I vettori di clonaggio

Transcript

VETTORI DI
CLONAGGIO
Perché clonare il DNA
¾ Per preparare una sonda di ibridazione
¾ Per costruire una genoteca allo scopo di isolare un gene o un cDNA
¾ Per trascrivere un gene e ottenere quantità elevate del relativo RNA
¾ Per trascrivere e tradurre un gene per ottenere quantità elevate della
relativa proteina
¾ Per sequenziare una molecola di DNA
¾ Per mutare un gene
¾ Per studiare la funzione di un elemento regolativo (es.: promotore,
enhancer, silencer)
I vettori di clonaggio: differenze nelle
dimensioni degli inserti
Dimensioni
inserto
Vettore
Ospite
naturale
Plasmidi
E. coli
5-10 kb
Fago λ
E. coli
5-25 kb
Cosmidi
E. coli
35-45 kb
Fago P1
E. coli
70-100 kb
PAC
E. coli
100-300 kb
BAC
E. Coli
≤ 300 kb
YAC
S. cerevisiae
200-2000 kb
Vettori per applicazioni specializzate
¾ Vettori per il clonaggio di DNA a singolo filamento
¾ Vettori per la preparazione di sonde a RNA
¾ Vettori per l’espressione di proteine:
• Vettori che massimizzano la sintesi proteica
• Vettori che semplificano la purificazione delle proteine ricombinanti
• Vettori che favoriscono la solubilizzazione delle proteine espresse
• Vettori che promuovono l’esportazione delle proteine
I PLASMIDI
La biologia dei plasmidi naturali: caratteristiche generali
I plasmidi sono molecole di DNA extracromosomico che si propagano
stabilmente nei batteri perché in grado di autoreplicarsi
Nella maggioranza dei casi assumono la forma di molecole circolari di
DNA a doppio filamento,
filamento con dimensioni che vanno da 1,5 a 500 kb
Sono ampiamente diffusi nei procarioti
Non sono indispensabili alla sopravvivenza della cellula ospite, tuttavia le
conferiscono talvolta fenotipi molto utili:
resistenza ad antibiotici
sintesi di antibiotici
fermentazioni di zuccheri
sintesi di enterotossine
resistenza a metalli pesanti
sistemi di restrizione-modificazione del DNA
degradazione di composti aromatici
La biologia dei plasmidi naturali: caratteristiche generali
Lo spettro d’ospite: ampio o ristretto
Sequenza ORI
Geni del plasmide coinvolti nella replicazione
Il numero di copie: basso (1 – 4), medio (~10) e alto (20 – 40)
Meccanismi molecolari che regolano la replicazione
la stabilità segregativa
Regione par
Superavvolgimento
Incompatibilità
Utilizzo dello stesso meccanismo di controllo della replicazione
I plasmidi come vettori di clonaggio:
caratteristiche desiderabili
9 Basso peso molecolare
facili da manipolare
facili da purificare
in genere sono ad alto numero di copie
9 siti unici per un ampio numero di enzimi di restrizione
9 marcatori genetici selezionabili
pBR322, il capostipite dei
vettori plasmidici artificiali
passaggi molecolari per la
creazione di pBR322
Mappa di restrizione di pBR322
11 siti unici di restrizione nel
gene TcR e 6 nel gene ApR,
utili per il clonaggio
pBR322
4361 bp
pBR322
4361 bp
La famiglia dei
plasmidi pUC
I vantaggi del Multiple Cloning Site
1. Aumenta la flessibilità delle strategie
di clonaggio poiché aumenta la scelta
degli enzimi di restrizione utilizzabili
per il clonaggio.
2. Si può effettuare un clonaggio con
due diversi enzimi di restrizione, senza
rischiare di rimuovere parti importanti
del vettore, eliminando così il problema
della ricircolarizzazione del plasmide.
3. L’MCS di pUC è inserito all’interno
del gene lacZ permettendo la selezione
bianco/blu dei cloni contenenti il
plasmide ricombinante.
Inserzione di un frammento di DNA nel plasmide pUC19
HOCH2
HOCH2
O
O
Galactose
HO
HO
Glucose
O
OH
HO
OH
OH
Lactose
O-β-D-galactopyranosyl-(1->4)-β-D-glucopyranose
X-Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside
β-Galactosidease
Lac Z
gene product
HOCH2
O
Galactose
HO
HO
O
(Colorless)
Cl
Br
OH
X-Gal
H2O
N
H
X-Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside
β-Galactosidease
HOCH2
O
Cl
Galactose
HO
HO
OH
HO
Br
OH
N
H
Blue
So How Do You Know If
You Cloned Something?
IPTG - Induces
expression of lacZ
X-Gal - A lactose analog
which turns blue when
split by β-galactosidase
Ampicillin - Kills all
bacteria that lack the
plasmid
So How Do You Know If
You Cloned Something?
Blue colonies - Express β-galatosidase
IPTG - Induces
expression of lacZ
X-Gal - A lactose analog
which turns blue when
split by β-galactosidase
Ampicillin - Kills all
bacteria that lack the
plasmid
which metabolizes colorles X-gal to blue
and turn blue thus lacZ is not disrupted
Cloned fragments
and there is no foreign DNA cloned
disrupt lacZ thus make
no b-galactosidase and
colonies remain white
Introduzione dei vettori plasmidici in cellule batteriche
Trasformazione con CaCl2
Batteri trattati con soluzioni fredde di ioni bivalenti, in particolare di ioni
calcio, lasciano entrare molecole di DNA in modo più efficiente. Si
ipotizza che il calcio modifichi le proprità chimico-fisiche della parete e
della membrana plasmatica rendendole più permeabili al DNA.
Introduzione dei vettori plasmidici in cellule batteriche
Elettroporazione
Le cellule (procariotiche ed eucariotiche) sottoposte a stimolazione
elettrica possono internalizzare il DNA. Impulsi elettrici ad alto voltaggio
destabilizzano la membrana plasmatica e inducono la formazione di pori
transienti del diametro di alcuni nanometri, attraverso cui possono
passare molecole di DNA.
Apparecchio per l’elettroporazione
cuvette
cuvette
0.4cm
I metodi per la purificazione del DNA plasmidico
1. Gradiente di densità in CsCl contenente etidio bromuro
Le molecole di DNA a doppio filamento circolari chiuse assorbono
meno EtBr rispetto alle lineari. Dal momento che la densità dei
complessi DNA-EtBr è inversamente proporzionale alla quantità
del composto intercalante, le molecole di plasmide hanno una
densità maggiore di quella del DNA lineare cromosomico e
possono quindi essere separate in un gradiente di densità di CsCl
2. Lisi alcalina delle cellule batteriche e
precipitazione
selettiva
del
DNA
plasmidico.
Trattamento con lisozima per indebolire la parete
cellulare. Trattamento con Sodio Dodecil Solfato
(SDS) per degradare la membrana plasmatica e
con NaOH per denaturare il frammenti lineari ad
alto peso molecolare di DNA cromosomico.
Precipitazione selettiva del DNA cromosomico ad
alto peso molecolare con sodio acetato a pH
acido.
3. Kit
commerciali
purificazione.
di
estrazione
e
Associano la lisi alcalina all’utilizzo di resine a
scambio ionico preimpaccate in colonne.
4. Lisi batterica in gel di agarosio per
plasmidi di grandi dimensioni.
Dopo trattamento con lisozima i batteri vengono
lisati in gel di agarosio a cui viene aggiunto un
detergente. Il DNA plasmidico viene recuperato
direttamente dal gel.
IL BATTERIOFAGO λ
La biologia del fago λ: caratteristiche generali
La biologia del fago λ: caratteristiche generali
ciclo litico e ciclo lisogenico del fago λ
Tappe principali del ciclo litico del fago λ

Infezione
Circolarizzazione del genoma
Replicazione bidirezionale del genoma
Replicazione a cerchio rotante
Tappe principali del ciclo litico del fago λ

Infezione
Circolarizzazione del genoma
Replicazione bidirezionale del genoma
Replicazione a cerchio rotante

Sintesi delle proteine della testa e della
coda
Impaccamento del genoma nella testa
Assemblaggio della coda

Impaccamento del DNA genomico del fago λ nelle
particelle fagiche
Un singolo genoma viene tagliato in corrispondenza
della sequenza cos e inserito nel testa
La biologia del fago λ: il genoma
Non essenziale
per il ciclo litico
COS
COS
Non essenziale
per il ciclo litico
Il genoma del fago λ è una molecola di DNA lineare a doppio
filamento lunga 48,5 kb. Al 5’ di ciascuna delle estremità è
presente un prolungamento a singolo filamento di 12 nt che
costituisce le estremità cos
Il fago λ come vettore di clonaggio
Il fago λ come vettore di clonaggio
Il braccio sinistro contiene
l’ informazione genetica
per la produzione delle
teste e delle code.
Il braccio destro contiene i
geni per la replicazione del
DNA e per la lisi delle
cellule.
Il frammento intermedio
porta i geni per i processi
di integrazione-escissione.
Selezione delle placche fagiche ricombinanti
Prodotti della reazione di ligasi
A
Saldatura di due bracci
Non danno progenie fagica. Non si
impaccano nella testa poiché hanno una
dimensione <37 kb (~29 kb)
Genoma selvatico
Non danno progenie fagica nel ceppo E.
coli lisogeno per il fago P2, poiché hanno
fenotipo Spi+, ossia sono sensibili alla
inibizione da parte del profago P2
B
C
Genoma ricombinante
Danno progenie fagica nel ceppo E. coli
lisogeno per il fago P2, poiché sono Spi-,
ossia sono resistenti alla inibizione da P2
I vettori λ EMBL
Introduzione dei vettori λ in cellule batteriche:
Impaccamento in vitro del DNA del fago λ
+
+
concatenamero del genoma ricombinante
proteine di
+ assemblaggio
Molecole di DNA di dimensioni
inferiori a 37 kb o superiori a 52 kb
non vengono impaccate. Questo
determina il limite di clonaggio per
inserti di dimensioni non superiori
alle 23 kb
Efficienza di trasferimento del vettore λ nelle cellule ospiti:
Trasformazione: 103-104 placche/μg DNA ricombinante
Trasfezione: 106 placche/μg DNA
Produzione delle teste e delle code del fago λ per
l’impaccamento in vitro del DNA ricombinante
Crescita in laboratorio del fago λ
Fago λ
Batteri
In laboratorio il fago lambda viene
cresciuto su una patina di cellule
batteriche.
I batteri e le particelle di fago vengono
mescolate con top agar liquido non
troppo caldo.
La sospensione viene versata su una
piastra di agar già preparata, sulla quale
il top agar viene lasciato solidificare.
La piastra è incubata per 12-16 h a 37°C.
Vantaggi dei vettori fagici rispetto ai vettori
plasmidici
9 Maggiore capienza
9 Maggiore efficienza di trasferimento del DNA nelle cellule batteriche
9Facilità di purificazione del vettore ricombinante
I FAGI A SINGOLA
ELICA
La biologia del fago M13:
il ciclo vitale
9Il genoma del fago M13 è costituito da una
molecola di DNA circolare a singola elica, lunga
6407 nt.
9M13 infetta solo ceppi F+ poiché entra nella
cellula batterica attraverso il pilo codificato dal
fattore F.
9Il DNA viene convertito nella forma replicativa
intermedia a doppio filamento (RF). Vengono
sintetizzate circa 100 copie della forma RF.
9Inizia la replicazione a cerchio rotante di
un’unica elica del genoma virale. Vengono
sintetizzate circa 1000 copie.
9Il genoma viene assemblato alle proteine per
costituire le nuove particelle virali che fuoriescono
dalla cellula batterica senza causarne la lisi.
Il batteriofago M13 come vettore per il clonaggio di
DNA a singolo filamento
Il genoma del fago M13,
nella sua forma replicativa
intermedia
RF,
viene
RF
utilizzato come vettore di
clonaggio.
Modificazioni del genoma selvatico per l’ottimizzazione del vettore:
• Aggiunta del gene lacZ’ come marcatore genetico per la selezione bianco/blu
delle placche positive contenenti il genoma ricombinante
• Aggiunta di un polylinker all’interno del gene lacZ
• Eliminazione dei siti di restrizione naturali
Tappe del clonaggio di DNA a singolo filamento nei
vettori derivati dal fago M13
Clonando l’inserto nell’orientamento
opposto si ottengono copie multiple
dell’elica complementare
• Si linearizza il vettore M13 a doppio
filamento con un enzima di restrizione,
come se fosse un plasmide.
• Si mescola il vettore linearizzato con
l’inserto
avente
estremità
coesive
compatibili con quelle del vettore. Si
aggiunge la ligasi.
•Il prodotto della reazione di ligasi viene
inserito nelle cellule E. coli mediante
trasformazione.
• Nell’ospite batterico il vettore verrà replicato
prima in maniera bidirezionale producendo
copie a doppia elica e poi a cerchio rotante
producendo copie a singola.
• Si selezionano le placche di colore bianco
contenenti il vettore ricombinante e si
scartano le blu contenenti il vettore virale
senza inserto.
Perché si clona DNA a singolo filamento?
9 Per sequenziare l’inserto clonato con il metodo di Sanger
9 Per mutare l’inserto con le tecniche di mutagenesi sito-specifica
9 Per ottenere sonde di ibridazione a singola elica
Vantaggi del vettore M13
9 La forma replicativa RF a doppio filamento può essere manipolata come un
normale plasmide
9 Non ci sono limiti nelle dimensioni dell’inserto come per il vettore lambda
poiché le dimensioni delle particelle virali dipondono dalla lunghezza del
DNA che contengono. Tuttavia inserti di dimensioni maggiori di 8-9 kb
rendono instabili il vettore
I COSMIDI
Caratteristiche dei vettori cosmidici
I cosmidi sono vettori di clonaggio creati dall’uomo. Uniscono alcune proprietà dei
pasmidi e dei fagi.
Sono plasMIDI contenenti la regione COS del fago lambda.
Si replicano come i plasmidi poiché contengono la sequenza ORI, ma si impaccano
nelle teste proteiche a formare le particelle virali come i fagi poiché contengono le
estremità cos.
Dimensioni del cosmide: ~5 kb
ORI
Polylinker
Marcatori genetici selezionabili
(in genere il gene ApR e lacZ’)
Sito Cos
Schema semplificato del clonaggio in vettori cosmidici
Linearizzazione del cosmide con
un enzima di restrizione
Digestione enzimatica del DNA
genomico
e
selezione
dei
frammenti con dimensioni di 3247 kb
Reazione di ligasi
Impaccamento in vitro
Infezione delle cellule batteriche.
Nelle cellule ospiti il cosmide
circolarizza e si replica come un
plasmide
Selezione bianco/blu delle colonie
batteriche ampicillina resistenti in
terreno contenente ampicillina e
X-Gal
Svantaggi nella sintesi del cosmide ricombinante
¾ Ligazione tra i frammenti da clonare
¾ Circolarizzazione del plasmide
¾ Ligazione tra due molecole di vettore
Soluzioni
¾ Defosforilazione dei frammenti da clonare
¾ Digestione del cosmide con due enzimi
Clonaggio in vettori cosmidici
di ultima generazione
Vettore. Due siti cos separati da un
sito di restrizione per Sca I, che
produce estremità piatte. Digestione
del cosmide con BamH I e Sca I
Genoma. Digestione parziale del DNA
genomico con BamH I. Defosforilazione
dei frammenti di DNA genomico per
evitare la ligazione tra due frammenti
Vantaggi dei vettori cosmidici
9 Clonaggio di inserti di dimensioni comprese tra le 32 le 47 kb.
9 Migliore efficienza di trasferimento del vettore ricombinante nelle
cellule batteriche.
9Sono molto utili ai fini della creazione di una genoteca poiché gli
inserti di maggiori dimensioni permettono lo screening di un
numero più ridotto di cloni.
Plasmidi, fagi e cosmidi a confronto
Vettore
Dimensioni
inserto
propagazione
Introduzione
nei batteri
Plasmidi
5-10 kb
Replicazione del plasmide
Trasformazione
Fago λ
5-23 kb
Riproduzione del fago
Infezione fagica
Cosmidi
35-45 kb
Infezione fagica
I VETTORI P1
La biologia del fago P1
Il genoma del batteriofago P1 è costituito da una molecola di DNA a
doppio filamento, lunga 115 kb e impaccata all’interno di una testa fagica.
Dopo l’infezione del batterio il fago P1 può:
attivare il ciclo litico producendo
100-200 particelle fagiche e
lisando il batterio
reprimere il ciclo litico e
mantenersi nella cellula come
un grosso plasmide a basso
numero di copie
Il fago P1 possiede due origini di replicazione, una per
controllare la replicazione litica (fagica), e l’altra per
mantenere il plasmide durante la crescita non litica
Il fago P1 come vettore di clonaggio
Dimensioni del vettore: ~ 15 kb
sito pac
siti loxP
Marcatori genetici
(ApR, TcR, KanR, sacB)
Replicone plasmidico
Replicone fagico (litico)
La ricombinazione sito-specifica
La sequenza interposta tra i due
siti loxP orientati come ripetizioni
dirette viene deleta
La sequenza interposta tra i due
siti loxP orientati come ripetizioni
invertite viene invertita
Sito loxP riconosciuto dalla ricombinasi Cre del batteriofago P1. I siti loxP
sono sequenze di 34 bp che comprendono due ripetizioni invertite di 13 bp
che fiancheggiano un elemento centrale di 8 bp
Tappe del clonaggio in vettori derivati
dal fago P1
Il vettore viene digerito in modo da
generare
due
bracci
che
vengono
defosforilati per impedirne l’autosaldatura
Digestione
enzimatica
del
DNA
genomico e selezione dei frammenti con
dimensioni di 85-100 kb
Reazione
di
ligasi
per
saldare
frammenti di DNA genomico ai bracci
i
Impaccamento
in
vitro
del
vettore
ricombinante in presenza delle teste e delle
code fagiche e in presenza dell’enzima pacasi
Infezione di un ceppo cre+ di E. coli. Nelle
cellule ospiti la ricombinasi induce la
circolarizzazione del vettore che inizia a
replicarsi come un plasmide
Si può incrementare l’amplificazione del
numero di copie del vettore inducendo il
replicone litico del fago
Tappe del clonaggio in vettori derivati dal fago P1
I VETTORI
BAC
Caratteristiche dei vettori BAC
• siti cos del fago λ
• siti loxP del fago P1
• polylinker
• marcatori genetici selezionabili
(CmR, lacZ’, sacB)
• oriS e repE per la replicazione del
fattore F
• i geni par per la stabilità segregativa
I Cromosomi Artificiali Batterici (BAC) sono
vettori che derivano dal fattore sessuale F
Vettori di clonaggio a confronto
Vettore
Dimensioni
inserto
propagazione
Introduzione
nei batteri
Plasmidi
5-10 kb
Trasformazione/
Elettroporazione
Fago λ
5-23 kb
Infezione fagica
Cosmidi
35-45 kb
Infezione fagica
Fago P1
85-100 kb
Infezione fagica
BAC
≤ 300 kb
Replicazione del Fattore F
Trasformazione/
Elettroporazione
I VETTORI
YAC
YAC: Yeast Artificial Chromosome
ARS: Autonomously Replicating
region, sequenza a replicazione
autonoma di lievito.
CEN: è una sequenza di 125 bp
tratta dai cromosomi di lievito che
permette
una
segregazione
regolare dei vettori durante la
mitosi delle cellule.
TEL: è una sequenza di 13 bp
ripetuta molte volte. E’ tratta dai
telomeri dei cromosomi di lievito e
serve a dare stabilità al vettore.
Vantaggi: si possono clonare
frammenti di DNA molto grandi
(fino a 1Mb)
Svantaggi: i costrutti sono difficili
da manipolare perché fragili e
nell’ospite tendono a ricombinare
Introduzione di DNA nelle cellule di lievito
¾ Produzione di sferoplasti e trattamento con polietilenglicole
¾ Elettroporazione
¾ Coniugazione batterio lievito
Marcatori genici di selezione
Geni implicati nella biosintesi di uno specifico nutriente, in genere un amminoacido.
I marcatori più utilizzati sono: His3, Leu2, Trp1, Lys2, Ura3.
Ura3
Il ceppo di lievito utilizzato nella trasfezione deve essere difettivo per la via
biosintetica in questione.
I ceppi che hanno internalizzato il vettore vengono identificati per la loro capacità di
complementare il difetto nutrizionale, pertanto vengono fatti crescere su un terreno
privo dello specifico nutriente.
Plasmidi per la preparazione di sonde a RNA
Sono plasmidi caratterizzati dalla presenza
di uno o più promotori fagici per la
trascrizione dell’inserto.
Caratteristiche dei promotori fagici T3, T7 ed
Sp6:
1. sono promotori molto forti
2. non sono riconosciuti dalla RNA pol di
E.coli
3. le RNA pol dei fagi T3, T7 ed Sp6 sono
enzimi semplici da manipolare
Possibili domande di esame sui vettori di clonaggio
Quali sequenze contengono
Come si clonano gli inserti
Quali sono i limiti delle dimensioni degli inserti
Come vengono inseriti nella cellula ospite
Come si replicano all’interno della cellula ospite
Come vengono selezionate le colonie o le placche contenenti i vettori ricombinanti