lezione 7

La tecnologia del DNA ricombinante
Un modo nuovo di studiare i geni
Isolare
Analizzare
Modificare
i geni
2 metodi per isolare geni di interesse
In vivo
(1973)
Clonaggio
genico
In vitro
(1983)
PCR
(polymerase
chain reaction)
Differenze tra clonaggio genico e PCR
Clonaggio genico
PCR
Conoscenza
sequenza genica
Tempi di
realizzazione
Lunghezza DNA
amplificato
Accuratezza
Non necessaria
Necessaria
Lunghi
Molto brevi
Variabile (anche
molto grande)
Elevata
Limitata
Rischi
contaminazione
Bassi
Elevati
Bassa
Clonaggio genico. Fasi
• 1. Isolamento del frammento di DNA di
interesse (DNA genomico, di sintesi, cDNA)
• 2. Unione del frammento di DNA al vettore di
clonaggio
• 3. Trasferimento del vettore ricombinante alla
cellula ospite
• 4. Identificazione delle cellule che
contengono la molecola ricombinante
1. Isolamento del frammento di DNA di
interesse.
Gli enzimi di restrizione
Digestione del DNA con gli enzimi di
restrizione
Estremità
adesive
complementari
2. Vettori di clonaggio. Proprietà.
Uno o più siti di
restrizione unici
Origine della
replicazione
Marcatore
selezionabile
Unione del
frammento di
DNA al vettore
Il vettore ricombinante
Vettori. Il plasmide pUC19.
polylinker
Utilizzo di LacZ per identificare i batteri
ricombinanti
3. Introduzione
del vettore nelle
cellule ospiti
Trasformazione
Costruzione di una
banca genomica
mediante digestione
parziale
Il batteriofago λ
come vettore
Creazione di una genoteca genomica in fago lambda
Clonare l’mRNA
• Sintesi del cDNA
• Genoteche di cDNA
Clonaggio di un gene per una proteina di cui si dispone di
un anticorpo specifico. Vettori di espressione
4. Identificazione delle
cellule che contengono la
molecola ricombinante.
Screening di una
genoteca di espressione
con anticorpi specifici
Clonaggio di un gene per una proteina di sequenza nota.
Sintesi dell’oligonucleotide sonda
Screening di una genoteca con una sonda di DNA
Clonaggio funzionale.
Complementazione di
mutazioni
Chromosome walking
Clonaggio di
frammenti di DNA
parzialmente
sovrapposti
Vettori per frammenti di grandi dimensioni
I cromosomi artificiali di lievito (YAC)
La reazione a catena
della polimerasi
(PCR)
Amplificazione
esponenziale in vitro
di un frammento di
DNA a sequenza nota
Copie di DNA prodotte= 2n
Da una singola molecola
dopo 30 cicli >109 molecole
Analisi DNA clonato. Separazione di frammenti di DNA
per elettroforesi su gel
Analisi di frammenti di DNA clonati in
plasmide per digestione ed
elettroforesi
Analisi DNA
clonato.
Sequenziamento
(F. Sanger)
Modificazione DNA
clonato. Mutagenesi
gene-specifica
Proteine ricombinanti prodotte per scopi terapeutici
Animali come
bio-reattori
Produzione di mammiferi transgenici
Marcatori molecolari.
I polimorfismi di lunghezza
dei frammenti di restrizione
(RFLP)
Analisi frammenti di restrizione
mediante il Southern blotting.
Utilizzo degli RFLP per le analisi di linkage
Eterozigote
Linkage tra il gene D e l’RFLP
Omozigote
Associazione (linkage) tra locus RFLP e locus
malattia
Gli alleli del RFLP di
(a) e quelli del locus
HD segregano in
modo indipendente
Il locus del RFLP di
(b) e il locus HD sono
strettamente associati
Marcatori molecolari
VNTR (minisatelliti) e STR (microsatelliti)
M” è associato
alla malattia
Clonaggio posizionale
Alcuni geni malattia
come quelli della
Corea di Huntington e
della Fibrosi Cistica
sono stati isolati
mediante clonaggio
posizionale
DNA fingerprint
mediante
analisi dei mini- e
microcrosatelliti