Rac possono
rappresentare modelli per lo studio del difetto corticale degli interneuroni: (i) abbiamo utilizzato animali
wild type per indurre l’Encefalomielite Sperimentale
Autoimmune (ESA), il modello sperimentale di SM, in
collaborazione con il gruppo del dr. Roberto Furlan, e
osservare gli effetti sugli interneuroni con analisi immunoistochimica quantitativa; (ii) abbiamo comparato lo sviluppo della malattia in seguito a induzione di
ESA nei topi con singolo KO, per vedere se questi
animali sono più sensibili all’ESA. Il secondo obbiettivo è l’analisi degli interneuroni spinali in topi con difetti
nella funzione delle Rac. Gli interneuroni spinali modulano la funzione dei neuroni motori, controllando il
comportamento motorio. I topi con doppio KO sono
atassici e mostrano un comportamento motorio poco
coordinato. Abbiamo iniziato l’analisi degli effetti della
rimozione di Rac sullo sviluppo degli interneuroni spinali. L’identificazione degli effetti sullo sviluppo degli
interneuroni spinali rappresenta un punto di partenza
importante per un progetto a lungo termine che ha lo
scopo di utilizzare questi animali KO e i rispettivi controlli, come modelli per l’analisi dei meccanismi che
colpiscono gli interneuroni inibitori spinali nella SM.
RISULTATI
Abbiamo mostrato una riduzione significativa del numero di interneuroni PV+ negli strati II e III della corteccia motoria primaria dei topi Rac1N o Rac3KO, ma
non del numero di interneuroni positivi per la calretinina (CR+). Abbiamo anche trovato una riduzione
significativa del numero di interneuroni PV+, ma non
CR+, negli strati II e III della corteccia motoria primaria
dei topi wild type con ESA. Questo risultato concorda con l’osservazione che i neuroni PV+ sono diminuiti nella corteccia motoria dei pazienti umani con
SM. I nostri risultati indicano che l’ESA rappresenta
un buon modello per analizzare questo aspetto poco
conosciuto della malattia. Abbiamo poi provato a vedere se i singoli KO Rac1N sono più sensibili nello sviluppare un difetto di interneuroni corticali indotto da
ESA. Tuttavia la maggior parte delle femmine Rac1N
muoiono troppo presto per questa analisi, probabilmente a causa dello sviluppo di un forte fenotipo epilettico indipendente dall’ESA. Quindi questo aspetto
del progetto non è potuto essere sviluppato ulteriormente.
Il secondo scopo del progetto è l’analisi degli interneuroni spinali nei topi con KO di Rac. La synI-Cre
utilizzata per eliminare Rac1 nei neuroni è già espressa nella spina dorsale a E15.5. Abbiamo stabilito le
condizioni per identificare differenti popolazioni neuronali, ed abbiamo iniziato l’analisi quantitativa nelle
spine dorsali dei topi P13 con doppio KO e dei rispettivi controlli (Rac3KO). I dati mostrano una riduzione
del numero di interneuroni nella spina dorsale dei topi
doppio KO rispetto ai controlli. Gli interneuroni PV+
nelle corna ventrali della spina dorsale lombare sono
ridotti del 57% nei topi doppio KO. Sia gli interneuroni CR+ che CB+ mostrato una riduzione del 31%
nelle corna ventrali della spina dorsale lombare dei
topi doppio KO. È interessante osservare che abbiamo anche osservato un aumento del numero di
propriocettori PV+ nei gangli delle radici dorsali, e un
aumento corrispondente dell’intensità delle afferenze
propriocettive PV+ all’interno della spina dorsale dei
topi doppio KO rispetto ai controlli.
CONCLUSIONI
I dati ottenuti durante questo progetto pilota indicano
che la perdita di specifiche popolazioni di interneuroni
è una caratteristica della corteccia motoria di topi con
ESA, come precedentemente descritto per la corteccia motoria dei pazienti umani con SM. Inoltre l’analisi
effettuata sulle spine dorsali mostra che interneuroni
diversi possono essere alterati nei topi KO per Rac. Ci
106
TARGETS-PATHWAYS
aspettavamo che alcuni degli approcci utilizzati avrebbero aiutato a identificare almeno un modello animale
adatto ad indagare il ruolo degli interneuroni nella SM.
In questa direzione: (1) abbiamo mostrato che ESA
induce una diminuzione degli interneuroni PV+ in topi
wild type, come osservato in pazienti umani, sugge-
rendo che ESA è un buon modello per studiare questo aspetto poco indagato della malattia; (2) abbiamo
stabilito le condizioni e iniziato l’analisi quantitativa per
esplorare gli effetti dell’ESA e del KO di Rac sugli interneuroni spinali, un altro aspetto poco conosciuto
della SM.
Regulation of GABAergic interneurons by Rac GTPases:
implications for multiple sclerosis
Recent post-mortem studies show that GABAergic
parvalbumin-positive (PV+) interneurons are decreased
in the motor cortex of multiple sclerosis (MS) patients.
Both motoneuron and interneuron numbers are reduced
also in the spinal cord of MS patients. We produced mice
with neuronal knockout (KO) of either one or both Rac1
and Rac3 GTPases. These mice have less cortical PV+
interneurons. In this one-year pilot project we have investigated two issues relevant to the understanding of
the neuronal defect in MS. First, we have tested if single
Rac KOs represent models to study the cortical defect
in interneurons: (i) we have used wild type mice to induce EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis)
in collaboration with the group of dr. Roberto Furlan, to
look at the effects on cortical GABAergic interneurons by
quantitative immuno-histochemical analysis; (ii) we have
compared the development of the disease after induction of EAE in single KO mice, to test if these animals are
more sensitive to EAE.
The second aim of the project is the analysis of the spinal
inhibitory interneurons in mice with affected Rac function.
In the spinal cord, networks of interneurons modulate
motor neuron firing, thus controlling motor behaviour.
Rac1N/Rac3-KO double mutant mice are ataxic and
show poorly coordinated behaviour. We have started
the analysis of the effects of Rac deletion on the development of spinal interneurons. The identification of the
defects in the development of spinal interneuronal networks would represent a starting point for a long-term
project aiming at the use of these KO and control mice
as animal models for the analysis of the mechanisms affecting spinal inhibitory interneurons in MS.
II and III of the primary motor cortex of EAE-treated wild
type mice. This result is in agreement with the published
observations that PV+ interneurons are decreased in the
motor cortex of human patients with MS. Therefore our
findings indicate that EAE represents a good model to
test this poorly explored aspect of the disease. We then
attempted to test if our single Rac1N KO mice would
be more sensitive in developing the defect of cortical
interneurons induced by EAE. We found though that
most female Rac1N mice died too early for this analysis,
possibly due to the development of a strong EAE-independent epileptic phenotype as these mice became
adult. Therefore this aspect of the project could not be
explored further.
The second aim of the project has been the analysis of
the spinal inhibitory interneurons in mice with affected
Rac function. The SynI-Cre used to delete Rac1 in neurons is already expressed at E15.5 in the developing
spinal cord. We have set the conditions to identify different neuronal populations in the spinal cord, and started
the quantitative analysis on P13 double KO and control
(Rac3KO) spinal cords. The data show a reduction of
a number of interneuronal cell types in the spinal cord
of double KO mice compared to controls. The PV+
interneurons in the ventral horn of lumbar spinal cord
were reduced by 57% in double KO mice. Both CR+
and CB+ interneurons showed a reduction of 31% in
the ventral horn of lumbar spinal cord double KO mice.
Intriguingly, we also observed an increase of PV+ proprioceptors in the dorsal root ganglia and a corresponding
increase in the intensity of PV+ proprioceptive afferents
in the spinal cord of the double KO mice compared to
control littermates.
RESULTS
CONCLUSIONS
During this one-year pilot project we have first identified
a significant reduction in the number of PV+, but not
calretinin-positive (CR+) interneurons in layers II and III
of the primary motor cortex of either Rac1N or Rac3KO
mice. Interestingly, we also found a significant reduction
of the number of PV+, but not CR+ interneurons in layers
The data obtained during this pilot project indicate that
loss of specific populations of interneurons is a hallmark
of the motor cortex of EAE in mice, as previously reported for the motor cortex of human patients with MS.
Moreover, the analysis performed so far in the spinal
cord shows that different interneurons may be affected
107
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
in the Rac mutant mice. We expected that some of the
approaches utilized would help identifying at least one
suitable animal model to address the role of interneurons
in MS. In this direction: (1) we have shown that EAE induces a decrease in cortical PV+ interneurons in WT mice,
as detected in human patients, suggesting that EAE is
a good model to study this poorly explored aspect of
the disease; (2) we have set the conditions, and started
the quantitative analysis that will be useful to explore the
effects of EAE and possibly of Rac KO on spinal cord
interneurons, another poorly explored aspect of MS.
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Vaghi V, Pennucci R, Talpo F, Corbetta S, Montinaro V, Barone C, Croci L, Spaiardi P, Consalez GG, Biella G, de Curtis I. Rac1 and Rac3 GTPases control synergistically the development of cortical
and hippocampal GABAergic interneurons. Cereb Cortex. 2012 Dec 20 [Epub ahead of print]
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Induzione di immunità protettiva in un modello murino
sperimentale di sclerosi multipla mediante agonisti
dei recettori TLR7 e TLR9
Francesca Fallarino
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Perugia, Perugia
Collaboratori
Claudia Volpi, Carmine Vacca
Collaboratori con altri gruppi
Bruno Gran, Division of Clinical Neurology Queen’s Medical Centre, University of Nottingham (Nottingham),
United Kingdom
I recettori toll-like (TLR) erano considerati molecole
stimolatorie in grado di attivare meccanismi iniziali di
difesa contro agenti infettivi. Tuttavia, dati più recenti
indicano che i TLR possono anche esercitare funzioni
regolatorie. Pertanto potrebbero diventare un utile bersaglio terapeutico nella prevenzione e terapia delle malattie infiammatorie, tra cui la sclerosi multipla (SM). Ci
sono tuttavia ancora ostacoli allo sviluppo di nuove terapie per la SM mirate ai TLR, a causa dell’incompleta
comprensione dei meccanismi coinvolti e di dati sperimentali contraddittori tra laboratori diversi. Resta da
chiarire quali TLR siano il miglior bersaglio terapeutico,
e inoltre le modalità e i tempi di somministrazione delle
sostanze che li attivano (o inibiscono) durante diverse
fasi di malattia, e i meccanismi alla base dei loro effetti
infiammatori e regolatori. Concentrare la nostra ricerca su particolari tipi di cellule che sappiamo esprimere
diversi tipi di TLR aumenta la probabilità di identificare
bersagli terapeutici. Le cellule dendritiche plasmacitoidi
(pDC) sono il bersaglio principale delle sostanze che
attivano specificamente i recettori TLR7 e TLR9. Queste sostanze comprendono rispettivamente il DNA virale a catena singola e le sequenze di DNA contenenti
‘motivi CpG’ derivate da agenti infettivi. Le pDC sono
considerate le cellule del sistema immunitario con la
maggior plasticità, e sembrano criticamente coinvolte
sia nei meccanismi di ‘innesco’ che in quelli di controllo dell’encefalite sperimentale autoimmune (ESA), il
più importante modello animale della SM. Laboratori
diversi hanno osservato effetti dei TLR e delle pDC diversi o anche opposti, forse a causa di meccanismi di
integrazione, coinvolgenti sia i TLR che le pDC, che
possono avere effetti sia infiammatori che protettivi a
seconda delle condizioni del ‘microambiente’ tissutale.
Inoltre le pDC sembrano avere effetti diversi nelle varie
fasi dell’ESA.
In questo progetto pilota, per aumentare le conoscenze di base in questo campo di ricerca, ci siamo concentrati sullo studio degli effetti di sostanze che attivano TLR9 nell’ESA, che comprendono sequenze di
oligonucleotidi (ODN), tra i quali abbiamo utilizzato in
particolare gli ODN contenenti sequenze CpG-A, -B, e
-C. Ne abbiamo studiato le attività immunoregolatrici
sia in vivo che in vitro.
I risultati più importanti ottenuti sono stati i seguenti: 1) i CpG-A diminuiscono la gravità di malattia; 2) il
trattamento delle pDC con CpG-A (ma non -B o -C) in
vitro promuove lo sviluppo di cellule T regolatrici (Treg)
ed attiva il sistema immunoregolatore dell’IDO (Indoleamine 2,3 Dioxigenase) in alcuni sottotipi di pDC; 3)
l’attività degli interferoni di tipo I (antiinfiammatori) non
è necessaria per l’induzione di IDO nelle pDC o perchè le pDC stesse inducano lo sviluppo di cellule Treg
dopo il trattamento con CpG-A in vitro.
Per la prima volta questi studi suggeriscono che, tra
le sostanze che attivano specificamente TLR9 (cioè
gli ODN che contengono sequenze CpG), solo alcuni sottotipi (CpG-A) sono in grado di indurre funzioni
immunoregolatorie delle pDC nell’ESA. Riteniamo che
questi studi saranno utili per sviluppare sostanze con
proprietà simili, per la terapia sperimentale della SM.
RISULTATI
Ci siamo concentrati sull’identificazione delle classi e delle dosi di ligandi del TLR9 (CpGA,CpGB and
CpGC) in grado di ridurre la gravità dell’ESA in vivo.
Abbiamo inoltre studiato la loro capacità di aumentare
l’attività immunoregolatoria delle pDC e l’espressione
del fattore di trascrizione forkhead box P3 (FoxP3)
nelle cellule Treg in vitro.
I ligandi CpGA erano più potenti degli altri CpG-ODN
nella modulazione di queste funzioni.
Abbiamo studiato 5 aspetti principali nel modello di
ESA murino indotto da peptide MOG:
1) il trattamento con CpG-ODN induce resistenza alla
ESA in vivo; 2) gli effetti protettivi di CpG-ODN correlano con l’induzione di IDO nelle pDC e con l’espressione di FoxP3 nelle cellule T CD4+; 3) tra i CpG-ODN
esaminati, la somministrazione di CpGA in modalità
preventiva era la più potente nel proteggere dall’ESA;
4) la funzione biologica degli interferoni (IFN) di tipo
I non è necessaria per l’induzione di IDO nelle pDC
da parte di CpGA in vitro; 5) l’induzione di FoxP3 nei
linfociti CD4+ da parte di pDC trattate con CpGA in
vitro non richiede la funzione del recettore per IFNα/β.
109
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
In un progetto futuro restano da determinare in dettaglio i meccanismi d’azione degli effetti di CpGA su
TLR9 o altri TLR (i.e TLR7) presenti negli endosomi.
CONCLUSIONI
Riteniamo che questi risultati abbiano rilevanza per la
SM per tre motivi: a) aumentano la conoscenza del
ruolo delle pDC e di IDO nella regolazione della demielinizzazione autoimmune; b) potrebbero aiutare ad
identificare nuovi approcci alla terapia della SM basati
sul ruolo immunoregolatore di TLR9; c) contribuiscono
a definire meccanismi molecolari finalizzati alla ‘riprogrammazione’ funzionale delle pDC tramite TLR9. Riteniamo inoltre che questi studi contribuiscano a chiarire la dicotomia funzionale dei TLR endosomali e delle
pDC, guidando la futura scelta di sostanze attivatrici
dei TLR nei modi e nei tempi più opportuni.
Generation of protective immune environment in murine models
of multiple sclerosis by TLR7 and TLR9 agonists
Although toll-like receptors (TLRs) were initially considered as stimulatory molecules capable of activating early defense mechanisms against invading pathogens, emerging data suggest that they can also
exert a regulatory function. Thus, TLRs may represent
valuable targets in the prevention/therapy of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS).
However, there are still several issues that are either
unclear or have generated conflicting results in distinct
laboratories, hampering the development of TLR-based,
innovative therapies in MS. These issues include the lack
of a precise identification of the best TLR target/s, the
best route and time of administration of TLR agonists
(or antagonists) during the course of the disease, and
the mechanisms underlying inflammatory vs. regulatory effects. Focusing our research on specific cell types
known to be targeted by TLR agonists increases the likelihood of identifying therapeutic targets. Plasmacytoid
dendritic cells (pDCs) are the principal cellular targets of
TLR7 and TLR9 agonists, such as viral ssDNA and microbial CpG-containing DNA sequences, respectively. Of
particular importance in the present context is the fact
that pDCs, the most plastic cells of the immune system,
seem to play a crucial role in both the pathogenesis and
the control of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the most widely accepted experimental model
of MS. Opposing results on the role of TLRs and pDCs in
EAE obtained by different laboratories may originate from
the existence of a common pathway that, by integrating
molecular (TLR) and cellular (pDC) features, may drive either inflammation or immune regulation in different environmental conditions. Distinct effects of pDCs at different
stages of the disease may also be involved.
In the current pilot project, we have aimed at filling specific gaps in basic knowledge in this field, specifically we
have focused our studies on the effects of known TLR9
agonists, in the form of synthetic CpG-Oligonucleotides
sequences (ODNs) on pDCs in EAE models. In particular, three different CpGODNs have been analyzed;
CpGODN-type A, B or C for their immunoregulatory
activity both in vivo and in vitro. The following is a list
of the most important results we have obtained in this
Pilot Study: 1) CpG-ODNs treatment contributes to EAE
resistance in vivo, 2) treatment of pDCs with CpG-ODN
-type A but not with type B or C promotes Regulatory
T cell (Treg) development and activates the tolerogenic
pathways of Indoleamine 2,3 Dioxigenase (IDO) in pDC
subsets, 3) Type I interferon signaling is not required for
IDO induction in pDC or to promote Treg increase after
CpG-A treatment in vitro.
Such study suggests for the first time that, among specific TLR9 ligands (i.e. CpGODNs), only specific types
are able induce a regulatory/tolerogenic function in EAE.
We believe that our study will help to design specific ligands with such properties to be be used in MS.
RESULTS
This pilot project has been focused at identifying the
best known TLR9 ligands and doses (i.e. CpGA,CpGB
and CpGC) able to ameliorate the clinical severity of EAE
in vivo, as well as their ability to increase the IDO immunoregulatory pathway in pDC and forkhead box P3
(FoxP3) expression in CD4+T cells in vitro.
We found that the synthetic TLR9 ligand CpGA was superior to the other CpGODNs in modulating such activities. In particular in this pilot study five major new issues
have been investigated and covered in the MOG peptide induced EAE mouse model: 1) CpGODNs treatment
contributes to EAE resistance in vivo; 2) The CpGODN
protective effect correlates with IDO induction in pDCs
and FoxP3 expression in T CD4+ T cells; 3) Among the
three different examined CpGODNs (i.e. Type A,B,C),
preventive CpGA administration in vivo is superior in
protecting the mice against EAE; 4) Type I interferon (IFN) signaling is not required for IDO induction
110
TARGETS-PATHWAYS
in pDCs after CpGA treatment in vitro; and 5) FoxP3
induction in CD4+ T cells by pDCs treated with CpGA
does not require Type I IFN signaling in pDCs in T cells
pDC/CpGA in vitro cocultures.
Specific requirements of TLR9 or other endosomal
TLRs (i.e TLR7) in the immunomodulatory effects of
CpGA remains to be demonstrated and could be the
focus of future projects.
CONCLUSIONS
We think that these results are relevant for MS for three main reasons: a) the need to fill the gap in scientific
knowledge on the role of pDCs and IDO in regulating
autoimmune inflammatory demyelination, b) the potential to identify novel approaches to MS treatment
by exploring the role of TLR9 ligands in preventing or
treating experimental neuroinflammation, c) the definition of specific molecular pathways to condition
or reset TLR9-expressing-pDCs, as new therapeutic
target cell type. Moreover, we believe that such results shed light into the crucial factors that underlie
the functional dichotomy of endosomal TLRs and
pDCs and teach us how and when to use appropriate
TLR ligands in MS.
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Volpi C, Fallarino F, Bianchi R, Orabona C, De Luca A, Vacca C, Romani L, Gran B, Grohmann U, Puccetti P, Belladonna ML. A GpC-rich oligonucleotide acts on plasmacytoid dendritic cells to
promote immune suppression. J Immunol. 2012;189(5):2283-9.
Volpi C, Fazio F, Fallarino F. Targeting metabotropic glutamate receptors in neuroimmune communication. Neuropharmacology. 2012, 63(4):501-6. Selected as listed Current Feature Article in
Global Medical Discovery
Volpi C, Fallarino et al. A novel TLR9–TRIF pathway mediates tolerogenic responses to CpGODN. Submitted and under revision: Nature Comunications.
Fallarino F, Pallotta MT, Orabona C, Volpi C, Vacca C,.Belladonna ML, Bianchi R, Servillo G, Fioretti MC, Puccetti P, Grohmann U. Indoleamine 2,3-dioxygenase: from catalyst to signaling function.
American Association of Immunologists (AAI) meeting, S. Francisco (CA). Maggio 2011.
Belladonna ML, Fallarino F, Pallotta MT, Orabona C, Volpi C, Bianchi C, Vacca C, Grohmann U, and Puccetti P. (2011). The role of TGF-beta as tolerogenic cytokine in regulating dendritic cell
function. Cytokine: 9th Joint meeting of ICS-ISICR., Firenze, Ottobre 9 Dicembre 2011, vol. 56(1), p. 15, Elsevier
Fallarino F, Pallotta MT, Volpi C, Orabona C, Vacca C, Belladonna ML, Bianchi R, Grohmann U, Puccetti P. 2012. Indoleamine 2,3 dioxygnenase: as an inducer and amplifier of regulatory T cell
functions.. In: -. 13th International Society for tryptophan Research. Sidney (Australia), 7-9 November 2012.
Crooks J, Matino D, O’Brien K, Volpi C, Gran B, and Fallarino F. Modulation of Plasmacytoid Dendritic Cells by TLR9 agonists in EAE. 11th International Society of Neuroimmunology Congress,
Boston MA, USA November 4-8, 2012
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di un anno e l’ ammontare di 30.000 €
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1,25(OH)2D3 come modulatore della SM: metabolismo,
attività immunoregolatoria e relazione con l’IFN di tipo I
in cellule dendritiche
Maria Cristina Gauzzi
Dipartimento di Ematologia, Oncologia e Medicina Molecolare, Istituto Superiore di Sanità, Roma
Collaboratori
Isabella Sanseverino, Arturo Ottavio Rinaldi, Cristina Purificato, Sandra Gessani
Antonio Cortese e Enrico Millefiorini, Centro Sclerosi Multipla, Policnico Umberto I, Sapienza Università di Roma, Roma
Rosella Mechelli e Marco Salvetti, Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS) Ospedale Sant’Andrea,
Sapienza Università di Roma, Roma
Insufficienti livelli di vitamina D (vitD) sono stati associati ad un alto rischio di contrarre la sclerosi multipla
(SM), o ad una maggiore severità del suo decorso
clinico. La vitD, nota principalmente come regolatore
del calcio e del tessuto osseo, è un ormone dotato di
molteplici attività inclusa la modulazione della risposta
immunitaria. Un suo importante bersaglio nel sistema immunitario sono le cellule dendritiche (DC), che
istruiscono i linfociti a distinguere tra molecole proprie,
verso cui si instaura una tolleranza immunologica, ed
estranee, che innescano la risposta immunitaria; la
vitD induce le DC ad indirizzare i linfociti T verso la
tolleranza. Sebbene la causa primaria delle lesioni
nella SM sia ancora oggetto di discussione, si ritiene
che vi contribuisca lo stato infiammatorio provocato
dalla rottura della tolleranza verso molecole proprie,
e numerose evidenze indicano un ruolo delle DC nel
sostenere questa reazione autoimmunitaria.
La nostra ipotesi di lavoro è stata che un’alterazione
della capacità delle DC di sintetizzare la forma bioattiva della vitD (1,25(OH)2D3) e/o di rispondere alla
sua attività “tollerogenica” potesse contribuire alla
patologia. Il nostro studio è stato dunque mirato alla
caratterizzazione del metabolismo/attività della vitD, e
della sua relazione con l’interferone (IFN), una delle
principali opzioni terapeutiche nella SM recidivante remittente, in DC di persone con SM. In particolare, ci
siamo proposti due obiettivi principali:
- Studiare l’espressione delle molecole che regolano
la produzione e la risposta alla 1,25(OH)2D3 (proteine
di trasporto, recettore ed enzimi metabolici) e la loro
possibile modulazione da parte dell’IFNβ.
- Analizzare la risposta all’attività immunomodulatoria
della 1,25(OH)2D3.
RISULTATI
L’intero progetto è stato svolto utilizzando monociti e
DC da essi derivate, isolati dal sangue di tre gruppi
di donatori: persone con SM non sottoposte ad alcuna terapia, persone con SM in terapia con l’IFN
e donatori sani. Sono stati ottenuti prelievi di san-
gue da 40 pazienti (6 dei quali nella fase acuta della
malattia) e 30 donatori di controllo scelti con una
simile distribuzione per sesso ed età. Circa metà dei
pazienti era in terapia con l’IFN da almeno un mese.
La risposta delle DC alla 1,25(OH)2D3 è stata caratterizzata analizzando diversi parametri, quali
l’immunofenotipo, l’espressione del fattore trascrizionale IRF4, da noi precedentemente descritto
come un bersaglio della 1,25(OH)2D3 nelle DC, la
secrezione di citochine e chemochine e la capacità
di attivare le cellule T. Nessuna differenza statisticamente significativa tra i gruppi sperimentali è emersa da questi studi, suggerendo che – nei limiti dei
parametri valutati - non vi siano alterazioni di rilievo
nella sensibilità all’attività immunomodulatoria della
1,25(OH)2D3 nelle DC dei pazienti. Tuttavia, poiché
la maggior parte di loro era nella fase di remissione,
non possiamo escludere che tali alterazioni possano avvenire nella fase attiva della malattia.
L’analisi dello status della vitD nel plasma – effettuata misurando non solo la concentrazione di
25OHD3, il principale metabolita circolante della
vitD, ma anche di DBP, la proteina plasmatica trasportatrice della vitD – ci ha invece permesso di evidenziare la presenza di livelli significativamente più
alti di DBP nei pazienti durante le fasi di remissione
clinica, ma non durante le fasi di ricaduta, rispetto ai
donatori di controllo.
Abbiamo inoltre osservato una potenziale cooperazione tra 1,25(OH)2D3 e IFNβ a livello molecolare,
che meriterà di essere approfondita in futuro. L’IFNβ
infatti induce un aumento dell’espressione dell’RNA
messaggero del recettore VDR, sia in vitro (in DC
generate in presenza di IFN) che come conseguenza della terapia (nei monociti appena isolati). Inoltre,
la 1,25(OH)2D3, come l’IFN, si è rivelata un potente
induttore di CCL2, una chemochina il cui ruolo nella patogenesi della SM è ancora controverso, ma
la cui secrezione in periferia potrebbe desensibilizzare i recettori sui leucociti circolanti o causare un
gradiente inverso che riduca il loro reclutamento nel
sistema nervoso centrale.
112
TARGETS-PATHWAYS
CONCLUSIONI
La deficienza di vitD è considerata uno dei principali
fattori di rischio ambientali per la SM ed il numero crescente di dati a supporto di un suo ruolo protettivo ha
alimentato la speranza di un suo potenziale terapeutico. A tale scopo, diversi studi clinici sono in corso per
valutarne l’efficacia, anche in combinazione con l’IFN.
Tuttavia, permangono incertezze sul meccanismo attraverso il quale la vitD esercita il suo effetto protettivo,
così come sui suoi effettivi bersagli cellulari. Nei limiti
dello studio, effettuato in vitro, l’osservazione che le
DC dei pazienti sono sensibili all’attività tollerogenica
della vitD, e che esiste un potenziale sinergia tra vitD e
IFNβ, suggerisce che le DC potrebbero mediare alcuni
degli effetti benefici della vitD, in particolare se somministrata in combinazione con l’IFN. Infine, la presenza
di alterati livelli di DBP nei pazienti suggerisce l’implicazione di questa proteina nella patofisiologia della MS.
Poiché DBP controlla anche la biodisponibilità della
vitD, questa potrebbe essere un’indicazione a favore
dell’inclusione della sua misurazione nella valutazione
dello status della vitD nelle persone con SM.
1,25(OH)2D3 as a disease modulator in MS:
metabolic pathways, immunoregulatory activity and relationship
with the type I IFN system in dendritic cells
Low plasma levels of 25(OH)D3, the main circulating
form of vitD, are associated with higher risk of MS and
disease severity. Although it is mainly known for its central function in calcium and bone metabolism, vitD has
also important effects on the growth and differentiation
of many cell types, and pronounced immunoregulatory
properties. Dendritic cells (DC) represent a key cell target of the hormone in the immune system. These cells
instruct T lymphocytes to discriminate between “self”
molecules, toward which an immunological tolerance is
esthablished, and “non-self”, that trigger an immune response. VitD induces DC to prime T cells for tolerance.
Although the concept of autoimmunity as primary trigger
in MS lesion formation is still a matter of discussion, it
is widely accepted that immune-mediated inflammation
contributes to MS pathogenesis, and several reports
suggest a role for DC in this autoimmune reaction.
Our working hypothesis has been that an alteration of the
autocrine vitD metabolism and/or a diverse susceptibility
to the tolerogenic activity of 1,25(OH)2D3 could contribute to the DC pathogenic role. Our study was focused
to the characterization of vitD metabolism/activity, and
of the relationship with IFN, which still represent a main
therapeutic option in relasing remitting MS (RRMS), in
DC obtained from MS patients. In particular, our project
foresaw two main aims:
- To study the expression of effector molecules, regulating 1,25(OH)2D3 synthesis and activity (carrier proteins,
receptor and metabolic enzymes) and their potential modulation by IFN
- To analyze the response to the 1,25(OH)2D3 immunomodulatory activity
RESULTS
The whole project was carried out on monocytes/mo-
nocyte-derived DC obtained from three donor groups:
MS patients free of therapy, MS patients undergoing IFN
therapy, and healthy donors. In parallel, we analyzed the
vitD status and blood levels of selected chemokines and
cytokines. A total of 40 patients (6 of which in the relapse phase of the disease) and 30 healthy donors were
analyzed. About half of the MS donors were on IFN therapy since at least one month.
The DC response to 1,25(OH)2D3 has been characterized by analyzing different parameters, including the
immunophenotype, the expression of the transcriptional regulator IRF4 - that we previously reported to be a
target of 1,25(OH)2D3 - chemokine/cytokine production
and the ability to activate T cells. No statistically significant difference among the experimental groups emerged from these studies, suggesting that - within the
limits of the studied parameters - no heavy defects in
the response to 1,25(OH)2D3 are present in DC from
patients. However, as most of the donors were in the
stable phase of the disease we cannot exclude that the
such alterations could appear or worsen in the active
phase.
The analysis of the vitD status of donors - performed
measuring not only the concentration of 25OHD3, but
also the levels of DBD, the major plasma carrier of vitD
metabolites - allowed us to unravel that, compared with
healthy subjects, significantly higher DBP levels were
present in patients during phases of clinical remission
but not during clinical exacerbations.
We also foresaw to generate relevant knowledge on
molecular mechanisms underlying beneficial effects of
vitD and relationship with IFNβ. In this regard, we observed an enhancing effect of IFNβ on VDR expression, either in vitro, or as consequence of IFN therapy. We also
found that 1,25(OH)2D3, like IFNβ, is a potent inducer
of CCL2 production by DC. The vitD-induced secretion
113
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
in periphery of this chemokine, whose role in MS is still
controversial, could desensitize chemokine receptors on
leukocytes or cause a reverse gradient which neutralize
leukocyte recruitment into central nervous system.
CONCLUSIONS
Vitamin D deficiency is currently considered one of the
main environmental MS risk factors and the number of
observations supporting its protective effect is rapidly
growing, fostering the idea that vitD deficiency might be
an important modifiable risk factor. Indeed, clinical trials
are ongoing to evaluate the efficacy of vitD in RRMS.
However, there are uncertainties and many unanswered
questions, including how vitD exerts a protective effect,
and which are the relevant cell targets.
Altogether, our results on the ability of DC obtained from
patients to normally respond to 1,25(OH)2D3 treatment
suggest that these cell could mediate some potentially protective effects of vitD. Furthermore, they indicate
that IFNβ and 1,25(OH)2D3 may synergize in modulating DC functions in a protective way. This appears of
particular relevance as one of the ongoing clinical trial is
evaluating vitD supplementation as add-on treatment to
IFN therapy. Finally, our data on the altered DBP plasma
levels in patients point to the involvement of this protein
in MS patho-physiology and highlight the importance to
include DBP in the evaluation of vitamin D status in MS
patients.
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Sanseverino I, Purificato C, Cortese A, Millefiorini E, Gessani S, Gauzzi MC. Immunoregulatory Activity of 1,25(OH)2D3 and Relationship with IFNβ in Dendritic Cells from Healthy Donors and MS
Patients. 20th ARSEP, Annual Multiple Sclerosis Meeting, Paris, 12-13 May 2011.
Sanseverino I, Purificato C, Rinaldi AO, Cortese A, Millefiorini E, Gessani S, Gauzzi MC. CCL2 Induction by 1,25(OH)2D: a study on dendritic cells from healthy donors and MS patients. ECTRIMS
2011-5th Joint Triennial Congress of the European and Americas Committees for Treatment and Research in Multiple Sclerosis, 19-22 October 2011, Amsterdam, The Nedherlands.
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114
Marcatura isotopica delle proteine per l’identificazione
dei fattori solubili coinvolti nell’azione neuroprotettiva mediata
dalle cellule staminali mesenchimali
Laura Lovato
Dipartimento di Scienze Riabilitative, Neurologia, Oftalmologia, Genetica e Scienze Materno-infantili (DINOGMI),
Università degli Studi di Genova, Genova
Mentore
Antonio Uccelli
Diversi studi hanno dimostrato che le cellule staminali
mesenchimali (CSM) sono in grado di modulare l’attacco autoimmune diretto al sistema nervoso centrale
tramite diversi meccanismi, tra cui il rilascio di fattori
solubili, la cui espressione è indotta da stimoli pro-infiammatori o neurodegenerativi, quali linfociti T attivati
o neuroni danneggiati (in vitro). Ad oggi, l’identità delle molecole rilasciate dalle CSM non è stata completamente definita. Nel presente progetto si è utilizzata
un’innovativa tecnica di proteomica, definita SILAC,
che permette di marcare metabolicamente le proteine
secrete dalle CSM in presenza di fattori solubili (non
marcati) derivanti dalle cellule bersaglio (linfociti T). Grazie alla marcatura delle CSM è possibile identificare e
quantificare i fattori solubili espressi dalle CSM (non attivate e attivate) coinvolti nell’azione terapeutica delle
CSM. L’identificazione di queste molecole non solo fornirà importanti informazioni sul meccanismo d’azione
delle CSM, ma permetterà anche il loro sviluppo a scopo terapeutico per la cura della sclerosi multipla (SM).
RISULTATI
È stata innanzitutto definita la marcatura ottimale delle
CSM per SILAC, senza indurre modifiche delle caratteristiche immunosoppressive. Quindi è stata analizzata l’espressione proteica delle CSM e dei fattori solubili
(secretomi) rilasciati in condizioni basali e dopo stimolazione con interferone gamma (IFNg). Nelle CSM
stimolate da IFNg abbiamo evidenziato un’aumentata
espressione di proteine coinvolte in un’azione neurotrofica, antiapoptotica e antiproliferativa. Queste
proteine sono tipicamente intracellulari ma possono
essere secrete nel compartimento extracellulare. L’analisi del secretoma delle MSC in condizioni basali ha
confermato il rilascio di alcuni di questi fattori solubili. È in corso l’analisi quantitativa dei fattori solubili
rilasciati dalle CSM dopo stimolazione con IFNg, per
avere uno spettro completo delle proteine modulate
nel secretoma delle CSM in condizioni infiammatorie.
CONCLUSIONI
Le CSM mostrano una spiccata plasticità terapeutica,
grazie alla quale sono state recentemente approvate
per la sperimentazione clinica per valutare il loro utilizzo come trattamento terapeutico per la SM. L’identificazione dei fattori solubili espressi dalle CSM in seguito a stimolazione derivante dalle cellule target, quali
linfociti T attivati, è un aspetto cruciale da definire per
capire come le CSM esercitano il loro effetto terapeutico e per scoprire nuove molecole rilevanti per una
futura strategia terapeutica nella SM che promuova
la riparazione del danno tissutale del sistema nervoso
centrale.
Protein isotope tagging for the identification of molecular features involved
in mesenchymal stem cells-mediated neuroprotection
MSC have been shown to affect the autoimmune attack
to the central nervous system (CNS) by different mechanisms among which the release of soluble factors, induced by microenvironmental cues, mainly pro-inflammatory cytokines derived from the target cells (i.e. activated
T cells o damaged neurons, in vitro). The identity of these soluble factors is only partially defined. This proposal
aims at identifying key molecules of the MSC secretome
induced by proinflammatory cues derived from target
cells (activated T cells), using an innovative proteomic
technique named Stable Isotope Labelling with Amino
acids in cell Culture (SILAC). Because of the methabolic
labelling of MSC, the complete spectra of secreted proteins by MSC under inflammatory conditions versus basal condition will be identified and quantified. These experiments will allow to identify new molecules secreted
by MSC, following proinflammatory environmental cues,
115
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
that are likely to be involved in some of the pivotal therapeutic activities displayed by MSC and that might be
translated in therapeutic molecules for the MS treatment.
RESULTS
We set the conditions for the optimal labeling of MSC for
SILAC, then we analyzed the changes in protein expression of unprimed and IFNg-primed MSC and the corresponding secretomes. In the IFNg-primed MSC, we highlighted an increased expression of proteins involved in
neurotrophic, anti-apoptotic and anti-proliferative effects.
These proteins mainly belong to the intracellular compartments but they can be released into the extracellular
compartment. Analysis of the unprimed MSC secretome
confirmed that some of these molecules are released in
the extracellular compartment by MSC in basal condi-
tion. We are currently running the quantitative analysis of
primed and IFNg-primed MSC secretomes, to have the
complete spectra of proteins modulated in the secretome of MSC under inflammatory conditions.
CONCLUSIONS
MSC display a robust therapeutic plasticity and therefore have been recently approved for clinical trial for MS
treatment. The identification of the soluble factors expressed by the MSC during the cross talks with target
cells such as activated T lymphocytes is a crucial aspect
to understand how MSC exert their therapeutic activity
and discover new therapeutic molecules of relevance
for future therapeutic strategies for MS fostering tissue
repair.
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Lovato L, Marzano V, Albino S, Vigo T, Pieroni L, Urbani A, Uccelli A, Comprehensive identification of the soluble factors involved in mesenchymal stem cells-mediated neuroprotection utilizing
the SILAC approach, 11th ISNI congress, Boston 4-8 November 2012.
Lovato L, Marzano V, Pieroni L, Urbani A, Uccelli A, Comprehensive identification of the soluble factors involved in mesenchymal stem cells-mediated neuroprotection utilizing the SILAC approach,
XXII AINI congress, Parco degli Aragonesi (Catania), September, 26-29th
Lovato L, Marzano V, Albino S, Vigo T, Pieroni L, Urbani A, Uccelli A, Comprehensive identification of the soluble factors involved in mesenchymal stem cells-mediated neuroprotection utilizing
the SILAC approach, 7th ItPA congress, Viterbo 12-15th June 2012.
..................................................................................................................................................
116
Trattamento epigenetico con il composto ipometilante
5-aza-2-deossicitidina in modelli animali di sclerosi multipla
Katia Mangano
Dipartimento di Scienze Bio-mediche, Università di Catania, Catania
Mentore
Ferdinando Nicoletti
La 5-aza-2-deossicitidina (DAC, decitabina) è un
noto inibitore della metilazione del DNA. È stato recentemente scoperto che questa sostanza e la TrichostatinA sono in grado di modulare l’espressione
di FoxP3 in cellule T naive CD4+/CD25-. Numerose
evidenze sulla encefalite sperimentale autoimmune
(ESA) si basano sull’idea che le cellule T regolatorie
(Treg) effettrici influenzino notevolmente lo sviluppo
della malattia e contribuiscano al naturale recupero
della ESA attivamente indotta. Inoltre, è ormai consolidato che l’accumulo di Treg nel sistema nervoso
centrale (SNC) sia correlato con la fase di recupero.
I processi epigenetici cambiano con l’età e possono
essere modificati da fattori ambientali, fornendo una
possibile spiegazione per il collegamento empirico
osservato tra i fattori ambientali, l’invecchiamento e
lo sviluppo di malattie autoimmuni (MA). A differenza
delle alterazioni genetiche che sono permanenti e si
tramettono attraverso la linea germinale alle nuove
cellule, le alterazioni epigenetiche, anche relative alle
MA, sono reversibili. Le alterazioni epigenetiche riguardano anche le MA organo-specifiche, come il
diabete di tipo 1, la sclerosi multipla (SM), la porpora
trombocitopenica Idiopatica (PTI) o il morbo celiaco.
Lo scopo di questo studio è quello di valutare l’efficacia del DAC nelle diverse forme cliniche (recidivante-remittente, primaria progressiva e secondaria
progressiva) di ESA, per trovare nuove strategie terapeutiche da utilizzare per il trattamento della SM.
RISULTATI
I risultati ottenuti in questo studio mostrano che il
trattamento con DAC alla dose di 0.1 mg/Kg esercita
una elevata protezione sulla ESA indotta dal MOG in
topi C57Bl6, sia in regime profilattico che terapeutico, e gli effetti sono stati mantenuti anche dopo
l’interruzione del trattamento. Nel modello di ESA indotto da PLP nei topi SJL, il trattamento con DAC è
stato in grado di proteggere dallo sviluppo della malattia, sia quando somministrato in terapia precoce
sia quando gli animali mostravano segni di malattia.
Negli studi con MOG è stato osservato un significativo aumento della percentuale di FoxP3+/CD25+ accompagnata da una significativa riduzione di cellule
che producono IL-17A e da una aumentata proliferazione MOG specifica degli splenociti isolati da topi
trattati con DAC. In questi topi è stata anche osservata una significativa riduzione di cellule infiltranti il
midollo spinale rispetto ai veicoli. Nei surnatanti raccolti dallo studio di proliferazione delle cellule isolate
da topi trattati con DAC, sono stati dosati il TNF-alfa
e l’IL-6 ed è stato osservato un significativo aumento
dei livelli di IL-6. Sono stati anche valutati gli effetti del DAC sull’espressione di Rorc, GATA3, Foxp3
e Tbx21 nonché di IFN-gamma, IL-9, IL-10, IL-12,
IL-17, IL-21, IL-27 e TGF-beta nelle cellule mononucleate isolate dai linfonodi dei topi. Un riduzione
significativa del Rorc, e l’aumento di espressione di
Foxp3 è stato accompagnato da una diminuzione
dell’espressione di citochine associate al Th17 quali,
IL-17A e IL-21, nonché dall’aumento della IL-27. Il
trattamento con DAC è stato anche associato ad
una riduzione del 30% nella metilazione del Foxp3
enhancer, suggerendo che l’induzione di Foxp3 nei
topi trattati con DAC può essere dovuta alla ridotta
metilazione del Foxp3 enhancer.
CONCLUSIONI
Questi studi mostrano che il trattamento con DAC,
sia sotto regime profilattico che terapeutico, migliora
il decorso clinico della ESA indotta dal MOG, e che il
farmaco è in grado di proteggere dallo sviluppo della
malattia nei topi SJL. Abbiamo dimostrato che una
parte degli effetti esercitati dal DAC può essere associata al notevole incremento, nelle cellule spleniche,
di Foxp3+/CD25+ e, alla significativa riduzione del
numero di cellule produttrici IL-17A. Inoltre, i livelli
aumentati di IL-6 nei surnatanti di splenociti di topi
trattati con DAC e stimolati ex vivo con MOG, suggeriscono che l’effetto protettivo mediato dal DAC
potrebbe essere in parte attribuito ad una aumentata capacità dei linfociti MOG specifici di secernere
questa citochina. Sulla base degli incoraggianti risultati ottenuti, abbiamo già avviato studi traslazionali
su cellule mononucleate del sangue periferico isolati
da pazienti con diverse forme di sclerosi multipla, al
fine di valutare gli effetti del DAC sulla polarizzazione
delle cellule T e la produzione di citochine.
Poiché, il DAC è un farmaco già utilizzato in clinica
per la sindrome mielodisplastica crediamo che i risultati ottenuti incoraggiano e rendano fattibili studi
di fase II-III con questo farmaco nel contesto della
SM umana.
117
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
Epigenetic interventions with hypomethilating agent 5-aza-2-deoxycytidine
in preclinical models of multiple sclerosis
5-aza-2-deoxycytidine (DAC, decitabine) is a known
DNA methylation inhibitors. It has been recently found
out that this epigenetic modifying agents and TrichostatinA are able to modulate the expression of FoxP3
in naive CD4+/CD25- T cells. Numerous evidences
from experimenal autoimmune encefalomyelitis (EAE)
support the idea that effector Tregs markedly influence the threshold of disease development and contributes to the natural recovery from actively-induced
EAE. Also, it has been established that accumulation
of Tregs in the central nervous system (CNS) precisely
correlated with the recovery phase.
Epigenetic states change with age and can become
disrupted by environmental influences, providing a
possible explanation for the empirical link observed
between environmental factors, aging and the development of autoimmune diseases (AID). Unlike genetic
alterations which are permanent and affect cells when
passed through the germline, AID related epigenetic
modifications are reversible and cell type specific such
as, primarily CD4+ T cells, regulatory T cells (Treg) and
B cells in SLE, lymphocytes and synovial fibroblasts
in RA, lymphocytes and skin fibroblasts in patients
with systemic sclerosis (SSc). Epigenetic alterations
concern also organ-specific AID, like type 1 diabetes,
multiple sclerosis (MS), idiopathic thrombocytopenic
purpura (ITP) or celiac disease.
Aim of this study was to assess the efficacy of DAC
administration in the different clinical forms of EAE (relapse-remitting, primary-progressive and secondaryprogressive) in order to find novel therapeutic strategies to be used for the treatment of MS.
RESULTS
Our results show an impressive protection effects in
the MOG- induced EAE in C57Bl6 mice where the
treatment with DAC at 0.1 mg/kg was effective both
under prophylactic and therapeutic regime and the effects were maintained also after the interruption of the
treatment. In the PLP induce EAE in SJL mice, the
treatment with DAC was able to protect from the disease development when administered under early and
full therapeutic regime. In the MOG studies we observed a significant increase of percentage of FoxP3+/
CD25+ cells accompanied by a significant reduction
of IL-17A producing cells and higher MOG specific
proliferation of splenocites isolated from DAC treated
mice. A strong reduction of spinal cord infiltrating cells
was observed in the DAC treated mice compared to
vehicles in the supernatants collected from the proliferation study of cells isolated from mice receiving
DAC, TNF-alpha and IL-6 were quantified and a significant increase in the levels of IL-6 were observed.
The effects of DAC on the mRNA expression of Rorc,
Gata3, Foxp3 and Tbx21 transcription factors as well
as of IFNgamma, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17, IL-21, IL27 and TGF-beta were also evaluated in mononuclear
cells isolated from lymph nodes of the mice. A significant downregulation of Rorc, and up-regulation of
Foxp3 was observed. This finding was accompanied
by a relative decrease in expression of the Th17-associated cytokines IL-17A and IL-21, as well as by
the upregulation of IL-27.
DAC treatment was associated with a 30% reduction
in the methylation of the Foxp3 enhancer, suggesting
that the induction of Foxp3 in the DAC-treated mice
may be due to decreased Foxp3 enhancer methylation.
CONCLUSIONS
Our data show that the treatment with DAC both under prophylactic and therapeutic regimens ameliorates
the clinical course of MOG-induced EAE, and that the
drug is able to protect SJL mice from development
of disease and to exert disease-modifying properties.
We also demonstrated that DAC effects can be partially due to the significant increase of Foxp3+/CD25+
cells ratio in splenic cells and, significant reduction in
the number of IL-17A-producing cells. Furthermore,
the significantly increased levels of IL-6 detected in
the supernatants of splenocytes from DAC-treated
mice re-stimulated ex vivo with MOG, suggest that the
protective effect mediated by DAC could be partially
ascribed to an enhanced ability of MOG-specific lymphocytes to secrete this cytokine.
The experiments planned in the project were completed and all objectives were achieved. Furthermore,
on the basis of these encouraging results, we have
already initiated translational studies on peripheral
blood mononuclear cells isolated from untreated patients with relapsing remitting, primary progressive
and secondary progressive MS, in order to evaluate
the effects of DAC on T-cell polarization and cytokine
production. Moreover, DAC is a drug already used in
clinic for the myelodisplastic syndrome and we believe
that the present study warrants phase II-III trials in the
context of human MS.
118
TARGETS-PATHWAYS
...................................................................................................................................................
Mangano K, Fagone P, Bendtzen K, Meroni PL, Quattrocchi C, Mammana S, Di Rosa M, Malaguarnera L, Di Marco R, Nicoletti F. Hypomethylating agent 5-aza-2′-deoxycytidine (DAC) ameliorates multiple sclerosis in mouse models. Submitted to Journal of immunology and accepted with major revision.
Borsa di studio finanziata con il Bando 2010 per un periodo di 2 anni e l’ammontare di 48.000 €
..............................................................................................................................................
119
NTZ-HSC: mobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche in
pazienti affetti da sclerosi multipla in terapia con anticorpo monoclonale
anti alfa-4 integrina: rilevanza funzionale e possibili applicazioni
Miriam Mattoscio
Imperial College London, UK
Mentore
Paolo A. Muraro
Il progetto finanziato si proponeva di verificare se l’incremento di cellule staminali ematopoietiche (HSC)
indotto dal natalizumab (Tysabri®) nella circolazione
periferica dei pazienti con sclerosi multipla (SM) fosse
il risultato assoluto della mobilizzazione di tali cellule
dal midollo osseo, o un effetto relativo, conseguente
al blocco della migrazione delle HSC verso tessuti ed
organi target. L’evenienza ipotizzata avrebbe notevole rilevanza scientifica in quanto questa popolazione
staminale sarebbe in grado di differenziarsi e dare vita
a diversi tipi di cellule, in particolare quelle del sistema
immunitario. Per verificare l’ipotesi è stata pianificata
la valutazione tramite citofluorimetria (FACS analisi)
del numero e dello stato del ciclo cellulare delle HSC
circolanti nel sangue periferico di 50 persone con SM
Esacerbante-Remittente in trattamento con natalizumab, (NTZ) nonché la funzionalità di tali cellule in
termini di capacità di proliferazione e differenziazione.
Per la misura dello stato del ciclo cellulare si intendeva
purificare le HSC tramite sorting magnetico della popolazione cellulare positiva per il marker di superficie
CD34.
Lo studio si proponeva, inoltre, di valutare possibili
cambiamenti indotti da NTZ nell’attività del timo eseguendo una enumerazione FACS della popolazione di
nuove cellule immunitarie RTE (Recent Thymic Emigrant) di cellule T CD4 e CD8, che ci si aspetterebbe
aumentata, e tramite studio di marker surrogati della
timopoiesi, in cui si ipotizza un aumento della diversità.
Inoltre si voleva verificare il potenziale riarrangiamento
delle popolazioni T e B cellulari mature, ipotizzando
un incremento della quota di cellule naive e regolatorie
e una diminuzione delle popolazione di cellule di memoria e cosiddette pro-infiammatorie. Per verificare la
capacità delle HSC mobilizzate nella circolazione periferica di promuovere la genesi di nuove cellule T si era
quindi pianificato, nel caso in cui il numero di RTE fosse risultato significativamente aumentato dal trattamento con NTZ, di studiare in dettaglio la diversità del
repertorio T cellulare tramite analisi del recettore delle
cellule T(T Cell Receptor) a livello molecolare (CDR3).
Tutte le misure suddette dovevano essere valutate a
time-point specifici, pre- e post-trattamento con NTZ.
Sulle HSC isolate da persone con SM e da controlli
sani (n+30) si intendeva valutare il potenziale proliferativo, nonché verificare le capacità di espansione e
differenziazione ex-vivo tramite enumerazione delle
unità formanti colonie (CFU).
RISULTATI
Abbiamo valutato la frequenza e lo stato di ciclo cellulare delle HSC circolanti e la proporzione dei diversi
gruppi di cellule immunitarie mature in 29 pazienti con
SM trattati con NTZ (12 seguiti prospetticamente, 17
arruolati come popolazione cross-sectional e studiati
ad un singolo time point durante il trattamento), in 10
pazienti con SM non in trattamento ed in 24 donatori sani, effettuando FACS analisi. Successivamente sono state valutate anche possibili correlazioni tra
mobilizzazione di HSC e risposta clinica al trattamento nonché tra livello di mobilizzazione di HSC e riarrangiamenti nella proporzione dei diversi sottogruppi
di cellule immunitarie B e T mature. Il nostro studio
ha evidenziato un generale aumento del numero di
HSC circolanti indotto da NTZ ma ha anche dimostrato, in modo totalmente innovativo, la presenza di
chiare differenze inter-individuali tra i pazienti trattati
riportando per la prima volta un’ampia distribuzione
della frequenza di HSC circolanti, che è risultata essere indipendente dal numero di infusioni ricevuto.
L’aumento del numero di HSC circolanti è risultato
significativo rispetto ai valori basali solo nella metà
della popolazione prospettica analizzata dopo due infusioni di NTZ. Inoltre, dallo studio di ciclo cellulare, le
HSC circolanti sono risultate essere prevalentemente
in stato quiescente nei pazienti trattati rispetto ai non
trattati; la stessa analisi ha anche dimostrato che la
proporzione di HSC in fase quiescente aumenta in
modo significativo durante il trattamento. Stratificando poi la popolazione di persone con SM in studio, in
base alla risposta di mobilizzazione di HSC, abbiamo
definito “non-mobilizer” quei pazienti in cui la conta
assoluta di HSC circolanti dopo 2 infusioni di NTZ era
risultata inferiore a 2 volte i valori basali.
Abbiamo anche osservato che la proporzione di cellule T CD4 e CD8 totali aumenta transitoriamente nella circolazione periferica dei pazienti trattati con NTZ
durante il primo anno di terapia e che la proporzione
di RTE sia nel compartimento CD4 che CD8 non si
modifica in modo significativo. La proporzione delle
cellule B CD19 + aumenta invece gradualmente ed in
modo persistente così come la percentuale di cellule
T CD8+ CD103+, descritte da diversi studi come re-
120
TARGETS-PATHWAYS
golatorie. In particolare, la proporzione delle cellule B
totali e delle T regolatorie CD103+ CD8+ aumenta in
misura più significativa nei pazienti “mobilizer”, in cui
inoltre la sottopopolazione di cellule B di memoria aumenta in modo preferenziale mentre le cellule B naive
risultano predominanti nei pazienti “non-mobilizer”.
Di particolare interesse è il risultato dello studio che ha
evidenziato come una maggiore attività alla risonanza
magnetica basale e una persistente attività clinica della malattia durante il trattamento (occorrenza di ricadute e attività in risonanza) siano associate allo stato
“non-mobilizer”.
Per valutare in modo più’ approfondito la funzionalità
delle HSC circolanti indotte dal NTZ abbiamo reclutato
nello studio in questione un nuovo gruppo di pazienti con SM, al fine di confermare la risposta variabile
di mobilizzazione di HSC che abbiamo riportato nella
popolazione SM precedentemente analizzata. Abbiamo eseguito conta FACS delle HSC circolanti su tutti
i campioni finora raccolti e ottimizzato il protocollo di
separazione delle stesse tramite magnetic labeling.
Le HSC separate dai campioni dei pazienti con SM in
trattamento con NTZ verranno utilizzate per eseguire
test di unità formante colonie (CFU) che è stato nel
contempo ottimizzato su campioni dei controlli.
CONCLUSIONI
Lo studio dimostra come l’aumento indotto da NTZ
del numero di HSC circolanti, peraltro risultate essere prevalentemente quiescenti, sia la conseguenza
di un vero e proprio processo di mobilizzazione dal
midollo osseo e che tale effetto ha notevole rilevanza funzionale (immunologica e clinica). La risposta
di mobilizzazione varia significativamente tra pazienti
con SM in trattamento con NTZ: la mancata mobilizzazione di HSC è associata al fallimento di risposta al
trattamento mentre l’effettiva mobilizzazione di HSC
correla con un aumento più significativo di linfociti
B circolanti, in particolare di memoria, ed anche di
cellule T regolatorie suggerendo un’implicazione di
tali popolazioni cellulari nell’attività anti-infiammatoria del farmaco. Riguardo la popolazione RTE è ben
noto essa rappresenti una porzione molto piccola
dei linfociti totali in un soggetto non linfo-penico per
cui possibili modifiche numeriche potrebbero essere
risultate troppo piccole per essere rilevate.
Di particolare interesse risulta la dimostrazione, da
parte, dello studio di una specifica redistribuzione
delle popolazioni B naive e di memoria nei due gruppi di pazienti con SM identificati in base alla risposta di mobilizzazione delle HSC: la predominanza
di cellule B di memoria nella coorte mobilizer e di
cellule B naive nella coorte non-mobilizer suggerisce che in quest’ultimo gruppo di pazienti le cellule
B di memoria potrebbero essere ancora in grado di
uscire dalla circolazione periferica e attraversare la
barriera emato-encefalica per accedere al sistema
nervoso centrale, contribuendo potenzialmente alla
persistenza della’ attività di malattia. Se validata nel
corso di ulteriori studi, la conta delle HSC circolanti
potrebbe rappresentare un marcatore biologico precoce della risposta clinica al NTZ.
NTZ-HSC: functional relevance of haematopoietic stem cell mobilisation
following therapeutic alpha 4-integrin blockade in multiple sclerosis
Natalizumab (NTZ), has been shown to induce increase of peripheral hematopoietic stem cells (HSC). This
single-centre, non-interventional, laboratory research
study wanted to address whether such effect is the
result of true mobilization from the bone marrow to the
peripheral blood (PB) or of impaired migration to target
organs and tissues, and whether it has potential functional relevance. To address this question we aimed
to evaluate HSC frequency by FACS (fluorocytometric) enumeration of CD34+ cells on whole PB. Direct
measures of the circulating HSC functionality were
planned to include cell cycle (CC) analysis by FACS
as well as some proliferation assays. All the experiments mentioned above were designed to be performed on magnetically sorted CD34+HSC. To assess
the ability of HSC peripheralization to promote T cell
neogenesis, as an indirect measure of NTZ-mobilised
HSCs functionality, we wanted to look at thymopoiesis, which we also expect to be increased, at T cell
repertoire (expected increased diversity) and at mature T and B cell compartment subpopulations potential rearrangements (possible increase in naive and
regulatory B/T cells population, decrease in memory
and pro-inflammatory subsets). Therefore we wanted
to evaluate surrogate markers of thymopoiesis and
mature T/B cell compartments immunophenotype at
pre- and post-treatment time points by FACS enumeration of CD4 and CD8 Recent Thymic Emigrant
(RTEs), naive/memory T and B cells, pro-inflammatory T- and regulatory B-cells. We also originally planned to eventually measure the T cell repertoire diver-
121
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
sity by analysis of the TCR at molecular level utilising
CDR3 spectratyping, in the case RTEs proportion
were found to be significantly increased during NTZ.
Moreover, we thought to measure ex vivo expansion
and clonogenicity of the sortesd natalizumab-induced
circulating HSC performing CFU assays on coltured
mono-nuclear cells isolated from PB by gradient separation, expecting evidence of fully functional differentiation capacity.
The study aimed at enrolling 50 subjects with RRMS
undertaking treatment with NTZ at Charing Cross Hospital who meet inclusion/exclusion criteria and 30 healthy controls.
In clinical practice, functional improvements of disability in MS patients after treatment with NTZ have been
observed, sometime beyond what would be expected
from immune modulation only. This study aimed at
exploring the biological mechanisms underlying these
observations.
CD103+CD8 regulatory T cells proportions increase more significantly in “Mobilizer” patients who
also showed a preferential increase of the B memory subset whereas B naive cells are predominant
in Non-Mobilizer subjects. Of particular interest,
higher MRI and clinical disease activity during treatment was found to be associated with Non-Mobilizer status.
To further assess the functional capacity of the
NTZ-induced circulating HSC, we have been more
recently recruiting new MS patients who were started on NTZ treatment, aiming to confirm the variable HSC mobilization response which we reported
among the MS population analyzed previously. We
have performed HSC enumeration on all the collected MS patients samples as well as HSC sorting
by magnetic labeling technique. The HSC sorted
samples will be used to perform Colony Forming
Units assay that has been set up on HD.
RESULTS
CONCLUSIONS
We evaluated circulating HSC frequency, CC status and immune cell-subsets by FACS in 29 NTZtreated MS patients (12 prospectively-followed, 17
cross-sectional), 10 untreated MS patients and 24
healthy donors (HD). We also enumerated by FACS
mature T and B lymphocytes populations and CD4/
CD8 RTEs. Possible correlations between HSC-mobilization status and both anti-inflammatory response to treatment and changes in immune cell-subsets
were then assessed.
We showed a NTZ-induced increase of circulating HSC also describing, for the first time to our
knowledge, clear inter-individual differences among
treated patients. Indeed we reported a wide distribution of circulating CD34+HSC frequency regardless
the number of infusion received in the cross-sectional group of patients. Moreover we showed that peripheral HSC increase in only half of our prospective
population after two NTZ infusions compared to baseline. Notably, HSC were predominantly quiescent
in NTZ-treated patients compared to the untreated
ones and the proportion of quiescent HSC was
found to increase significantly during the treatment.
According to the HSC mobilization response we
then decided to call “Non-Mobilizer” those patients
whom circulating HSC absolute count increased
less than 2-fold after 2 NTZ infusions compared to
baseline.
We also observed that CD4 and CD8 T cells proportion increases transiently during the first year of
NTZ in the total treated population and that within
this compartment, RTE do not significantly vary in
proportion. Very interestingly, CD19+B cells proportion gradually but persistently increases as well as
the proportion of CD103+CD8 T cells, described by
several studies as regulatory. Notably, B cells and the
These data provide evidence that NTZ-induced increase of circulating HSC, also proven to be predominantly quiescent, is the result of true mobilization
from the BM and it has functional (immunological
and clinical) relevance. There are widely different
HSC-mobilization responses among NTZ-treated
patients; also HSC-mobilization failure is associated
with lack of treatment response while HSC-mobilization correlates with a more significant increase in
circulating B cells and CD8 T regulatory cells than in
all other lymphocyte subsets suggesting an implication in the anti-inflammatory effect of the drug. On
the other hand the RTE population, that we haven’t
found to increase significantly during NTZ treatment,
has a very small proportion in a non-lymphopenic
host and potential changes might have been too
small to detect.
Very interestingly we demonstrate a specific profile
of naive/memory phenotype redistribution in accordance to the HSC-mobilization response showing a
predominance of early memory B cells in the Mobilizer cohort and of naive B cells in the Non-Mobilizer
cohort, suggesting that memory B cells might still
able to exit the blood stream and cross the bloodbrain barrier to access the CNS in the latter patient
group, potentially contributing to persistence of disease activity.
If validated in further studies, HSC-mobilization
could represent an early biomarker of clinical response to NTZ.
122
TARGETS-PATHWAYS
...................................................................................................................................................
Mattoscio M, Nicholas R, Malik O, Dazzi F and Muraro P. Hematopoietic stem cell mobilization and re-arrangement of immune cell subsets following therapeutic alpha 4-integrin blockade in
multiple sclerosis: prospective study and preliminary clinical correlation.
63rd Annual Meeting of the American Academy of Neurology, April 2011 (oral presentation). The fellowship recipient has been awarded with the 2011 International Scholarship Award.
Mattoscio M, Nicholas R, Malik O, Lee J, Waldman A, Dazzi F and. Muraro P. Differential increase of circulating hematopoietic stem cells (HSC) following therapeutic alpha 4-integrin
blockade in multiple sclerosis: correlation between HSC mobilization status and response to treatment.
Multiple Sclerosis, October 2011, Vol. 17 No. 10 Suppl S53-S276; Immunomodulation 1; P453. Abstract has been selected for poster presentation at ECTRIMS Conference, October
2011.
Mattoscio M, Nicholas R, Malik O, Lee J, Waldman A, Dazzi F and. Muraro P. Differential Increase of Circulating hematopoietic stem cells (HSC) Following Therapeutic alpha 4-Integrin
Blockade in Multiple Sclerosis: updated on correlation between HSC Mobilization Status and Response to Treatment(IN8-1.006)
Neurology April 22, 2012 78:IN8-1.006. Abstract has been selected for dual presentation, poster and Stem CellsIntegrated Neuroscience Session, at the 64th Annual Meeting of the
American Academy of Neurology, April 2012.
Mattoscio M, Nicholas R, Malik O, Lee J, Waldman A, Dazzi F and. Muraro P. Hematopoietic stem cell increase and response to natalizumab in patients with multiple sclerosis.
Submitted for pubblication
..............................................................................................................................................
123
Valutazione degli effetti protettivi degli steroidi neuroattivi nel modello
della encefalomielite autoimmune sperimentale
Roberto Cosimo Melcangi
Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari, Università degli Studi di Milano, Milano
Collaboratori
Silvia Giatti, Marzia Pesaresi, Donato Calabrese, Donatella Caruso, Federico Abbiati, Barbara Viviani,
Maria Serena Boraso
Guido Cavaletti, Dipartimento Neuroscienze e Tecnologie Biomediche Università degli Studi di Milano-Bicocca, Milano
Studi condotti su pazienti con sclerosi multipla (SM)
o in modelli animali di encefalomielite sperimentale
autoimmune (ESA) hanno dimostrato la possibile efficacia del trattamento con steroidi. Ciononostante, i
risultati fino ad ora ottenuti si sono rivelati contrastanti;
infatti, a seconda della sperimentazione il trattamento con progesterone (PROG) o testosterone (T) si è
rivelato efficace, inefficace o addirittura peggiorativo
della sintomatologia. Fisiologicamente, nel sistema
nervoso centrale (SNC), queste molecole possono
essere ulteriormente convertite in metaboliti più attivi,
i quali possono esercitare il loro effetto con un differente meccanismo d’azione rispetto ai loro precursori. Infatti, il SNC non è solo un organo bersaglio per
ormoni sessuali prodotti in periferia, ma viene anche
controllato dagli steroidi neuroattivi, una classe di
composti steroidei sintetizzati o metabolizzati direttamente nel SNC che esplicano effetti trofici e protettivi. Recentemente, nel nostro laboratorio abbiamo
osservato come il metabolismo di questi composti sia
sessualmente dimorfico nel SNC di animali indotti con
ESA. Infatti, i livelli di tetraidroprogesterone (THP) e
3alfa-diolo (due metaboliti di PROG e T) sono modificati nel midollo spinale di ratti ESA maschi rispetto
alle femmine. Sulla base delle differenze nell’impatto,
progressione e severità della patologia, osservate nei
due sessi, tale osservazione potrebbe essere di estrema rilevanza in quanto permetterebbe di individuare
delle terapie sesso-specifiche basate sugli steroidi
neuroattivi.
Ipotizziamo quindi che, nel modello sperimentale
ESA, il trattamento con THP o 3alfa-diolo possa risultare più efficace del trattamento con i suoi precursori. Un’ulteriore strategia terapeutica potrebbe essere
quella di aumentare i livelli di tali molecole direttamente nel SNC, evitando così effetti collaterali associati al
trattamento sistemico con ormoni. Questo obiettivo
potrebbe essere raggiunto con la somministrazione di
un ligando del traslocatore proteico da 18kDa, TSPO,
per il quale è stata dimostrata in altri modelli l’efficacia
nell’induzione della steroidogenesi.
Gli obiettivi del progetto da noi originariamente propo-
sto erano quindi quelli di valutare, durante la fase acuta (cioè dopo 14 giorni dall’induzione) e cronica (cioè
dopo 45 giorni dall’induzione) della patologia, i livelli
degli steroidi neuroattivi, insieme ad una serie di parametri funzionali, immunologici e molecolari. I dati ottenuti sarebbero stati necessari per la caratterizzazione
dell’evoluzione dei meccanismi coinvolti nella progressione della patologia nelle sue diverse fasi. Inoltre, avrebbero anche rappresentato una base per la
valutazione successiva dei potenziali effetti terapeutici
dei trattamenti con steroidi neuroattivi. In particolare,
gli effetti del trattamento con THP, 3alfa-diolo e Ro54864 (un ligando di TSPO) sarebbero stati analizzati
in ratti ESA e comparati con quelli osservati a seguito
del trattamento con PROG o T.
RISULTATI
Originariamente il nostro progetto era articolato su due
anni, ma essendo stato finanziato solo per un anno,
come progetto pilota, si è reso necessario rimodulare il
piano sperimentale. La sperimentazione è stata perciò
suddivisa in due parti. Nella prima (ovvero nei primi sei
mesi di progetto), l’ESA è stata indotta attivamente attraverso inoculazione sottocutanea di un omogenato di
midollo spinale in adiuvante incompleto di Freund in ratti
maschi Dark Agouti. In questa parte sono stati valutati,
in fase acuta e cronica, i livelli degli steroidi neuroattivi, il
numero di cellule MHC-II positive, l’infiltrazione di cellule
infiammatorie, e parametri molecolari e funzionali, come
l’espressione genica di citochine infiammatorie, della
proteina basica della mielina (MBP), di quella proteolipidica (PLP) e l’attività della pompa Na+, K+-ATPasica.
Durante i successivi sei mesi dei progetto, ratti maschi
ESA sono stati trattati con il solo veicolo o con PROG
e ci siamo focalizzati sulla fase cronica della patologia,
stimando il possibile effetto protettivo della somministrazione dello steroide. Il razionale di questa scelta era
basato sul fatto che fino ad ora gli effetti di questo steroide neuroattivo erano stati valutati nella fase acuta della
patologia. I dati ottenuti 45 giorni dopo l’induzione della
patologia hanno mostrato un effetto protettivo del trattamento con PROG sul punteggio neurologico, confermato successivamente dalle analisi di danno effettua-
124
TARGETS-PATHWAYS
te sul midollo spinale degli animali, e cioè la reattività
microgliale, i livelli di citochine, l’espressione di MBP
e l’attività della pompa Na+, K+-ATPasica. Inoltre, nel
midollo spinale degli animali ESA trattati con PROG,
i livelli di diidroprogesterone e isopregnanolone, due
metaboliti del PROG, sono risultati significativamente
aumentati rispetto al trattamento col solo veicolo.
CONCLUSIONI
Nel loro insieme, questi dati indicano quindi che il PROG
è in grado di ridurre la severità dell’ESA in fase cronica
e perciò potrebbe rappresentare un possibile punto di
partenza nello sviluppo di terapie per la sclerosi multipla.
Evaluation of the protective effects of neuroactive steroids
in experimental autoimmune encephalomyelitis model
Protective effects of sex steroid hormones have been
evaluated in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and in human multiple sclerosis (MS).
The efficacy of these molecules is promising but in
some cases shows also discordant results. Indeed,
depending on the studies, the therapy with progesterone (PROG) or testosterone (T) could be effective, ineffective or causing a worsening of symptoms.
However physiologically, in the central nervous system (CNS), PROG and T may be further converted
in metabolites that are more active and in some cases
utilize a different mechanism of action in relation to their
parental compound. Moreover, CNS is not only a target
for sex steroid hormones release by peripheral steroidogenic tissues, but it is also controlled in a paracrine/
autocrine manner by neuroactive steroids (i.e., steroids
directly synthesized or metabolized in CNS) and that can
exert trophic and protective effects. Recently, we have
observed that steroid metabolism is affected in a sex dimorphic manner in the CNS of EAE animals. Thus, the
levels of tetrahydroprogesterone (THP) and 3alpha-diol
(i.e., two metabolites of PROG and T), are significantly
modified in male but not in female spinal cord (SC). That
could be extremely important because of the impact,
progression and severity of the MS is different in the two
sexes and consequently these results may suggest the
possibility to design a sex-specific therapy based on
neuroactive steroids.
For these reasons we hypothesize that the direct treatment in male animals with THP and 3alpha-diol may
improve the efficacy of the protective effects of neuroactive steroids so far observed. Another interesting therapeutic strategy could be to increase the levels of neuroactive steroids directly in the CNS, avoiding endocrine
side effects possibly due to the systemic administration
of hormones. With this perspective, ligands of translocator protein of 18kDa, TSPO, which have been already
demonstrated to be able to induce steroidogenesis, may
represent a relevant therapeutic option.
The specific aims for this project were to evaluate during
the acute (i.e., 14 day post induction) and chronic (i.e.,
45 day post induction) phase of the disease the neuroactive steroid levels, within functional, immunological
and molecular parameters. Data obtained would be instrumental for characterizing the concomitant evolution
of different pathways related to the progression of the
disease along its different phases. They also represented an important background to successively evaluate
the potential therapeutic effects of neuroactive steroid
treatments. In particular, the effects of THP, 3alpha-diol
or Ro5-4864 (i.e., a TSPO ligand) treatment would be
analyzed in EAE animals and compared to what observed in case of treatments with PROG or T.
RESULTS
Our original project was planned on two years but
granted by FISM like an one year project. Therefore, we have been forced to reduce our experimental
planning and, in particular, the number of treatments.
Indeed, we planned two series of experiments. During the first part (first six months of this project), EAE
was induced by hind footpads subcutaneous inoculation of 100 mg of myelin homogenate suspended
in incomplete Freund’s adjuvant in male Dark Agouti rats. We applied a multimodal analysis evaluating,
in the acute and chronic phase of the disease, the
neuroactive steroid levels, number of MHC-II-positive
cells, the infiltration of inflammatory cells, molecular
and functional parameters, such as cytokines, myelin basic protein (MBP) and proteolipid protein (PLP)
gene expression as well as Na+, K+-ATPase pump
activity. During the last six month of the project, EAE
rats were treated with vehicle or PROG, and we focus our attention on the chronic phase, evaluating the
possible protective effects of steroid administration.
Data obtained 45 days after EAE induction show that
PROG treatment exerts a beneficial effect on clinical
125
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
score confirming by surrogate parameters on spinal
cord damage in chronic EAE (i.e., reactive microglia,
cytokine levels, activity of Na+, K+-ATPase pump and
myelin basic protein expression). Increased levels of
dihydroprogesterone and isopregnanolone (i.e., two
PROG metabolites) were also observed in SC after
PROG treatment.
CONCLUSIONS
Altogether these results indicate that PROG is effective in reducing the severity of chronic EAE and subsequently may represent a potential basis for candidate
for MS treatment.
...................................................................................................................................................
Pubblicazioni
Melcangi RC, Panzica G, Garcia-Segura LM. Neuroactive steroids: focus on human brain. Neuroscience 191:1-5, 2011
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Massella A, D’Intino G, Fernandez M, Sivilia S, Lorenzini L, Giatti S, Melcangi RC, Calza L, Giardino L. Gender effect on neurodegeneration and myelin markers in an animal model for multiple
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and chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Neuroimmune Pharmacol 2012, Jun 30. Doi 10.1007/s11481-012-9385-9
..................................................................................................................................................
126
FK866 e fluridone: nuovi agenti immunosoppressivi
e anti-infiammatori per la sclerosi multipla?
Alessio Nencioni
Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, Università di Genova, Genova
Collaboratori
Denise Lasigliè, Debora Soncini, Irene Caffa, Inga Bauer, Santina Bruzzone, Mirko Magnone,
Laura Sturla, Elena Zocchi
Antonio Uccelli, Sara Morando, DINOG, Università di Genova
Questo progetto ha mirato alla valutazione del ruolo
del NAD, in particolare dei due enzimi NAD+ dipendenti, Sirt6 e CD38, nella risposta immunitaria che
media la sclerosi multipla (SM). Questo obiettivo è
stato perseguito tramite l’uso di topi CD38-/- e
Sirt6-/- ottenuti rispettivamente dalla dottoressa
Frances Lund (University of Rochester, Rochester,
NY), e dal dottor Raul Mostoslavsky (MGH Cancer
Center, Boston, MA USA). L’intento è stato quello di
caratterizzare questi animali dal punto di vista immunologico e di usarli successivamente in esperimenti di
encefalite sperimentale autoimmune, ESA.
In aggiunta, il progetto ha mirato a investigare i meccanismi attraverso cui queste due proteine (CD38 e
Sirt6) influenzano l’attività delle cellule del sistema immunitario al fine di permettere uno sfruttamento razionale di questi target nel trattamento della sclerosi
multipla.
Inizialmente il progetto prevedeva anche di studiare il
ruolo di nuovi agenti immunosoppressivi e anti-infiammatori come FK866 e fluoridone nella SM, ma, seguendo le indicazioni del Comitato Scientifico, dopo
rimodulazione a progetto pilota, ci siamo focalizzati
solo sugli obiettivi qui descritti.
RISULTATI
I topi CD38-/- e Sirt6-/- sono stati ottenuti, genotipizzati e le rispettive colonie sono state generate e
mantenute. Gli esperimenti di ESA con topi CD38-/hanno dimostrato un ritardo nella comparsa della
malattia rispetto agli animali controllo. Questi ritrovamenti sono ora nella fase di essere approfonditi dal punto di vista del sottostante meccanismo
immunologico. Esperimenti in vitro condotti dalla
dottoressa Bruzzone e dal suo gruppo (unità Prof.
Zocchi) hanno valutato il ruolo del CD38 e del NAD+
intracellulare nelle risposte mediate dal Ca2+ (Magnone M at al. J Biol Chem. 2012;287:21067-81).
Gli esperimenti di ESA in topi Sirt6-/- sono stati
resi impossibili dal fatto che questi animali muoiono spontaneamente poco dopo lo svezzamento.
Comunque, questi animali sono andati incontro ad
una estensiva caratterizzazione dal punto di vista
immunologico che ha permesso di confermare una
ridotta produzione di citochine (TNF, Cxcl1, Cxcl2)
da parte di cellule immunitarie Sirt6-deficienti.
Inoltre, un probabile ruolo per Sirt6 nell’omeostasi
dei linfociti B è anche emerso come sottolineato
da una significativa carenza di cellule B220+ nella
milza di topi Sirt6-/-.
Anche questi ritrovamenti sono tuttora oggetto di
ulteriori valutazioni.
Infine, in collaborazione con il dottor Alberto Del
Rio (Università di Bologna) sono stati identificati
inibitori di Sirt6 potenti e specifici che riducono la
produzione di TNF in cellule umane.
CONCLUSIONI
Gli studi effettuati suggeriscono un ruolo per il NAD+ intracellulare e per il CD38 nella cascate del segnale che controllano l’attivazione dei linfociti T. Un
ruolo per Sirt6 nella risposta immunitaria appare
probabile, anche se il suo valore come target nel
trattamento della sclerosi multipla richiede ulteriori
conferme.
A questo fine, gli inibitori di Sirt6 sviluppati nel corso dello studio appaiono come uno strumento di
grande valore e utilità per questo tipo di valutazioni. Nel complesso, il progetto ha raggiunto i suoi
obiettivi e applicazioni cliniche per il trattamento
della sclerosi multipla sono prevedibili, specialmente una volta che inibitori di CD38 e di Sirt6 per
uso clinico saranno stati identificati e validati.
127
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
FK866 and fluridone: new NAD+-related immunosuppressive
and anti-inflammatory therapeutics in MS?
This project aimed to the evaluation of the role of
NAD+, namely of the NAD+-dependent enzymes Sirt6
and CD38 in the immune response that leads to multiple sclerosis. This goal was pursued through the use of
CD38-/- and Sirt6-/- mice which have been obtained
from Dr. Frances Lund (University of Rochester, Rochester, NY), and Dr. Raul Mostoslavsky (MGH Cancer
Center, Boston, MA USA), respectively. CD38-/- and
Sirt6-/- mice, as well as their wild type controls, should
be characterized from an immunological viewpoint and
subsequently used in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) experiments.
In addition, the mechanism by which these two NAD+dependent enzymes affect immune cell function should
be investigated in human and in mouse cells. This type
of investigations were meant to allow to assess the
potential of CD38 and of Sirt6 as targets for the treatment of multiple sclerosis. Initially, one of the aim of
the project was to study the role of new immunosuppressive agents and anti-inflammatory drugs such as
FK866 and fluoridone in MS, but, following the indications of the Scientific Committee for a pilot project, we
focused only on the aims described herein.
RESULTS
CD38-/- and Sirt6-/- mice were obtained, genotyped
and mouse colonies were established and maintained.
EAE experiments were performed with CD38-/- mice vs.
wild type animals showing a slight delay in EAE onset
in CD38 mice (ongoing experiments aim to assess the
underlying mechanism for this effect). In vitro experi-
ments conducted by Dr. Bruzzone and colleagues (from
the Prof. Zocchi Unit) have also assessed CD38 role in
Ca2+-dependent responses in human T cells.
EAE experiments with Sirt6-/- mice were prevented by
the spontaneous death of these animals which typically
occurs after weaning. However, these mice underwent
extensive immunological phenotyping and a role for
Sirt6 in the promotion of cytokine secretion (TNF, Cxcl1,
Cxcl2) by mouse CD4+ T cell could be confirmed (Bauer
I, et al. J Biol Chem. 2012;287:40924-37). A role for
Sirt6 in B cell homeostasis also appears likely based on
the studies that were conducted since a significant reduction in spleen B220+ cells in Sirt6KO mice could be
documented. Also these findings are now in the process
of being further developed.
Finally, in collaboration with Dr. Alberto Del Rio (Department of Experimental Pathology) several Sirt6 inhibitors with considerable specificity (the most active leads
have IC50 values in the low-micromolar range) that were
found to reduce TNF production.
CONCLUSIONS
These findings suggest a role for intracellular NAD+ and
for CD38 in activatory signaling cascades in T cells. A
role for Sirt6 in immunity seems likely, although its potential as a therapeutic target needs confirmation. The Sirt6
inhibitors that have been developed during the project
appear as a viable tool for this type of assessments.
Overall, the project goals have been achieved and clinical applications for the treatment of multiple sclerosis are
envisaged, especially upon identification and validation
of Sirt6 and CD38 inhibitors for clinical use.
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Magnone M, Bauer I, Poggi A, Mannino E, Sturla L, Brini M, Zocchi E, De Flora A, Nencioni A, Bruzzone S. J Biol Chem. 2012;287:21067-81
Bauer I, Grozio A, Lasigliè D, Basile G, Sturla L, Magnone M, Sociali G, Soncini D, Caffa I, Poggi A, Zoppoli G, Cea M, Feldmann G, Mostoslavsky R, Ballestrero A, Patrone F, Bruzzone S, Nencioni
A. J Biol Chem. 2012;287:40924-37
Lasigliè D, Morando S, Bauer I, Bruzzone S, Poggi A, Patrone F, Ballestrero A, Mostoslavsky C, Uccelli A, Nencioni A. Catastrophic NAD + depletion in activated T lymphocytes through NAMPT
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Lasigliè D, Morando S, Bauer I, Bruzzone S, Poggi A, Patrone F Ballestrero A Mostoslavsky C, Uccelli A, Nencioni A. NAD+-dependent histone deacetylase SIRT6 regulates immune cell function
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Nencioni A, NAD+biosynthesis inhibitors: applications in cancer treatment and inflammatory disorders”. Opening conference of University of Trento’s CIBIO 2011”, seminar.
Nencioni A, Pharmacological inhibition of nicotinamide phosphoribosyl-transferase (Nampt) reduces neutrophilmediated injury in a mouse model of myocardial ischemia/reperfusion, FASEB
Summer Conference NAD metabolism & signaling, Lucca Italy 2011
Nencioni A, NAD+ biosynthesis inhibitors: applications in cancer treatment and inflammatory disorders. Department Pharmazie, Zentrum für Pharmaforschung, Ludwig-Maximilians-Universität
München, Germania, 2011.Seminar
128
Potenziali terapeutici di antagonisti del recettore istaminergico
H4 nel trattamento di neuropatologie autoimmuni
Maria Beatrice Passani
Dipartimento NEUROFARBA, Sezione Farmacologia e Tossicologia, Università di Firenze, Firenze
Collaboratori
Clara Ballerini, Alessandra Aldinucci, Emanuela Masini, Patrizio Blandina
Paul L Chazot, School of Biological and Biomedical Sciences Durham University, UK
L’attività allergica, le reazioni infiammatorie e l’autoimmunità possono avere effettori comuni. Negli ultimi anni è
stato dimostrato che sia l’istamina che i recettori istaminergici possono costituire un bersaglio per approcci terapeutici anche in patologie autoimmuni come la sclerosi
multipla.
Per esempio, l’azione farmacologica specifica sul recettore istaminergico H1 determina un miglioramento della
encefalomielite sperimentale allergica, ESA, modello animale per la sclerosi multipla.
Fra i recettori istaminergici il più recente ad essere stato
clonato e caratterizzato è il recettore H4, che è espresso
principalmente nelle cellule coinvolte nelle risposte immunitaria ed infiammatoria e su cellule del sistema nervoso periferico e centrale. Quindi, la funzione molteplice
di questo recettore può essere associata a patologie di
origine immune e autoimmune. Infatti, osservazioni precliniche indicano una potenziale efficacia di antagonisti
di questo recettore nel trattamento di malattie allergiche
ed autoimmuni quali l’asma, la dermatite atopica ed il
morbo di Sjögren. Per questo la comunità scientifica e
le industrie farmaceutiche stanno dimostrando grande interesse per i potenziali terapeutici di antagonisti H4 per il trattamento dell’asma e del prurito, nonostante non sia ancora
ben chiaro il meccanismo d’azione del recettore H4.
Nel nostro progetto ci siamo proposti di verificare il ruolo del recettore H4 sullo sviluppo e sulla progressione
dell’ESA utilizzando un farmaco antagonista selettivo, il
JNJ7777120 che è in fase di studio clinico.
RISULTATI
Le nostre recenti osservazioni hanno dimostrano un
inaspettato peggioramento del decorso e dei segni
immunopatologici dell’ESA in seguito alla somministrazione giornaliera per 10 giorni dell’antagonista
selettivo del recettore H4, JNJ7777120, in topi affetti
da ESA. Infatti, abbiamo osservato aumentati segni
d’infiammazione e demielinizzazione nel midollo di
animali affetti da ESA e trattati con JNJ7777120 rispetto ai controlli, insieme all’aumentata produzione
di citochine pro-infiammatorie e diminuita produzione
di fattori antiinfiammatori.
CONCLUSIONI
In conclusione, i nostri dati hanno dimostrato che il
blocco dei recettori istaminergici H4, che in altre patologie infiammatorie come l’asma comporta un miglioramento della patologia, peggiora il quadro di una
malattia autoimmune come la ESA. Riteniamo che
con i nostri esperimenti abbiamo contribuito ad approfondire le conoscenze dei meccanismi complessi
ed eterogenei che la determinano. Inoltre, è nostra
opinione che lo studio di un ampio spettro di fattori
coinvolti nella patogenesi della sclerosi multipla possa contribuire a capire i potenziali benefici clinici e a
predire possibili effetti indesiderati degli antagonisti
H4 nel trattamento di malattie autoimmuni e infiammatorie.
The histaminergic H4 receptor as a novel therapeutic target
for the treatment of autoimmune neuropathologies
The recent discovery of histamine H4 receptors (H4R)
expressed mainly on immune and inflammatory cells
suggested a new potential for H4R antagonists in tre-
ating allergy and autoimmune diseases. Preclinical
studies though, are revealing intriguing and at times
unexpected effects of H4R activation or blockade, depending on the parameters of the immune response
129
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
that are being analysed. Despite the uncertainties regarding the mechanisms of action, the scientific community
is displaying great excitement for the therapeutic potentials of H4R antagonists for the treatment of asthma and
refractory inflammation. Therefore, we believed that exploring a full range of parameters in experimental allergic
encephalomyelitis (EAE), using antagonists of the H4R
will help to anticipate clinical benefits and predict possible detrimental effects in the treatment of autoimmune
and inflammatory diseases. Clinical studies are currently
ongoing to validate the effect of H4R antagonists as antipruritic and anti-asthmatic treatment is expected to be
available in the near future
RESULTS
The results we obtained indicate clearly that treatment
of EAE mice with JNJ7777120 a selective H4R antagonist worsens the severity of the disease. We described a full range of physiopathological and immu-
nological parameters characteristic of EAE which are
affected by the chronic treatment with the H4 receptor
antagonist using the funds made available by AISM.
CONCLUSIONS
With our study we explored new pathogenic mechanisms of EAE related to the activation of the histamine H4R. We demonstrated that blocking the H4R
has detrimental effects on EAE. As often the case,
translation of preclinical results to the clinics is not
foreseeable in the immediate future. MS is not fully
reproduced in EAE, but our studies will hopefully indicate the utility of H4R ligands in the treatment of
multiple sclerosis. Indeed, given the interest in the development of H4R antagonists as anti-inflammatory,
anti-asthma and anti-pruritus compounds, it is important to understand the role of the H4R in immune diseases to anticipate clinical benefits and also predict
possible detrimental effects.
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Ballerini C, Aldinucci A, Luccarini I, Galant A, Manuelli C, Blandina P, Katebe M, Chazot PL, Masini E and Passani MB. Antagonism of histamine H4 receptor exacerbates clinical and pathological
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Passani MB, Ballerini C Histamine and neuroinflammation: insights from murine experimental autoimmune encephalomyelitis. Front. Syst. Neurosci (2012) 6:32
Passani MB. H4R and neuroinflammation: insights from mouse experimental autoimmune encephalomyelitis (Plenary Lecture). 42st Annual Meeting of the European Histamine Research Society,
Belfast (UK), 5-9 May 2012
Passani MB, Aldinucci A, Masini E, Blandina P, Bani D, Chazot PL, Ballerini C. Antagonism of the histaminergic H4 receptor exacerbates clinical and pathological signs of EAE. 41st Annual
Meeting of the Society for Neuroscience, Washington (USA), 15-19 November 2011
Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2010 per il periodo di 1anno e l’ammontare di 20.000 €
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130
MyD88: un nuovo bersaglio molecolare per la terapia
della sclerosi multipla
Claudio Sette
Laboratorio di Neuroembriologia, Fondazione Santa Lucia, Roma
Collaboratori
Maria Loiarro, Elisabetta Volpe, Mario Picozza
Giuseppe Matarese, Istituto di Endocrinologia e Oncologia Sperimentale, Consiglio Nazionale delle Ricerche,
Napoli
La sclerosi multipla (SM) è una patologia neurologica
che coinvolge l’infiammazione e la neurodegenerazione.
I sintomi sono causati da focolai infiammatori che promuovono una reazione autoimmunitaria contro la proteina basica della mielina presente sull’assone. Questa
risposta infiammatoria coinvolge sia l’immunità innata
che acquisita, ed è amplificata dalla comunicazione tra
le cellule coinvolte in queste due risposte. È stato recentemente dimostrato che la proteina MyD88 svolge un
ruolo essenziale per la risposta infiammatoria in modelli
animali di SM. MyD88 è un regolatore chiave della risposta infiammatoria sia innata che acquisita, grazie al suo
ruolo di trasduttore dei segnali attivati dalle famiglie dei
recettori Toll (TLR) e dei recettori per la Interleuchina 1 (IL1R). Quindi, è altamente probabile che farmaci in grado
di bloccare la funzione di MyD88 avranno un effetto sulla
progressione dei sintomi della SM. Questo progetto si
prefigge di identificare le regioni critiche di MyD88 necessarie per la sua funzione e di sviluppare molecole che
possano selettivamente bloccare l’interazione di MyD88
con i recettori TLR/IL-1R o con le proteine di segnale a
valle, le quali potrebbero essere espresse o funzionanti
in modo aberrante nelle cellule con rilevanza per la SM.
RISULTATI
L’unità di ricerca 1 (Prof. Sette) ha svolto un’analisi
struttura-funzione del dominio TIR di MyD88 mediante
mutagenesi sito-specifica. Questo studio ha consentito di identificare alcune nuove parti della proteina che
sono essenziali per la sua funzione. Abbiamo poi utilizzato queste informazioni per produrre delle mini-proteine “decoy” di MyD88 che possano competere con
la proteina endogena nella cellula. L’espressione di
queste proteine in cellule sperimentali ha confermato
la loro capacità di interferire con le funzioni di MyD88.
In particolare, abbiamo mostrato che l’espressione di
due di queste proteine interferisce con la risposta infiammatoria mediata dall’attivazione di TLR2 e TLR4
nella linea cellulare promonocitaria THP1. Questi risultati identificano una nuova regione all’interno del
dominio TIR di MyD88 che è cruciale per la sua attività e suggeriscono che questa regione possa essere
utilizzata come stampo per la produzione di piccole
molecole inibitorie per il segnale della via TLR/MyD88
da testare nel contesto della SM.
Abbiamo anche studiato il coinvolgimento delle risposte mediate dai recettori TLR e da MyD88 nelle cellule
presentanti l’antigene (APC) ottenute da pazienti SM.
L’espressione di MyD88 e dei TLR è stata analizzata
in sottopopolazioni APC nelle PBMC di pazienti SM
e queste cellule sono state caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente rispetto a quelle ottenute da
donatori sani (HD). Abbiamo riscontrato che le cellule dendritiche mieloidi (mDCs) sono aumentate nella
fase acuta di SM, mentre la frequenza delle cellule
dendritiche plasmacitoidi (pDCs) è diminuita nella fase
stabile di SM rispetto agli HD. Tuttavia, non abbiamo
osservato differenze nella espressione di MyD88 e dei
TLR tra HD e pazienti SM. Inoltre, abbiamo osservato che la polarizzazione delle cellule Th mediate dalle
DC è paragonabile nei pazienti SM e gli HD e che
le mDC stimolano una risposta Th17, mentre le pDC
promuovono risposte Th1 e Treg. Dato il noto ruolo
patologico delle cellule Th17 nella SM, abbiamo deciso di utilizzare le mDC come bersaglio per modulare
la risposta infiammatoria nella SM con le mini-proteine MyD88 “decoy” descritte sopra. L’espressione di
queste proteine inibitorie di MyD88 nelle mDC è stata
capace di ridurre la frequenza di cellule che producono IL-1b e TNF-a in risposta alla stimolazione con
agonisti di TLR4 e TLR7/8. Questi risultati confermano la potente azione delle proteine inibitorie di MyD88
in cellule con una rilevanza diretta per la SM.
La ricerca della Unità 2 (Dott. Matarese) si è focalizzata sui recenti collegamenti osservati tra l’espressione
dell’ormone adipocitario leptina, lo stato nutrizionale,
il tessuto adiposo e le risposte autoimmuni. Questi
studi hanno mostrato che questi processi regolano la
sopravvivenza e la proliferazione delle cellule autoreattive ed effettrici T CD4+ nel contesto dell’encefalomielite sperimentale autoimmune (ESA). In particolare, è stato dimostrato che l’espressione della leptina è
necessaria per consentire alle cellule T CD4+ attivate
di indurre la ESA quando vengono trapiantate in un
animale ricevente. Questo studio ha, inoltre, identifi-
131
compendio 2013
compendio 2013
TARGETS-PATHWAYS
cato la proteina chinasi mTOR, un trasduttore fondamentale dei segnali nutrizionali nella cellula, come un
mediatore chiave della via di segnale della leptina sia
in vitro che in vivo.
CONCLUSIONI
I nostri studi hanno caratterizzato due regolatori chiave dell’inizio e della progressione della SM: MyD88
e mTOR. Abbiamo dimostrato che le vie di segnale
stimolate da queste proteine hanno una rilevanza di-
retta per l’attivazione di processi coinvolti nella SM. I
nostri studi identificano anche una regione limitata di
MyD88 che potrà essere utilizzata come stampo per
generare piccole molecole farmacologiche in grado
di bloccare la sua attività nelle cellule. Poiché gli inibitori di mTOR sono già in uso nella pratica clinica e
gli inibitori di MyD88 possono ora essere prodotti, è
ragionevole pensare che i nostri studi possano rappresentare la base per lo sviluppo di nuovi approcci
terapeutici per la SM.
MyD88: a novel therapeutic molecular target for the treatment
of multiple sclerosis
Multiple sclerosis (MS) is a neurological disease that
involves inflammation and neurodegeneration. The
symptoms of MS are due to inflammatory foci in which
the immune system promotes an autoimmune reaction
against the myelin protein present in the axon outer
sheath. This inflammatory response involves both innate and adaptive immune response and it is amplified by
a crosstalk between cells involved in these responses.
Recent evidence has shown that the adaptor protein
MyD88 is essential for the onset of the inflammatory
response in animal models of MS. MyD88 is a central
player in the inflammatory response of cells involved
in both innate and adaptive immunity, by transducing
the signal emanated by Toll-like family (TLR) and Interleukin 1 family (IL-1R) receptors. Thus, it is likely that
compounds that specifically block MyD88 function will
have an effect on the progression of the symptoms of
MS. The aims of this project were oriented at further
elucidating the regions of MyD88 that are essential for
its function and at developing compounds that can
selectively block the interaction of MyD88 with either
TLR/IL-1R or with the downstream signalling proteins,
which might be differentially expressed or functionally
involved in cells with relevance for MS.
RESULTS
Research unit 1 (Prof. Sette) performed a structure-function analysis of MyD88 TIR domain by site-directed
mutagenesis. This study has allowed us to identify several new portions of the protein that are essential for
its function in the cell. We have used this information
to produce decoy MyD88 recombinant mini-proteins
that may compete with the function of the endogenous
protein in live cells. Expression of these proteins in experimental cells has confirmed their ability to interfere
with MyD88 functions. In particular, we showed that
expression of two of these MyD88 decoy proteins
interfered with TLR2-and TLR4-mediated activation
of the inflammatory response in the promonocytic
THP1 cell line. These results identify a new region
within the TIR domain of MyD88 that is crucial for
protein activity and strongly suggest that this region could be used as template to generate small
inhibitory molecules for the TLR/MyD88 pathway
to be tested in the context of MS.
We have also investigated the involvement of TLRs
and MyD88-mediated responses in antigen presenting cells (APCs) obtained from MS patients.
The expression of MyD88 and TLRs was analyzed
in APCs subpopulations in PBMCs of MS patients
and characterized these cells phenotypically and
functionally in comparison to cells obtained from
healthy donors (HD). We found that frequency
of myeloid dendritic cells (mDCs) is increased in
acute phase of MS, while the frequency of plasmacytoid dendritic cells (pDCs) is decreased in
stable phase of MS compared to HD. However,
no differences in the expression of MyD88 and
TLRs were found between HD and MS patients.
Moreover, we observed that DC-mediated Th polarization is comparable in MS patients and HD
and that mDCs stimulate a Th17 response, while
pDCs promote Th1 and Treg responses. Given the
known pathogenic role of Th17 cells in MS, we set
out to use mDCs as target to modulate the inflammatory response in MS with the MyD88 inhibitory
decoy mini-proteins described above. Expression
of these MyD88 inhibitory proteins in mDCs was
capable to reduce the frequency of IL-1b or TNFa producing cells in response to stimulation with
TLR4 and TLR7/8 agonists. These results confirm
the potent action of MyD88 inhibitory proteins in
cells with direct relevance to MS.
The research of Unit 2 (Dr. Matarese) has focused
on the recently emerged links between adipocyte-
132
derived hormone leptin, nutritional status, adipose tissue and autoimmune responses. They have
shown that these processes regulate the survival
and proliferation of autoreactive and effector CD4+
T cells in the context of EAE. In particular, they
have demonstrated that expression of leptin is required for the ability of activated CD4+ T cells to
induce experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) when transplanted in a recipient animal.
In addition, this study has identified mTOR, a kinase that is fundamental to transducer nutritional
signals in the cell, as a key effector of the leptin
pathway both in vitro and in vivo.
CONCLUSIONS
Our studies have characterized two key players in the
onset and progression of MS: MyD88 and mTOR. We
provide evidence that the pathways triggered by these
proteins have direct relevance for the activation of processes involved in MS. Moreover, our studies identify a
small region of MyD88 that can be used as template to
generate small molecule drugs to block its activity in live
cells. Since mTOR inhibitors are already currently used
in clinic and MyD88 inhibitory drugs can now be produced, it is conceivable that these results will pave the way
for novel therapeutic approaches to MS.
...................................................................................................................................................
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..............................................................................................................................................
133
2012
PROGETTI DI RICERCA E BORSE
DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM
BANDO DI RICERCA FISM
2012
Francesca BOSCIA
Università di Napoli “Federico II” Facoltà di Medicina Dipartimento di Neuroscienze, NAPOLI
Studio del ruolo dell’isoforma dello scambiatore Na+/Ca+2 NCX3 nelle cellule oligodendrocitiche per individuare nuove strategie terapeutiche per il controllo della demielinizzazione e rimielinizzazione nella sclerosi multipla
Progetto di ricerca € 30.000,00 - 1 anno
...................................................................................................................................................
Roberta BRAMBILLA
University of Miami, Miller School of Medicine, The Miami Project To Cure Paralysis, Deptartment of Neurological Surgery, MIAMI, FLORIDA,
USA
L’effetto di rimielinizzazione del Tumor Necrosis Factor di membrana: studio specifico del ruolo del Tumor Necrosis Factor Receptor 2
Progetto di ricerca € 236.000,00 - 3 anni
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Claudia CANTONI
Washington University School of Medicine Neurology, ST. LOUIS, MISSOURI, USA
Ruolo di miR-223 nella sclerosi multipla e nel suo modello animale
Borsa di ricerca € 85.000,00 - 2 anni
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Andrea COSSARIZZA
Università di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento di Scienze Biomediche, MODENA
Fenotipo e polifunzionalità delle cellule iNKT periferiche come marcatore immunologico delle diverse forme di sclerosi multipla e dopo
diverse terapie immunomodulatorie
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Marika Maria Caterina FALCONE
Ospedale San Raffaele, Divisione di Immunologia, Trapianti e Malattie Infettive, MILANO
Ruolo dei meccanismi immunoregolatori intestinali nella patogenesi della sclerosi multipla
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Cinthia FARINA
Ospedale San Raffaele, Department of Neuroscience, Lab of Immunobiology of Neurological Disorders, MILANO
Un ruolo per gli astrociti nell’infiammazione e demielinizzazione del sistema nervoso centrale
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Diego FRESEGNA
Centro Europeo di Ricerca sul Cervello (CERC), Fondazione Santa Lucia, ROMA
Il potenziale coinvolgimendo dell’interleuchina-1beta nelle alterazioni dell’umore in un modello animale di sclerosi multipla
Borsa di addestramento € 41.500,00 - 2 anni
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Fabrizia Claudia GUARNIERI
Ospedale San Raffaele, Divisione di Neuroscienze, MILANO
Effetti modulatori di citochine pro- e anti-infiammatorie sulle vie di trasduzione e sulla composizione molecolare delle terminazioni
nervose
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Liliana Elisa LUCCA
Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan, Inserm UMR 1043, Team 5: Inflammatory diseases of the Central Nervous System: mechanisms and therapy, TOULOUSE, FRANCE
Linfociti T che co-riconoscono antigeni mielinici e neuronali: tolleranza immunologica e contributo relativo all’autoimmunità del Sistema
Nervoso Centrale
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Giuseppe MATARESE
Facoltà di Medicina, Università degli Studi di Salerno, Dipartimento di Medicina e Chirurgia, BARONISSI, SALERNO
Paradossi nella biologia delle cellule T regolatorie: la base molecolare per uno “switch” metabolico oscillatorio mTOR-dipendente nel
controllo della tolleranza immunologica nella sclerosi multipla
135
2012
Claudia MINICI
Ospedale San Raffaele, DIBIT, Divisione di Immunologia, Trapianti e Malattie Infettive, laboratorio di Biocristallografia, MILANO
Caratterizzazione strutturale e biochimica della peptidil-arginina deiminasi 2, una proteina coinvolta nella destabilizzazione della guaina
mielinica nella sclerosi multipla
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Linda OTTOBONI
Ospedale San Raffaele, Istituto di Neurologia Sperimentale INSpe, Laboratorio di Neuroimmunologia, MILANO
Approccio traslazionale per studiare il ruolo del gene ZFP36L1 nella sclerosi multipla: nesso tra stomaco e cervello
borsa di ricerca senior € 72.000,00 - 2 anni
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Simone PATERGNANI
Università di Ferrara, Dipartimento di medicina sperimentale e diagnosica - Sezione di patologia generale, FERRARA
Analisi della funzionalità e dell’energetica mitocondriale come caratteristiche principali del differenziamento oligodendrocitario
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Silvia RAVERA
Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Farmacia, GENOVA
Valutazione del danno al metabolismo aerobio della guaina mielinica nel topo EAE, un modello murino di sclerosi multipla
Borsa di ricerca € 24.000,00 - 1 anno
Eleonora COCCO
Università di Cagliari, Dipartimento di Sanità Pubblica, Medicina Clinica e Molecolare, Centro Sclerosi Multipla, Ospedale Binaghi, CAGLIARI
Geoepidemiologia della sclerosi multipla: I fattori ambientali
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Roberto D’AMICO
Università di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento di Oncologia, Ematologia e Patologie dell’Apparato Respiratorio,
Unità di Statistica Medica, MODENA
Migliorare la sintesi dei risultati della ricerca sui trattamenti nella sclerosi multipla per il loro utilizzo nella pratica clinica e per influenzare
l’agenda della ricerca futura
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Letizia LEOCANI
Ospedale San Raffaele, Dipartimento Neurologico, MILANO
Effetto della stimolazione magnetica ripetitiva sulla deambulazione nella SM: studio di fase III controllato, randomizzato, in doppio cieco
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Patrizia PANTANO
Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Neurologia e Psichiatria, ROMA
Plasticità strutturale in pazienti con SM e atassia: variazioni longitudinali della microarchitettura della sostanza bianca associate con il
training propriocettivo
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Maria Assunta ROCCA
Ospedale San Raffaele, Neuroimaging Research Unit, Institute of Experimental Neurology, MILANO
Effetti della action observation therapy sulla riabilitazione dei deficit motori dell’arto superiore destro dominante nei pazienti con SM:
uno studio esplorativo con RM strutturale e funzionale
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Domenico Antonio RESTIVO
Unità Operativa di Neurologia, Dipartimento di Medicina, CATANIA
Valutazione dell’efficacia della stimolazione transcranica a corrente diretta (tDCS) nella disfagia associata a sclerosi multipla
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2012
Giorgio SANDRINI
IRCCS Istituto Neurologico Nazionale C. Mondino e Università degli Studi di Pavia, Dipartimento di Sanità Pubblica, Neuroscienze, Medicina
Sperimentale e Forense, Sezione di Scienze Neurologiche, PAVIA
Effetto della stimolazione spinale a corrente continua sul dolore nella sclerosi multipla: valutazione clinica, neurofisiologica e dell’attività
del sistema endocannabinoide
VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS/PATHWAYS
Sabina LUCHETTI
Netherlands Institute for Neuroscience (NIN), Department of Neuroimmunology, Amsterdam, THE NETHERLANDS
Neurosteroidi come agenti neuroprotettivi, pro-mielinizzanti e anti-infiammatori nella sclerosi multipla
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Serena MARTIRE
Istituto di Neuroscienze della Fondazione Cavalieri Ottolenghi, Unità di Neurobiologia Clinica, ORBASSANO, TORINO
La deregolazione di microRNAs e dei loro mRNAs bersaglio causa un difetto nel circuito di retroazione negativa che sopprime l’infiammazione in pazienti con sclerosi multipla
Borsa di addestramento € 22.000,00 - 1 anno
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Miriam MATTOSCIO
Imperial College London, Division of Brain Sciences, Centre for Neuroscience, LONDON UK
Rilevanza clinica del diverso effetto della terapia con anticorpo monoclonale anti alfa-4 integrina sulla mobilizzazione di cellule staminali
ematopoietiche in pazienti affetti da sclerosi multipla
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Rosetta PEDOTTI
Fondazione Istituto Neurologico IRCCS Carlo Besta, Neuroimmunology and Muscolar Pathology Unit, MILANO
Le prokineticine nelle malattie demielinizzanti autoimmuni del sistema nervoso centrale: possibili nuovi target di terapia per la sclerosi
multipla
NUOVI METODI DIAGNOSTICI
Maria DI IOIA
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara, Dipartimento di Scienze Biomediche, Ce.SI (Centro Scienze dell’invecchiamento), Fondazione
Universitaria, Laboratori dell’Unità di Biochimica Analitica e Proteomica, CHIETI
Sviluppo di metodi di estrazione dei lipidi liquorali ed applicazione di tecniche di spettrometria di massa per la caratterizzazione del
profilo lipidico e dei livelli di neurosteroidi nei pazienti SM
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Massimo FILIPPI
Università Vita-Salute San Raffaele, Ospedale San Raffaele, Divisione di Neuroscienze, Istituto di Neurologia Sperimentale, Unità di Neuroimaging Quantitativo, MILANO
Mappatura regionale della struttura e delle funzioni dell’ippocampo nella sclerosi multipla: correlazioni con le forme cliniche della malattia e con il deficit cognitivo
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Costanza GIANNI’
Massachussets General Hospital (MGH), Harvard Medical School (HMS), MGH/MIT/HMS Athinoula A. Martinos Center for Biomedical
Imaging, BOSTON, MASSACHUSSETS, USA
Tecniche multimodali di neuro-immagini per lo studio della patologia corticale nella sclerosi multipla
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Claudia VERDERIO
Istituto CNR di Neuroscienze, Dipartimento di Farmacologia Medica, MILANO
Potenziale patogenico e diagnostico delle microvescicole rilasciate dalla microglia nella sclerosi multipla
Progetto di ricerca €170.000,00 - 3 anni
137
2012
PROGETTI SPECIALI 2012
Giancarlo COMI e Gianluigi MANCARDI
On behalf of CoSMo Collaborative Study Group
Estensione “Studio di prevalenza della CCSVI nella sclerosi multipla e in altre malattie neurodegenerative (CoSMo)”
Progetto speciale € 100.000,00 - 1 anno
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SALUTE E QUALITÀ DELLA VITA
Alessandra SOLARI
Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Unità di Neuroepidemiologia, MILANO
Cure palliative domiciliari per le persone con forme gravi di sclerosi multipla: studio PeNSAMI (Palliative Network for Severely Affected
Adult with MS in Italy)
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VALIDAZIONE DI NUOVE TERAPIE CLINICHE
Antonio UCCELLI
CBA, Laboratorio di Neuroimmunobiologia, GENOVA
Studio immunologico ancillare al protocollo: Cellule staminali mesenchimali per la terapia della sclerosi multipla-Progetto MESEMS
Progetto speciale € 170.000,00 - 2 anni
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RICERCA SOCIO-SANITARIA
Michela PONZIO
Fondazione Italiana Sclerosi Multipla, GENOVA
Famiglia e persona di fronte alla disabilità: il caso della sclerosi multipla (analisi stakeholder)
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RIABILITAZIONE
Giampaolo BRICHETTO
Fondazione Italiana Sclerosi Multipla, GENOVA
Outcome di riabilitazione nella sclerosi multipla
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RIABILITAZIONE
Maria Laura LOPES DE CARVALHO
Associazione Italiana Sclerosi Multipla, GENOVA
Disturbi dell’equilibrio nella sclerosi multipla
138
2011
2011
Cristina AGRESTI
Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, ROMA
Studio del ruolo dei recettori del TNF durante i processi di demielinizzazione e rimielinizzazione
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Francesca ALOISI
Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, ROMA
Analisi dell’infezione con virus di Esptein-Barr e della risposta immunitaria nel fluido cerebrospinale e nel sangue di pazienti con sclerosi
multipla mediante tecniche altamente sensibili di PCR
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Vincenzo BARNABA
Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, ROMA
Immunoattivazione cronica nella sclerosi multipla
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Luca BATTISTINI
Fondazione Santa Lucia, Neuroscienze Sperimentali, ROMA
Ruolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: come la flora intestinale influenza le risposte autoimmuni?
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Laura BERGAMASCHI
Duke University - Medical Center, Center for Human Genetics, Durham, NC
Analisi molecolare dell’espressione allele specifica di IL-7Ralpha e il suo effetto sul segnale mediato da IL-7 in cellule: mDC, CD4+ e
CD8+ isolate da pazienti con sclerosi multipla e controlli sani
Borsa di ricerca € 37.000,00 - 1 anno
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Paola CAIAFA
Sapienza Università di Roma, Facoltà di Farmacia e Medicina, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, ROMA
Riprogrammazione epigenetica nella sclerosi multipla
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Paolo CALABRESI
Università di Perugia, Clinica Neurologica, Laboratori di Neurologia Sperimentale, Dipartimento Specialità Medico-Chirurgiche e Sanità Pubblica, Ospedale S Maria della Misericordia, PERUGIA
Uno studio elettrofisiologico dei meccanismi di alterata plasticità sinaptica in modelli sperimentali di sclerosi multipla
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Giuseppe CHIAPPETTA
Istituto Superiore di Sanità, Reparto di Malattie infiammatorie e demielinizzanti del sistema nervoso, Dipartimento di Biologia Cellulare e
Neuroscienze, ROMA
Ricerca di interazioni patogeneticamente rilevanti tra EBV e il retrovirus endogeno della famiglia W MSRV nel cervello con sclerosi
multipla
Borsa di addestramento € 22.000,00 - 1 anno
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Annalisa CHIOCCHETTI
IRCAD & Università del Piemonte Orientale, Dipartimento Scienze Mediche, NOVARA
Ruolo di Osteopontina e degli anticorpi anti-Osteopontina nella sclerosi multipla
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Sandra D’ALFONSO
Università degli Studi del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”, Dipartimento di Scienze Mediche, NOVARA
Mappatura fine dei loci di suscettibilita’ alla SM nella popolazione dell’Italia continentale: dai marcatori genetici identificati attraverso
studi di associazione genome-wide alla varianti causali
140
2011
Dario DI LUCA
Università degli Studi di Ferrara, Sezione di Microbiologia, Dipartimento di Medicina Diagnostica e Sperimentale, FERRARA
Studio delle alterazioni nelle risposte antivirali dell’immunità innata in pazienti con SM
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Diletta DI MITRI
Istituto di ricovero e cura a carattere scientifico Fondazione Santa Lucia, Unità di Neuroimmunologia, ROMA
Ruolo svolto dall’immunosenescenza nell’insorgenza e nella progressione della sclerosi multipla
Borsa di Ricerca Senior € 64.000,00 - 2 anni
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Anna FALCO
Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico, Divisione di Neuroscienze, MILANO
Regolazione degli interneuroni cerebrali e spinali da parte delle GTPasi Rac
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Bruno GRAN
University of Nottingham, Division of Clinical Neurology, NOTTINGHAM, UK
Modulazione dell’ equilibrio tra cellule T regolatrici e T helper 17 da parte di recettori Toll-like: implicazioni per la sclerosi multipla
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Roberta MAGLIOZZI
Istituto Superiore di Sanità, Biologia Cellulare e Neuroscienze, ROMA
Studio neuropatologico e molecolare mirato a comprendere la relazione tra processo infiammatorio nelle meningi e danno cerebrale
corticale nella sclerosi multipla
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Mara MARONGIU
CNR - Consiglio Nazionale delle Ricerche, IRGB Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica, Cittadella Universitaria Monserrato, Monserrato (CA)
Studio del meccanismo funzionale alla base dell’associazione di CBLB con la scerosi multipla
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Stefano MORARA
Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Neuroscienze, MILANO
Ruolo protettivo di Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) nella patogenesi dell’EAE
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Silvia MUSIO
IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Immunologia e Patologia Muscolare, MILANO
Il ruolo dei basofili nella encefalite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla
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Francesco NOVELLI
Università di Torino, Dipartimento Medicina e Oncologia Sperimentale, Centro Ricerche Medicina Sperimentale, AOU San Giovanni Battista,
TORINO
Regolazione interferone-dipendente dei linfociti Th17 e Th22 nella sclerosi multipla
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Stefano PREVITALI
Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, INSPE, Divisione di Neuroscienze, MILANO
Ruolo di COP5/Jab1 nella mielinizzazione e nella rimielinizzazione del Sistema Nervoso Centrale (CNS)
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Marco SALVETTI
Sapienza Università di Roma, Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali, Dipartimento di Neuroscienze, Salute Mentale e Organi
di Senso, ROMA
Caratterizzazione dei genoptipi del virus di Epstein-Barr nella sclerosi multipla attraverso approcci di sequenziamento massivo
141
2011
Antonio UCCELLI
Università di Genova, Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, GENOVA
Studio di un modello murino transgenico per la caratterizzazione del proteoglicano NG2/CSPG4 nella patogenesi della sclerosi multipla
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Flavia VALTORTA
Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Divisione di Neuroscienze, Laboratorio di Neuropsicofarmacologia Sperimentale, MILANO
Ruolo delle citochine pro- e anti-infiammatorie nella modulazione dell’attività e della composizione presinaptica: nuove prospettive
nella ricerca sulla sclerosi multipla
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Jonathan VINET
Department of Neuroscience, section Medical Physiology, University Medical Center Groningen, Groningen, THE NETHERLANDS
Caratterizzazione di un fenotipo microgliale favorevole alla rimielinizzazione
Marta BASSI
Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze Cliniche, MILANO
Il sistema della cura: promozione del benessere tra persone con sclerosi multipla, caregiver ed operatori sanitari
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Marco BOVE
Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Fisiologia Umana, GENOVA
L’impatto della riabilitazione motoria e cognitiva sulle proprietà dinamiche della struttura cerebrale: verso la personalizzazione di interventi terapeutici in pazienti affetti da sclerosi multipla
Progetto di ricerca € 146.000,00 - 2anni
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Flavia MATTIOLI
Spedali Civili di Brescia, UO Riabilitazione Specialistica, BRESCIA
L’efficacia della stimolazione tramite tDCS (transcranial Direct Current Stimulation) nella riabilitazione cognitiva della sclerosi multipla:
studio clinico controllato
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Franca TECCHIO
Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), ISTC, LET’S, Dip. di Neuroscienze, Ospedale Fatebenefratelli, ROMA
Alleviare la Fatica nella sclerosi multipla mediante stimolazione transcranica in corrente continua (tDCS): è possibile differenziare target
di stimolazione entro le cortecce primarie sensorimotorie?
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Valentina TOMASSINI
University of Oxford, Nuffield Department of Clinical Neurosciences, (FMRIB Centre and Clinical Neurology), FMRIB Centre, John Radcliffe
Hospital, Headington, OXFORD CARDIFF, UK
Valutazione delle capacità di immaginazione motoria e degli effetti della pratica mentale di un compito motorio in pazienti affetti da
sclerosi multipla
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Carlo TROMPETTO
Istituto di Neurologia, Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, Università di Genova, GENOVA
Effetto delle onde d’urto sulla rigidità della caviglia in pazienti con sclerosi multipla
142
2011
VALIDAZIONE DI NUOVI TARGET/PATHWAYS
Pasquale ANNUNZIATA
Università degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Neurochirurgiche e del Comportameno, SIENA
Studio degli effetti immunomodulatori di un nuovo cannabinoide agonista selettivo per il recettore CB2 su cellule immunocompetenti
nella sclerosi multipla
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Francesco CUCCA
IRGB “Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica” of CNR, Dipartimento di Biomedicina del CNRIRGB, Cittadella Universitaria di Monserrato,
Monserrato (CA)
Approccio razionale per la ricerca di composti per la cura della sclerosi multipla basato sull’analisi dei target biologici individuati dagli
studi di associazione sull’intero genoma in Sardegna
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Roberta DE SIMONE
Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, Istituto Superiore di Sanità, ROMA
I mitocondri come bersagli e mediatori degli effetti benefici degli agonisti PPARG nella sclerosi multipla
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Massimo DEGANO
Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Divisione di Immunologia, Trapianti e Malattie Infettive, MILANO
Comprendere il meccanismo ed aumentare l’efficacia del composto FTY720 (Fingolimod) nella terapia della sclerosi multipla tramite
un approccio di biologia strutturale
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Letizia LEOCANI
IRCCS university Hospital San Raffaele, Neurological Dep.t; INSPE-Experimental Neurophysiology, MILANO
Stimolazione cerebrale transcranica a corrente diretta come terapia immunomodulante nella SM: studio pilota in modelli murini
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Rosetta PEDOTTI
Neurological Institute Foundation IRCCS Carlo Besta, Neuroimmunology and Muscolar Pathology Unit, MILANO
Il sistema delle prokineticine nelle malattie demielinizzanti autoimmuni del sistema nervoso centrale: meccanismi patogenetici e possibili nuovi bersagli di terapia per la sclerosi multipla
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Paola TIRASSA
Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto Biologia Cellulare & Neurobiologia, ROMA
Il nerve growth Factor dato in forma di collirio in un modello animale di sclerosi multipla: uno studio prospettico sul trattamento durante
le fasi precoci della malattia
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Loretta TUOSTO
Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles Darwin, ROMA
Caratterizzazione delle vie di segnalazione del CD28 come bersagli terapeutici nella regolazione della tolleranza immunologica nella
sclerosi multipla
Laura BONZANO
Università degli Studi di Genova, DINOG - Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, GENOVA
Performance motoria della mano come nuovo endpoint clinico quantitativo nella SM: valutazione longitudinale su pazienti CIS e correlazione con accumulo di disabilità e integrità tissutale alla RM
143
2011
Andrea COSSARIZZA
Università di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento di Scienze Biomediche, Sezione di Patologia Generale, MODENA
Polifunzionalità delle cellule iNKT periferiche come marcatore immunologico delle differenti forme di sclerosi multipla
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Franca DERIU
Università di Sassari, Dipartimento di Scienze Biomediche, Lab di Fisiologia e Bioingegneria dell’Uomo, SASSARI
Studio neurofisiologico, neuroradiologico e clinico del tronco encefalico in pazienti con sclerosi multipla
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Massimo FILIPPI
Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Neuroimaging Research Unit, INSPE, Divisione di Neuroscienze, MILANO
Definizione della rete di connettività strutturale e funzionale nella sclerosi multipla tramite l’applicazione dell’approccio “graph theory”
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Pasquina MARZOLA
Università di Verona, Dipartimento di Informatica, VERONA
Imaging funzionale nello studio della plasticità neuronale in un modello sperimentale di sclerosi multipla su ratto
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Morena MARTUCCI
Charitè Medical University, Institute of Biochemistry, BERLIN (GERMANY)
Identificazione di marcatori infiammatori e dei relativi meccanismi specific per la sclerosi multipla
NUOVI TRATTAMENTI SINTOMATICI
Diego CENTONZE
Dipartimento di Neuroscienze, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università Tor Vergata, ROMA
Trattamento sintomatico con procedure di neurostimolazione centrale e periferica per persone con sclerosi multipla
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MIELINIZZAZIONE
Carla TAVEGGIA
Istituto di Neurologia Sperimentale, Ospedale San Raffaele, MILANO
Laboratorio Interazioni Axo-Gliali
144
2010
2010
Cosima BALDARI
Università di Siena, Dipartimento di Biologia Evolutiva, SIENA
La proteina adattatrice Rai in differenziamento, attività e chemiotassi dei linfociti Th17 e nella patogenesi della sclerosi multipla
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Antonio BERTOLOTTO
Azienda Ospedaliero Universitaria (AOU) S. Luigi Gonzaga, SCDO Neurologia 2 - Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM),
Orbassano, TORINO
Correlazione tra neurodegenerazione e infiammazione nella sclerosi multipla: NR4A2 come modulatore di infiammazione
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Angela BONONI
Università di Ferrara, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Sezione di Patologia Generale, FERRARA
Ruolo di proteine mitocondriali nella patogenesi della sclerosi multipla
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Paolo CALABRESI
Università degli Studi di Perugia, Clinica Neurologica, Dipartimento Specialità Medico-Chirurgiche, PERUGIA
Uno studio elettrofisiologico sulla plasticità sinaptica in modelli sperimentali di sclerosi multipla
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Matteo COEN
University of Geneva, Faculty of Medicine, Department of Pathology and Immunology, GENEVA (Switzerland)
Caratterizzazione della parete venosa nella sclerosi multipla
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Gabriela CONSTANTIN
Università degli Studi di Verona, Dipartimento di Patologia, VERONA
Ruolo della mucina e immunoglobulina TIM-1 nella migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale infiammato
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Giulio DISANTO
University of Oxford
Department of Neurology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Prof. Ebers group, OXFORD, UK
Caratterizzazione funzionale delle varianti dei geni KIF coinvolti nella patogenesi della sclerosi multipla
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Antonina DOLEI
Universita di Sassari, Centro di Eccellenza per lo sviluppo della ricerca biotecnologica e per lo studio della biodiversità della Sardegna e
dell’area mediterranea, SASSARI
Studio del retrovirus associato alla sclerosi multipla (MSRV)/HERV-W come marcatore prognostico di progressione e del suo contributo
alla patogenesi
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Chiara FRESIA
Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Sperimentale (DIMES), Sezione Biochimica, GENOVA
Ruolo dell’acido abscissico nella sclerosi multipla: studio dei livelli in vivo nei pazienti e degli effetti in vitro su oligodendrociti e neuroni
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Paolo GIANNETTI
Imperial College London, Multiple Sclerosis Trial Collaboration, LONDON UK
Il ruolo della microglia attivata nella sclerosi multipla e nelle Sindromi Clinicamente Isolate: studio di imaging immunologico
146
2010
Gianluca MENICHETTI
Fondazione Cavalieri Ottolenghi. Istituto di Neuroscienze, Dipartimento di Neuroscienze, Sezione di Fisiologia, Università di Torino, TORINO
Effetto dell’interazione oligondendrocita-assone sulla regolazione delle proprietà intrinseche di crescita assonale e maturazione oligondendrocitaria
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Simone PATERGNANI
Università di Ferrara, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Sezione di Patologia Generale, FERRARA
Analisi di parametri mitocondriali in oligodendrociti durante condizioni pro-infiammatorie
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Simona PERGA
AOU S. Luigi Gonzaga, Centro di Riferimento Regionale Sclerosi Multipla, Orbassano, TORINO
Analisi delle variazioni di singoli nucleotidi polimorfi in TNFAIP3 associati alla sclerosi multipla
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Marzia PERLUIGI
Sapienza Università di Roma, Facoltà di Medicina, Dipartimento di Scienze Biochimiche, ROMA
Ruolo dello stress ossidativo nella sclerosi multipla. Un’analisi proteomica e red-ox proteomica
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Francesco RIA
Università Cattolica, Istituto di Patologia Generale, ROMA
Meccanismi molecolari del trasferimento delle informazioni ambientali alle cellule T nella patogenesi della EAE: ruolo del TLR2
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Elisabetta VOLPE
Fondazione Santa Lucia, Unità di Neuroimmunologia, ROMA
Meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione dell’apoptosi di cellule Th17 nella sclerosi multipla
QUALITÀ DELLA VITA RIABILITAZIONE
Nino BASAGLIA
Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara, UO Medicina Riabilitativa, Dipartimento di Neuroscienze/Riabilitazione, FERRARA
Gli effetti della terapia robotica del cammino sulla capacità deambulatoria e sull’attivazione delle unità motorie in soggetti con sclerosi
multipla. Uno studio randomizzato controllato
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Antonio CERASA
Istituto di Scienze Neurologiche-CNR, Unità di Ricerca Neuroimmagini, Germaneto, CATANZARO
I correlati di neuroimmagine della riabilitazione cognitiva nei pazienti con sclerosi multipla con sintomi cerebellari
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Nicola DE STEFANO
Università degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Neurochirurgiche e del Comportamento, SIENA
Modifiche nell’arco di 10 anni della sostanza bianca e grigia cerebrale in pazienti con sclerosi multipla in rapporto a disabilità fisica e
disfunzione cognitiva
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Graziella FILIPPINI
Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta, Unità Neuroepidemiologia, MILANO
Integrare le esperienze e le preferenze dei pazienti con sclerosi multipla con i risultati della ricerca scientifica per sviluppare informazioni
sulla salute utili per decisioni informate e condivise
147
2010
Patrizia PANTANO
Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Scienze Neurologiche, ROMA
Plasticità strutturale in pazienti con SM e atassia: variazioni longitudinali della microarchitettura della sostanza bianca associate con il
training propriocettivo
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Domenico RESTIVO
Unità Operativa di Neurologia, Ospedale “Nuovo Garibaldi”, CATANIA
Valutazione del trattamento della disfagia associata a sclerosi multipla, con stimolazione elettrica periferica del faringe. Studio pilota
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Paolo RICCIO
Università della Basilicata, Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, POTENZA
Le basi molecolari per un intervento nutrizionale nella sclerosi multipla
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Alessandra SOLARI
Preferenze di ruolo, conoscenza del rischio e decision-making nelle persone con sclerosi multipla (AutoMS)
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Franca TECCHIO
Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Scienze e Tecnologie della Cognizione, ROMA
Alleviare la Fatica nella sclerosi multipla: un intervento con stimolazione transcranica in corrente continua (tDCS)
VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS/PATHWAYS
Maria Pia ABBRACCHIO
Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze Farmacologiche, Laboratorio di Famacologia Cellulare e Molecolare della Trasmissione Purinergica, MILANO
Strategie rimielinizzanti innovative per la sclerosi multipla: focus su GPR17, nuovo recettore coinvolto nel differenziamento oligodendrocitario
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Carlo AVOLIO
Università degli Studi di Foggia, Sezione di Clinica delle Malattie del Sistema Nervoso, Dipartimento di Scienze Mediche e del Lavoro,
FOGGIA
Recettore purinergico P2X7 su monociti di pazienti con sclerosi multipla ed effetti degli attuali trattamenti immunomodulanti per la
malattia
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Alessandra BOLINO
Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, INSPE-Division of Neuroscience, MILANO
Un possibile ruolo per la chinesina kif13B nella mielinizzazione e rimielinizzazione del sistema nervoso centrale
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Ovidio BUSSOLATI
Università degli Studi di Parma, Dipartimento di Medicina Sperimentale, PARMA
L’induzione dei trasportatori per il glutamato EAAT da parte dei retinoidi: un approccio per la prevenzione del danno eccitotossico degli
oligodendrociti e dei loro precursori
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Simona CASAZZA
Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Neurologia, Oftalmologia e Genetica, GENOVA
Le cellule mesenchimali staminali influenzano l’ambiente microgliale? Implicazioni per il trattamento della sclerosi multipla
Borsa di ricerca senior € 64.000,00 - 2 anni
148
2010
Annalisa CHIOCCHETTI
Università del Piemonte Orientale, Dipartimento di Scienze Mediche, NOVARA
Mappatura funzionale dell’attività di Osteopontina nell’encefalomielite autoimmune sperimentale e nella sclerosi multipla
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Ivan de CURTIS
Università Vita-Salute San Raffaele, Divisione di Neuroscienze, Laboratorio di Adesione cellulare, MILANO
Regolazione degli interneuroni GABAergici da parte delle GTPasi Rac: implicazioni per la sclerosi multipla
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Francesca FALLARINO
Università degli Studi di Perugia, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche - Sezione di Farmacologia, PERUGIA
Induzione di immunità protettiva in un modello murino sperimentale di sclerosi multipla mediante agonisti dei recettori TLR7 e TLR9
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Roberto FURLAN
Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor
Divisione di Neuroscienze, Istituto di Neurologia Sperimentale, Unità di Neuroimmunologia Clinica, MILANO
IL-27 e IL 35 nella encefalomielite autoimmune sperimentale: un affare di famiglia
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Laura LOVATO
Università degli Studi di Genova Dipartimento di Neuroscienze Oftalmologia e Genetica, GENOVA
Identificzione mediante marcatura isotopica di proteine coinvolte nell’azione immunomodulante e neuroprotettiva delle cellule staminali mesenchimali
Borsa di ricerca senior € 64.000,00 - 2 anni
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Mauro MACCARRONE
Università degli Studi di Teramo, Dipartimento di Scienze Biomediche Comparate, TERAMO
Ruolo del Sistema Endocannabinoide nel Processo Neurodegenerativo della sclerosi multipla sperimentale
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Miriam MATTOSCIO
Imperial College London, Centre for Neuroscience, Division of Experimental Medicine, LONDON, UK
Mobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche in pazienti affetti da sclerosi multipla in terapia con anticorpo monoclonale anti alfa-4
integrina: rilevanza funzionale e possibili applicazioni
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Katia MANGANO
Università degli Studi di Catania, Dipartimento di Scienze Biomediche, CATANIA
Trattamento epigenetico con il composto ipometilante 5-aza-2-deossicitidina in modelli animali di sclerosi multipla
...................................................................................................................................................
Roberto Cosimo MELCANGI
Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Endocrinologia, Fisiopatologia e Biologia Applicata (DEFIB), MILANO
Valutazione degli effetti protettivi degli steroidi neuroattivi nel modello della encefalomielite autoimmune sperimentale
...................................................................................................................................................
Paolo MURARO
Imperial College London, Division of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, LONDON, UK
Rilevanza funzionale della mobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche a seguito di trattamento con anticorpo contro integrina
alpha4 in pazienti con sclerosi multipla
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Alessio NENCIONI
Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, GENOVA
FK866 e fluridone: nuovi farmaci NAD-correlati contro la sclerosi multipla?
149
2010
Marilena PALMISANO
Fondazione San Raffaele del Monte Tabor, Dipartimento di Genetica e Biologia Cellulare, Laboratorio di Neuro Glia, MILANO
Ruolo delle MAP chinasi p38 nella mielinizzazione
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Maria Beatrice PASSANI
Università di Firenze, Dipartimento Farmacologia Preclinica e Clinica, FIRENZE
Potenziali terapeutici di antagonisti del recettore istaminergico H4 nel trattamento di neuropatologie autoimmuni
...................................................................................................................................................
Stefano PLUCHINO
Cambridge Centre for Brain Repair, Department of Clinical Neurosciences, CAMBRIDGE, UK
RNA non codificanti e plasticità terapeutica delle cellule staminali neurali
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Riccardo SACCARDI
Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Firenze, SODc Ematologia, Dipartimento di Area Critica Medico Chirurgica, Università di Firenze,
FIRENZE
Valutazione immunologica del midollo osseo in pazienti affetti da sclerosi multipla severa sottoposti ad autotrapianto di cellule staminali
ematopoietiche
Gian Carlo AVANZI
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”, Dipartimento di Medicina Traslazionale, NOVARA
Il ruolo di Gas6 e dei suoi recettori nella sclerosi multipla: studio clinico e biologico
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Massimo FILIPPI
Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Unità di Neuroimaging Quantitativo, Istituto di Neurologia Sperimentale, MILANO
Definizione delle misure RM predittive dell’accumulo di disabilità e compromissione cognitiva a lungo termine in pazienti con SM e un
esordio a ricadute della malattia: studio longitudinale a 13 anni
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Vittorio MARTINELLI
Istituto Scientifico San Raffaele, Dipartimento di Neurologia, MILANO
Caratterizzazione di profili di espressione di geni e di microRNA da cellule di sangue perifierico di pazienti affetti da sclerosi multipla
...................................................................................................................................................
Damiana PIERAGOSTINO
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara, Dipartimento di Scienze Biomediche, laboratori del Ce.S.I. Centro Studi sull’Invecchiamento,
Fondazione universitaria, CHIETI
Strategie di Proteomica nella sclerosi multipla: studi strutturali e funzionali delle isoforme ossidate della transtiretina, un possibile biomarcatore di malattia
...................................................................................................................................................
Claudia VERDERIO
Istituto CNR di Neuroscienze-Milano, Dipartimento di Farmacologia Medica, MILANO
Microvescicole microgliali nel liquido cerebrospinale: un potenziale marcatore nella sclerosi multipla
150
2010
Andrea GIORDANO
Impiego del supplemento informativo “Sapere Migliora” per i pazienti con SM di nuova diagnosi nella pratica clinica corrente (SIMSPractice)
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CCSV I
Giovanni MALFERRARI
Dipartimento Neuromotorio, S.C. Neurologia, S.S., Patologia Cerebrovascolare, Arcispedale Santa Maria Nuova, REGGIO EMILIA
Confronto fra studio neurosonologico con valutazione in real time (Virtual Navigator) e RMN nell’analisi dell’emodinamica venosa cerebrale in pazienti con SM e controlli
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Alessandra SOLARI
La versione italiana del “Motherhood Choice”: un ausilio decisionale sulla maternita’ per le donne con SM
151
2012
E SEGRETERIA FISM
FISM 2012
BIOMEDICAL RESEARCH FISM SCIENTIFIC COMMITTEE
Antonio Bertolotto
AOU S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM) - Orbassano, TORINO
Luca Battistini
IRCCS S. Lucia, Neuroimmunology Unit, European Centre for Brain Research - ROMA
Diego Centonze
Fondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze - ROMA
Gabriela Constantin
Dipartimento di Patologia e Diagnostica, Università degli Studi di Verona - VERONA
Francesco Cucca
Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Sassari - SASSARI
Roberto Furlan
Unità di Neuroimmunologia Clinica, Ospedale San Raffaele, DIBIT - MILANO
Peter Goodfellow
Visiting Professor in Biosciences at the University of Kent - UK
Matilde Inglese
Mount Sinai School of Medicine - NEW YORK, USA
Paolo Muraro
Division of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Imperial College London - LONDON, UK
Stefano Pluchino
Department of Clinical Neurosciences, Centre for Brain Repair and Wellcome Trust-MRC Cambridge Stem Cell Institute,
University of Cambridge - CAMBRIDGE, UK
Nicolò Rizzuto
Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione, Sezione di Neurologia Università degli Studi di Verona,
Policlinico Borgo Roma - VERONA
Lawrence Wrabetz
Hunter James Kelly Research Institute (HJKRI), University at Buffalo - Buffalo NY, USA
153
FISM 2012
SOCIAL & BEHAVIOURAL SCIENCE RESEARCH FISM
SCIENTIFIC COMMITTEE
Olga Ciccarelli
Department Brain Repair and Rehabilitation, University College London, Institute of Neurology - LONDON, UK
Monica Falautano
Dipartimento di Neurologia, Servizio di Psicologia, Ospedale San Raffaele - MILANO
Peter Feys
Department of Physical Medicine and Rehabilitation, AZ Sint-Blasius - DENDERMONDE, BELGIUM
Franco Franchignoni
Fondazione Salvatore Maugeri, Istituto Scientifico di Riabilitazione - Veruno, NOVARA
Maura Pugliatti
Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Sassari, Clinica Neurologica - SASSARI
Marco Rovaris
Fondazione Don Gnocchi, Unità Sclerosi Multipla, IRCCS Santa Maria Nascente - MILANO
Jean-Louis Thonnard
Université catholique de Louvain, Institute of NeuroScience (IoNS) - BRUXELLES, BELGIQUE
SEGRETERIA SCIENTIFICA
FISM 2012
Umberto Dianzani
Dipartimento di Scienze Mediche, I.R.C.A.D., Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro” - NOVARA
Massimo Filippi
Neuroimaging Research Unit , INSPE, Divisione di Neuroscienze, Fondazione Centro San Raffaele - MILANO
Gianvito Martino
Unità di Neuroimmunologia, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT - MILANO
Vito Pistoia
Laboratorio di Oncologia, I.R.C.C.S. G. Gaslini - GENOVA
Marco Salvetti
Università “La Sapienza” - Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS) - ROMA
Alessandra Solari
Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta - MILANO
Bernard Zalc
Bâtiment ICM, Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Hôpital de la Salpêtrière - PARIS, FRANCE
DIRETTORE RICERCA SCIENTIFICA
Paola Zaratin
Associazione Italiana Sclerosi Multipla - Fondazione Italiana Sclerosi Multipla - GENOVA
154
2011
2010
FISM
FISM 2011
Francesca Bagnato
Department of Radiology and Radiological Sciences, Institute of Imaging Science; Vanderbilt University - Nashville, USA
Luca Battistini
IRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Research - ROMA
Antonio Bertolotto
ASO S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM) - Orbassano, TORINO
Diego Centonze
Gabriela Constantin
Dipartimento di Patologia e Diagnostica, Università degli Studi di Verona- VERONA
Francesco Cucca
Umberto Dianzani
Dipartimento di Scienze Mediche, I.R.C.A.D., Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro - NOVARA
Roberto Furlan
Unità di Neuroimmunologia Clinica, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT - MILANO
Maria Grazia Grasso
IRCCS Fondazione Santa Lucia - ROMA
Matilde Inglese
Gianvito Martino
Paolo Muraro
Vito Pistoia
Paolo Riccio
Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università della Basilicata - POTENZA
Marco Salvetti
Sapienza Università di Roma, Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS) - ROMA
Alessandra Solari
Jean-Louis Thonnard
Bernard Zalc
Bâtiment ICM, Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Hôpital de la Salpêtrière - PARIS, FRANCE
156
FISM 2011
CHAIRMAN COMITATO SCIENTIFICO FISM
Giulio Levi
Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e Sistema - ROMA
FISM 2010
Francesca Bagnato
Department of Radiology and Radiological Sciences, Institute of Imaging Science, Vanderbilt University - NASHVILLE USA
Luca Battistini
IRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Research - ROMA
Antonio Bertolotto
ASO S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM) - Orbassano, TORINO
Diego Centonze
Francesco Cucca
Umberto Dianzani
Dipartimento di Scienze Mediche, I.R.C.A.D., Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro - NOVARA
Roberto Furlan
Unità di Neuroimmunologia Clinica, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT - MILANO
Enrico Granieri
Istituto di Clinica Neurologica, Università di Ferrara, Arcispedale Sant’Anna - FERRARA
Maria Grazia Grasso
IRCCS Fondazione Santa Lucia - ROMA
Matilde Ingelse
Gianvito Martino
Paolo Muraro
Vito Pistoia
Marco Salvetti
Università La Sapienza, Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS) - ROMA
157
FISM 2010
Alessandra Solari
Jean-Louis Thonnard
Lawrence Wrabetz
Laboratorio di Biologia della Mielina, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT - MILANO
Bernard Zalc
Bâtiment de la Pharmacie, Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière,
Hôpital de la Salpêtrière - PARIS, FRANCE
COORDINATORE DELLA RICERCA FISM
Giulio Levi
Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e Sistema - ROMA
158
Finito di stampare nel mese di maggio 2013
Arti Grafiche Giuseppe Lang - Genova
160

la ricerca sulla sclerosi multipla

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