Amnio chamberSF Amnio chamberSF

Amnio
chamberSF
Protocollo di utilizzo
Protocol of use
PER LA COLTURA IN SITU E LA SUCCESSIVE ANALISI DI
AMNIOCITI E VILLI CORIALI
FOR THE IN SITU CULTURE AND SUBSEQUENT ANALYSIS
OF AMNIOTICYTES AND CHORIONIC VILLI.
AmnioChamberSF è una cameretta in polistirene con coperchio,
saldata mediante un adesivo biocompatibile ad un vetrino da
microscopia SuperFrost®. Al termine della coltura, la cameretta viene
rimossa dalla slide. Il sistema è ottimizzato per la coltura in situ e la
successive analisi di amniociti e villi coriali.
EKAMC96SF Q.tà: 96 pezzi
Materiale fornito
Ogni scatola contiene 12 vassoi sterili e pronti per l’uso, per un totale di 96
AmnioChamberSF.
Dimensioni vetrino: 76x25 mm.
Area di cultura: 8,6 cm2
Validità: 5 anni.
Italiano
Protocollo per coltura in situ di amniociti
Nota: scongelare Amniomed Plus (cod. EKAMG200) in un bagnetto termostatato a
37°C, agitando adeguatamente prima dell’uso. Non richiede aggiunta di L-Glutamina,
antibiotici o siero.
1. Miscelare delicatamente la sospensione cellulare (ottenuta dopo centrifugazione di circa 7,5-10 ml di liquido amniotico a 10001500 rpm per 10 min) in 3 ml di Amniomed Plus e trasferire all’interno di AmnioChamberSF.
2. Incubare a 37°C, 5% CO2.
3. Al giorno 4°-5° controllare la slide, se sono visibili 5-6 colonie è possibile processarla; altrimenti cambiare completamente il terreno
di coltura con 3 ml di Amniomed Plus fresco e porre in incubatore.
4. Al giorno 6°/8° valutare la crescita mediante microscopio invertito. Quando l’area di crescita mostra un sufficiente numero di cellule
in mitosi aggiungere Colcemid alla concentrazione di 0,05ug/ml.
5. Incubare a 37°C, 5% CO2 per 2 – 3 ore.
Fissazione cromosomi e preparazione vetrino, metodo manuale
1. Rimuovere completamente il terreno.
2. Gocciolare 3 ml di soluzione ipotonica (H2O distillata, 0,6% sodio citrato, 0,1% KCl) e incubare a temperatura ambiente per 10
minuti.
3. Rimuovere la soluzione ipotonica e gocciolare 3 ml di soluzione di Ibraimov (H2O distillata, 5% acido acetico), incubare a
temperatura ambiente per 5 minuti.
4. Rimuovere la soluzione di Ibramov e gocciolare 3 ml di soluzione fissativa fresca (metanolo:acido acetico, 4:1) a temperature
ambiente. Il tempo di questa incubazione, non influenza il risultato finale.
5. Ripetere due volte il punto 4.
6. Mediante l’utilizzo dello speciale attrezzo fornito, staccare il vetrino dalla slide e procedure all’asciugatura in adeguate e costanti
condizioni di temperatura ed umidità relativa (28°C, 42%RH), mediante l’impiego di Optichrome (cod. EKAMH950).
Protocollo per coltura di campioni di villi coriali (CVS)
1. Porre la biopsia in una Petri da 60 mm, contenente 5 ml di RPMI 1640.
2. Lavare i villi con medium fresco per rimuovere i residui di sangue.
3. Mediante microscopio invertito rimuovere delicatamente i coaguli e i residui di decidua; trasferire i villi in una Capsula Petri (35 mm
Ø) con 3 ml di Hank’s Balanced Salts Solution senza Ca2+-Mg2+ e lavarli accuratamente
Cultura in situ
1. Trasferire i villi in un tubo da 15 ml, contenente 2 ml of Pronase E (4*106 PU/g) e incubare a temperatura ambiente per 4 - 6 minuti.
2. Aggiungere 3-5 ml di Hank’s Balanced Salts Solution senza Ca2+-Mg2+, fredda (circa +4°C).
3. Centrifugare per 5 minuti a 1500 rpm e rimuovere il surnatante.
4. Aggiungere 2 ml di Collagenase type II sterile (1 mg/ml) e incubare a 37°C per 20/40 minuti.
5. Aggiungere 3-5 ml di HBSS fredda (circa +4°C).
6. Centrifugare per 5 minuti a 1000 rpm e rimuovere il surnatante.
7. Aggiungere 1-2 ml di Amniomed Plus e risospendere il pellet. Centrifugare per 5 minuti a 1000 rpm e rimuovere il surnatante
8. Aggiungere 1-2 ml di Amniomed Plus e risospendere vigorosamente il pellet.
9. Dividere la sospensione cellulare in 1-3 AmnioChamberSF, a seconda del numero di cellule. Aggiungere 3 ml di Amniomed Plus a
ciascuna AmnioChamberSF.
10. Incubare a 37°C, 5% CO2.
11. Al giorno 4 valutare la crescita mediante microscopio invertito. Quando l’area di crescita mostra un sufficiente numero di cellule
in mitosi aggiungere Colcemid alla concentrazione di 0,05ug/ml.
12. Incubare a 37°C, 5% CO2 per 3-4 ore.
Fissazione cromosomi e preparazione vetrino
Vedi il protocollo per trattamento di amniociti.
AmniChamberSF is a polystyrene chamber with cover, sealed with a
strong biocompatible glue to a SuperFrost® microscope glass slide.
At the end of the in situ culture the chamber is removed from the
slide. The system is optimized for the in situ culture of amniocytes,
chorionic villi derived cells.
Ref. EKAMC96SF
Q.ty 96 pcs
Material supplied
Each box contains 12 sterile packages ready for use, for a total of 96 AmnioChamberSF.
Slide dimensions: 76x25 mm.
Culture area: 8,6 cm2
Validity: 5 years.
English
Amniocyte culture, in situ protocol
Note: thaw the Amniomed Plus (ref. EKAMG200) in a 37°C water bath and mix well by
swirling prior to use. Addition of L-Glutamine, antibiotics and serum are not necessary
since these components are already present.
1. Mix the cell suspension (obtained after centrifugation of around 7,5-10 ml of amniotic fluid, at 1000-1500 rpm for 10 min) with 3
ml of Amniomed Plus and transfer it to an AmnioChamberSF.
2. Incubate a 37°C, 5% CO2.
3. On Day 4-5, check the chamber, if at least 5-6 colonies have appeared, they can be processed; otherwise remove the medium by
aspiration, replace with 3 ml of fresh Amniomed Plus and incubate.
4. On Day 6 / Day 8 check for progress of growth using an inverted microscope.
When the areas of growth show a sufficient number of cells in mytosis, add 0,05 μg/ml of Colcemid.
5. Incubate at 37°C, 5% CO2 for 2 - 3 hours.
Chromosome preparation
1. Suck the medium up completely.
2. Drop 3 ml of hypotonic solution (distilled H2O, 0,6% sodium citrate, 0,1% KCl) and incubate at room temperature for 10 minutes.
3. Suck the hypotonic solution up and drop 3 ml of Ibraimov solution (distilled H2O, 5% acetic acid), incubate at room temperature
for 5 minutes.
4. Suck the Ibramov solution up and drop 3 ml of fresh fixative mixture (methanol: acetic acid, 4:1) at room temperature. The time
for this wash has no influence on final results.
5. Repeat 4) twice.
6. Remove the slide from the upper chamber with the special opener, and dry under constant condition of right temperature and
relative humidity (28°C, 42% RH) into Optichrome (ref.EKAMH950).
Chorionic villi sampling (CVS) culture protocol
1. Transfer the specimen into a 60 mm Petri dish containing 5 ml of RPMI 1640.
2. Wash villi with fresh medium to remove blood cells.
3. Using the inverted microscope, carefully dissect any remaining clots or decidual fragments, and transfer them in a Petri dish (35mm
Ø) with 3ml of Hank’s Balanced Salts Solution without Ca2+-Mg2+. Wash them carefully with this solution.
In situ culture
1. Transfer the villi in a 15 ml sterile centrifuge tube containing 2 ml of Pronase E (4*106 PU/g) and incubate at room temperature
for 4 - 6 minutes.
2. Add 3 - 5 ml of cold Hank’s Balanced Salts Solution without Ca2+-Mg2+. (kept at +4°C).
3. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpm and discard the supernatant.
4. Add 2 ml of sterile Collagenase type II (1 mg/ml) and incubate at 37°C for 20/40 minutes.
5. Add 3 - 5 ml of cold HBSS (kept at +4°C).
6. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpm and discard the supernatant.
7. Add 1-2 ml of Amniomed Plus and resuspend the pellet; centrifuge for 5 minutes at 1000 rpm and discard the supernatant.
8. Add 1-2 ml of Amniomed Plus and resuspend vigorously the pellet.
9. Divide the cell suspension in 1-3 AmnioChamberSF, depending on the number of cells. Add 3ml of Amniomed Plus medium to
each AmnioChamberSF.
10. Incubate at 37°C in 5% CO2.
11. On Day 4 check for progress of growth using an inverted microscope. When the areas of growth show a number of cells in
mytosis, add 0,05 μg/ml of Colcemid (10 μg/ml).
12.Incubate at 37 °C, 5% CO2 for 3-4 hours.
Chromosome preparation.
See protocol chromosome preparation of Amniotic fluid.
PRINTED IN ITALY - ed0/0312/47_AmnioChamberSF