Monitoring angiogenesis in tissue engineering - ETH E

Diss. ETH No. 21148
Monitoring angiogenesis in tissue
engineering through time-lapsed
vascular imaging
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Laura Nebuloni
MSc, Politecnico di Milano, Italy
born 4th December, 1984
citizen of Italy
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Ralph Müller, examiner
Dr. Gisela Anna Kuhn, co-examiner
Prof. Dr. Damien Lacroix, co-examiner
2013
Summary
The complex network of blood vessels is responsible for carrying the necessary
nutrients and oxygen to all cells of a living organism. When needed, new blood
vessels can form through a process called angiogenesis or neovascularization. Under
physiological conditions, this mechanism is under strict control of a number of factors, including the family of vascular endothelial growth factors (VEGF), angiopoietins (ANG) and fibroblast growth factors (FGFs). However, when the interaction
between these factors is unbalanced, it could lead to either poor or excessive angiogenesis, which could result in the loss or even failure of tissues and organs. Several
diseases are caused or characterized by pathological angiogenesis, such as tumors,
Alzheimer’s disease, atherosclerosis, diabetes, osteoporosis, obesity, and many more.
Regenerative medicine or tissue engineering has nowadays emerged as a new field of
science with the purpose of regenerating or reconstructing deaseased tissues. Tissue
engineering strategies aim at replacing defective tissues with engineered substitutes.
A major limitation of such tissue constructs is their limited or absent vascularization
after implantation. Therefore, several approaches are currently being developed to
induce angiogenesis in these biomaterials. High-resolution, three-dimensional, noninvasive imaging techniques are required to monitor this intrinsically time-dependent
process. The available in vivo imaging modalities for the assessment of angiogenesis
are based on Computed Tomography (CT), Magnetic Resonance Imaging (MRI),
Positron Emission Tomography (PET), Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) and optical methods, which are lacking in resolution and/or spatial
information. In vivo micro-computed tomography (micro-CT) demonstrated great
abilities in imaging live biological processes. Therefore, it shows high potential for
use in high-resolution time-lapsed vascular imaging and for the investigation of angiogenesis in vivo. The present thesis was developed to address the need of an
adequate imaging method for angiogenesis. It was divided in the following aims: (i)
development of an in vivo imaging method for time-lapsed quantification of the vas-
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Summary
cular network; (ii) monitoring of angiogenesis in applications of tissue engineering.
In a first step, commercially available vascular contrast agents were tested in
terms of imaging and pharmacokinetic properties. Only a nanoparticulated bloodpool formulation (ExitronT M nano 12000) provided all the necessary requirements
for high-resolution in vivo micro-CT imaging: safety, strong blood enhancement,
contrast stability, negligible extra-vascular leakage. A new method for time-lapsed
vascular imaging was then developed using this contrast agent. The method allowed
the quantification of the major and medium vessels of the network with standard
morphometric analysis, and of the small vessels below resolution with a new approach based on a densitometric analysis of the contrast agent. The technique was
found to be reproducible and robust. It also proved to be sensitive to vascular
changes in an in vivo model for angiogenesis based on arterial occlusion. Correlations with histological analysis and with ex vivo ultra-high resolution micro-CT of
vascular corrosion casts proved the accuracy of the method.
The technique developed in the first aim of the thesis was then applied to monitor vascular ingrowth in an established model for tissue engineering. The model
consisted of injecting a biomaterial based on fibrin gel, loaded with different concentrations of vascular endothelial growth factor (VEGF). Subsequently, the vascular
density inside and outside the biomaterial was monitored with in vivo micro-CT
over a period of 2 weeks. Different vascularization levels could be detected with this
method and led to different degradation times of the biomaterial. In accordance
with literature, high doses of VEGF led to the formation of aberrant vascular structures, while biomaterials that did not receive a minimum amount of VEGF did not
show a significant integration within the surrounding tissues.
In conclusion, this thesis revealed that in vivo micro-CT can be used to assess
angiogenesis in a high-resolution, three-dimensional and non-invasive fashion. The
results presented here underlined the finding that this novel imaging approach can
provide useful information for the identification of correct biomaterial degradation
properties and efficient pro-angiogenic strategies.
vi
Sommario
La complessa rete di vasi sanguigni è responsabile dell’apporto dei nutrienti e
dell’ossigeno a tutte le cellule di un organismo vivente. Quando necessario, nuovi
vasi possono essere formati attraverso un processo chiamato angiogenesi o neovascolarizzazione. In condizioni fisiologiche, questo meccanismo è sotto stretto controllo di
diversi fattori, che includono la famiglia del fattore di crescita dell’endotelio vascolare
(VEGF), angiopoietine (ANG) e i fattori di crescita dei fibroblasti (FGF). Tuttavia,
quando l’interazione tra questi fattori è sbilanciata, essa può portare ad angiogenesi carente o eccessiva, che può risultare nella perdita di tessuti e organi. Diverse
malattie sono causate o caratterizzate da angiogenesi patologica, come ad esempio
i tumori, il morbo di Alzheimer, l’aterosclerosi, il diabete, l’osteoporosi, l’obesità e
tante altre. La medicina rigenerativa o ingegneria dei tessuti sta ad oggi emergendo
come un nuovo settore scientifico con l’obiettivo di rigenerare o ricostruire tessuti
malati. Le strategie di ingegneria tissutale mirano a rimpiazzare tessuti difettosi con
sostituti ingegnerizzati. Una grossa limitazione di questi costrutti è la loro scarsa
o assente vascolarizzazione seguente all’impianto. Di conseguenza, diversi approcci
sono attualmente in fase di sviluppo per indurre l’angiogenesi in questi biomateriali.
Per monitorare questo processo intrinsecamente tempo-dipendente, sono necessarie
tecniche di imaging ad alta risoluzione, tridimensionali e non-invasive. Le modalità
di imaging in vivo al momento disponibili sono basate su Tomografia Computerizzata (CT), Risonanza Magnetica (MRI), Tomografia a Emissione di Positroni (PET),
Tomografia Computerizzata a Emissione di Singoli Fotoni (SPECT) o sistemi ottici,
che presentano carenze in termini di risoluzione e/o informazione spaziale. L’utilizzo
in vivo della micro-tomografia computerizzata (micro-CT) ha dimostrato grandi capacità nell’osservazione di processi biologici viventi. Di conseguenza, essa mostra
un alto potenziale per l’impiego nell’imaging vascolare ad alta risoluzione e per il
monitoraggio dell’angiogenesi in vivo. La presente tesi è stata sviluppata per affrontare il bisogno di un adeguato metodo di imaging dell’angiogenesi. Il lavoro è
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Sommario
stato diviso nei seguenti obiettivi: (i) sviluppo di un metodo di imaging in vivo per
la quantificazione temporale della rete vascolare; (ii) monitoraggio dell’angiogenesi
in applicazioni di ingegneria dei tessuti.
Nella prima parte della tesi, diversi agenti di contrasto vascolare disponibili sul
mercato sono stati testati in termini di proprietà di visualizzazione e farmacocinetiche. Solo il mezzo di contrasto basato su nano-particelle (ExiTronT M nano
12000) ha fornito tutti i requisiti necessari per l’imaging vascolare ad alta risoluzione
con micro-CT: non-citotossicità, stabilità e alti livelli di contrasto, perdite extravascolari trascurabili. Un nuovo metodo per l’imaging vascolare è stato successivamente sviluppato utilizzando questo mezzo di contrasto. Questo metodo ha permesso la quantificazione dei maggiori vasi sanguigni attraverso analisi standard di
morfometria, e dei vasi più piccoli al di sotto della risoluzione attraverso un nuovo
approccio basato sull’analisi della densità. I risultati hanno mostrato che la tecnica è riproducibile e robusta. Hanno inoltre mostrato che il metodo è sensibile a
cambiamenti vascolari in un modello in vivo per l’angiogenesi basato sull’occlusione
arteriosa. Le correlazioni con l’analisi istologica e con l’analisi ex vivo ad altissima
risoluzione di riproduzioni della rete vascolare hanno dimostrato l’accuratezza del
metodo.
La tecnica sviluppata nella prima parte della tesi è stata poi applicata per monitorare la crescita vascolare in un noto modello di ingegneria dei tessuti. In questo
modello un biomateriale (gel fibrinico) è stato iniettato in vivo, con diverse concentrazioni di fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF). Successivamente, la
densità vascolare all’interno e all’esterno del biomateriale è stata monitorata con
micro-CT in vivo per un periodo di 2 settimane. Con il metodo sviluppato è stato
possibile individuare diversi livelli di vascolarizzazione del biomateriale, che hanno
portato a diversi livelli di degradazione. In accordo con la letteratura scientifica,
alte dosi di VEGF hanno condotto alla formazione di strutture vascolari aberranti,
mentre i biomateriali che non avevano ricevuto nessun fattore di crescita non hanno
mostrato una integrazione significativa con i tessuti circostanti.
In conclusione, questa tesi ha rivelato che la micro-CT in vivo può essere utilizzata per valutare l’angiogenesi ad alta risoluzione, in tre dimensioni e in modo
non-invasivo. I risultati hanno evidenziato che questo nuovo approccio può fornire
informazioni preziose per l’identificazione di adeguate proprietà dei biomateriali e
di efficienti strategie pro-angiogeniche.
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