proposta di una nuova metodologia di saggi

Biol. Mar. Medit. (2006), 13 (1): 1081-1084
G. Gorbi, S. Sei, M. Invidia, F. Bettoni
Dipartimento di Scienze Ambientali, Università di Parma,
Parco Area delle Scienze, 11/A - 43100 Parma, Italia.
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UTILIZZO DEGLI STADI UOVO/NAUPLIO IN TEST
TOSSICOLOGICI CON ACARTIA TONSA DANA, 1848:
PROPOSTA DI UNA NUOVA METODOLOGIA DI SAGGIO
TOXICITY TESTS ON EGG/NAUPLIUS STAGES
OF ACARTIA TONSA DANA, 1848: A NEW BIOASSAY PROPOSAL
Abstract
A new test methodology on egg/nauplius stages of the copepod Acartia tonsa Dana, 1848, applicable
on demand, is proposed. Screening tests with Zn, Cd, Ni, Cr(VI) and As(V) were performed to standardize and evaluate the sensitivity of the procedure. The suitability of an artificial marine water for both
acute and long-term experiments was evaluated. The high degree of standardization and the sensitivity of
the end point “nauplius mortality” suggest that the set up methodology can be included in water quality
assessment procedures.
Key-words: toxicity tests, Acartia tonsa, eggs, nauplius, heavy metals.
Introduzione
Il copepode planctonico Acartia tonsa Dana,1848 è stato ampiamente utilizzato in studi ecotossicologici sia negli Stati Uniti che in Europa e rientra tra le
specie indicate dalla International Organization for Standardization (ISO, 1999)
per i saggi biotossicologici applicati agli ambienti marini e salmastri.
La metodica ISO prevede l’utilizzo di individui adulti o al V stadio di copepodite e implica quindi il sorting degli organismi da allevamenti mantenuti in
condizioni standardizzate oppure l’allestimento di colture sincrone (coorti) in previsione del test (14-21 giorni prima). Entrambe le procedure comportano tuttavia
alcuni problemi: nel primo caso si utilizzano individui di età non nota e la loro
selezione mediante osservazione al microscopio può costituire uno stress aggiuntivo; l’allestimento di coorti rende invece difficoltosa l’applicazione “a domanda”
del saggio. È stato inoltre dimostrato che maschi e femmine adulti possono avere
diversa sensibilità alle sostanze tossiche e che lo stadio naupliare è molto più
sensibile di quello adulto (Medina et al., 2002).
Recentemente Andersen et al. (2001) e Wollenberger et al. (2003) hanno proposto una metodologia di saggio per test cronici su A. tonsa che, partendo dall’esposizione delle uova, utilizza come end point il passaggio dallo stadio naupliare a
quello di copepodite. La sensibilità delle uova di diverse specie di copepodi a
varie sostanze tossiche era già stata accertata da Lindley et al. (1999).
Considerando che A. tonsa è un organismo a riproduzione continua, rilascia le
uova liberamente nell’acqua e queste si sviluppano in ~24 ore, abbiamo ipotizzato
che lo stadio uovo potesse essere idoneo come “materiale biologico” di partenza
per la realizzazione di saggi tossicologici acuti e cronici e che schiusa e mortalità dei naupli potessero essere utilizzati come end point. È stata quindi messa a
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G. Gorbi, S. Sei, M. Invidia, F. Bettoni
punto una metodologia di saggio standardizzata per la realizzazione di test da
applicare “a domanda”.
Materiali e metodi
Organismi appartenenti alla specie Acartia tonsa sono stati raccolti nella laguna
di Venezia e allevati in laboratorio in acqua marina naturale secondo le procedure
riportate da Invidia et al. (2004).
Sopravvivenza e sviluppo di A. tonsa in acqua marina artificiale.
Considerato l’elevato grado di standardizzazione necessario per i test finalizzati
al controllo ambientale e alla classificazione tossicologica delle sostanze, è stata
valutata la possibilità di utilizzare acqua marina artificiale sia per i test acuti che
per i test cronici. È stata utilizzata l’acqua marina artificiale descritta in A.P.H.A.,
A.W.W.A, W.P.C.F. (1989) modificata per ottenere una salinità di 30±1‰. Uova
prodotte da organismi isolati dalle colture di mantenimento sono state trasferite
in cristallizzatori (∅ 60 mm) contenenti acqua marina artificiale (4 uova per cristallizzatore, 1 ind/10 ml) mantenuti in cella climatizzata alle stesse condizioni
dell'allevamento. Dopo 24 h è stata verificata la schiusa delle uova. Gli organismi
sono stati alimentati con una miscela algale composta da 5×104 cell/ml di Isochrysis galbana e 1×104 cell/ml di Tetraselmis suecica. Sopravvivenza e sviluppo
sono stati controllati giornalmente fino al raggiungimento dello stadio adulto.
Successivamente sono stati effettuati controlli a giorni alterni fino alla morte degli
organismi. Il rinnovo del mezzo e dell’alimento è stato effettuato a giorni alterni.
In totale sono state utilizzate 177 uova in 7 repliche dell’esperimento.
Test di tossicità acuta.
Per valutare la sensibilità delle uova e dei naupli sono stati effettuati test
di screening con Zn, Cd, Ni, Cr(VI) e As(V) (almeno 2 test per ogni sostanza
presa in esame). Per ogni metallo è stata preparata una soluzione madre in acqua
bidistillata, dalla quale con diluizioni successive in acqua marina artificiale sono
state ottenute le soluzioni per i trattamenti. Le uova sono state ottenute da circa
40 organismi adulti (20 maschi e 20 femmine) selezionati dall’allevamento 15-16
ore prima dell’inizio del test e mantenuti in cristallizzatori contenenti 200 ml di
acqua marina naturale. Sotto stereomicroscopio, le uova sono state distribuite in
modo casuale in capsule Petri contenenti acqua marina artificiale (controllo) o le
soluzioni del tossico e immediatamente trasferite in piastre multipozzetto da 24
pozzetti (1 uovo per pozzetto contenente 2,5 ml di acqua o soluzione, 10 uova
per piastra). Per ogni trattamento e per il controllo sono state utilizzate 2 piastre
(= 20 uova per trattamento per ciascun test). In questo modo è stato possibile
osservare singolarmente gli organismi e verificare la schiusa delle uova e la sopravvivenza dei naupli dopo 24 e 48 ore di trattamento.
Risultati
Nell’acqua marina artificiale il successo di schiusa è variato dal 92 al 100%,
con un valore complessivo di circa 98%. Il 68% degli organismi ha raggiunto lo
stadio di copepodite e il 51% lo stadio adulto. I primi copepoditi sono stati osservati dopo 5-7 giorni dalla nascita; i primi adulti dopo 10-12 giorni. Dopo pochi
giorni dal raggiungimento dello stadio adulto sono state osservate uova e naupli
vitali. Il tempo massimo di sopravvivenza degli organismi è stato di 50 giorni. I
Test su stadi uovo/nauplio di A. tonsa: nuova metodologia di saggio
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tempi di sviluppo da noi osservati in acqua marina artificiale sono in accordo
con quelli riscontrati da Landry (1983) e Berggreen et al. (1988) in acqua marina
naturale.
In Tab. 1 sono riportate le minime concentrazioni che hanno determinato
inibizione significativa della schiusa e quelle che hanno causato il 90-100% di
mortalità dei naupli. In quasi tutti i casi l’inibizione della schiusa è avvenuta a
concentrazioni superiori di almeno un ordine di grandezza rispetto alle concentrazioni che hanno causato elevata mortalità dei naupli. In letteratura non sono
disponibili dati sulla sensibilità di uova e naupli di A. tonsa ai metalli. Per gli
adulti Sosnoswsky e Gentile (1978) riportano valori di LC50 a 96 h di 0,09 mg
Cd/l, Kusk e Wollenberger (1999) hanno osservato valori di LC50 per il K2Cr2O7
(sostanza spesso usata come tossico di riferimento) di 20 e 10 mg/l (pari a 7,07
e 3,54 mg Cr(VI)/l) rispettivamente a 24 h e 48 h. I risultati da noi ottenuti
con Cr(VI) indicano che il test messo a punto sullo stadio uovo/nauplio ha una
sensibilità paragonabile al test sugli adulti quando si utilizza come end point la
mortalità dei naupli.
Tab. 1 - Minime concentrazioni che hanno causato inibizione significativa della schiusa (test di
Dunnett, p<0.01) e 90-100% di mortalità dei naupli.
Lowest concentrations causing significant reduction of hatching success (Dunnet test, p<0.01)
and 90-100% nauplius mortality.
Zn2+
Cd2+
Ni2+
Cr(VI)
As(V)
Inibizione schiusa
10 mg/l
10 mg/l
1 mg/l
non determinata
non determinata
Mortalità dei naupli
1 mg/l
1 mg/l
1 mg/l
10 mg/l
10 mg/l
Conclusioni
La metodologia di saggio proposta risulta vantaggiosa dal punto di vista pratico in quanto: nell’arco di 15-16 ore può essere ottenuto un numero elevato di
uova da organismi isolati da colture di mantenimento e quindi il test può essere
realizzato su richiesta; le uova sono facilmente riconoscibili e, essendo ovviamente
immobili, possono essere raccolte e manipolate in modo agevole senza rischio di
stress per l’organismo; la schiusa è facilmente identificabile. La metodologia messa
a punto per esperimenti di lungo termine in acqua artificiale risulta appropriata
per la realizzazione di test cronici. L’elevato grado di standardizzazione consentito dall’uso di acqua marina artificiale e la sensibilità dell’end point mortalità
dei naupli costituiscono indicazioni positive per l’applicazione della metodologia
proposta sia per la valutazione della tossicità dei contaminanti che per il controllo
della qualità delle acque.
Bibliografia
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La presente ricerca è stata parzialmente finanziata dal MURST (PRIN 2003, Progetto NITIDA).