BD Middlebrook 7H10 Agar

ISTRUZIONI PER L'USO
TERRENI SU PIASTRA
PRONTI ALL'USO
PA-254520.07
Rev.: Sep 2012
BD Middlebrook 7H10 Agar
USO PREVISTO
BD Middlebrook 7H10 Agar (agar 7H10 di Middlebrook) è usato per l’isolamento e la coltura
di micobatteri.
PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA
Metodo microbiologico.
Negli ultimi cento anni, sono stati allestiti numerosi terreni per la coltura dei micobatteri. I primi
erano preparati a base d’uovo che comprendevano anche i terreni di Löwenstein-Jensen e
Petragnani. Dubos e Middlebrook hanno svolto un ruolo fondamentale nello sviluppo di
numerose formulazioni contenenti acido oleico e albumina come ingredienti chiave per
facilitare la crescita dei bacilli tubercolari e proteggere i microrganismi da svariati agenti
tossici.1 Successivamente, Middlebrook e Cohn hanno ulteriormente migliorato l’agar con acido
oleico e albumina, ottenendo una crescita più rapida e rigogliosa di Mycobacterium spp. sul
terreno, denominato 7H10.2,3 È stato documentato che il terreno 7H10 consente la crescita di
un minor numero di agenti contaminanti rispetto ai terreni a base d’uovo comunemente
utilizzati per la coltura di micobatteri.4
BD Middlebrook 7H10 Agar contiene svariati sali inorganici che forniscono sostanze
essenziali per la crescita di micobatteri. Il citrato di sodio, una volta convertito in acido citrico,
serve a mantenere alcuni cationi inorganici in soluzione. Il glicerolo è una fonte abbondante di
carbonio ed energia. L’acido oleico e altri acidi grassi a catena lunga possono essere utilizzati
dai bacilli tubercolari e svolgono un ruolo essenziale nel metabolismo dei micobatteri. La
catalasi distrugge i perossidi tossici eventualmente presenti nel terreno. L’effetto principale
dell’albumina è quello di proteggere dagli agenti tossici i bacilli tubercolari, migliorando
l'isolamento primario di questi ultimi. La parziale inibizione dei batteri contaminanti si ottiene
grazie alla presenza del colorante verde malachite.
REAGENTI
BD Middlebrook 7H10 Agar
Formula* per litro di acqua purificata
Solfato di magnesio
0,025 g
Albumina bovina V
Citrato ferrico di ammonio
0,04
Catalasi
0,4
Piridossina
Citrato di sodio
Solfato di ammonio
0,5
Solfato di zinco
Glutammato monosodico
0,5
Solfato di rame
Fosfato disodico
1,5
Biotina
Fosfato monopotassico
1,5
Cloruro di calcio
Agar
17,0
Verde malachite
Cloruro di sodio
0,85
Glicerolo
Glucosio
2,0
Acido oleico
pH 6,6 ± 0,2
*Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di rendimento.
5,0 g
0,004
0,001
0,001
0,001
0,0005
0,0005
0,00025
5,0
0,05 mL
PRECAUZIONI
. Solo per uso professionale.
Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazioni cromatiche,
essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento.
Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i
prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO.
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Le procedure di laboratorio per i micobatteri richiedono attrezzature e tecniche speciali per
minimizzare i rischi biologici.5-7 Attenersi al livello di sicurezza biologica 3 durante il trattamento
dei campioni e delle colture.
CONSERVAZIONE E VITA UTILE
Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 – 8 °C nella confezione originaria fino a
immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono
essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i
tempi di incubazione raccomandati.
Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana
se conservate in luogo pulito a 2 – 8 °C.
CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL’UTENTE
Inoculare i campioni rappresentativi con i seguenti ceppi (per informazioni più dettagliate, v.
ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO). Incubare a 35 ± 2 °C in aerobiosi o in atmosfera
aerobica arricchita con anidride carbonica.
Ceppo
Incubazione
Risultato
Mycobacterium tuberculosis H37Ra
2 – 3 settimane
Crescita da buona a eccellente
ATCC 25177
Mycobacterium fortuitum DSM 46621
2 – 3 settimane
Crescita da buona a eccellente
Mycobacterium smegmatis DSM 43061 2 – 5 giorni
Crescita da buona a eccellente
Mycobacterium terrae ATCC 15755
2 – 3 settimane
Crescita da discreta a eccellente
Staphylococcus aureus ATCC 25923
2 – 5 giorni
Inibite
Escherichia coli ATCC 25922
2 – 5 giorni
Inibite
Non inoculate
Ambrate, con una leggerissima sfumatura verdastra
PROCEDURA
Materiali forniti
BD Middlebrook 7H10 Agar (piastre Stacker da 90 mm). Microbiologicamente controllate.
Materiali non forniti
Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio necessarie.
Tipi di campioni
Il terreno viene utilizzato sia per l'isolamento e la coltura di micobatteri da campioni clinici, sia
per la coltura di micobatteri in alcuni test specifici (come nelle analisi dei disinfettanti per i
micobatteri).
Per informazioni sui campioni più adatti, consultare la bibliogafia.6-10
Procedura del test
Le procedure dei test sono quelle raccomandate dai Centers for Disease Control and
Prevention (CDC) per l’isolamento primario da campioni contenenti micobatteri. Per la
decontaminazione e la digestione usare un agente delicato ma efficace, come la soluzione a
base di N-acetil-L-cisteina e idrossido di sodio (NALC-NaOH). Per informazioni dettagliate sui
metodi di decontaminazione e coltura, consultare la bibliografia.4-10
Dopo l’inoculo, tenere le piastre al riparo dalla luce e disporle, con il terreno rivolto in basso, in
un contenitore BD GasPak, usando l'involucro monouso GasPak per liberare anidride
carbonica, o un altro sistema in grado di generare un'atmosfera aerobica arricchita con
anidride carbonica. Incubare a 35 ± 2 °C. Evitare l'essiccamento del terreno durante
l'incubazione.
N.B. Incubare a 25 – 33 °C le colture da lesioni di cute e tessuti molli che si sospetta
contengano M. marinum, M. ulcerans, M. haemophilum, M. chelonae o altre specie con
temperatura ottimale inferiore. Incubare una coltura duplicata a 35 – 37 °C.5,9
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Risultati
Leggere i risultati delle colture entro 5 – 7 giorni dall’inoculo e successivamente una volta la
settimana per non più di 8 settimane. Per informazioni più dettagliate su morfologia e
pigmentazione delle colonie, consultare la bibliogafia.6-10
Per esaminare le colture, capovolgere le piastre sulla piattaforma di un microscopio per
dissezione. Leggere con ingrandimento 10 – 60x, usando luce trasmessa. Effettuare la
scansione rapida a 10 – 20x per individuare la presenza di colonie. Per osservare la morfologia
delle colonie, ad es. le colonie a serpentina, può risultare utile un ingrandimento più elevato (30
– 60x).
Registrare le seguenti osservazioni.5,6
1. Giorni necessari perché le colonie diventino macroscopicamente visibili.
2. Numero di colonie:
Nessuna colonia = Negativo
Meno di 50 colonie = Conta effettiva
50 – 100 colonie = 1+
100 – 200 colonie = 2+
Quasi confluenti (200 – 500) = 3+
Confluenti (più di 500) = 4+
3. Produzione di pigmento
Bianco, crema o color cuoio = Non cromogeno (NC)
Limone, giallo, arancio, rosso = Cromogeno (Ch)
Gli strisci colorati presentano bacilli acido-resistenti, refertati soltanto come “bacilli acidoresistenti”, a meno che non vengano eseguiti test definitivi. Per informazioni su ulteriori test di
differenziazione e procedure utili per completare l'identificazione degli organismi isolati,
consultare le relative voci della bibliografia.4-10
PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
BD Middlebrook 7H10 Agar è un terreno convenzionale a base di agar per l'isolamento e la
coltura di micobatteri da campioni clinici.4,6,7-11
Poiché il terreno è solo parzialmente selettivo, possono svilupparsi bacilli diversi dai micobatteri se i
campioni non vengono adeguatamente pretrattati per essere decontaminati.6,7,9,10
La negatività delle colture non esclude la presenza di un'infezione da micobatteri. È buona pratica
inoculare vari terreni (solidi e liquidi) basati su formule differenti.6-10
BIBLIOGRAFIA
1. Dubos, R.J., and G. Middlebrook. 1947. Media for tubercle bacilli. Am. Rev. Tuberc.
56:334-345.
2. Middlebrook, G., and M.L. Cohn. 1958. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods.
Am. J. Pub. Health. 48:844-853.
3. Middlebrook, G., M.L. Cohn, W.E. Dye, W.B. Russell, Jr., and D. Levy. 1960. Microbiologic
procedures of value in tuberculosis. Acta Tuberc. Scand. 38:66-81.
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mycobacteriology. PHS Publication No. 1547. U.S. Government Printing Office,
Washington, D.C.
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8. Baron, E.J., L.R. Peterson, and S.M. Finegold. 1994. Bailey & Scott's diagnostic
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9. Pfyffer, G.E., B.A. Brown-Elliott, and R.J. Wallace, Jr. 2003. Mycobacterium: general
charcteristics, isolation, and staining procedures. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H.
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Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed.
American Society for Microbiology, Washington, D.C.
10. DIN 58943. 1996. Diagnosis of tuberculosis. Part 3: Detection of mycobacteria by culture
methods. Beuth Verlag, Berlin.
11. Vincent, V., B.A. Brown-Elliott, K.C. Jost, Jr., and R.J. Wallace, Jr. 2003. Mycobacterium:
phenotypic and genotypic identification. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M.
A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society
for Microbiology, Washington, D.C.
CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ
BD Middlebrook 7H10 Agar
N. di cat. 254520
Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20
N. di cat. 254521
Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 120
ULTERIORI INFORMAZIONI
Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona.
Becton Dickinson GmbH
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