Phadebact® ETEC-LT Test

53-1145-02, May-12
Phadebact®
ETEC-LT Test
Istruzioni per l´Uso
MKL Diagnostics AB
Kung Hans Väg 3
192 68 Sollentuna
Sweden
Stafilococchi ricoperti di anticorpi
Co-agglutinazione
Microorganismo con
gli antigeni corrispondenti
UTILIZZO
Phadebact® ETEC-LT Test è stato messo a punto per l’identificazione dell’enterotossina labile in rispetto al calore
prodotta da E. coli proveniente da colture di feci.
SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Escherichia coli (ETEC) enterotossigenica è una causa frequente della diarrèa nei paesi in via di sviluppo e della
diarrèa del viaggiatore. ETEC produce una o due enterotossine distinte, enterotossina labile rispetto al calore (LT) ed
enterotossina stabile rispetto al calore (ST), tutte e due cause di diarrèa.
La diagnosi in laboratorio di diarrèa dovuta a E. coli presenta un particolare problema vista la capacità degli
organismi di causare diarrèa attraverso meccanismi diversi. L’inadeguatezza delle colture tradizionali e dei metodi
sierologici di rivelare molte delle famiglie patologiche complica ulteriormente questo problema. Per rilevare la
maggior parte delle famiglie patologiche di E. coli occorrono i metodi utilizzati nei test per tossina. Poichè molti di
questi metodi richiedono colture di origine animale o colture cellulari, essi non sono applicabili per un uso di routine
in laboratori clinici (1). Un semplice test con gel a immunodiffusione, il test Biken, è stato sviluppato e indicato essere
più adatto per laboratori bisognosi di test semplici di E. coli LT nelle diagnosi di routine. Lo svantaggio principale del
test Biken (2) è che i risultati sono ottenuti dopo 3-4 giorni.
Phadebact® ETEC-LT Test è basato sulla tecnica di co-agglutinazione, una rapida e semplice prova di immunità, che
richiede poca strumentazione di laboratorio e nessuna formazione speciale del personale.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Phadebact® ETEC-LT Test è un test di co-agglutinazione contenente Reagente ETEC-LT, Controllo ETEC-LT ed
Extraction Solution. Il reagene ETEC-LT è composto di anticorpi di coniglio che agiscono contro l’enterotossina
LT altamente purificata, legati alla proteina A di stafilococchi non-vitali. Il controllo ETEC-LT è composto di
gammaglobulina di coniglio non immunizzato legata agli stafilococchi. Quando una goccia di estrazione cellulare di
colonie batteriche sospese provenienti da famiglie di E. coli producente LT viene mescolato con il reagente ETEC-LT,
gli antigeni specifici legano agli anticorpi corrispondenti sulla superfice dello stafilococco. In questo modo si forma
una grata di co-agglutinazione visibile ad occhio nudo.
REAGENTI
Ogni confezione Phadebact® ETEC-LT Test contiene reagenti sufficienti per 50 rilevazioni. I reagenti sono colorati blu
(blu Metilene) per facilitare l’interpretazione dei risultati.
Ingredienti reattivi
•
Reagente ETEC-LT
Anticorpi specifici di coniglio
legati a stafilococchi non vitali.
•
ETEC-LT Controllo, negativo
Gammaglobulina negativa di coniglio non immunizzato
legata a stafilococchi non vitali.
•
Extraction Solution
1 fiala
1 fiala
2 fiale
Altri componenti
•
Contagocce
•
Slides usa e getta
•
Istruzioni per l’Uso
Precauzioni
Per un uso diagnostico in vitro.
Attenzione! I controlli contengono Sodio azide (NaN3) come conservante. Il Sodio azide può reagire con il piombo ed
il rame presenti nell’impianto idraulico formando metalli azidi altamente espolosivi. Pertanto, se si utilizza l’impianto
idraulico per disfarsi dei controlli, far scorrere grande quantità di acqua per prevenire accumulo di azide. Fare riferimento
alle procedure di decontaminazione così come illustrato da CDC.
Preparazione dei reagenti
I reagenti sono PRONTI PER L’USO.
Modalità di conservazione
La data di scadenza è riportata sull’etichetta esterna e sulle etichette delle fiale. Si raccomanda di conservare il kit ad
una temperatura di 2-8oC. I reagenti devono essere protetti dal congelamento.
RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI
Si prega di riferirsi ad un libro di testo standard di microbiologia per quanto riguarda l’informazione sulla raccolta,
sul trattamento e sul trasporto dei campioni. Una batteria di terreni per un uso di routine nella coltura di campioni
provenienti da feci deve includere un sostrato non-selettivo come agar di sangue, un sostrato differenziale
moderatamente selettivo come agar Mac Conkey, un sostrato differenziale più selettivo come agar di xyloselysine-deoxycholate, e un arricchimento di brodo (1). L’uso di una tale batteria consentirà la rilevazione di
Enterobacteriaceae più communemente associata con infezioni enteriche includendo campioni di Salmonella e
Shigella e E. coli. Comunque la produzione di tossina può essere ottimizzata tramite l’addizione di lincomycin e
clindamycin (9,10). Si raccomanda, per esempio, 5% agar di cavallo, pH 8.0, con clindamycin (45µg/mL) (10).
Materiali richiesti ma non forniti
•
Provette di plastica
•
Pipette
•
Dispositivo riscaldante o bagno di acqua
•
Centrifuga
•
Occhielli usa e getta
•
Orologio con indicatore di minuti facilmente leggibile
Parametri del metodo
Temperatura di reazione
Volume dei reagenti
Tempo di reazione
Temperatura ambiente
Una goccia
1 minuto
Preparazione dei campioni
Fare riferimento ai libri di testo standard di microbiologia riguardanti informazioni dettagliate sulla preparazione di colture
primarie. Dopo l’inoculazione, il sostrato deve essere incubato a 35-37oC per 18-24 ore (4). Le colonie sospette di essere
E. coli possono quindi essere testate con Phadebact® ETEC-LT Test per l’identificazione:
•
Prelevare dalla piastra un ochiello pieno di batteri sospetti di essere E. coli.
•
Suspendere i batteri in una piccola provetta, in100μl di Extraction Solution .
•
Incubare a 37oC per 30 minuti in un bagno di acqua o tramite l’uso di un dispositivo riscaldante.
•
Centrifugare la sospensione a 2000xg per 5 minuti.
•
Una goccia del supernatante viene usata per il test.
Protocollo del test
Nota! Sospendere le gocce interamente tramite agitazione o rotazione vorticale.
Mettere una goccia del reagente
ETEC-LT in uno dei cerchi sulla
slide ed una goccia del controllo
ETEC-LT in un altro cerchio.
Fig. 1.
Mettere una goccia del supernatante
centrifugato accanto alla goccia del
reagente ETEC-LT ed una goccia accanto
alla goccia del controllo ETEC-LT. Fig 2.
Fig. 2
Fig. 1
Mescolare le gocce. Iniziando
con il controllo negativo, lo stesso
ochiello usa e getta può essere
utilizzato sia per il mescolamento
del controllo che del reagente.
Fig. 3.
Fig. 4
Fig. 3
Fare oscillare la slide e leggere i risultati entro un minuto.
Fig 4.
Stabilità della miscela finale di reazione
La reazione di co-agglutinazione è stabile, ma una buona pratica di laboratorio suggerisce che il risultato va letto
entro 1 minuto (notare che c’è il rischio che il seccarsi dei reagenti può essere misinterpretato come una reazione
positiva).
Calibrazione
Nessuna calibrazione è necessaria.
Controllo di qualità
Controllo positivo
Come controllo deve essere usato una Famiglia di LT+ E. coli identificato in laboratorio (p. es. NIH 2011 (8)). Nella
procedura del test le famiglie di controllo sono trattate nella stessa maniera dei batteri sconosciuti.
Controllo negativo
Come controllo deve essere usato una Famiglia di LT- E. coli identificato in laboratorio (p. es. ATCC 8739). Nella procedura
del test le famiglie di controllo sono trattate nella stessa maniera dei batteri sconosciuti.
Aspetto della reazione
Nessuna reazione
Reazione positiva
RISULTATI
Risultato positivo
Un precipitato blu, la co-agglutinazione, se osservato nel cerchio del reagente ETEC-LT con nessuna reazione o una
reazione debole nel controllo, conferma l’identità del campione come E. coli producente enterotossnina LT.
Risultato negativo
Una reazione molto debole nel reagente ETEC-LT insieme con una reazione molto debole nel controllo ETEC-LT o
nessuna reazione in entrambi, suggerisce fortemente che i batteri testati non sono E. coli producente enterotossina
LT.
LIMITI DELLA PROCEDURA
A causa delle similarità sia biologiche che immunologiche delle tossine, V. Cholerae e E. coli reagiscono in maniera
incrociata. Comunque, seguendo le linee guide generali indicate nei manuali di microbiologia per la coltivazione dei
campioni, questo problema può essere evitato. A causa della eterogeneità tra isolati umani e animali (7), test di isolati
veterianari possono risultare falsamente negativi.
CARATTERISTICHE DI RENDIMENTO
Specificità e sensibilità
Sono state analizzate un totale di 436 famiglie sospette di essere E. coli producente enterotossina LT (5, 6, 7, 8). I
metodi di riferimento sono stati il test Biken, il test ELISA e il test cellulare. Il rendimento complessivo del Phadebact
ETEC-LT Test è stato il seguente:
1. Numero di famiglie
COA
Test Biken
45
+
+
50
-
-
1
+
-
4
-
+
2. Numero di famiglie
COA
ELISA
58
+
+
71
-
-
6
+
-
5
-
+
3. Numero di famiglie
COA
Test cellulare
100
+
+
210
-
-
16
+
-
10
-
+
Un totale di 665 isolati di origine umana e veterinaria (incluse famiglie identificate in laboratorio) sono stati analizzati
(5-10) rispetto ai metodi di riferimento con una sensibilità di 90.0% (271/301) ed una specificità di 95.1% (346/364).
Riferimento
Phadebact®
+
-
+
271
18
-
30
346
GARANZIA
I dati di rendimento qui presentati sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi cambiamento o modifica
nelle procedure non raccomandato da MKL Diagnostics AB può affettare i risultati. In tal caso, MKL Diagnostics AB disconosce
tutte le garanzie, espresse, implicite o statuarie, incluse le garanzie implicate nella commerciabilità e nella convenienza per
l’uso. MKL Diagnostics AB, e i sui rivenditori autorizzati, in tali casi non saranno considerati responsabili per qualsiasi danno
diretto, indiretto o consequenziale.
Riferimenti:
1.
Manual of Clinical Microbiology, 4th edition Ed. by Edwin H. Lenette. American Society for Microbiology,
Washington, D.C. 1985.
2.
Honda, T., Arita, M., Takeda, Y. and Miwatani, T.: Further Evaluation of the Biken Test (Modified Elek Test) for
Detection of Enterotoxigenic Escherichia coli Producing Heat-Labile Enterotoxin and Application of the Test to
Sampling of Heat-Stable Enterotoxin. J. Clin. Microbiol. 16 (1982) 60-62.
3.
Christensen, P., Kahlmeter, G., Jonsson, S. and Kronvall, G.: New Method for the Serological Grouping of
Streptococci with Specific Antibodies Adsorbed to Protein A-Containing Staphylococci. Infect. Immun. 7 (1973)
881-885.
4.
Manual for Laboratory Investigations of Acute Enteric Infections. World Health Organization CDD/83.3.
5.
Rönnberg, B. and Wadström, T.: Rapid Detection by a Coagglutination Test of Heat-Labile Enterotoxin in Cell
Lysates from Blood Agar-Grown Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 17 (1983) 1021-1025.
6.
Dipak, S., Malay, R. S. and Sudhir C. P.: Evaluation of Three Simple and Rapid Immunological Tests for
Detection of Heat-Labile Enterotoxin of Enterotoxigenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 19 (1984) 194-196.
7.
Steinrück, H., Samtleben, S., Rönnberg, B., and Wadström, T.: Comparison of a Coagglutination Test with the
GM1-ELISA and the Y-1 Adrenal Cell Assay for the Detection of Heat-Labile Enterotoxin from Escherichia coli.
Zbl. Bakt. Hyg. A 260 (1985) 436-442.
8.
Bettelheim, K.A., Gracey, M. and Wadström, T.: The Use of the Coagglutination Test to Determine whether
Australian and New Zealand Isolates of Escherichia coli Produce the Heat-Labile Enterotoxin. Zbl. Bakt. Hyg. A
260 (1985) 293-299.
9.
Rudensky, B., Isacsohn, M. and Zilberberg, A.: Improved detection of heat-labile enterotoxin of
enterotoxinogenic Escherichia coli by using a commercial coagglutination test. J. Clin. Microbiol. 26 (1988)
2231-2232.
10. Chapman, P.A. and Daly, C.M.: Comparison of Y1 mouse adrenal cell and coagglutination assays for detection
of Escherichia coli heat labile toxin. J. Clin. Pathol. 42 (1989) 755-758.
PRODOTTI
Phadebact® COA System
Phadebact® Streptococcus Tests
Phadebact® Streptococcus Respiratory Test
Phadebact® Strep A Test
Phadebact® Strep B Test
Phadebact® Strep D Tests
Phadebact® Strep F Test
Phadebact® Strep Positive Controls
Phadebact® Pneumococcus Test
Phadebact® Haemophilus Test
Phadebact® GC Positive Controls
Phadebact® CSF Test
Phadebact® CSF Positive Controls
Phadebact® Extraction Solutions
Phadebact® Monoclonal GC Test
Phadebact® ETEC-LT Test
Phadebact® Salmonella Test
Phadebact® Staph Aureus Test
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Phadirect® Strep A
Phadirect® Rapid CRP Test
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