PLATELIA® EB-NA-1 IgG

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72939
96 Tests
ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUALITATIVE
DETERMINATION OF IgG ANTIBODIES TO EPSTEINBARR VIRUS (EPSTEIN-BARR NUCLEAR ANTIGEN-1)
IN HUMAN SERUM
TABLE OF CONTENTS
2
1-
INTENDED USE
2-
CLINICAL VALUE
3-
PRINCIPLE OF THE PROCEDURE
4-
CONTENTS OF THE KIT
5-
PRECAUTIONS AND WARNINGS
6-
MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
7-
PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS
8-
SPECIMENS
9-
ASSAY PROCEDURE
10-
CALCULATION AND INTERPRETATION OF THE RESULTS
11-
PERFORMANCES
12-
LITERATURE
1 - INTENDED USE
This immunoassay kit is for the qualitative determination of IgG antibodies
to Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen-1 (EB-NA-1) in human serum. The
Platelia® EB-NA-1 IgG assay may be used in conjunction with other
Epstein-Barr serology's (Platelia® EBV-VCA IgM, Platelia® EBV-VCA IgG
and Platelia® EBV-EA-D IgG) as an aid in the diagnosis of infectious
mononucleosis.
2 - CLINICAL VALUE
Detection of the Epstein-Barr virus was first described in 1964 by Epstein,
Achong, and Barr using electron microscopic studies of cultured
lymphoblasts derived from patients with Burkitt's lymphoma. EBV is
classified as a member of the herpes-virus family based upon its
characteristic morphology.
EBV infection may demonstrate a wide spectrum of clinical symptoms. The
majority of primary EBV infections are transmitted via saliva, occur during
childhood, and are subclinical. In the United States, 50% of the
population demonstrate EBV antibodies before the age of 5 years; 80%
by adulthood. Transfusion-associated EBV infections have also been
reported.
In young adults, EBV infection may be clinically manifested as Infectious
Mononucleosis (IM) with relatively atypical symptoms of fever pharyngitis,
tonsilitis, lymphadenopathy, malaise, headache, myagia, spleno- and
hepatomegaly, rash and leucocytosis. College students and military
personnel are often cited as a high morbidity incidence population for IM.
Following primary EBV infection, it is postulated that the B lymphocyte
may continue to harbor the EBV genome and establish a latent infection
that may extend through life. Reactivation of EBV infection or enhanced
EBV activation has been documented in immunodeficient or immunosuppressed patients, i.e., organ transplant patients, individuals with
malignancies, pregnant women, and persons of advanced age.
Controversy persists regarding the definitive implication of EBV as the
etiologic agent in the clinical state labeled "chronic EBV infection" or
"chronic mononucleosis".
Epstein-Barr virus has also been associated in the pathogenesis of two
human cancers, Burkitt's lymphoma and nasopharyngeal carcinoma.
Documentation by means of DNA hybridization studies demonstrates the
presence of the EBV genome on biopsy specimens taken from individuals
with these carcinomas.
3
Burkitt's lymphoma is primarily observed in Sub-Sahara Africa, especially
in African children, and in New Guinea. Malarial infections are usually
diagnosed in Burkitt's lymphoma patients and are suggested to be a cofactor. Nasopharyngeal carcinoma is observed in Asia, most notably in
Southern China, and may have genetic or environmental influences as the
co-factor.
B-cell lymphomas similar to the African Burkitt's lymphoma have recently
been reported in patients with Acquired Immunodeficiency Syndrome
(AIDS). It is suggested that AIDS patients may be pre-disposed of EBV
infection/reactivation due to their general state of immunosuppression.
Infection by EBV results in the production of antibodies to four distinct
antigenic complexes. These include: EBV-induced Nuclear Antigen
(EBNA), EBV-induced Early Antigen (EA), Viral Capsid Antigen (VCA),
and EBV-induced Membrane Antigen (MA). The EA complex is divided
into two components which include EA-D (diffuse component) and EA-R
(restricted component).
Infection of the target cells leads to two forms of viral cycles: 1) latent,
non-productive and 2) productive, replicative infections. In both cycles,
one of the earliest antigens expressed is lymphocyte-detected membrane
antigen, a cell-surface antigen recognized by T-cells. It has been well
established that most individuals exposed to EBV develop a heterophile
antibody response. Expression of EBNA-1 either follows or parallels
membrane antigen at 12 to 24 hours post infection. EB-NA-1 is found as
nonstructural, intranuclear antigen(s), present in all EBV-transformed cell
lines as in tumors from Burkitt's and nasopharyngeal carcinoma patients.
In the fully productive, replicative cycle, the synthesis of antigen follows
EB-NA-1. The viral capsid antigen complex (VCA) appears late in the
replicative cycle.
It has recently become apparent that EB-NA-1 is probably not a single
antigenic moiety, but a multicomponent antigen complex, on the basis of
reactivities of sera from different classes of patients. The major component
EBNA-1 has been purified and sequenced in its entirety.
Antibody levels of EB-NA-1 IgG are diagnostic in determining acute and
convalescent stages in IM. IgG antibodies to EB-NA-1 are rarely present
in acute IM and rise during convalescence. They will rise to a plateau
level in three months to a year and will normally persist for life.
4
3 - PRINCIPLE OF THE PROCEDURE
The Bio-Rad Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) rely on the
ability of biological materials, (i.e., antigens) to adsorb to plastic surfaces
such as polystyrene (solid phase). The Platelia® EB-NA-1 IgG kit utilizes
the ELISA technology where a purified recombinant EB-NA-1 antigen is
bound to the wells of a microplate. When antigens bound to the solid
phase are brought into contact with a patient's serum, antigen specific
antibody, if present, will bind to the antigen on the solid phase forming
antigen-antibody complexes. Excess antibody is removed by washing.
This is followed by the addition of goat anti-human IgG conjugated with
horseradish peroxidase which then binds to the antibody-antigen
complexes. The excess conjugate is removed by washing, followed by the
addition of Substrate, tetramethylbenzidine (TMB). If specific antibody to
the antigen is present in the patient's serum, a blue color develops. When
the enzymatic reaction is stopped with 1N H2SO4, the contents of the
wells turn yellow. The color, which is proportional to the concentration of
antibody in the serum, can be read on a suitable spectrophotometer or
ELISA microwell plate reader.
The sensitivity, specificity and reproducibility of enzyme-linked
immunosorbent assays may be comparable to other serological tests for
antibody, such as immunofluorescence, complement fixation,
hemagglutination and radioimmunoassays.
5
4 - CONTENTS OF THE KIT
All reagents are exclusively for in vitro diagnostic use.
Label
Nature of reagents
Presentation
R1
12 Strips (8 wells each) coated with recombinant Epstein-Barr
Nuclear Antigen-1 (EB-NA-1), stored in a foil pouch with
dessicant/humidity indicator
1
Concentrated washing solution (20 x)
R2 Tris buffer (pH 7.2 ± 0.2) with 1% Tween® 20.
1 x 60 ml
Preservatives : Proclin® 300 (0.1%).
Non reactive control (human) for anti-EB-NA-1 IgG antibodies
R3 Negative for HBs Ag and HIV-1, HIV-2 and HCV antibodies.
1 x 0.4 ml
Preservatives: sodium azide (< 0.1%) and pen/strep (0.01%)
Positive control I (human) for anti-EB-NA-1 IgG antibodies
R4a Negative for HBs Ag and HIV-1, HIV-2 and HCV antibodies.
1 x 0.4 ml
Positive control II (human) for anti-EB-NA-1 IgG antibodies
R4b Negative for HBs Ag and HIV-1, HIV-2 and HCV antibodies.
R5
R6
Calibrator (human) for anti-EB-NA-1 IgG antibodies, with kit
specific factor printed on the outer box label.
Negative for HBs Ag and HIV-1, HIV-2 and HCV antibodies
Conjugate: goat antibodies to human IgG coupled with
horseradish peroxidase; preservatives:
Proclin® 300 (0.1%) and gentamycine
Diluent I: ready-to-use buffer (pH 7.5 ± 0.2).
R7 Preservatives: Proclin® 300 (0.1%)
Chromogen/Substrate solution (ready-to-use):
Tetramethylbenzidine (TMB).
R9 The reagent should remain closed when not in use, otherwise,
1 x 0.4 ml
1 x 0.4 ml
1 x 16 ml
1 x 30 ml
1 x 15 ml
a precipitate may form in the reaction wells.
R10 Stopping solution (ready-to-use): 1N Sulfuric acid
Assay worksheet
1 x 15 ml
1
5 - PRECAUTIONS AND WARNINGS
Precautions
The reliability of the results depends on correct implementation of the
following Good Laboratory Practices:
• Do not use expired reagents.
• Do not mix reagents from different lots within a given test run.
6
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
REMARK: It is possible to use other lots than those contained in the kit,
provided the same lot is used within a given test run: washing solution
(R2), Chromogen/Substrate solution (R9) and stopping solution (R10).
These reagents can be used with Platelia® EBV-VCA IgG, Platelia®
EBV-EA-D IgG and Platelia® EBV-VCA IgM of our catalogue. Diluent I
(R7) can be used with Platelia® EBV-EA-D IgG and Platelia® EB-VCA
IgG. Contact our technical service for detailed information.
Before use, it is necessary to wait 30 minutes for the reagents to
stabilize to room temperature.
Carefully reconstitute the reagents avoiding any contamination.
Do not carry out the test in the presence of reactive vapors (acid
alkaline, aldehyde vapors) or dust that could alter the enzyme activity
of the conjugate.
Use glassware thoroughly washed and rinsed with deionized water or
preferably, disposable material.
Do not allow the microplate to dry between the end of the washing
operation and the reagent distribution.
The enzyme reaction is very sensitive to metal ions. Consequently, do
not allow any metal element to come into contact with the various
conjugate or substrate solution.
The Chromogen/Substrate solution must be colorless. The appearance
of color indicates that the reagent cannot be used and must be
replaced. Use a new pipette tip for each sample.
Washing the microplate is a critical step in the procedure: respect the
recommended number of washing cycles and make sure that all wells
are completely filled and then completely emptied. Incorrect washing
may lead to inaccurate results.
Never use the same container to distribute conjugate and development
solution.
Check the pipettes and other equipment for accuracy and correct
operation.
Do not change the assay procedure.
Health and safety instructions
All the reagents provided are intended for in vitro diagnostic use.
• Wear disposable gloves when handling reagents.
• Do not pipette by mouth.
7
• Human origin material used in the preparation of the reagents has
been tested and found non-reactive for hepatitis B surface antigen
(HBs Ag), antibodies to hepatitis C (HCV) and to human
immunodeficiency virus (anti-HIV1 and anti-HIV2). Because no method
can absolutely guarantee the absence of infectious agents, handle
reagents of human origin and patient samples as if capable of
transmitting infectious disease.
• Consider any material directly in contact with samples and reagents of
human origin, as well as washing solution, as infectious material.
• Avoid spilling samples or solutions containing samples.
• Spills must be rinsed with bleach diluted to 10 %. If the contaminating
fluid is an acid, spills must be initially neutralized with sodium
bicarbonate, then cleaned with bleach and dried with absorbent
paper. The material used for cleaning must be discarded in a
contaminated residue container.
• Samples, reagents of human origin, as well as contaminated material
and products should be discarded after decontamination.
- either by immersion in bleach at the final concentration of 5 % of
sodium hypochloride for 30 minutes,
- or by autoclaving at 121°C for 2 hours minimum.
Autoclaving for at least one hour at 121°C, is the best method to
inactivate the HIV viruses and the HB virus.
CAUTION: DO NOT INTRODUCE SOLUTIONS CONTAINING
SODIUM HYPOCHLORIDE INTO THE AUTOCLAVE.
• Chemicals should be handled and disposed of in accordance with
Good Laboratory Practices.
• Avoid any contact of the substrate buffer, the chromogen and the
stopping solution with the skin or mucosa (risk of toxicity, irritation or
burn).
• Some reagents contain sodium azide as a preservative. Sodium azide
may react with laboratory plumbing to form copper or lead azides.
Such azides are explosive. To prevent azide from building-up, flush the
pipes with a large quantity of water if solutions containing azide are
disposed of in the sink after inactivation.
The safety data sheet is available upon request.
8
6 - MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Vortex mixer.
Microplate reader equipped with 450 nm filters (*).
Container for biohazard waste.
Sodium hypochloride (bleach) and sodium bicarbonate.
Distilled or deionized water.
Graduated cylinders.
Disposable latex gloves.
Goggles or safety glasses.
Absorbent paper.
Automatic or semi-automatic, adjustable or preset, pipettes or
multipipettes to measure and dispense 10, 100 and 1000 µl.
• Manual, semi-automatic or automatic microplate washer (*).
• Disposable tubes.
(*) Consult us for detailed information about the equipment recommended
by our technical department.
7 - RECONSTITUTION AND STORAGE OF REAGENTS
The kit should be stored at +2-8°C until the expiry date mentioned on the
package (except for specific instructions). Before use, allow reagents to
reach room temperature (+18-30°C). Return all reagents to refrigerator
promptly after use.
1) Ready-to-use reagents
• Reagent 1 (R1): microplate
Each tray containing 12 trips is wrapped in a sealed foil lined bag. Cut
the bag with scissors or a scalpel 0.5 - 1 cm above the line. Replace
unused strips into the bag immediately. Reseal the bag carefully and
replace it at +2-8°C. Then, the strips are stable for 1 month.
• Reagent 3 (R3): non-reactive control
• Reagent 4a (R4a): positive control I
• Reagent 4b (R4b): positive control II
• Reagent 5 (R5): calibrator
• Reagent 6 (R6): conjugate
• Reagent 7 (R7): diluent I
• Reagent R9: Chromogen/Substrate solution
• Reagent 10 (R10): stopping solution
9
2) Reagents to be reconstituted
• Reagent 2(R2): washing solution concentrated 20x
Dilute 60 ml of the 20X washing solution to 1.2 l with distilled and/or
deionized water to obtain the ready-for-use solution. Mix well. After
dilution, store at +2-8°C for 5 days.
8 - SPECIMENS
Collect a blood sample according to the current practices. Test will be
performed with non diluted samples. Separate the serum from the clot or
red cells as soon as possible to avoid any haemolysis. Extensive
haemolysis may affect test performance. Specimens with aggregates
should be clarified by centrifugation prior testing. Suspended fibrin
particles or aggregates may yield falsely positive results.
The specimens can be stored at +2-8°C if screening is performed within
5 days or they may be deep-frozen at -20°C for several months. Avoid
repeated freeze / thaw cycles. If the specimens are to be shipped, they
must be packaged in accordance with the regulations in force regarding
the transport of etiological agents.
DO NOT USE CONTAMINED, HYPERLIPAEMIC, ICTERIC
HYPERHAEMOLYSED OR HEAT-INACTIVATED SERA.
9 - ASSAY PROCEDURE
Strictly follow the proposed procedure.
Use the calibrator and the controls for each series of determinations to
validate the test results.
Follow the following Good Laboratory Practice:
1. Carefully establish the sample distribution and identification plan.
2. Prepare the diluted washing solution (R2) (refer to section 7).
3. Take the carrier tray and the strips (R1) out of the protective pouch.
Place the desired number of antigen-coated strips into a microwell
frame. Allow 1 well for the reagent blank, 2 wells for Calibrator, 1
well for each Negative, Positive I and Positive II Controls.
10
1
2
A B1
S2
B R3
S3
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
C R4a S4
D R4b S5
E R5
S6
F R5
S7
G R5
S8
H S1
S9
4. All samples, controls and calibrator should be vortexed before use.
Dilute test samples, Calibrator, Negative and Positive Controls 1:21
(e.g. 10 µl + 200 µl) with Sample Diluent I (R7) within dilution tubes or
dilution plate.
5. Pipette 100 µl of each diluted Calibrator, Control or patient sample
into each well. Pipette 100 µl of Sample Diluent I (R7) into the first well
for the reagent blank.
6. Incubate the microplate for 20 minutes ± 2 minutes at room
temperature (21-25°C).
7. Aspirate the contents of all wells into a container for biohazards waste
(containing sodium hypochloride). Add immediately into each well, a
minimum of 300 µl of washing solution. Aspirate again. Repeat this
procedure at least 4 times (a total of a minimum of 5 washes). If
necessary, dry the plate by turning it upside down on absorbent paper.
If an automatic washer is used, follow the same procedure.
8. Distribute 100 µl of the ready-to-use Conjugate (R6) into all wells.
9. Incubate 20 minutes ± 2 minutes at room temperature (21-25°C).
10. Empty all wells by aspiration and wash 5 times as described above.
11. Quickly dispense 100 µl of Chromogen/Substrate Solution (R9) into
each well.
11
12. Allow the reaction to develop in the dark for 10 minutes ± 2 minutes at
room temperature (21-25°C). Do not use adhesive film during this
incubation. The Chromogen/Substrate Solution will turn blue in wells
containing detectable levels of IgG antibodies.
13. Add 100 µl of Stopping Solution to each well. Mix by gently tapping
the plate. Addition of the Stopping Solution will result in a color
change from blue to yellow.
14. Wait for a minimum of 5 minutes and read. Carefully wipe the plate
bottom. Using a wavelength of 450 nm, blank the reader on the
reagent blank well and measure the optical density of each well. The
plate should be read within 30 minutes of adding the Stopping
Solution (the strips must always be kept away from light before
reading).
15. Check all results for agreement between the reading and the plate and
sample distribution and identification plan.
10- CALCULATION AND INTERPRETATION OF THE RESULTS
1) Calculate the mean absorbance
1. Mean Cut-off Calibrator O.D. (Optical Density) - Calculate the mean
O.D. value for the Cut-off Calibrator from the three Calibrator R5
determinations. If any of the three calibrators Values differ by more
than 15 % from the mean, discard that value and calculate the average
of the two remaining values.
2. Correction Factor - To account for day-to-day fluctuations in assay
activities due to room temperature and timing, a Correction Factor is
determined for each lot of kits. The Correction Factor is printed on the
Calibrator vial.
3. Cut-off Calibrator Value - The Cut-off Calibrator value for each assay is
determined by multiplying the Correction Factor by the mean Cut-off
Calibrator O.D. determined in step 1.
4. ISR Value - Calculate an Immune Status Ratio (ISR) for each specimen b
dividing the specimen O.D. Value by the Cut-off Calibrator Value
determined in Step 3.
Example : O.D.'s obtained for Calibrator
= 0.380, 0.400, 0.420
Mean O.D. for Calibrator
= 0.400
Correction factor
= 0.5
Cut-off Calibrator Value = 0.5 x 0.400 = 0.200
12
O.D. obtained for patient sera
ISR Value
5. The maximum linearity of the assay is an
value > 5.40 should be reported as greater
= 0.600
= 0.600/0.200 = 3.00
ISR of 5.40, therefore ISR
than 5.40.
2) Assay validation
1. Reagent Blank (when read against blank air) must be < 0.150 at
450 nm : OD RB < 0.150
2. Negative control R3 must be ≤ 0.250 at 450 nm (when read against
reagent blank): OD R3 ≤ 0.250
3. Each calibrator R5 must be ≥ 0.250 at 450 nm (when read against
reagent blank): OD R5 ≥ 0.250
4. Positive control R4b must be ≥ 0.500 at 450 nm (when read against
reagent blank): OD R4b ≥ 0.500
5. The ISR (Immune Status Ratio) Values for negative, positive I and
positive II controls (R3, R4a, R4b) should be in their respective ranges
printed on the vials.
If those criteria are not within their respective ranges, the test should be
considered invalid and should be repeated.
3) Interpretation of the results
The patients’ ISR (Immune Status Ratio) Values are interpreted as follows:
ISR Value
Results
Interpretation
≤ 0.90
Negative
No significant level
of detectable EB-NA-1 IgG antibody
0.91-1.09
Equivocal
Samples should be retested
≥ 1.10
Positive
Significant level
of detectable EB-NA-1 IgG antibody
1. The following is a recommended method for reporting the results
obtained ; "The following results were obtained with the Platelia®
EB-NA-1 IgG test. Values obtained with different methods may not be
used interchangeably. The magnitude of the reported IgG level cannot
be correlated to an endpoint titer".
13
2. Four distinctive EBV antibodies are used to provide a comprehensive
picture of EBV infection ; these are EBV-VCA IgM, EBV-VCA IgG,
EBV-EA IgG and EB-NA IgG. Accurate interpretation of EBV infection is
based on the results from all these antibodies, and usually should not
rely on single test results for a diagnosis.
3. Samples that remain equivocal after repeat testing should be retested by an
alternate method, e.g., immunofluorescence assay (IFA). If results remain
equivocal upon further testing, an additional sample should be taken.
4. The performance characteristics for this product have been established
using one calibrator. If a linear dose response curve with the assay is
desired, the customer should establish a minimum of two additional
calibrators.
5. To evaluate paired sera for significant change in antibody level, both
samples must be tested in duplicate in the same assay. The mean ISR of
both (acute and convalescent) must be greater than 1.00 to evaluate the
paired sera for a significant rise in antibody level.
4) Expected values
➣ Acute Phase
EBV-VCA IgG and EBV-VCA IgM antibodies are normally present.
EB-NA-1 IgG antibodies are normally absent or at very low levels.
➣ Transitional Phase
EBV-VCA IgG antibodies persist and EBV-VCA IgM antibodies usually
decline. EB-NA-1 IgG antibodies begin to increase.
➣ Convalescent Phase
EBV-VCA IgM drop to negative or very low. EBV-VCA IgG and EB-NA-1
IgG antibodies persist usually for life. In the US, about 50 % of the
population seroconverts before age 5. Another wave of sero-conversion
occurs midway through the second decade of life. By adulthood, 90-95%
of most populations will have EB-NA-1 antibodies.
5) Prevalence
A group of 204 sera from a healthy population in the north east portion
of the US were tested on the Platelia® EB-NA-1 IgG assay. The sera were
randomized for gender, age, and race. The distribution of ISR Values
from this study is presented in the following chart. In this study, 86.4% of
the population were positive in the assay.
14
Distribution of ISR values in normal population (N = 204)
40
35
Frequency
30
25
20
15
10
5
[
-8
[
[7
[6
-7
[
[5
-6
[
-5
[
[4
-4
[3
-3
[
[
[2
-2
.1
[1
[
.9
[0
-0
.9
[
.5
.5
[0
-0
[0
-1
.1
[
0
ISR
6) Limitations of use
1. Kit procedures or practices outside those in this package insert may
yield questionable results.
➣ Non repeatable reactions are often caused by:
• Inadequate microplate washing,
• Inadequate timing of the incubation steps,
• Contamination of negative samples by serum or plasma with a
high antibody titre,
• Contamination of the development solution by oxidizing agents
(bleach, metal ions...),
• Contamination of the stopping solution.
➣ Contaminated, icteric, lipemic, hemolyzed or heat inactivated sera
may cause erroneous results and should be avoided.
➣ The performance characteristics have not been established for any
matrices other than serum.
2. The physician in the light of other clinical findings and diagnostic
procedures should interpret results of this test.
15
➣ This kit is designed to measure IgG antibody in patient samples.
Positive results in neonates must be interpreted with caution, since
maternal IgG is transferred passively from the mother to the fetus
before birth. IgM assays are generally more useful indicators of
infection in children below 6 months of age. The values obtained from
this assay are intended to be an aid to diagnosis only. Each physician
must interpret the results in light of the patient's history, physical
findings and other diagnostic procedures.
The performance characteristics have not been established for patients
with nasopharyngeal carcinoma, Burkitt's lymphoma, other EBV
associated lymphadenopathies, and other EBV associated diseases
other than EBV related mononucleosis. The results of Platelia® EB-NA-1
IgG performed on serum from immunosuppressed patients must be
interpreted with caution. The performance characteristics for this assay
have not been established for paediatric specimens.
➣ Individuals with chronic active Epstein-Barr virus infection may not
produce an antibody response to EB-NA-1
➣ There is a possibility of assay cross-reactivity with specimens containing
anti-E. coli antibody.
11- PERFORMANCES
1 - Relative Sensitivity and Specificity Based on Serum
Characterization
357 serums were tested. The serums from the study were previously
characterized using commercially available ELISA assays. The sensitivity,
specificity and agreement of the assay were determined based on this
characterization. The results are summarized in the table below.
Platelia® EB-NA-1 IgG
Other EIA
TEST
Result
Positive
Doubtful
Negative
Total
Positive
270
5
6
281
Doubtful
0
0
1
1
Negative
0
1
74
75
Total
270
6
81
357
This allows the following calculations (doubtful samples excluded)
16
Results
Specificity
74/74
100 %
Sensitivity
270/276
97.8 %
Overall agreement
344/350
98.3 %
2 - Precision
The Platelia® EB-NA-1 IgG test was evaluated for precision by testing
three sera in duplicate twenty times each in 3 different labs. The results
are summarized in the Table below.
Serum
n
X
S.D.
CV %
Negative
120
0.02
0.02
138
Low positive
120
1.41
0.16
11.5
Positive
120
5.04
0.37
7.3
X
= Mean ISR Value
S.D. = Standard Deviation
C.V. = Coefficient of Variation
3 - Cross-reactivity
The following 5 serum samples were assayed and were found negative
with the Platelia® EB-NA-1 IgG test.
HSV 1 IgG
HSV 2 IgG
CMV IgG
VZV IgG
Platelia®
EB-NA-1 IgG
1
2.43 +
0.6 -
1.69 +
2.28 +
0.67 -
2
0.32 -
0.08 -
0.18 -
3.17 +
0.36 -
3
3.67 +
0.86 -
1.11 +
2.45 +
0.73 -
4
0.3 -
0.39 -
0.18 -
3.21 +
0.29 -
5
6.18 +
5.98 +
0.18 -
2.14 +
0.34 -
17
12- BIBLIOGRAPHY
1. Baltz, M. 1992. Identifying Stages of EBV Infection. American Clinical
Lab. pp. 20-22.
2. Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong. 1965. Studies with Burkitt's
Lymphoma. Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4:69-82.
3. Schooley, R.T. and R. Dolin. 1988. Epstein-Barr Virus (Infectious
Mononucleosis), 2nd edition. In: Principles and Practices of Infectious
Diseases. Mandell, G.L., R.G. Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley
and Sons, New York. pp.97-982.
4. Ambinder, R.F., Mullen, M., Chang, Yung-Nien, Hayward, G.S., and
Hayward, S.D. 1991. Functional Domains of Epstein-Barr Virus Nuclear
Antigen EBNA-1. Journal of Virology, ASM. Vol. 65, No.3, pp. 1466-1478
5. Davidsohn, I. 1937. Serologic Testing of Infectious Mononucleosis. Journal
of American Medical Association. 183: 289-295.
6. Evans, A.S. 1974. History of Infectious Mononucleosis. American
Journal of Medical Science. 267: 189-195.
7. Lennette, E.T. 1988. Herpesviridae: Epstein-Barr Virus. In: Laboratory
Diagnosis of Infectious Diseases, Principles and Practice. Vol. II. Lennette,
E.H., Halonen, P., Murphy, F.A., eds. Springer-Verlag, NY. pp. 230-246.
8. Lennette, E.T. and W. Henle. 1987. Epstein-Barr Virus Infections: Clinical
and Serological Features. Laboratory Management June: pp. 22-28.
9. Henle G., W. Henle, and C.A. Horwitz. 1974. Antibodies to EpsteinBarr Virus-Associated Nuclear Antigen in Infection Mononucleosis.
Journal of infectious Diseases. 130:231-239.
10. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay, (ELISA) Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry.
8:871-874.
11. Engvall, E. and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,
ELISA. In: Proteins of the Biological Fluids, H. Peeters, ed., Proceedings of
the Nineteenth Colloquium, Brugge Oxford. Pergamon Press. p. 553-556.
12. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 1971. Enzyme- Linked
Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein Antigen,
Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme-Labelled Antigen and AntibodyCoated Tubes. Biochem. Biophys. Acta., 251:427-434.
13. Van Weeman, B. K. and A.H.W.M. Schuurs. 1971. Immunoassay Using
Antigen-Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 15:232-235.
18
14. Bakerman, S. 1980. Enzyme Immunoassays. Lab Mgmt. August, p. 21-29.
15. Voller, A., and D.E. Bidwell. 1975. Brit. J. Exp. Pathology. 56:308 -339.
ELISA. III. Quantitation of Anti-Immunoglobulins in Antigen-Coated Tubes.
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17. CDC-NIH Manual. 1993. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. 3rd edition. U.S. Dept. of Health and Human Services,
Public Health Service. Pp. 18-24.
18. Sumaya, Ciro. 1992. Epstein-Barr Virus. Textbook of Pediatric Infectious
Diseases, 3rd ed.. Feigin, R., and H Cherry eds. WB Saunders Co.,
Philadelphia. P. 1549.
19. Miller C., E. Grogan, et al. 1097. Selective lack of antibody to a
component of EB nuclear antigen in patients with chronic active EpsteinBarr Virus Infection. J Inf Dis. 156:26-35.
72939
96 Tests
TROUSSE IMMUNOENZYMATIQUE POUR LA
DETERMINATION DES IgG ANTI-VIRUS EPSTEINBARR (EPSTEIN-BARR NUCLEAR ANTIGEN-1) DANS
LE SERUM HUMAIN
TABLE DES MATIÈRES
22
1-
BUT DU DOSAGE
2-
INTÉRÊT CLINIQUE
3-
PRINCIPE DU TEST
4-
COMPOSITION DE LA TROUSSE
5-
PRÉCAUTIONS, HYGIÈNE ET SÉCURITÉ
6-
MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
7-
RECONSTITUTION DES RÉACTIFS, VALIDITÉ ET CONSERVATION
8-
ÉCHANTILLONS
9-
MODE OPÉRATOIRE
10-
CALCULS ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
11-
PERFORMANCES
12-
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1 - BUT DU DOSAGE
Ce coffret est destiné à la recherche qualitative des anticorps IgG vis à
vis de l'antigène nucléaire 1 du virus d'Epstein-Barr (EB-NA-1) dans le
sérum humain. La trousse Platelia® EB-NA-1 IgG peut être utilisée avec
les autres tests Platelia® EBV-VCA IgG (code 72937), Platelia® EBV-EA-D
IgG (code 72938) et Platelia® EBV-VCA IgM (code 72936) pour
contribuer au diagnostic de mononucléose infectieuse.
2 - INTÉRÊT CLINIQUE
La détection du virus d'Epstein-Barr a été décrite la première fois en 1964
par Epstein, Achong, et Barr, observant au microscope électronique des
lymphoblastes cultivés provenant de patients présentant le lymphome de
Burkitt. L'EBV est classé dans la famille des Herpesviridae d'après sa
morphologie caractéristique.
L'infection à EBV peut présenter une gamme étendue de symptômes
cliniques. La majorité des infections primaires à EBV est transmise par
l'intermédiaire de la salive, se déclare pendant l'enfance, et est
subclinique. Aux Etats-Unis, 50 % de la population présentent des
anticorps EBV avant l'âge de 5 ans et 80 % à l'âge adulte. En France, la
fréquence dans la population adulte atteint 85 %. Les infections à EBV,
consécutives à une transfusion, ont également été rapportées.
Chez les jeunes adultes, l'infection à EBV peut se manifester cliniquement
par une mononucléose infectieuse (MNI) dont la symptomatologie est
assez atypique, fièvre, pharyngite, amygdalite, adénopathies, céphalées,
myalgies, fatigue, hyperleucocytose, splénomégalie, hépatomégalie,
hépaties et éruption cutanée. Les étudiants et les militaires sont souvent
cités comme population au sein de laquelle l'incidence de morbidité par
MNI est élevée.
Après une infection primaire à EBV, il est admis que le lymphocyte B peut
continuer à héberger le génome EBV et conduire à une infection latente
évolutive tout au long de la vie. L'activation ou la réactivation d'une
infection à EBV survient chez les patients immunodéficients ou
immunodéprimés, suite à une greffe d'organe ou lors d'un cancer, mais
aussi parfois chez les femmes enceintes et les personnes âgées.
23
Si la responsabilité de l'EBV dans le syndrome de "mononucléose
chronique" n'est pas clairement démontrée, elle l'est pour deux cancers
humains, le lymphome de Burkitt et le carcinome nasopharyngé. En effet,
des études d'hybridation d'ADN montrent la présence du génome EBV
sur des coupes de biopsies prélevées sur des individus atteints.
Le lymphome de Burkitt s'observe principalement chez les enfants en
Afrique sub-saharienne et en Nouvelle-Guinée ; le cofacteur en serait le
paludisme habituellement diagnostiqué chez ces patients. Le carcinome
nasopharyngé s'observe en Asie, notamment en Chine méridionale,
prédispositions génétiques et/ ou causes environnementales en étant le
cofacteur. Plus récemment, des lymphomes de cellules B semblables au
lymphome africain de Burkitt ont été rapportés chez les patients atteints
du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), ce qui les prédisposerait
à l'infection ou la réactivation de l'EBV.
L'infection EBV a pour conséquence la production d'anticorps dirigés
contre quatre complexes antigéniques distincts. Ceux-ci incluent : EBVinduced Nuclear Antigen (EBNA), EBV-induced Early Antigen (EA), Viral
Capsid Antigen (VCA), and EBV-induced Membrane Antigen (MA). Le
complexe d'EA est divisé en deux composants qui incluent EA-D
(composant diffus) et EA-R (composant restreint). L'infection des cellules
cibles conduit à deux formes de cycles viraux :
1) un cycle infectieux latent, non productif,
2) un cycle infectieux productif et réplicatif.
Dans les deux cycles, un des antigènes précoces exprimés est l'antigène
de membrane détecté par les lymphocytes, un antigène de surface
reconnu par les cellules T. L'expression d'EB-NA-1 suit ou est parallèle à
l’expression de l'antigène de membrane 12 à 24 heures après infection.
EB-NA-1 est considéré comme un antigène non structurel, intranucléaire,
présent dans toutes les lignées cellulaires transformées telles que les
tumeurs de Burkitt et le carcinome nasopharyngé.
Dans le cycle infectieux productif et réplicatif, la synthèse des antigènes
suit celle d’EB-NA-1, le complexe antigène de capside virale (VCA)
apparaissant tard dans le cycle.
Il a été bien établi que la plupart des individus exposés à l'EBV développent
une réponse d'anticorps hétérophiles.
24
Il est récemment devenu évident qu'EB-NA-1 n'est probablement pas une
seule entité antigénique, mais un complexe de composants d'antigènes,
sur la base des réactivités des sérums de différentes classes des patients.
Le composant principal EB-NA-1 a été purifié et séquencé dans sa totalité.
La présence ou l’absence d'anticorps EB-NA-1 IgG contribue au diagnostic
dans les états aigus ou convalescents de MNI : les anticorps IgG dirigés
contre l'EB-NA-1 sont rarement présents dans la MNI aiguë ; ils apparaissent pendant la convalescence ; ils atteignent un plateau au bout de
trois mois à une année et persistent toute la vie.
3 - PRINCIPE DU TEST
Le principe des trousses ELISA-Microplaques de Bio-Rad repose sur la
capacité des substances biologiques, en l'occurrence des antigènes, à
s'adsorber sur les surfaces en plastique telles que le polystyrène (phase
solide). Le coffret Platelia® EB-NA-1 IgG se base sur la technologie ELISA
et utilise des antigènes EB-NA purifiés fixés sur la phase solide. Lors de la
1ère étape de la réaction, ces antigènes, fixés au fond des puits de la
microplaque, sont mis en contact avec le sérum du patient. Les anticorps
spécifiques de ces antigènes, s'ils sont présents, se lient pour former des
complexes antigène-anticorps. A la fin de l'incubation, l'excès d'anticorps
et les protéines du sérum sont éliminés par les lavages. Lors de la 2ème
étape de la réaction, le conjugué, des anti-IgG humaine de chèvre
marquées à la peroxydase de raifort, est ajouté et se lie spécifiquement
aux complexes anticorps-antigènes présents. A la fin de l'incubation, le
conjugué est éliminé par les lavages. L'addition de substrat
tétraméthylbenzidine (TMB) fait apparaître une coloration bleue si des
anticorps spécifiques aux antigènes EB-NA sont présents. Quand la
réaction est arrêtée par une solution d'acide (H2SO4 1N), le contenu du
puits vire au jaune. L'intensité de cette couleur, proportionnelle à la
concentration d'anticorps dans le sérum, peut être lue sur un
spectrophotomètre approprié ou sur un lecteur de microplaques ELISA.
La limite de détection, la spécificité et la reproductibilité des dosages
ELISA sont comparables à d'autres techniques de détection des anticorps,
telles que l'immunofluorescence, la fixation de complément,
l'hémagglutination ou les radioimmunoassays.
25
4 - COMPOSITION DE LA TROUSSE
Tous les réactifs sont destinés à l’usage exclusif du diagnostic in vitro.
Etique
-tage
Nature des réactifs
Microplaque de 12 Barrettes (8 puits) sensibilisées par
R1 EB-NA-1 recombinant, conservée dans un sachet avec un
deshydratant
Solution de lavage concentrée (x 20) :
R2 tampon Tris (pH 7,2 ± 0,2).
Conservateurs : Proclin® 300 (0,1%)
Contrôle négatif (humain) non IgG réactif vis-à-vis d'EB-NA-1.
Négatif en antigène HBs et en anticorps anti-VIH1, anti-VIH2
R3 et anti-VHC
Conservateurs : azide de sodium (< 0,1%) et pen/strep (0,01%)
Contrôle positif I (humain) IgG réactif vis-à-vis d'EB-NA-1.
R4a et anti-VHC
Contrôle positif II (humain) IgG réactif vis-à-vis d'EB-NA-1.
R4b et anti-VHC
Etalon (humain) IgG réactif vis-à-vis d'EB-NA-1, avec le facteur
spécifique de la trousse imprimé sur l'étiquette du flacon.
R5 Négatif en antigène HBs et en anticorps anti-VIH1, anti-VIH2 et
anti-VHC
Conjugué (prêt à l'emploi) : Ac anti-IgG humaines (chèvre) / POD.
R6 Conservateurs : Proclin® 300 (0,1%) et gentamycine
Diluant I : tampon prêt à l'emploi (pH 7.5 ± 0 ,2).
R7 Conservateurs : Proclin® 300 (0,1%)
Solution de Chromogène / Substrat prête à l'emploi :
Tetramethylbenzidine (TMB).
R9 Le réactif doit rester fermé s'il n'est pas utilisé ; dans le cas
contraire, un précipité peut se former dans le puits de réaction.
R10 Solution d’arrêt (H2SO4 1N)
Feuille de travail
Présentation
1
1 x 60 ml
1 x 0.4 ml
1 x 0.4 ml
1 x 0.4 ml
1 x 0.4 ml
1 x 16 ml
1 x 30 ml
1 x 15 ml
1 x 15 ml
1
5 - PRÉCAUTIONS, HYGIENE ET SÉCURITÉ
Précautions
La qualité des résultats est dépendante du respect des Bonnes Pratiques
de Laboratoire suivantes:
26
• Ne pas utiliser de réactifs après la date d’expiration.
• Ne pas mélanger des réactifs de lots différents au cours d’un même essai.
REMARQUE: Il est possible d'utiliser d'autres lots de solution de lavage
(R2), Solution de Chromogène / Substrat prête à l'emploi (R9), et de
solution d'arrêt (R10) des trousses Platelia® EBV-VCA IgG, Platelia®
EBV-EA-D IgG and Platelia® EBV-VCA IgM de notre catalogue, ainsi que
le Diluant I (R7) de Platelia® EBV-EA-D IgG et Platelia® EBV-VCA IgG ;
contacter nos services techniques pour obtenir des informations détaillées.
• Avant utilisation, il est nécessaire d'attendre 30 minutes que les réactifs
s'équilibrent à la température du laboratoire.
• Reconstituer soigneusement les réactifs en évitant toute contamination.
• Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides,
alcalines, aldéhydes) ou de poussières qui pourraient altérer l'activité
enzymatique du conjugué.
• Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l'eau distillée ou de
préférence du matériel à usage unique.
• Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du lavage et la
distribution des réactifs.
• La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux et ions
métalliques. Par conséquent, aucun élément métallique ne doit entrer
en contact avec les différentes solutions contenant le conjugué ou le
substrat.
• La Solution de Chromogène / Substrat prête à l'emploi doit être
incolore. L'apparition d'une coloration indique que le réactif est
inutilisable et doit être remplacé. Conserver cette solution à l'abri de la
lumière.
• Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque échantillon.
• Le lavage des cupules est un étape essentielle de la manipulation:
respecter le nombre de cycles de lavage prescrits, et s'assurer que
toutes les cupules sont complètement remplies, puis, complètement
vidées. Un mauvais lavage peut entraîner des résultats incorrects.
• Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la
solution de révélation.
• Vérifier l'exactitude des pipettes et le bon fonctionnement des appareils
utilisés.
• Ne pas modifier le mode opératoire.
27
Consignes d’hygiène et sécurité
Tous les réactifs sont destinés à l’usage du diagnostic in vitro.
• Porter des gants à usage unique lors de la manipulation des réactifs.
• Ne pas pipeter à la bouche.
• Le matériel d'origine humaine utilisé dans la préparation des réactifs, a
été testé et trouvé non-réactif en antigène de surface du virus de
l'hépatite B (Ag HBs), en anticorps dirigés contre le virus de l'hépatite C
(anti-HCV), en anticorps dirigés contre le virus de l'immunodéficience
humaine (anti-HIV1 et anti-HIV2). Du fait qu'aucune méthode ne peut
garantir de façon absolue l'absence d'agents infectieux. Considérer les
réactifs d'origine humaine, ainsi que tous les échantillons de patients,
comme potentiellement infectieux et les manipuler avec les précautions
d'usage.
• Considérer le matériel directement en contact avec les échantillons et
les réactifs d'origine humaine, ainsi que les solutions de lavage comme
des produits contaminés.
• Eviter les éclaboussures d'échantillons ou de solution les contenant.
• Les surfaces souillées seront nettoyées par de l'eau de Javel diluée à
10%. Si le liquide contaminant est un acide, les surfaces souillées
seront neutralisées au préalable avec du bicarbonate de soude, puis
nettoyées avec de l'eau de Javel et séchées avec du papier absorbant.
Le matériel utilisé pour le nettoyage devra être jeté dans un conteneur
spécial pour déchets contaminés.
• Les échantillons, les réactifs d'origine humaine ainsi que le matériel et
les produits contaminés seront éliminés après décontamination :
- soit par trempage dans de l'eau de Javel à la concentration finale
de 5% d'hypochlorite de sodium pendant 30 minutes,
- soit par autoclavage à 121°C pendant 2 heures minimum.
L'autoclave à 121°C, pendant une heure minimum, est le meilleur
procédé d'inactivation des virus VIH et du virus de l'hépatite B.
NE PAS INTRODUIRE DANS L’AUTOCLAVE
DE SOLUTIONS CONTENANT DE L’HYPOCHLORITE DE SODIUM.
• La manipulation et l'élimination des produits chimiques doivent être
effectuées selon les Bonnes Pratiques de Laboratoire.
28
• Eviter tout contact de la solution de chromogène / substrat et de la
solution d'arrêt avec la peau et les muqueuses (risque de toxicité,
irritation ou brûlure).
• Certains réactifs contiennent de l'azoture de sodium comme
conservateur. Ce composé peut former des azotures métalliques
hautement explosifs avec des canalisations de plomb ou de cuivre. Afin
d'éviter toute accumulation d'azotures, rincer à grande eau les
canalisations lors de l'élimination de ces réactifs dans un évier.
La fiche de données de sécurité est disponible sur simple demande.
6 - MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Agitateur type vortex.
Appareil de lecture (*) pour microplaques (équipés de filtres 450 nm).
Conteneur de déchets contaminés.
Hypochlorite de sodium (eau de Javel) et bicarbonate de soude.
Eau distillée.
Eprouvettes graduées.
Gants à usage unique.
Lunettes de protection.
Papier absorbant.
Pipettes, multipipettes, automatiques ou semi-automatiques, réglables
ou fixes pouvant distribuer 10, 100 et 1000 µl.
• Système de lavage, automatique (*), semi-automatique (*) ou manuel
pour microplaque.
• Tubes à usage unique.
(*) Nous consulter pour une information précise concernant les appareils
validés par nos services techniques
7 - RECONSTITUTION DES RÉACTIFS, VALIDITÉ ET
CONSERVATION
La trousse doit être gardée à +2-8°C. Chaque élément de la trousse
conservé à +2-8°C peut être utilisé jusqu'à la date de péremption
indiquée sur le coffret (sauf indication spécifique).
Avant utilisation, laisser tous les réactifs atteindre la température
ambiante (+21-25°C). Remettre rapidement tous les réactif à +2-8°C
après usage.
29
1) Réactifs prêts à l’emploi
• Réactif 1 (R1): microplaque
Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionné en
sachet 'ZIP'. Couper le sachet à l'aide de ciseaux ou scalpel 0,5 à
1 cm au-dessus du ZIP. Ouvrir le sachet et sortir le cadre. Replacer
immédiatement dans le sachet les barrettes non utilisées. Refermer
soigneusement le sachet et le replacer à +2-8°C. Les barrettes ainsi
conservées sont stables pendant 1 mois.
• Réactif 3 (R3) : contrôle négatif
• Réactif 4a (R4a) : contrôle positif I
• Réactif 4b (R4b) : contrôle positif II
• Réactif 5(R5) : calibrateur
• Réactif 6 (R6) : conjugué
• Réactif 7 (R7) : diluant I
• Réactif 9 (R9) : Solution de Chromogène / Substrat
• Réactif 10 (R10): solution d’arrêt
2) Réactifs à reconstituer
• Réactif 2 (R2) : solution de lavage concentrée 20 fois
Diluer 60 ml de la solution concentrée 20X dans 1,2 l d’eau distillée. On
obtient ainsi la solution de lavage prête à l’emploi. Bien mélanger. Après
dilution, la solution de lavage se conserve 5 jours à +2-8°C.
8 - ÉCHANTILLONS
Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage. Les tests
sont effectués sur des échantillons non dilués de sérum. Extraire le sérum
du caillot ou des hématies dès que possible pour éviter toute hémolyse.
Une hémolyse très prononcée peut affecter les performances du test. Les
échantillons présentant des agrégats doivent être clarifiés par
centrifugation avant le test. Les particules ou agrégats de fibrine en
suspension peuvent donner des résultats faussement positifs.
Les échantillons seront conservés à +2-8°C si le test est effectué dans les
5 jours, ou seront conservés congelés à -20°C pendant plusieurs mois.
Eviter les congélations / décongélations répétées. Si les échantillons
doivent voyager, les emballer selon la réglementation en usage pour le
transport des agents étiologiques.
NE PAS UTILISER DE SERUMS CONTAMINES, HYPERLIPEMIQUES
ICTERIQUES, HEMOLYSES OU INACTIVES A LA CHALEUR.
30
9 - MODE OPÉRATOIRE
Suivre strictement le protocole proposé.
Utiliser les sérums de contrôle négatif, seuil et positifs à chaque mise en
œuvre du test pour valider la qualité du test.
Appliquer les Bonnes Pratiques de Laboratoire :
1. Etablir soigneusement le plan de distribution et d'identification des
échantillons.
2. Préparer la solution de lavage diluée (R2) (se référer au chapitre 7).
3. Sortir le cadre support et les barrettes (R1) de l'emballage protecteur.
Placer le nombre désiré de puits recouverts d'antigènes sur un support
de microplaques. Prévoir 3 puits pour le calibrateur, 1 puits pour le
contrôle négatif, 1 puits pour les contrôles positifs I et II et 1 puits pour
le blanc réactif :
1
2
A B1
S2
B R3
S3
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
C R4a S4
D R4b S5
E R5
S6
F R5
S7
G R5
S8
H S1
S9
4. Contrôles, calibrateur et échantillons doivent être vortexés
préalablement ; diluer les échantillons, le calibrateur, les contrôles
négatif et positifs au 1:21 (par exemple 10 µl + 200 µl) avec le diluant I
d'échantillon (R7) dans les tubes de dilution ou la plaque de dilution.
5. Pipeter 100 µl de calibrateur, de contrôles ou d'échantillon de patient
dilués dans les puits indiqués. Ajouter 100 µl de diluant I d'échantillon
(R7) au puits de blanc réactif.
6. Incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante
(23 ± 2°C).
31
7. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour
déchets contaminés (contenant de l'hypochlorite de sodium) et ajouter
immédiatement dans chacune d'elles un minimum de 300 µl de
solution de lavage. Aspirer de nouveau. Répéter le lavage au moins 4
fois (soit un minimum de 5 lavages au total). Sécher la plaque par
retournement sur une feuille de papier absorbant. Si l'on dispose d'un
laveur automatique, respecter le même cycle opératoire.
8. Distribuer 100 µl de conjugué (R6) dans toutes les cupules.
9. Incuber 20 ± 2 minutes à la température ambiante (23 ± 2°C).
10. Vider toutes les cupules par aspiration et laver 5 fois comme
précédemment.
11. Distribuer rapidement dans toutes les cupules 100 µl de solution de
chromogène / substrat (R9).
12. Laisser la réaction se dérouler à l'obscurité pendant 10 ± 2 minutes à
température ambiante (23 ± 2°C). Lors de cette incubation, ne pas
utiliser de film adhésif. La solution de chromogène / substrat devient
bleue s'il y a présence d'IgG.
13. Ajouter 100 µl de solution d'arrêt (R10) en adoptant la même
séquence et le même rythme de distribution que pour la solution de
chromogène / substrat. Mélanger en tapotant la microplaque.
L'addition de la solution d'arrêt entraîne le passage du bleu au jaune.
14. Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Attendre 5 minutes et
lire la densité optique à 450 nm à l'aide d'un lecteur de plaques dans
les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction (les barrettes doivent
toujours être conservées à l'abri de la lumière avant la lecture).
15. S'assurer avant la transcription des résultats, de la concordance entre
la lecture et le plan de distribution et d'identification des plaques et des
échantillons.
32
10- CALCUL ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
1) Calcul de la moyenne des absorbances
1. Moyenne des DO (Densité Optique) du Calibrateur R5 : calculer la
moyenne des DO en utilisant les 3 valeurs individuelles de DO du R5.
Si l'une des valeurs est aberrante, différant de plus de 15 % de la DO
moyenne, refaire le calcul sans l'utiliser.
2. Facteur de correction : afin de prendre en compte les variations
journalières (temps, température), un facteur de correction, déterminé
pour chaque lot de trousses, est imprimé sur l'étiquette du flacon de
calibrateur R5.
3. Valeur-seuil du calibrateur : celle-ci est obtenue en multipliant la
Moyenne des DO (Densité Optique) du Calibrateur R5 (cf. étape 1)
par le Facteur de Correction.
4. Valeur d'ISR : calculer le ratio d'immunité (ISR) pour chaque échantillon
en divisant la DO obtenue par la Valeur-seuil du calibrateur (cf. étape 3).
Exemple : DO du calibrateur R5
= 0.380, 0.400, 0.420
Moyenne des DO du calibrateur R5 = 0.400
Facteur de correction
= 0.5
Valeur-seuil du calibrateur
= 0.5 x 0.400 = 0.200
DO d’un patient
= 0.600
Valeur d’ISR
= 0.600/0.200 = 3.00
2) Validation de l’essai
1. Le Blanc Réactif (lu contre l’air) doit être < 0.150 à 450 nm :
DO BR < 0.150
2. Le contrôle négatif R3 doit être ≤ 0.250 à 450 nm (lu contre le Blanc
Réactif) : DO R3 ≤ 0.250
3. Chaque calibrateur R5 doit être ≥ 0.250 à 450 nm (lu contre le Blanc
Réactif) : DO R5 ≥ 0.250
4. Le contrôle positif R4b doit être ≥ 0.500 à 450 nm (lu contre le Blanc
Réactif) : DO R4b ≥ 0.500
5. Les valeurs d’ISR (pour “Immune Status Ratio” ou ratio d’immunité) des
contrôles négatif, positifs I et II (R3, R4a, R4b) doivent dans l’intervalle
indiqué sur chacun des flacons.
Si ces critères ne sont pas respectés, recommencer la manipulation.
33
3) Interprétation des résultats
Pour chaque échantillon, le ratio d’immunité (ISR), calculé en divisant la
densité optique de l’échantillon par la valeur seuil, est interprété comme suit :
ISR échantillon
Résultats
Interprétation
≤ 0.90
Négatif
IgG anti-EB-NA-1 non détectable
0.91-1.09
Douteux
Echantillon devant être testé à nouveau
≥ 1.10
Positif
Présence d’IgG anti-EB-NA-1
1. Ce mode d'expression des résultats et les valeurs obtenues sont
spécifique au test Platelia® EB-NA-1 IgG. Des valeurs obtenues avec
d'autres techniques ne sont pas interchangeables avec ces résultats.
2. Les résultats des 4 tests sérologiques, EBV-VCA IgM, EBV-VCA IgG,
EBV-EA-D IgG et EB-NA-1 IgG sont nécessaires à l'interprétation d'une
infection à l'EBV, en particulier au diagnostic de mononucléose
infectieuse ; le résultat d'un test isolé EBV-VCA IgM, EBV-VCA IgG,
EBV-EA-D IgG ou EB-NA-1 IgG ne permet pas de conclure.
3. Il est recommandé de retester les sérums de patients trouvés douteux soit
à partir du même échantillon mais par une autre méthode (par exemple
en immunofluorescence), soit à partir d'un second prélèvement.
4. L'interprétation des résultats a été établie en utilisant un seul
calibrateur. Une approche semi-quantitative est possible à la condition
que l'utilisateur ajoute deux calibrateurs supplémentaires.
5. La comparaison des résultats entre deux échantillons d'un même
patient implique que ces deux échantillons soient testés au cours du
même essai. L'ISR doit être supérieur à 1 pour conclure à une
augmentation du taux d'anticorps
4) Valeurs attendues
➣ En phase aiguë :
Les anticorps VCA IgG et VCA IgM sont normalement présents. Les
anticorps EB-NA-1 IgG sont normalement absents ou à des taux très bas.
➣ En phase intermédiaire :
Habituellement, les anticorps VCA IgG persistent et les anticorps VCA
IgM diminuent habituellement. Les anticorps EB-NA-1 IgG commencent à
augmenter.
34
➣ En phase de convalescence :
Les anticorps VCA IgM diminuent jusqu'à être négatifs ou très bas. Les
anticorps VCA IgG et EBNA-1 IgG persistent habituellement pour la vie.
Aux Etats Unis environ 50 % de la population est séroconvertie avant
l'âge de 5 ans. Une autre vague de séroconversion survient au cours de
la seconde décennie de la vie. Avant l'âge adulte 90-95 % de la plupart
des populations ont des anticorps EBNA-1 (3).
5) Prévalence
204 échantillons provenant d'une population normale du nord est des
Etats Unis comprenant diverses classes d'âge ont été testés avec le test
Platelia® EBV EB-NA-1 IgG. 86.4% des échantillons ont été trouvés
positifs.
Histogramme de répartition des échantillons
40
Nombre de sérum
35
30
25
20
15
10
5
[
[7
-8
[
[6
-7
[
[5
-6
[
[4
-5
[
-4
[3
[2
-3
[
[
-2
.1
.9
[0
-0
.5
[0
[1
[
.9
[
.5
-0
[0
-1
.1
[
0
ISR
6) Limites de la procédure
1. Une utilisation hors des recommandations de la notice technique peut
conduire à des résultats non interprétables.
➣ L’origine des réactions non reproductibles est souvent en relation avec
les causes suivantes :
35
• Lavage insuffisant des microplaques,
• Durée d’incubation non correcte,
• Contamination des échantillons négatifs par un sérum ou un
plasma contenant un titre élevé d’anticorps,
• Contamination ponctuelle de la solution de révélation par des
agents chimiques oxydants (eau de Javel, ions métalliques...),
• Contamination ponctuelle de la solution d’arrêt.
➣ Les sérums contaminés, hyperlipémiques, ictériques, hémolysés ou
inactivés à la chaleur pouvant donner des résultats aberrants ne
doivent pas être utilisés.
➣ Les performances du test ont été établies sur des sérums et non sur des
plasmas.
2. Toute interprétation de ce test ne peut être faite qu’en fonction du
contexte clinique et d’autres résultats d’analyse
➣ Cette trousse n'est pas destinée à déterminer la réponse immune liée à
une infection primaire ou à une réactivation de l'infection virale. Les
échantillons de patients atteints d'infection chronique active à EBV
présentent parfois des résultats négatifs n'excluent pas une infection
primaire récente. Les performances du test ne sont pas données pour
les patients atteints de carcinome du nasopharynx, de lymphome de
Burkitt, ou d'autres lymphadénopathies associées à l'EBV qui ne soient
pas la mononucléose infectieuse. Les résultats trouvés sur des
échantillons de sérum provenant de patients immunodéprimés doivent
être interprétés avec précautions. Les performances du test ne sont pas
données pour les échantillons de sérums prélevés en pédiatrie.
➣ Des échantillons contenant des anticorps anti-E. coli peuvent donner
des réactions faussement positives.
36
XI- PERFORMANCES
1) Sensibilité et spécificité
357 échantillons ont été testés avec Platelia® EB-NA-1 IgG. Les tests EBVVCA IgG ELISA, EBV-VCA IgM ELISA, EBV-EBNA IgG ELISA utilisés pour
la caractérisation préalable des échantillons sont disponibles
commercialement. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous.
Autre test EIA
Résultats
Positif
Douteux
Négatif
Total
Positif
270
5
6
281
Douteux
0
0
1
1
Négatif
0
1
74
75
Total
270
6
81
357
La sensibilité et la spécificité du test ont été déterminées comme suit : La
sensibilité et la spécificité du test ont été déterminées comme suit
(échantillons douteux non inclus) :
Résultats
Spécificité
74/74
100 %
Sensibilité
270/276
97.8 %
Concordance
344/350
98.3 %
2) Etude de précision
Trois sérums, un négatif, un faible positif et un positif ont été testés en
double 20 jours de suite sur 3 sites différents, les moyennes, déviations
standard et coefficients de variation sont calculés pour chacun des
sérums.
n
moyenne
DS
CV %
Négatif
120
0.02
0.02
138
Positif faible
120
1.41
0.16
11.5
Positif
120
5.04
0.37
7.3
Les CV sur les sérums positifs sont inférieurs à 15 %.
37
3) Réactions croisées
Cinq échantillons ont été testés. Ces échantillons ont été trouvés positifs
pour un ou plusieurs paramètres tel qu'indiqué ci-dessous.
Aucun de ces échantillons n'a présenté d'interférence avec le test
Platelia® EB-NA-1 IgG.
HSV 1 IgG
HSV 2 IgG
CMV IgG
VZV IgG
Platelia®
EB-NA-1 IgG
1
2.43 +
0.6 -
1.69 +
2.28 +
0.67 -
2
0.32 -
0.08 -
0.18 -
3.17 +
0.36 -
3
3.67 +
0.86 -
1.11 +
2.45 +
0.73 -
4
0.3 -
0.39 -
0.18 -
3.21 +
0.29 -
5
6.18 +
5.98 +
0.18 -
2.14 +
0.34 -
XII-REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Baltz, M. 1992. Identifying Stages of EBV Infection. American Clinical
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Mononucleosis), 2nd edition. In: Principles and Practices of Infectious
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Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein Antigen,
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component of EB nuclear antigen in patients with chronic active EpsteinBarr Virus Infection. J Inf Dis. 156:26-35.
39
96 pruebas
72939
INMUNOVALORACIÓN ENZIMÁTICA PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE
ANTICUERPOS IgG AL VIRUS DE EPSTEIN BARR (EPSTEIN-BARR NUCLEAR
ANTIGEN-1) EN EL SUERO HUMANO
ÍNDICE
1- USO PREVISTO
2- VALOR CLÍNICO
3- PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO
4- CONTENIDO DEL KIT
5- PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
6- MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
7- PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS
8- MUESTRAS
9- PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
10- CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
11- RENDIMIENTOS
12- BIBLIOGRAFÍA
1- USO PREVISTO
Este kit de inmunovaloración es para la determinación cualitativa de anticuerpos IgG frente al antígeno nuclear-1 (EB-NA-1)
del Epstein-Barr en el suero humano. La valoración de Platelia® EB-NA-1 IgG puede usarse conjuntamente con otras
serologías del Epstein Barr (Platelia® EBV-VCA IgM, Platelia® EBV-VCA IgG y Platelia® EBV-EA-D IgG) como ayuda en el
diagnóstico de la mononucleosis infecciosa.
2- VALOR CLÍNICO
La detección del virus de Epstein-Barr fue descrita por primera vez en 1964 por Epstein, Achong y Barr usando estudios de
microscopia electrónica de linfoblastos cultivados obtenidos de pacientes con linfoma de Burkitt. El VEB se clasifica como
miembro de la familia de virus herpes de acuerdo con su morfología característica.
La infección por VEB puede mostrar un amplio espectro de síntomas clínicos. La mayoría de las infecciones primarias por el
VEB se transmiten por la saliva, se producen durante la infancia y son subclínicas. En Estados Unidos, el 50% de la
población muestra anticuerpos al VEB antes de los 5 años; el 80% en la edad adulta. También se han comunicado
infecciones por el VEB asociadas a transfusiones.
En adultos jóvenes, la infección por VEB puede manifestarse clínicamente como mononucleosis infecciosa (MI) con los
síntomas relativamente atípicos de fiebre, faringitis, amigdalitis, linfadenopatía, malestar, cefalea, mialgia, espleno y
hepatomegalia, erupción y leucocitosis. Los estudiantes de instituto y el personal militar se citan a menudo como
poblaciones con alta incidencia de morbilidad por la MI.
Después de la infección primaria por VEB, se postula que el linfocito B podría continuar albergando el genoma del VEB y
establecer una infección latente que podría extenderse a través de la vida. Se ha documentado la reactivación de la
infección por el VEB o potenciación de la activación del VEB en pacientes inmunodeficientes o inmunodeprimidos, p. ej.,
pacientes con trasplantes de órganos, personas con tumores malignos, mujeres embarazadas y personas de edad
avanzada.
Existe polémica sobre la implicación definitiva del VEB como agente causal en el estado clínico conocido como “infección
crónica por VEB” o “mononucleosis crónica”.
Se ha asociado también el virus de Epstein Barr a la patogenia de dos cánceres humanos, el linfoma de Burkitt y el
carcinoma nasofaríngeo.
La documentación por medio de estudios de hibridación del ADN demuestra la presencia del genoma del VEB en muestras
de biopsias tomadas de individuos con estos carcinomas.
El linfoma de Burkitt se observa fundamentalmente en el África subsahariana, especialmente en niños africanos y en Nueva
Guinea. Suelen diagnosticarse infecciones por la malaria en pacientes con linfoma de Burkitt y se sugiere que son un
cofactor.
El carcinoma nasofaríngeo se observa en Asia, muy especialmente en el sur de China y puede tener influencias genéticas o
ambientales como cofactor.
Recientemente se han comunicado linfomas B similares al linfoma de Burkitt africano en pacientes con síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se sugiere que los pacientes con SIDA podrían estar predispuestos a la infección /
reactivación del VEB debido a su estado general de inmunodepresión. La infección por VEB conduce a la producción de
anticuerpos a cuatro complejos antigénicos diferenciados. Entre estos están: Antígeno nuclear inducido del VEB (EBNA),
Antígeno precoz inducido del VEB (EA), antígeno de la cápside vírica (VCA) y antígeno de membrana inducido del VEB
(MA). El complejo EA se divide en dos componentes que incluyen el EA-D (componente difuso) y el EA-R (componente
restringido). La infección de las células diana conduce a dos formas de ciclos víricos: 1) Infecciones latentes, no productivas
y 2) productivas, replicativas. En ambos ciclos, uno de los antígenos más precoces expresados es el antígeno de membrana
detectado por los linfocitos, un antígeno de superficie celular reconocido por los linfocitos T. Se ha establecido bien que la
mayoría de las personas expuestas a VEB desarrollaron una respuesta de anticuerpos heterófilos. La expresión de EBNA-1
sigue o va en paralelo con el antígeno de membrana a las 12 a 24 horas después de la infección. El EB-NA-1 se encuentra
como antígeno(s) no estructural(es), intranuclear(es), presentes en todas las líneas celulares transformadas con VEB, como
en los tumores de los pacientes con linfoma de Burkitt y carcinoma nasofaríngeo.
En el ciclo plenamente productivo, replicativo, la síntesis de antígeno sigue al EB-NA-1. El complejo del antígeno de la
cápside vírica (VCA) aparece más adelante en el ciclo replicativo.
Recientemente se ha observado que el EB-NA-1 probablemente no es una única región antigénica, sino un complejo de
antígenos multicomponente, de acuerdo con las reactividades de los sueros de diferentes clases de pacientes. El
componente principal, EBNA-1 ha sido purificado y secuenciado en su integridad.
Los niveles de anticuerpos de IgG anti EB-NA-1 son diagnósticos para determinar las etapas aguda y convaleciente en la
MI. Los anticuerpos IgG a EB-NA-1 rara vez están presentes en la MI aguda y se elevan durante la convalecencia.
Aumentarán hasta un nivel meseta en tres meses a un año y normalmente persistirán durante toda la vida.
3 - PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO
Las valoraciones de inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) de Bio-Rad se basan en la capacidad de los materiales
biológicos (p. ej., los antígenos) para adsorberse a superficie plásticas como el poliestireno (fase sólida). El kit Platelia® EBNA-1 IgG utiliza la tecnología ELISA en la que se une un antígeno EB-NA-1 recombinante purificado a los pozos de una
microplaca. Cuando los antígenos unidos a la fase sólida se llevan en contacto con el suero de un paciente, el anticuerpo
específico del antígeno, si está presente, se unirá al antígeno de la fase sólida formando complejos antígeno-anticuerpo. El
exceso de anticuerpo se elimina mediante lavado.
Esto se continúa con la adición de anticuerpos de carnero anti-IgG humano conjugados con peroxidasa de rabanito picante
que luego se unen a los complejos anticuerpo-antígeno. El exceso de conjugado se elimina mediante lavado, seguido de la
adición de sustrato, tetrametilbenzidina (TMB). Si hay anticuerpo específico al antígeno en el suero del paciente, se
desarrolla un color azul. Cuando se detiene la reacción enzimática con H2SO4 1N, el contenido de los pocillos se vuelve
amarillo. El color, que es proporcional a la concentración de anticuerpo en el suero, puede leerse en un espectrofotómetro
adecuado o en un lector de placas de micropozos de ELISA.
La sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de las valoraciones de inmunosorbentes ligados a enzimas podría ser
comparable a otras pruebas serológicas para anticuerpos, como la inmunofluorescencia, la fijación de complemento, la
hemaglutinación y los radioinmunoensayos.
4 – CONTENIDO DEL KIT
Todos los reactivos son exclusivamente para uso diagnóstico in vitro.
Etiquetado
R1
R2
R3
R4a
R4b
R5
R6
R7
R9
R10
Naturaleza de los reactivos
12 tiras (8 pozos cada una) revestidas por antígeno nuclear 1 del Epstein Barr (EBNA-1) recombinante, conservado en una bolsa de aluminio con desecante / indicador
de humedad
Solución de lavado concentrada (20 x) :
Tampón Tris (pH 7,2 ± 0,2) con Tween® 20 al 1%.
Conservantes: Proclin® 300 (0,1%).
Control no reactivo (humano) para anticuerpos IgG anti-EB-NA-1.
Negativo para HBsAg, y anticuerpos anti-VIH1, VIH2 y anti-VHC.
Conservantes: azida sódica (< 0,1%) y pen/estrep (0,01%)
Control positivo I (humano) para anticuerpos IgG anti-EB-NA-1
Control positivo II (humano) para anticuerpos IgG anti-EB-NA-1
Calibrador (humano) para anticuerpos IgG anti EB-NA-1, con factor específico del kit
impreso en la etiqueta de la caja externa.
Negativo para HBsAg y anticuerpos anti-VIH1, VIH2 y anti-VHC
Conjugado: anticuerpos de carnero frente a la IgG humana acoplados con
peroxidasa de rabanito picante; conservantes:
Proclin® 300 (0,1%) y gentamicina
Diluyente I: tampón listo para usar (pH 7,5 ± 0,2)
Conservantes: Proclin® 300 (0,1%)
Solución cromógeno / sustrato (lista para usar):
Tetrametilbenzidina (TMB).
El reactivo debe permanecer cerrado cuando no se está usando; de otro modo,
podría formarse un precipitado en los pozos de reacción.
Solución de parada (lista para usar): Ácido sulfúrico 1N
Hoja de trabajo de la valoración
Presentación
1
1 x 60 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 16 ml
2 x 45 ml
1 x 15 ml
1 x 15 ml
1
5 - PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
Precauciones
La fiabilidad de los resultados depende de la correcta implementación de las siguientes Buenas Prácticas de Laboratorio:
• No usar reactivos caducados.
• No mezclar reactivos de distintos lotes dentro de un mismo desarrollo de la prueba.
NOTA: Es posible usar otros lotes que los contenidos en el kit, siempre que se use el mismo lote dentro de un desarrollo de
prueba determinado: solución de lavado (R2), solución de cromógeno/sustrato (R9) y solución de parada (R10).
estos reactivos pueden usarse con Platelia® EBV-VCA IgM, Platelia® EBV-EA-D IgG y Platelia® EBV-VCA IgM de nuestro
catálogo. El diluyente I (R7) puede usarse con Platelia® EBV-EA-D IgG y Platelia® EB-VCA IgG. Contacte con nuestro
servicio técnico para más información.
• Antes de usarlos, es necesario esperar 30 minutos para que los reactivos se estabilicen a temperatura ambiente.
• Reconstituya cuidadosamente los reactivos evitando cualquier contaminación.
• No realice la prueba en presencia de vapores reactivos (vapores ácidos, alcalinos, aldehídos) o polvo que pueda alterar la
actividad enzimática del conjugado.
• Use material de vidrio lavado y aclarado concienzudamente con agua desionizada o, preferiblemente, material desechable.
• No permita que la microplaca se seque entre el final de la operación de lavado y la distribución del reactivo.
• La reacción enzimática es muy sensible a los iones metálicos. En consecuencia, no permita que ningún elemento metálico
entre en contacto con las diversas soluciones de conjugado o sustrato.
• La solución de cromógeno / sustrato debe ser incolora. La aparición de color indica que el reactivo no puede usarse y debe
cambiarse. Use una nueva punta de pipeta para cada muestra.
• El lavado de la microplaca es un paso crítico en el procedimiento: respete el número recomendado de ciclos de lavado y
compruebe que todos los pozos se llenan completamente y luego se vacían completamente. El lavado incorrecto puede
llevar a resultados inexactos.
• No use nunca el mismo recipiente para distribuir la solución conjugada y la de desarrollo.
• Compruebe que las pipetas y el resto del equipo funcionan de forma exacta y correcta.
• No cambie el procedimiento de valoración.
Instrucciones de salud y seguridad
Todos los reactivos incluidos están previstos para uso diagnóstico in vitro.
• Lleve guantes desechables cuando manipule los reactivos.
• No pipetee con la boca.
• El material de origen humano usado en la preparación de los reactivos ha sido estudiado y ha resultado no reactivo para el
antígeno de superficie de la hepatitis B (HBs Ag), anticuerpos frente a la hepatitis C (VHC) y frente al virus de la
inmunodeficiencia humana (anti-HIV1 y anti-HIV2). Como no hay ningún método que pueda garantizar absolutamente la
ausencia de agentes infecciosos, manipule los reactivos de origen humano y las muestras de pacientes como si pudieran
transmitir enfermedades infecciosas.
• Considere cualquier material directamente en contacto con las muestras y reactivos de origen humano, así como la
solución de lavado, como material contaminado.
• Evite derramar muestras o soluciones que contienen muestras.
• Los vertidos deben limpiarse con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido, los vertidos se deben
neutralizar inicialmente con bicarbonato sódico, luego se deben limpiar con lejía y se deben secar con papel absorbente. El
material usado para la limpieza debe desecharse en un recipiente para residuos contaminados.
• Deben desecharse las muestras, los reactivos de origen humano, así como el material y los productos contaminados
después de descontaminarlos.
- por inmersión en lejía a la concentración final del 5% de hipoclorito sódico durante 30 minutos,
- o mediante autoclave a 121° C durante un mínimo de 2 horas.
El tratamiento en autoclave durante al menos una hora a 121°C es el mejor método para inactivar los virus VIH y el virus de
la HB.
PRECAUCIÓN: NO INTRODUCIR EN EL AUTOCLAVE SOLUCIONES CON HIPOCLORITO SÓDICO.
• Las sustancias químicas deben manejarse y eliminarse de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio.
• Evite cualquier contacto del tampón del sustrato, el cromógeno y la solución de parada con la piel o la mucosa (riesgo de
toxicidad, irritación o quemadura).
• Algunos reactivos contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar con las tuberías del
laboratorio formando azidas de cobre o plomo.
Dichas azidas son explosivas. Para impedir la acumulación de azidas, irrigue las tuberías con una gran cantidad de agua si
se eliminan las soluciones con azidas por el sumidero después de su inactivación.
Se dispone de una hoja de datos de seguridad para quien la pida.
6 - MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
• Mezclador vorticial.
• Lector de microplacas equipado con filtros de 450 nm (*).
• Recipiente para desechos biopeligrosos.
• Hipoclorito sódico (lejía) y bicarbonato sódico.
• Agua destilada o desionizada.
• Probetas graduadas.
• Guantes de látex desechables.
• Gafas de seguridad.
• Papel absorbente.
• Pipetas o multipipetas automáticas o semiautomáticas, ajustables o preconfiguradas, para medir y dispensar 10, 100 y
1.000 µl.
• Lavador de microplacas manual, semiautomático o automático (*).
• Tubos desechables.
(*) Consúltenos para información más detallada sobre el equipamiento recomendado por nuestro departamento técnico.
7 – RECONSTITUCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS
El kit debe conservarse a +2-8° C hasta la fecha de caducidad indicada en el envase (excepto si hay instrucciones
específicas). Antes de usar, permita que los reactivos alcancen temperatura ambiente (+18-30°C). Devuelva todos los
reactivos a la nevera rápidamente después de su uso.
1) Reactivos listos para usar
• Reactivo 1 (R1): microplaca
Cada bandeja con 12 tiras está envuelta en una bolsa sellada tapizada con aluminio. Corte la bolsa con tijeras o un bisturí
0,5 – 1 cm por encima de la línea. Vuelva a colocar inmediatamente las tiras no usadas en la bolsa. Vuelva a cerrar la bolsa
cuidadosamente y vuelva a ponerla a +2-8°C. Entonces, las tiras son estables durante 1 mes.
• Reactivo 3 (R3): control no reactivo
• Reactivo 4a (R4a): control positivo I
• Reactivo 4b (R4b): control positivo II
• Reactivo 5 (R5): calibrador
• Reactivo 6 (R6): conjugado
• Reactivo 7 (R7): diluyente I
• Reactivo R9: Solución cromógeno / sustrato
• Reactivo 10 (R10): solución de parada
2) Reactivos a reconstituir
• Reactivo 2 (R2): solución de lavado concentrada 20x
Diluir 60 ml de la solución de lavado 20X hasta 1,2 l con agua destilada y/o desionizada para obtener la solución lista para
usar. Mezclar bien. Después de la dilución, conservar a +2-8°C durante 5 días.
8 - MUESTRAS
Recoja una muestra de sangre según las prácticas actuales. La prueba se realizará con muestras no diluidas. Separe el
suero del coágulo o los glóbulos rojos cuanto antes para evitar cualquier posible hemólisis. Una hemólisis excesiva puede
afectar al rendimiento de la prueba. Las muestras con agregados deben aclararse mediante centrifugación antes de hacer la
prueba. Las partículas de fibrina suspendidas o los agregados pueden dar resultados falsamente positivos.
Las muestras pueden conservarse a +2-8° C si la prueba se realiza en 5 días o se pueden congelar profundamente a –20° C
durante varios meses. Evite los ciclos repetidos de congelación / descongelación. Si se van a enviar las muestras, deben
envasarse de acuerdo con las normas en vigor relativas al transporte de agentes etiológicos.
NO USAR SUEROS CONTAMINADOS, HIPERLIPIDÉMICOS, ICTÉRICOS, HIPERHEMOLIZADOS O INACTIVADOS AL
CALOR.
9 - PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Siga estrictamente el procedimiento propuesto.
Use el calibrador y los controles para cada serie de determinaciones para validar los resultados de la prueba.
Siga las siguientes normas de Buena Práctica de Laboratorio:
1. Establezca cuidadosamente la distribución de la muestra y el plan de identificación.
2. Prepare la solución de lavado diluida (R2) (véase la sección 7).
3. Tome la bandeja transportadora y las tiras (R1) de su bolsa protectora. Coloque el número deseado de tiras recubiertas
por antígeno en un marco de micropozos. Deje 1 pozo para el reactivo blanco, 2 pozos para el calibrador, 1 pozo en
cada caso para los controles negativo, positivo I y positivo II.
A
B
C
D
E
F
G
H
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
1
B1
R3
R4a
R4b
R5
R5
R5
S1
2
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Todas las muestras, controles y calibrador deben someterse a agitación vorticial antes de su uso. Diluya las muestras
de prueba, el calibrador, los controles negativos y positivos 1:21 (p. ej., 10 µl + 200 µl) con muestra diluyente I (R7)
dentro de los tubos de dilución o la placa de dilución.
Pipetee 100 µl del calibrador, control o muestra de paciente diluidos en cada pozo. Pipetee 100 µl de diluyente I de
muestra (R7) en el primer pozo para el reactivo blanco.
Incube la microplaca durante 20 minutos ± 2 minutos a temperatura ambiente (21-25 °C).
Aspire el contenido de todos los pozos en un recipiente para residuos biopeligrosos (con hipoclorito sódico). Añada
inmediatamente a cada pozo un mínimo de 300 µl de solución de lavado. Aspire de nuevo. Repita este procedimiento al
menos 4 veces (un total de un mínimo de 5 lavados). Si es necesario, seque la placa dándole la vuelta sobre papel
absorbente. Si se usa una lavadora automática, siga el mismo procedimiento.
Distribuya 100 µl del conjugado listo para usar (R6) en todos los pozos.
Incube durante 20 minutos ± 2 minutos a temperatura ambiente (21-25°C).
Vacíe todos los pozos por aspiración y lave 5 veces como se describió antes.
Dispense rápidamente 100 µl de solución cromógeno / sustrato (R9) en cada pozo.
Permita que la reacción se revele en la oscuridad durante 10 minutos ± 2 minutos a temperatura ambiente (21-25°C).
No use película adhesiva durante esta incubación. La solución cromógeno / sustrato se volverá azul en los pozos que
contienen niveles detectables de anticuerpos IgG.
Añada 100 µl de solución de parada a cada pozo. Mezcle golpeando suavemente la placa. La adición de la solución de
parada producirá un cambio de color de azul a amarillo.
14. Espere un mínimo de 5 minutos y lea. Limpie cuidadosamente el fondo de la placa. Usando una longitud de onda de
450 nm, ponga en blanco el lector en el reactivo blanco y mida la densidad óptica de cada pozo. La placa debe
interpretarse en 30 minutos después de añadir la solución de parada (las tiras deben mantenerse siempre fuera de la
luz antes de leerlas).
15. Compruebe todos los resultados en cuanto a acuerdo entre la lectura y la placa y la distribución de la muestra y el plan
de identificación.
10-CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
1) Cálculo de la absorbancia media
1. Media de D.O. de corte del calibrador (Densidad óptica) – Calcule el valor medio de D.O. para el calibrador de punto de
corte a partir de las tres determinaciones del calibrador R5. Si cualquiera de los tres valores de los calibradores difiere
en más del 15% de la media, deseche ese valor y calcule el promedio de los dos valores restantes.
2. Factor de corrección – Para tener en cuenta las fluctuaciones día a día de las actividades de la valoración debido a la
temperatura ambiente y al momento, se determina un factor de corrección para cada lote de kits. El factor de corrección
se imprime en el vial del calibrador.
3. Valor de corte del calibrador – El valor de corte del calibrador para cada valoración se determina multiplicando el factor
de corrección por la media de D.O. del punto de corte del calibrador determinada en el paso 1.
4. Valor ISR – Calcule un Cociente de estado inmunitario (ISR) para cada muestra dividiendo el valor de D.O. de la
muestra por el valor de corte del calibrador determinado en el paso 3.
Ejemplo:
D.O. obtenidas para el calibrador = 0,380, 0,400, 0,420
D.O. media para el calibrador A = 0,400
Factor de corrección
= 0,5
Valor de corte del calibrador
= 0,5 x 0,400 = 0,200
D.O. obtenida para los sueros de los pacientes = 0,600
Valor de ISR = 0,600/0,200
= 3,00
5. La linealidad máxima de la valoración es un ISR de 5,40, por lo que el valor de ISR > 5,40 debe comunicarse como
mayor de 5,40.
2) Validación del ensayo
1. El reactivo blanco (cuando se lee frente a aire blanco) debe ser < 0,150 a 450 nm: DO RB < 0,150
2. El control negativo R3 debe ser ? ? ?
0,250 a 450 nm (cuando se lee contra el reactivo blanco): DO R3 ? ? ?
0,250
3. Cada calibrador R5 debe ser ? ? ?
0,250 a 450 nm (cuando se lee contra el reactivo blanco): DO R5 ? ? ?
0,250
4. El control positivo R4b debe ser ? ? ?
0,500 a 450 nm (cuando se lee contra el reactivo blanco): DO R4b ? ? ?
0,500
5. Los valores de ISR (cociente de estado inmunitario) para los controles negativos, positivos I y positivos II (R3, R4a,
R4b) deben estar en sus intervalos respectivos impresos en los viales.
Si esos criterios no están dentro de sus intervalos respectivos, la prueba debe considerarse inválida y debe repetirse.
3) Interpretación de los resultados
Los valores de ISR (Cociente del estado inmunitario) de los pacientes se interpretan como sigue:
Valor de ISR
Resultados
Interpretación
Negativo
Sin nivel significativo de anticuerpo IgG detectable frente a EB-NA-1.
≤?
0,90
0,91-1,09
Equívoca
Deben volverse a estudiar las muestras
Positivo
Nivel significativo de anticuerpo IgG frente a EB-NA-1 detectable
≥?
1,10
1.
2.
3.
4.
5.
El siguiente es un método recomendado para comunicar los resultados; « Se obtuvieron los resultados siguientes con la
prueba Platelia® EB-NA-1 IgG. Los valores obtenidos con métodos diferentes podrían no poderse usar de modo
intercambiable. La magnitud del nivel comunicado de IgG no puede correlacionarse con un título de punto final”.
Se usan cuatro anticuerpos diferenciados frente al VEB para dar un cuadro completo de la infección por VEB; estos IgM
anti VCA del VEB, IgG anti VCA del VEB, IgG anti EA del VEB y e IgG anti EB-NA. La interpretación exacta de la
infección por VEB se basa en los resultados de todos estos anticuerpos y habitualmente no se basa en los resultados
de una sola prueba para un diagnóstico.
Las muestras que sigan siendo equívocas después de pruebas repetidas deben volverse a estudiar mediante un
método alternativo, p. ej., valoración por inmunofluorescencia (IFA). Si los resultados siguen siendo equívocos con las
nuevas pruebas, debe tomarse una nueva muestra.
Las características de rendimiento para este producto se han establecido usando un calibrador. Si se desea una curva
de relación dosis-respuesta lineal con la valoración, el usuario debe establecer un mínimo de dos calibradores
adicionales.
Para evaluar los sueros por parejas en cuanto a cambios significativos en el nivel del anticuerpo, deben estudiarse
ambas muestras por duplicado en la misma valoración. El ISR medio de ambos (agudo y convaleciente) debe ser mayor
de 1,00 para evaluar los sueros emparejados en cuanto a un aumento significativo del nivel de anticuerpos.
4) Valores Esperados
Fase aguda
?
Normalmente están presentes los anticuerpos IgG frente al VCA del VEB e IgM frente al VCA del VEB.
Normalmente, están ausentes las IgG EB-NA1 o están en niveles muy bajos.
? ase de transición
F
Los anticuerpos IgG frente al VCA del VEB persisten y las IgM frente al VCA del VEB habitualmente disminuyen. Los
anticuerpos IgG al EB-NA-1 comienzan a aumentar.
Fase convaleciente
?
Las IgM frente al VCA del VEB caen a negativos o muy bajos. Los anticuerpos IgG frente al VCA del VEB e IgG frente al EBNA-1 suelen persistir de por vida. En EE.UU., aproximadamente el 50% de la población se seroconvierte antes de los 5
años. Se produce otra oleada de seroconversiones a medio camino de la segunda década de la vida. Para la edad adulta, el
90%-95% de la mayoría de las poblaciones tendrán anticuerpos anti EB-NA-1.
5) Prevalencia
Se estudió un grupo de 204 sueros de una población sana en la porción noreste de EEUU con la valoración Platelia® EBNA-1 IgG. Los sueros se asignaron aleatoriamente en cuanto a sexo, edad y raza. En la gráfica siguiente se presenta la
distribución de los valores de ISR de este estudio. En este estudio, el 86,4% de la población fueron positivos en la
valoración.
Distribución de los valores de ISR en una población normal (n = 204)
6) Limitaciones de uso
1. Los procedimientos o prácticas con el kit fuera de los indicados en este prospecto pueden dar resultados cuestionables.
A menudo, se producen reacciones no reproducibles por:
?
• Lavado inadecuado de las microplacas,
• Tiempo inadecuado en los pasos de incubación,
• Contaminación de muestras negativas mediante suero o plasma con un alto título de anticuerpos,
• Contaminación de la solución de desarrollo mediante agentes oxidantes (lejía, iones metálicos...),
• Contaminación de la solución de parada.
Los sueros contaminados, ictéricos, lipémicos, hemolizados o inactivados por calor pueden producir resultados erróneos y
?
deben evitarse.
No se han establecido las características de rendimiento para ninguna matriz distinta del suero.
?
2. El médico, a la luz de otros hallazgos clínicos y procedimientos diagnósticos, debe interpretar los resultados de esta
prueba.
Este kit está diseñado para medir el anticuerpo IgG en muestras de pacientes.
?
Los resultados positivos en neonatos deben interpretarse con cuidado, porque la IgG materna se transfiere de forma pasiva
de la madre al feto antes del nacimiento. Las valoraciones de IgM suelen ser indicadores más útiles de infección en niños
menores de 6 meses. Los valores obtenidos de esta valoración están previstos sólo como ayuda al diagnóstico. Cada
médico debe interpretar los resultados a la luz de la historia, los hallazgos en la exploración física y otros procedimientos
diagnósticos realizados al paciente.
No se han establecido las características de rendimiento para los pacientes con carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt,
otras linfadenopatías asociadas a VEB y otras enfermedades asociadas al VEB distintas de la mononucleosis relacionada
con el VEB. Los resultados de Platelia® EB-NA-1 IgG realizados en el suero de pacientes inmunodeprimidos deben
interpretarse con cuidado. No se han establecido las características de rendimiento para esta valoración en muestras
pediátricas.
Las personas con infección crónica activa por el virus de Epstein-Barr pueden no producir una respuesta de anticuerpos a
?
EB-NA-1.
Existe una posibilidad de reactividad cruzada de la valoración con muestras con anticuerpos anti-E. coli.
?
11-RENDIMIENTOS
1 – Sensibilidad y especificidad relativas basadas en la caracterización del suero
Se estudiaron 357 sueros. Los sueros del estudio fueron caracterizados previamente usando valoraciones de ELISA
disponibles comercialmente. Se determinaron la sensibilidad, la especificidad y la concordancia de la valoración de acuerdo
con esta caracterización. Los resultados se resumen en la tabla siguiente.
Otros EIA
PRUEBA
Resultado
Positivo
Dudoso
Negativo
Total
Positivo
Dudoso
270
5
0
0
0
1
270
6
Negativo
6
1
74
81
Total
281
1
75
357
Esto permite realizar los siguientes cálculos (se excluyen las muestras dudosas)
Resultados
Especificidad
Sensibilidad
Acuerdo global
74 / 74
270 / 276
344 / 350
100 %
97,8 %
98,3 %
2 - Precisión
La prueba Platelia® EB-NA-1 IgG fue evaluada en cuanto a precisión estudiando tres sueros por duplicado veinte veces
cada uno en 3 laboratorios diferentes. Los resultados se resumen en la tabla siguiente.
Suero
Negativo
Positivo bajo
Positivo
n
X
D.E.
CV %
120
120
120
0,02
1,41
5,04
0,02
0,16
0,37
138
11,5
7,3
X = Valor medio del ISR
D.E. = Desviación estándar
C.V. = Coeficiente de variación
3 – Reactividad cruzada
Se valoraron las siguientes 5 muestras de suero y resultaron negativas con la prueba Platelia® EB-NA-1 IgG.
IgG HSV 1
IgG HSV 2
IgG CVM
IgG VZV
Platelia
EB-NA-1 IgG
1
2,43 +
0,6 -
1,69 +
2,28 +
0,67 -
2
0,32 -
0,08 -
0,18 -
3,17 +
0,36 -
3
3,67 +
0,86 -
1,11 +
2,45 +
0,73 -
4
0,3 -
0,39 -
0,18 -
3,21 +
0,29 -
5
6,18 +
5,98 +
0,18 -
2,14 +
0,34 -
12-BIBLIOGRAFÍA
Véase la versión inglesa.
96 Tests
72939
ENZYMIMMUNOASSAY FÜR DIE QUALITATIVE BESTIMMUNG VON IgG-ANTIKÖRPERN GEGEN DAS
EPSTEIN-BARR-VIRUS (EPSTEIN-BARR NUCLEAR ANTIGEN-1) IN HUMANSERUM
INHALTSVERZEICHNIS
1 - VERWENDUNGSZWECK
2 - KLINISCHE BEDEUTUNG
3 - TESTPRINZIP
4 - INHALT DES KITS
5 - WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
6 - ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
7 - VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
8 - PROBEN
9 - TESTVERFAHREN
10 - BERECHNUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
11 - LEISTUNGSMERKMALE
12 - LITERATUR
1
1 - VERWENDUNGSZWECK
Dieser Immunoassay ist für die qualitative Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen das Epstein-Barr-Virus-nukleäres
Antigen-1 (EB-NA-1) in Humanserum vorgesehen. Platelia® EB-NA-1 IgG kann in Verbindung mit anderen Epstein-BarrSerologietests (Platelia® EBV-VCA IgM, Platelia® EBV-VCA IgG und Platelia® EBV-EA-D IgG) als Hilfsmittel für die
Diagnose einer infektiösen Mononukleose verwendet werden.
2- KLINISCHE BEDEUTUNG
Der Nachweis des Epstein-Barr-Virus wurde zuerst im Jahre 1964 von Epstein, Achong und Barr durch
elektronenmikroskopische Studien von gezüchteten Lymphoblasten von Patienten mit Burkitt-Lymphom beschrieben. EBV
wird aufgrund seiner charakteristischen Morphologie zur Familie der Herpes-Viren gezählt.
Eine EBV-Infektion kann ein breites Spektrum an klinischen Symptomen aufweisen. Die meisten EBV-Primärinfektionen
werden über Speichel übertragen, treten während der Kindheit auf und verlaufen subklinisch. In den USA werden EBVAntiköper bei 50% der Bevölkerung vor Erreichen des 5. Lebensjahres und bei 80% der Erwachsenen nachgewiesen.
Darüber hinaus wurden EBV-Infektionen in Zusammenhang mit Transfusionen berichtet.
Bei jungen Erwachsenen kann sich eine EBV-Infektion als infektiöse Mononukleose (IM) mit relativ atypischen Symptomen
wie fiebrige Pharyngitis, Tonsilitis, Lymphadenopathie, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Myalgien, Spleno- und Hepatomegalie,
Hautausschlag und Leukozytose manifestieren. Schüler und Militärpersonal werden häufig als eine für IM sehr anfällige
Population genannt.
Nach einer EBV-Primärinfektion kann der B-Lymphozyt das EBV-Genom weiterhin enthalten und eine latente Infektion
hervorrufen, die lebenslang persistieren kann. Eine Reaktivierung der EBV-Infektion oder eine verstärkte EBV-Aktivierung
wurde bei immunsupprimierten Menschen wie Patienten nach Organtransplantationen, Krebspatienten, schwangeren Frauen
und älteren Menschen dokumentiert.
Weiterhin umstritten ist die endgültige Rolle von EBV als Erreger des als “chronische EBV-Infektion” oder “chronische
Mononukleose” bezeichneten klinischen Zustandes.
Das Epstein-Barr-Virus wurde auch mit der Pathogenese zweier Krebsarten beim Menschen, dem Burkitt-Lymphom und dem
Nasopharyngealkarzinom, assoziiert.
DNA-Hybridisierungsstudien belegen das Vorliegen des EBV-Genoms in Biopsieproben von Patienten mit diesen
Karzinomen.
Das Burkitt-Lymphom wird hauptsächlich bei afrikanischen Kindern südlich der Sahara sowie in Neu-Guinea beobachtet.
Malaria-Infektionen werden in der Regel bei Patienten mit Burkitt-Lymphom diagnostiziert und als Kofaktor vermutet.
Das Nasopharyngealkarzinom wird in Asien, hauptsächlich im südlichen China, beobachtet und kann als Kofaktor genetische
und Umwelteinflüsse haben.
B-Zell-Lymphome ähnlich dem afrikanischen Burkitt-Lymphom wurden in letzter Zeit bei Patienten mit der
Immunschwächekrankheit AIDS berichtet. Es wird vermutet, dass AIDS-Patienten für EBV-Infektionen bzw. –Reaktivierung
aufgrund ihres allgemeinen immunsupprimierten Zustandes prädisponiert sind.
Die EBV-Infektion führt zur Produktion von Antikörpern gegen vier verschiedene Antigenkomplexe. Zu diesen zählen: das
EBV-induzierte nukleäre Antigen (EBNA), das EBV-induzierte Early Antigen (EA, frühes Antigen), das Viruskapsidantigen
(VCA) und das EBV-induzierte Membranantigen (MA). Der EA-Komplex wird in zwei Komponenten, EA-D (diffuse
Komponente) und EA-R ((restricted) begrenzte Komponente) unterteilt.
Die Infektion der Zielzellen führt zu zwei Formen von Viruszyklen: 1) latenten, nicht-produktiven und 2) produktiven,
replikativen Infektionen. In beiden Zyklen ist das am frühesten auftretende Antigen das lymphozyt-detektierte
Membranantigen, ein Zelloberflächen-Antigen, das von T-Zellen erkannt wird. Es ist erwiesen, dass die meisten EBVexponierten Menschen eine heterophile Antikörperantwort entwickeln. EBNA-1 wird entweder gleichzeitig mit dem oder nach
dem Membranantigen 12 bis 14 Stunden nach der Infektion gebildet. EB-NA-1 wird als nicht-strukturelles, intranukleäres
Antigen nachgewiesen, das in allen EBV-transformierten Zelllinien in Tumoren bei Patienten mit Burkitt-Lymphom und
Nasopharyngealkarzinom vorliegt.
In einem vollständig produktiven, replikativen Zyklus erfolgt die Antigensynthese nach EB-NA-1. Der ViruskapsidantigenKomplex (VCA) erscheint später im replikativen Zyklus.
Vor kurzem wurde deutlich, dass EB-NA-1 wahrscheinlich zwar eine einzelne Antigeneinheit, jedoch ein MultikomponentenAntigenkomplex auf der Basis von Reaktivitäten der Seren von verschiedenen Arten von Patienten darstellt. Die
Hauptkomponente EBNA-1 wurde vollständig gereinigt und sequenziert.
EB-NA-1 IgG-Antikörperkonzentrationen sind für die Bestimmung akuter und konvaleszenter Stadien von IM charakteristisch.
EB-NA-1 IgG-Antikörper sind bei akuter IM selten vorhanden und steigen während der Genesung an. Sie erreichen in drei
Monaten bis einem Jahr eine Plateaukonzentraton und persistieren in der Regel lebenslang.
3 - TESTPRINZIP
Die ELISA-Assays (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) von Bio-Rad beruhen auf der Fähigkeit von biologischen
Materialien (d. h. Antigenen), an Kunststoffoberflächen wie z. B. Polystyrol (Festphase) zu adsorbieren. Platelia® EB-NA-1
IgG verwendet die ELISA-Technik, wobei ein gereinigtes, rekombinantes EB-NA-1-Antigen an die Vertiefungen einer
Mikrotiterplatte gebunden ist. Wenn die an die Festphase gebundenen Antigene mit dem Patientenserum in Berührung
kommen, bindet der antigenspezifische Antikörper, sofern vorhanden, an das Antigen auf der Festphase und bildet AntigenAntikörper-Komplexe. Überschüssiger Antikörper wird durch einen Waschgang entfernt.
Anschließend wird mit Meerrettich-Peroxidase markiertes Anti-Human-IgG (Ziege) zugegeben, das an die AntikörperAntigen-Komplexe bindet. Überschüssiges Konjugat wird durch einen Waschgang entfernt. Danach wird Substrat,
2
Tetramethylbenzidin (TMB), zugegeben. Ist für das Antigen spezifischer Antikörper im Patientenserum vorhanden, entwickelt
sich eine blaue Färbung. Nach Stoppen der Enzymreaktion mit 1N H2SO4 verfärbt sich der Inhalt der Vertiefungen gelb. Die
Färbung, die proportional zur Antikörperkonzentration im Serum ist, kann mit einem geeigneten Spektrophotometer oder
einem ELISA-Mikrotiterplattenleser abgelesen werden.
Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit von ELISA-Assays können mit anderen serologischen Tests für Antikörper wie
Immunfluoreszenz, Komplementbindung, Hämagglutination und Radioimmunoassays vergleichbar sein.
4 - INHALT DES KITS
Alle Reagenzien sind ausschließlich für die in vitro-Diagnostik bestimmt.
Etikett
R1
R2
R3
R4a
R4b
R5
R6
R7
R9
R10
Art der Reagenzien
Darreichungsform
12 Streifen (à 8 Vertiefungen), beschichtet mit rekombinantem Epstein-Barr1
Nukleäres Antigen-1 (EB-NA-1), in einem Folienbeutel mit Trockenmittel/Feuchtigkeitsindikator
Konzentrierte Waschlösung (20fach): Tris-Puffer (pH 7,2 ± 0,2) mit 1% Tween® 20.
1 x 60 ml
Konservierungsmittel: Proclin® 300 (0,1%).
Nicht reaktive Kontrolle (human) für Anti-EB-NA-1 IgG-Antikörper,
1 x 0,4 ml
negativ für HBs Ag und HIV-1-, HIV-2- und HCV-Antikörper.
Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,1 %) und Pen/Strep (0,01%)
Positive Kontrolle I (human) für Anti-EB-NA-1 IgG-Antikörper,
1 x 0,4 ml
Positive Kontrolle II (human) für Anti-EB-NA-1 IgG-Antikörper,
1 x 0,4 ml
Kalibrator (human) für Anti-EB-NA-1 IgG-Antikörper, mit kit1 x 0,4 ml
spezifischem Faktor auf dem Etikett der Packung aufgedruckt.
Konjugat: Ziegen-Antikörper gegen Human-IgG, markiert mit
1 x 16 ml
Meerrettich-Peroxidase; Konservierungsmittel:
Proclin® 300 (0,1%) und Gentamycin
Verdünnungsmittel I: Gebrauchsfertiger Puffer (pH 7,5 ± 0,2).
1 x 30 ml
Konservierungsmittel: Proclin® 300 (0,1%)
Chromogen/Substratlösung (gebrauchsfertig): Tetramethylbenzidin (TMB).
1 x 15 ml
Das Reagenz sollte nach der Verwendung wieder verschlossen werden, da sich
ansonsten Präzipitat in den Reaktionsvertiefungen bilden kann.
Stopplösung (gebrauchsfertig): 1N Schwefelsäure
1 x 15 ml
Testarbeitsblätter
1
5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
VORSICHTSMASSNAHMEN
Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt von der Einhaltung folgender GLP-Richtlinien ab:
•
Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.
•
Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen innerhalb einer Messreihe vermischen.
ANMERKUNG: Es können Chargen aus unterschiedlichen Kits miteinander verwendet werden, sofern immer die gleiche
Charge für eine bestimmte Messreihe verwendet wird: Waschlösung (R2), Chromogen/Substratlösung (R9) und Stopplösung
(R10).
Diese Reagenzien können mit Platelia® EBV-VCA IgG, Platelia® EBV-EA-D IgG und Platelia® EBV-VCA IgM unseres
Katalogs verwendet werden. Das Verdünnungsmittel I (R7) kann mit Platelia® EBV-EA-D IgG und Platelia® EB-VCA IgG
verwendet werden. Detaillierte Informationen erhalten Sie von unserer Technikabteilung.
•
Vor der Verwendung 30 Minuten warten, damit sich die Reagenzien bei Raumtemperatur stabilisieren.
•
Reagenzien vorsichtig auflösen und jegliche Kontamination vermeiden.
•
Den Test nicht in Gegenwart reaktiver Dämpfe (saure, alkalische, Aldehyd-Dämpfe) oder unter Staubeinwirkung
durchführen, durch die die Enzymaktivität des Konjugats beeinträchtigt werden könnte.
•
Sorgfältig gewaschene und mit entionisiertem Wasser gespülte Glasgefäße oder vorzugsweise Einwegmaterial
verwenden.
•
Die Mikrotiterplatte nach Beendigung des Waschvorgangs und vor dem Pipettieren der Reagenzien nicht trocknen
lassen.
•
Die Enzymreaktion weist gegenüber Metallionen eine hohe Sensitivität auf. Daher dürfen Metallelemente nicht mit den
verschiedenen Konjugat- und Substratlösungen in Berührung kommen.
•
Die Chromogen/Substratlösung muss farblos sein. Ist eine Verfärbung sichtbar, darf das Reagenz nicht verwendet
werden und muss ersetzt werden. Für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden.
3
•
•
•
•
Das Waschen der Mikrotiterplatte ist ein wesentlicher Arbeitsgang: Die empfohlene Anzahl an Waschzyklen ist zu
beachten, und es ist sicherzustellen, dass alle Vertiefungen vollständig befüllt und anschließend vollständig geleert
werden. Nicht korrekt durchgeführte Waschzyklen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
Niemals das gleiche Gefäß zum Pipettieren des Konjugates und der Entwicklungslösung verwenden.
Für die Genauigkeit des Tests und einen korrekten Testablauf Pipetten und Zubehör überprüfen.
Das Testverfahren darf nicht geändert werden.
Sicherheitsvorschriften
Alle Reagenzien sind ausschließlich für die In-vitro-Diagnostik bestimmt.
•
Beim Umgang mit Reagenzien Einweghandschuhe tragen.
•
Nicht mit dem Mund pipettieren.
•
Das Humanmaterial zur Vorbereitung der Reagenzien wurde getestet und als nicht reaktiv für Hepatitis-BOberflächenantigen (HBs Ag), Antikörper gegen das Hepatitis-C-Virus (anti-HCV) und gegen das humane
Immundefizienz-Virus (anti-HIV1 und anti-HIV2) befunden. Da keine Testmethode eine potentielle Infektionsgefahr mit
absoluter Sicherheit ausschließen kann, müssen alle Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, und Patientenproben
als potentiell infektiös behandelt werden.
•
Alle Materialien, die mit Proben und Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, in Berührung kommen, einschließlich
der Waschlösung, sollten als infektiös betrachtet werden.
•
Verschütten von Proben oder probenhaltigen Lösungen vermeiden.
•
Verschüttete Proben müssen mit auf 10% verdünnter Natriumhypochloritlösung gespült werden. Wenn es sich bei der
Flüssigkeit um eine Säure handelt, muss die verschüttete Menge zunächst mit Natriumbicarbonat neutralisiert und
anschließend mit Natriumhypochloritlösung gereinigt und mit Papiertüchern getrocknet werden. Das für die Reinigung
verwendete Material ist in einem Behälter für Sondermüll zu geben.
•
Proben, Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, sowie kontaminierte Materialien und Produkte sollten nach einer
Dekontaminierung entsorgt werden, und zwar
entweder durch Eintauchen in Natriumhypochloritlösung mit einer Natriumhypochlorit-Endkonzentration von 5% für
die Dauer von 30 Minuten
oder durch Autoklavieren bei 121°C für mindestens 2 Stunden.
Mindestens halbstündiges Autoklavieren bei 121°C ist die beste Methode zum Inaktivieren von HIV- und HBV-Viren.
VORSICHT: NATRIUMHYPOCHLORITHALTIGE LÖSUNGEN NICHT IN DEN AUTOKLAVEN STELLEN.
•
Chemikalien müssen gemäß den GLP-Richtlinien gehandhabt und entsorgt werden.
•
Substratpuffer, Chromogen und Stopplösung nicht mit der Haut oder den Schleimhäuten in Berührung bringen (giftig,
reizend und kann Verbrennungen verursachen).
•
Einige Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann zur Bildung von Blei- oder
Kupferaziden in Rohrleitungen führen.
•
Solche Azide können explosiv sein. Um die Azidbildung zu vermeiden, Leitungen mit reichlich Wasser nachspülen, wenn
die azidhaltigen Lösungen nach Inaktivierung über den Abfluss entsorgt werden.
Ein Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage erhältlich.
6 - ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
• Vortex.
• Mikrotiterplatten-Lesegerät, ausgestattet mit 450 nm-Filtern (*).
• Behälter für infektiösen Abfall.
• Natriumhypochlorit und Natriumbicarbonat.
• Destilliertes oder entionisiertes Wasser.
• Zylinder mit Maßeinteilung.
• Einweg-Latexhandschuhe.
• Schutzbrille.
• Saugfähige Papiertücher.
• Automatische oder halbautomatische, einstellbare oder voreingestellte Pipetten oder Multipipetten zum Abmessen und
Pipettieren von 10, 100, und 1000 µl.
• Manuelles, halbautomatisches oder automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät (*).
• Einwegröhrchen.
(*) Weitere Informationen zu den von unserer Technikabteilung empfohlenen Geräten erhalten Sie direkt bei uns.
7 - REKONSTITUTION UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
Der Kit kann bei +2-8°C bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum gelagert werden, sofern nicht anders
vorgeschrieben. Die Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (+18-30°C) bringen. Alle Reagenzien nach der
Verwendung sofort wieder in den Kühlschrank stellen.
1) Gebrauchsfertige Reagenzien
• Reagenz 1 (R1): Mikrotiterplatte
4
Jede Blotwanne mit 12 Teststreifen ist in einem versiegelten Folienbeutel verpackt. Den Beutel mit einer Schere oder einem
Skalpell 0,5 - 1 cm über der Linie abschneiden. Unbenutzte Streifen unverzüglich zurück in die Verpackung stecken. Den
Beutel sorgfältig verschließen und bei +2-8°C lagern. Auf diese Weise sind die Streifen bis zu einem Monat haltbar.
• Reagenz 3 (R3): nicht reaktive Kontrolle
• Reagenz 4a (R4a): positive Kontrolle I
• Reagenz 4b (R4b): positive Kontrolle II
• Reagenz 5 (R5): Kalibrator
• Reagenz 6 (R6): Konjugat
• Reagenz 7 (R7): Verdünnungsmittel I
• Reagenz R9: Chromogen/Substratlösung
• Reagenz 10 (R10): Stopplösung
2) Aufzulösende Reagenzien
• Reagenz 2 (R2): Konzentrierte Waschlösung (20fach)
60 ml der 20fach konzentrierten Waschlösung auf 1,2 l mit destilliertem bzw. entionisiertem Wasser verdünnen, um eine
gebrauchsfertige Lösung zu erhalten. Gründlich mischen. Nach der Verdünnung ist die Lösung bei +2-8°C 5 Tage haltbar.
8 - PROBEN
Die Entnahme der Blutprobe erfolgt gemäß der üblichen Vorgehensweise. Der Test wird mit unverdünnten Proben
durchgeführt. Das Serum vom Blutkuchen bzw. den Erythrozyten so schnell wie möglich trennen, um eine Hämolyse zu
vermeiden. Eine starke Hämolyse kann die Testleistung beeinträchtigen. Proben, die Gerinnsel enthalten, müssen vor dem
Test durch Zentrifugation geklärt werden. Aufgeschwemmte Fibrinaggregate oder -partikel können zu falsch positiven
Ergebnissen führen.
Die Proben sollten bei +2-8°C gelagert werden, sofern die Analyse innerhalb von 5 Tagen erfolgt, andernfalls können sie
tiefgeforen bei -20°C über mehrere Monate aufbewahrt werden. Wiederholtes Einfrieren/Auftauen vermeiden. Zum Transport
sind die Proben gemäß den Bestimmungen für den Transport infektiöser Stoffe zu verpacken.
KEINE KONTAMINIERTEN, HYPERLIPÄMISCHEN, IKTERISCHEN, HYPERHÄMOLYTISCHEN ODER
HITZEINAKTIVIERTEN SEREN VERWENDEN.
9 - TESTVERFAHREN
Bitte das Testverfahren strikt befolgen.
Verwenden Sie zur Validierierung der Testergebnisse für jede Messreihe den Kalibrator und die Kontrollen.
Halten Sie sich an die folgenden GLP-Richtlinien:
1. Probenverteilung und Identifikationsplan sorgfältig festlegen.
2. Die verdünnte Waschlösung (R2) vorbereiten (siehe Abschnitt 7).
3. Die Blotwanne und die Streifen (R1) aus der Schutzpackung nehmen. Die erwünschte Anzahl an Antigen-beschichteten
Streifen in einen Mikrotiter-Rahmen stellen. 1 Vertiefung wird für den Reagenz-Leerwert, 2 Vertiefungen für den
Kalibrator, jeweils 1 Vertiefung für die negative Kontrolle, die positive Kontrolle I und die positive Kontrolle II benötigt.
A
B
C
D
E
F
G
H
1
B1
R3
R4a
R4b
R5
R5
R5
S1
2
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
3
4
5
6
4.
1.
7
8
9
10
11
12
Alle Proben und Kontrollen sowie der Kalibrator müssen vor der Verwendung auf dem Vortex gemischt werden.
Die Testproben, den Kalibrator sowie die negative und die positiven Kontrollen im Verhältnis 1:21 (z. B. 10 µl + 200 µl)
mit Verdünnungsmittel I (R7) in den Verdünnungsröhrchen oder der Verdünnungsplatte verdünnen.
5. 100 µl des verdünnten Kalibrators, der Kontrolle bzw. der Patientenprobe in eine Vertiefung geben. 100 µl
Probenverdünnungsmittel I (R7) in die erste Vertiefung für den Reagenzleerwert pipettieren.
6. Die Mikrotiterplatte 20 Minuten ± 2 Minuten bei Raumtemperatur (21-25°C) inkubieren.
7. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit Natriumhypochlorit) absaugen. Unverzüglich
mindestens 300 µl Waschlösung in jede Vertiefung geben. Anschließend Rückstände absaugen. Dieses Verfahren
mindestens viermal wiederholen (d. h. der Waschgang wird insgesamt mindestens fünfmal wiederholt). Falls
erforderlich, die Platte umdrehen und auf einem Papiertuch abtrocknen.
2. Wird eine automatische Waschvorrichtung benutzt, ist die Vorgehensweise die gleiche.
8. 100 µl des gebrauchsfertigen Konjugats (R6) in alle Vertiefungen geben.
9. 20 Minuten ± 2 Minuten bei Raumtemperatur (21-25°C) inkubieren.
10. Den Inhalt aller Vertiefungen absaugen und wie oben beschrieben fünfmal waschen.
11. 100 µl Chromogen/Substratlösung (R9) schnell in alle Vertiefungen pipettieren.
5
12. Für die Entwicklung der Reaktion die Platte lichtgeschützt bei Raumtemperatur (21-25°C) 10 ± 2 Minuten stehen lassen.
Während dieser Inkubation keine Klebefolie verwenden. Die Chromogen/Substratlösung wird sich in den Vertiefungen
mit nachweisbaren IgG-Antikörperkonzentrationen blau färben.
13. 100 µl Stopplösung in jede Vertiefung geben. Den Inhalt durch vorsichiges Klopfen auf die Platte mischen. Durch
Zugabe der Stopplösung kommt es zu einer Farbänderung von blau in gelb.
14. Mindestens 5 Minuten warten und anschließend die Ergebnisse ablesen. Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Bei
einer Wellenlänge von 450 nm den Leser über der Vertiefung für den Reagenzleerwert auf null stellen und die optische
Dichte jeder Vertiefung messen. Die Platte sollte innerhalb von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion abgelesen
werden (die Streifen müssen vor dem Ablesen stets lichtgeschützt aufbewahrt werden).
15. Alle Ergebnisse hinsichtlich der Übereinstimmung zwischen den Werten sowie gegen die Platten- und Probenverteilung
und den Identifikationsplan prüfen.
10 - BERECHNUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
1) Berechnung der mittleren Extinktion
1. Mittlere OD (optische Dichte) des Grenzwert-Kalibrators – Die mittlere OD des Grenzwert-Kalibrators aus den drei
Bestimmungen des Kalibrators R5 berechnen. Weicht einer der drei Kalibratorwerte mehr als 15% vom Mittelwert ab,
wird der Wert verworfen und der Mittelwert aus den übrigen beiden Werten berechnet.
2. Korrekturfaktor – Um Schwankungen der Assayaktivität zwischen den Tagen aufgrund der Raumtemperatur oder der
Testzeiten zu berücksichtigen, wird für jede Kitcharge ein Korrekturfaktor bestimmt. Der Korrekturfaktor ist auf dem
Fläschchenetikett aufgedruckt.
3. Wert des Grenzwert-Kalibrators – Der Wert des Grenzwert-Kalibrators für jeden Assay wird durch Multiplikation des
Korrekturfaktors mit der in Schritt 1 bestimmten mittleren OD des Grenzwert-Kalibrators bestimmt.
4. ISV-Wert – Ein Immunstatusverhältnis (ISV) für jede Probe wird durch Division der Proben-OD durch den in Schritt 3
bestimmten Wert des Grenzwert-Kalibrators berechnet.
Beispiel:
ODs der Kalibratoren
= 0,380, 0,400, 0,420
Mittlere OD der Kalibratoren
= 0,400
Korrekturfaktor
= 0,5
Wert des Grenzwert-Kalibrators
= 0,5 x 0,400 = 0,200
OD der Patientenseren
= 0,600
ISV-Wert
= 0,600/0,200 = 3,00
5.
Die maximale Linearität des Assays liegt bei einem ISV von 5,40, daher sollte ein ISV > 5,40 als größer 5,40 berichtet
werden.
2) Validierung des Assays
1. Reagenzleerwert (wenn gegen die Luft abgelesen) muss < 0,150 bei 450 nm sein: OD RB < 0,150
2. Negative Kontrolle R3 muss = 0,250 bei 450 nm sein (wenn gegen Reagenzleerwert abgelesen): OD R3 = 0,250
3. Jeder Kalibrator R5 muss =?
0,250 bei 450 nm sein (wenn gegen Reagenzleerwert abgelesen): OD R5 =?
0,250
4. Positive Kontrolle R4b muss =?
0,500 bei 450 nm sein (wenn gegen Reagenzleerwert abgelesen): OD R4b =?
0,500
5. Die ISV-Werte (Immunstatusverhältnis) für die negative Kontrolle, die positive Kontrolle I und die positive Kontrolle II
(R3, R4a, R4b) sollten innerhalb der auf den Fläschchen aufgedruckten Bereiche liegen.
Liegen diese Werte nicht innerhalb ihrer Bereiche, sollte der Test als ungültig betrachtet und wiederholt werden.
3) Interpretation der Ergebnisse
Die ISV-Werte der Patienten werden wie folgt interpretiert:
ISV-Wert
= 0,90
0,91-1,09
=?
1,10
1.
2.
3.
4.
5.
Ergebnisse
Negativ
Nicht eindeutig
Positiv
Interpretation
Keine signifikante Konzentration an nachweisbarem EB-NA-1 IgG-Antikörper
Die Proben sollten erneut getestet werden.
Signifikante Konzentration an nachweisbarem EB-NA-1 IgG-Antikörper
Folgende Methode wird zur Weiterleitung der Ergebnisse empfohlen: "Folgende Ergebnisse wurden mit Platelia® EBNA-1 IgG erzielt. Die mit unterschiedlichen Methoden erzielten Werte können nicht ausgetauscht werden. Die Höhe der
berichteten IgG-Konzentration kann nicht mit einem Endpunkttiter korreliert werden".
Vier verschiedene EBV-Antikörper werden für ein aussagekräftiges Bild der EBV-Infektion verwendet: EBV-VCA IgM,
EBV-VCA IgG, EBV-EA IgG und EB-NA IgG. Eine genaue Interpretation der EBV-Infektion basiert auf den Ergebnissen
all dieser Antikörper, und die Diagnose sollte in der Regel nicht auf einem einzigen Testergebnis basieren.
Wiederholt nicht eindeutige Proben sollten mit einer anderen Methode, z. B. Immunfluorezenz (IF) erneut getestet
werden. Sind die Ergebnisse nach weiterem Testen immer noch nicht eindeutig, sollte eine zusätzliche Probe
entnommen werden.
Die Leistungsmerkmale dieses Produktes wurden mit einem Kalibrator ermittelt. Ist eine lineare Reaktionskurve mit dem
Assay erwünscht, sollte der Kunde mindestens zwei weitere Kalibratoren mitführen.
Um gepaarte Seren für signifikante Änderungen der Antikörperkonzentration zu evaluieren, müssen beide Proben in der
gleichen Messreihe in Doppelbestimmung getestet werden. Das mittlere ISV beider Bestimmungen (akut und
6
konvaleszent) muss über 1,00 liegen, um
Antikörperkonzentration evaluieren zu können.
die
gepaarten
Seren
für
eine
signifikante
Erhöhung
der
4) Erwartete Werte
.Akute Phase
EBV-VCA IgG- und EBV-VCA IgM-Antikörper sind in der Regel vorhanden.
EB-NA-1 IgG-Antikörper sind in der Regel nicht oder nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden.
.Übergangsphase
EBV-VCA IgG-Antikörper persistieren und EBV-VCA IgM-Antikörper nehmen in der Regel ab. EB-NA-1 IgG-Antikörper
nehmen langsam zu.
.Konvaleszente Phase
EBV-VCA IgM-Antikörper gehen herunter auf negative oder sehr geringe Konzentrationen. EBV-VCA IgG- und EB-NA-1 IgGAntikörper persistieren in der Regel lebenslang. In den USA weisen ca. 50% der Bevölkerung bis zum 5. Lebensjahr eine
Serokonversion auf. Eine weitere Serokonversion findet in der Mitte des zweiten Lebensjahrzehnts statt. Im
Erwachsenenalter weisen 90-95% der meisten Populationen EB-NA-1-Antikörper auf.
5) Prävalenz
Eine Gruppe von 204 Seren einer gesunden Population aus dem Nordosten der USA wurde mit Platelia® EB-NA-1 IgG
getestet. Die Seren wurden nach dem Zufallsprinzip nach Geschlecht, Alter und Rasse ausgewählt. Die Verteilung der ISVWerte dieser Studie ist in folgender Tabelle dargestellt. In dieser Studie war 86,4% der Population mit diesem Assay positiv.
Verteilung der ISV-Werte in einer normalen Population (n = 204)
6) Grenzen des Verfahrens
1. Andere Verfahren oder Techniken als die in dieser Packungsbeilage beschriebenen können zu falschen Ergebnissen
führen.
•
Nicht wiederholbare Reaktionen haben häufig folgende Ursachen:
nicht korrekt durchgeführte Waschgänge der Mikrotiterplatten,
falsche Inkubationszeiten,
Kontamination negativer Proben durch Serum oder Plasma mit hoher Antikörperkonzentration,
Kontamination der Entwicklungslösung durch Oxidationsmittel (Bleiche, Metallionen...),
Kontamination der Stopplösung.
•
Kontaminierte, ikterische, lipämische, hämolytische oder hitzeinaktivierte Seren können zu falschen Ergebnissen führen
und sollten nicht verwendet werden.
•
Die Leistungsmerkmale wurden lediglich für Serum evaluiert.
2.
•
•
Der Arzt sollte die Testergebnisse im Zusammenhang mit klinischen Befunden und anderen Diagnostikverfahren
interpretieren.
Dieser Kit ist für die Messung der IgG-Antikörperkonzentration in Patientenproben vorgesehen.
Positive Ergebnisse bei Neugeborenen müssen unter Vorbehalt interpretiert werden, da vor der Geburt mütterliches IgG
passiv von der Mutter auf den Föten übertragen wird. IgM-Assays sind in der Regel bei Kindern unter 6 Monaten
nützlichere Indikatoren für eine Infektion. Alle mit diesem Assay gemessenen Werte dienen lediglich als Hilfsmittel für
die Diagnose. Der Arzt muss die Ergebnisse im Zusammenhang mit der Anamnese des Patienten, klinischen Befunden
und anderen Diagnistikverfahren interpretieren.
7
•
•
•
Die Leistungsmerkmale wurden nicht für Patienten mit Nasopharyngealkarzinom, Burkitt-Lymphom, anderen mit EBV
assoziierten Lymphadenopathien und weiteren, mit EBV assoziierten Erkrankungen sowie mit EBV assoziierter
Mononukleose bestimmt. Die Ergebnisse von mit Platelia® EB-NA-1 IgG getestetem Serum von immunsupprimierten
Patienten müssen unter Vorbehalt interpretiert werden. Die Leistungsmerkmale dieses Assays wurden nicht mit
pädiatrischen Proben bestimmt.
Patienten mit chronisch aktiver Epstein-Barr-Virus-Infektion können unter Umständen keine Antikörperantwort gegen
EB-NA-1 entwickeln.
Proben mit Anti-E. coli-Antikörper können zu Kreuzreaktionen mit dem Assay führen.
11 - LEISTUNGSMERKMALE
1 - Relative Sensitivität und Spezifität auf der Basis einer Serumcharakterisierung
357 Seren wurden getestet. Die Seren der Studie wurden zuvor mit im Handel erhältlichen ELISA-Assays charakterisiert. Die
Sensitivität, Spezifität und die Übereinstimmung des Assays wurden auf der Basis dieser Charakterisierung bestimmt. Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Anderer EIA-TEST
Ergebnis
Positiv
Nicht eindeutig
Negativ
Gesamt
Positiv
270
0
0
270
Nicht eindeutig
5
0
1
6
Negativ
6
1
74
81
Gesamt
281
1
75
357
Dies ermöglicht folgende Berechnungen (nicht eindeutige Proben ausgenommen)
Ergebnisse
Spezifität
Sensitivität
Gesamtübereinstimmung
74/74
270/276
344/350
100 %
97,8 %
98,3 %
2 - Präzision
Die Präzision von Platelia® EB-NA-1 IgG wurde durch die Analyse von drei Seren in Doppelbestimmung zwanzigfach in drei
unterschiedlichen Labors bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Serum
Negativ
Schwach positiv
Positiv
n
120
120
120
X
0,02
1,41
5,04
S.A.
0,02
0,16
0,37
VK%
138
11,5
7,3
X = Mittleres ISV
S.A. = Standardabweichung
VK = Variationskoeffizient
3 - Kreuzreaktivität
Die folgenden 5 Serumproben wurden analysiert und mit Platelia® EB-NA-1 IgG als negativ befunden.
1
2
3
4
5
HSV 1 IgG
HSV 2 IgG
CMV IgG
VZV IgG
2,43 +
0,32 3,67 +
0,3 6,18 +
0,6 0,08 0,86 0,39 5,98 +
1,69 +
0,18 1,11 +
0,18 0,18 -
2,28 +
3,17 +
2,45 +
3,21 +
2,14 +
8
Platelia®
EB-NA-1 IgG
0,67 0,36 0,73 0,29 0,34 -
12 - LITERATUR
1. Baltz, M. 1992. Identifying Stages of EBV Infection. American Clinical Lab. pp. 20-22.
2. Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong. 1965. Studies with Burkitt's Lymphoma. Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4:6982.
3. Schooley, R.T. and R. Dolin. 1988. Epstein-Barr Virus (Infectious Mononucleosis), 2nd edition. In: Principles and
Practices of Infectious Diseases. Mandell, G.L., R.G. Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley and Sons, New York.
pp.97-982.
4. Ambinder, R.F., Mullen, M., Chang, Yung-Nien, Hayward, G.S., and Hayward, S.D. 1991. Functional Domains of
Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-1. Journal of Virology, ASM. Vol. 65, No.3, pp. 1466-1478
5. Davidsohn, I. 1937. Serologic Testing of Infectious Mononucleosis. Journal of American Medical Association. 183: 289295.
6. Evans, A.S. 1974. History of Infectious Mononucleosis. American Journal of Medical Science. 267: 189-195.
7. Lennette, E.T. 1988. Herpesviridae: Epstein-Barr Virus. In: Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases, Principles and
Practice. Vol. II. Lennette, E.H., Halonen, P., Murphy, F.A., eds. Springer-Verlag, NY. pp. 230-246.
8. Lennette, E.T. and W. Henle. 1987. Epstein-Barr Virus Infections: Clinical and Serological Features. Laboratory
Management June: pp. 22-28.
9. Henle G., W. Henle, and C.A. Horwitz. 1974. Antibodies to Epstein-Barr Virus-Associated Nuclear Antigen in Infection
Mononucleosis. Journal of infectious Diseases. 130:231-239.
10. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of
Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8:871-874.
11. Engvall, E. and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. In: Proteins of the Biological Fluids, H.
Peeters, ed., Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge Oxford. Pergamon Press. p. 553-556.
12. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 1971. Enzyme- Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein
Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme-Labelled Antigen and Antibody-Coated Tubes. Biochem. Biophys.
Acta., 251:427-434.
13. Van Weeman, B. K. and A.H.W.M. Schuurs. 1971. Immunoassay Using Antigen-Enzyme Conjugates. FEBS Letter.
15:232-235.
16. Engvall, E. and P. Perlman. 1972. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of AntiImmunoglobulins in Antigen-Coated Tubes. J. Immunol. 109:129-135.
17. CDC-NIH Manual. 1993. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 3rd edition. U.S. Dept. of Health and
Human Services, Public Health Service. Pp. 18-24.
18. Sumaya, Ciro. 1992. Epstein-Barr Virus. Textbook of Pediatric Infectious Diseases, 3rd ed.. Feigin, R., and H Cherry
eds. WB Saunders Co., Philadelphia. P. 1549.
19. Miller C., E. Grogan, et al. 1097. Selective lack of antibody to a component of EB nuclear antigen in patients with chronic
active Epstein-Barr Virus Infection. J Inf Dis. 156:26-35.
9
72939
96 Test
Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgG
verso il virus di Epstein Barr (Epstein-Barr nuclear antigen-1) nel siero umano
SOMMARIO
1- SCOPO DEL TEST
2 - INTERESSE CLINICO
3 - PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
4 - COMPOSIZIONE DEL KIT
5 - PRECAUZIONI E AVVERTENZE
6- MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
7- PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI
8 - CAMPIONI
9 - PROCEDURA
10 - CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
11 - PRESTAZIONI
12 - BIBLIOGRAFIA
1- SCOPO DEL TEST
Il presente kit di dosaggio immunoenzimatico è inteso per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgG verso l’antigene
nucleare 1 del virus di Epstein Barr (EB-NA-1) nel siero umano. Il dosaggio Platelia® EB-NA-1 IgG può essere impiegato in
associazione con altri dosaggi sierologici di Epstein Barr (Platelia® EBV-VCA IgM, Platelia® EBV-VCA IgG e Platelia® EBVEA-D IgG) come supporto per la diagnosi della mononucleosi infettiva.
2 - INTERESSE CLINICO
La rivelazione del virus di Epstein Barr è stata descritta per la prima volta nel 1964 da Epstein, Achong e Barr mediante studi
al microscopio elettronico di colture di linfoblasti derivati da pazienti affetti da linfoma di Burkitt. In base alle sue
caratteristiche morfologiche, il virus EBV è classificato come appartenente alla famiglia degli herpes virus.
L’infezione può evidenziare un ampio spettro di sintomi clinici. La maggior parte delle infezioni primarie da EBV si
trasmettono attraverso al saliva, colpiscono soprattutto i bambini e hanno carattere subclinico. Negli Stati Uniti il 50% della
popolazione ha sviluppato anticorpi anti EBV prima dell’età di 5 anni e l’80% entro l’età adulta. Sono stati altresì riportati casi
di infezioni da EBV associati alle trasfusioni.
Nei giovani adulti le infezioni da EBV possono manifestarsi clinicamente come mononucleosi infettiva (IM) con sintomi
relativamente atipici come febbre, faringite, tonsillite, linfoadenopatia, malessere, cefalea, mialgia, spleno ed epatomegalia,
rash e leucocitosi. Gli studenti dei collegi e il personale militare sono spesso citati tra le popolazioni a maggiore incidenza di
morbilità per la mononucleosi infettiva.
Successivamente all’infezione primaria da EBV, si è ipotizzato che il linfocita B possa continuare a ospitare il genoma
dell’EBV e stabilire un'infezione latente che si può prolungare per tutta la vita. La riattivazione o un aumento dell’attivazione
dell’infezione da EBV è stata documentata in pazienti immunodeficienti o immunodepressi, vale a dire pazienti che hanno
subito trapianti di organi, individui affetti da tumori maligni, donne in gravidanza e persone in età avanzata. Sussistono
controversie riguardo alla definitiva implicazione dell’EBV quale agente eziologico nello stato clinico indicato come “infezione
cronica da EBV” o “mononucleosi cronica”.
Il virus Epstein Barr è stato altresì associato alla patogenesi di due carcinomi umani, il linfoma di Burkitt e il carcinoma
nasofaringeo.
La documentazione basata su studi di ibridazione del DNA dimostra la presenza del genoma del virus EBV nei campioni
bioptici prelevati da individui affetti da tali carcinomi.
Il linfoma di Burkitt è stato osservato per la prima volta nell’Africa Subsahariana, principalmente nei bambini, e in Nuova
Guinea. Solitamente nei pazienti affetti da linfoma di Burkitt vengono diagnosticate infezioni da malaria ritenute un cofattore.
Il carcinoma nasofaringeo è stato osservato in Asia, soprattutto nella Cina meridionale, e può subire influenze genetiche o
ambientali quali cofattori.
Casi di linfomi a cellule B simili al linfoma africano di Burkitt sono stati di recente riportati in pazienti con sindrome da
immunodeficienza acquisita (AIDS). Si ritiene che i pazienti affetti da AIDS possano essere predisposti all'infezione /
riattivazione del virus EBV a causa del loro generale stato di immunosoppressione.
Le infezioni da EBV causano la produzione di anticorpi diretti contro quattro distinti complessi antigenici. Questi
comprendono: Antigene nucleare del virus EBV (EBNA), Antigene precoce del virus EBV (EA), antigene del capside virale
(VCA) e antigene di membrana del virus EBV (MA). Il complesso EA è suddiviso in due componenti che comprendono EA-D
(componente diffuso) e EA-R (componente ristretto).
L’infezione delle cellule bersaglio comporta due forme di cicli virali: 1) infezioni latenti, non produttive e 2) infezioni produttive
e replicative. In entrambi i cicli, uno degli antigeni espressi per primi è l’antigene di membrana rivelato dai linfociti, un
antigene di superficie riconosciuto dalle cellule T. È stato stabilito che la maggior parte dei soggetti esposti al virus EBV
sviluppano una risposta anticorpale eterofila. L'antigene EB-NA-1 viene espresso successivamente o contemporaneamente
all'antigene di membrana a 12 - 24 ore dall'infezione. L’EB-NA-1 si riscontra in forma di antigene(i) non strutturale,
endonucleare, presente in tuttle le linee cellulari trasformate in EBV, come nei pazienti affetti da tumori di Burkitt e carcinomi
nasofaringei.
Durante il ciclo di replicazione e produzione completo, la sintesi dell’antigene segue l’EB-NA-1. Il complesso dell’antigene del
capside virale (VCA) si manifesta più avanti durante ciclo di replicazione.
Recentemente è stato messo in evidenza che l’EB-NA-1 probabilmente non costituisce una semplice frazione antigenica,
bensì un complesso antigenico comprendente molteplici componenti, in base alle reattività dei sieri di varie classi di pazienti.
Il componente principale dell’EBNA-1 è stato purificato e sequenziato nella sua interezza.
I livelli anticorpali di IgG EB-NA-1 hanno valore diagnostico in quanto determinano gli stadi acuti e convalescenti della
mononucleosi infettiva. Gli anticorpi IgG verso l’EB-NA-1 sono raramente presenti nella IM acuta e aumentano durante la
convalescenza; continueranno ad aumentare fino a un livello limite nel giro di tre mesi - un anno e normalmente
persisteranno per tutta la vita.
3 - PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Il dosaggio immunoenzimatico in fase solida (ELISA) di Bio-Rad si fonda sulla capacità dei materiali biologici (come gli
antigeni) di adsorbire a superfici di plastica come il polistirene (fase solida). Il kit Platelia® EB-NA-1 IgG utilizza la tecnologia
ELISA in cui un antigene purificato ricombinante EB-NA-1 si lega ai pozzetti di una micropiastra. Quando gli antigeni legati
alla fase solida vengono messi a contatto con il siero di un paziente, l’anticorpo specifico per l’antigene, se presente, si
legherà all’antigene sulla fase solida a formare complessi antigene-anticorpo. L’anticorpo in eccesso viene eliminato
mediante lavaggio.
2
Tale operazione è seguita dall’aggiunta di globulina di capra anti IgG umana coniugata con perossidasi di rafano che quindi
si lega al complesso anticorpo-antigene. Il coniugato in eccesso viene eliminato mediante lavaggio, seguito dall’aggiunta di
Substrato, tetrametilbenzidina (TMB). Se nel siero del paziente è presente l’anticorpo specifico per l'antigene apparirà una
colorazione blu. Una volta bloccata la reazione enzimatica con 1N H2SO4, il contenuto dei pozzetti diventerà giallo.
L’intensità di colorazione, che è proporzionale alla concentrazione di anticorpo nel siero, può essere letta mediante un
adeguato apparecchio spettrofotometrico o un lettore di micropiastre per tecnica ELISA.
La sensibilità, specificità e riproducibilità dei dosaggi immunoenzimatici in fase solida possono essere paragonabili ad altri
test sierologici per la rivelazione di anticorpi, come il test di immunofluorescenza, della fissazione del complemento, di
emoagglutinazione e dosaggio immunoradiologico.
4 - COMPOSIZIONE DEL KIT
Tutti i reagenti sono intesi esclusivamente per uso diagnostico in vitro
Etichetta Natura dei reagenti
Presentazione
R1
12 Strip (da 8 pozzetti ciascuna) sensibilizzate con antigene nucleare ricombinante 1 del
virus di Epstein Barr (EB-NA-1) confezionato in un involucro di alluminio con essiccante /
indicatore di umidità
R2
Soluzione di lavaggio concentrata (20 x)
Tampone Tris (pH 7,2 ± 0,2) con l’1% di Tween® 20.
Conservanti: Proclin® 300 (0.1%).
1 x 60 ml
R3
Controllo non reattivo (umano) per gli anticorpi IgG anti EB-NA-1
Negativo per gli anticorpi Ag HBs e HIV-1, HIV-2 e HCV
Conservanti: sodio azide (< 0,1 %) e penicillina /streptomicina (0,01%)
1 x 0,4 ml
R4a
Controllo positivo I (umano) per gli anticorpi IgG anti EB-NA-1
Controllo positivo II (umano) per gli anticorpi IgG anti EB-NA-1
1 x 0,4 ml
R4b
1
1 x 0,4 ml
R5
Calibratore (umano) per gli anticorpi IgG anti EB-NA-1, con il fattore specifico del kit
stampato sull'etichetta esterna della confezione.
1 x 0,4 ml
R6
Coniugato: Anticorpi caprini anti IgG umane legati con perossidasi di rafano; conservanti:
Proclin® 300 (0,1%) and gentamicina
1 x 16 ml
R7
Diluente I: tampone pronto per l’uso (pH 7,5 ± 0,2)
Conservanti: Proclin® 300 (0,1%)
1 x 30 ml
R9
Soluzione cromogeno/ substrato (pronta per l’uso): Tetrametilbenzidina (TMB).
Quando non viene usato, il reagente va conservato ben chiuso, altrimenti nei pozzetti di
reazione si potrebbe formare un precipitato.
1 x 15 ml
R10
Soluzione bloccante (pronta per l'uso): 1N acido solforico
1 x 15 ml
Foglio dati per dosaggi
1
5 - PRECAUZIONI E AVVERTENZE
Precauzioni
L'affidabilità dei risultati dipende dal rispetto delle seguenti buone pratiche di laboratorio:
•
Non utilizzare reagenti scaduti.
•
Non mescolare i reagenti prelevati da lotti diversi per uno stesso ciclo di test.
NOTA: È possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, purché durante un ciclo di test sia utilizzato sempre lo
stesso lotto. soluzione di lavaggio (R"), soluzione cromogeno/substrato (R9) e soluzione bloccante (R10).
Tali reagenti possono essere utilizzati con with Platelia® EBV-VCA IgG, Platelia® EBV-EA-D IgG e Platelia® EBV-VCA IgM
del nostro catalogo. Il diluente I (R7) può essere utilizzato con Platelia® EBV-EA-D IgG e Platelia® EB-VCA IgG. Contattare
il nostro servizio di assistenza tecnica per informazioni più dettagliate.
•
Prima dell’utilizzo è necessario attendere 30 minuti affinché i reagenti si stabilizzino a temperatura ambiente.
•
Ricostituire i reagenti usando cautela per evitare qualunque contaminazione.
•
Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (acidi alcalini, vapori aldeidi) o di polveri che potrebbero alterare l'attività
enzimatica del coniugato.
•
Utilizzare recipienti di vetro perfettamente lavati e risciacquati con acqua deionizzata o preferire materiale mono-uso.
•
Evitare di lasciar asciugare la micropiastra tra la fine delle operazioni di lavaggio e la distribuzione dei reagenti.
3
•
La reazione enzimatica è molto sensibile agli ioni metallici. Pertanto, evitare qualunque contatto delle diverse soluzioni di
substrato o coniugato con elementi metallici.
•
La soluzione di cromogeno/substrato deve essere incolore. La presenza di colore indica che il reagente non può esser
usato e deve essere sostituito. Utilizzare un puntale nuovo per ciascun campione.
•
Il lavaggio della micropiastra costituisce una fase essenziale nella procedura: attenersi al numero di cicli di lavaggio
prescritti e assicurarsi che tutti i pozzetti siano riempiti completamente e successivamente svuotati. Lavaggi non
appropriati possono comportare risultati inesatti.
•
Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di rivelazione.
•
Controllare le pipette e gli altri strumenti per garantire che le operazioni siano precise e corrette.
•
Non modificare il modo operativo.
Indicazioni par la salute e la sicurezza
Tutti i reagenti forniti sono destinati all'uso esclusivo per la diagnosi in vitro.
•
Durante la manipolazione dei reagenti indossare guanti monouso.
•
Non pipettare con la bocca.
•
I materiali di origine umana utilizzati per la preparazione dei reagenti sono stati sottoposti a test che hanno rivelato la
non reattività per l'antigene di superficie dell'epatite B (Ag HBs), per gli anticorpi del virus dell'epatite C (HCV) e per il
virus di immunodeficienza umana (anti-HIV1 e anti-HIV2). Poiché nessun metodo può garantire con certezza assoluta
l'assenza di agenti infettivi, maneggiare i reagenti di origine umana e i campioni dei pazienti come potenzialmente
infettivi.
•
Qualunque materiale che venga in diretto contatto con i campioni e i reagenti di origine umana, come pure la soluzione
di lavaggio, dovrebbero essere considerati come prodotti infettivi.
•
Evitare schizzi di campioni o di soluzioni che li contengono.
•
Eventuali schizzi devono essere lavati con candeggina diluita al 10%. Se il liquido contaminante è un acido, le superfici
sporche devono essere neutralizzate inizialmente con bicarbonato di sodio, poi lavate con candeggina e asciugate con
carta assorbente. Il materiale usato per ripulire deve essere eliminato in un contenitore per residui contaminati.
•
I campioni, i reagenti di origine umana, come pure i materiali ed i prodotti contaminati devono essere eliminati solo dopo
decontaminazione.
o mediante immersione in candeggina a concentrazione finale del 5% di ipoclorito di sodio per 30 minuti,
oppure mediante autoclavaggio a 121°C per almeno 2 ore.
L’autoclavaggio per almeno un’ora a 121 °C è il metodo migliore per inattivare i virus HIV e HBV.
ATTENZIONE : NON INTRODURRE SOLUZIONI CONTENENTI IPOCLORITO DI SODIO NELL’AUTOCLAVE.
•
•
•
La manipolazione e l’eliminazione dei prodotti chimici devono essere effettuate attenendosi alle buone pratiche di
laboratorio.
Evitare qualunque contatto del tampone substrato, del cromogeno e della soluzione bloccante con la pelle o le mucose
(rischio di tossicità, irritazioni o bruciature).
Certi reagenti contengono sodio azide come conservante. La sodio azide può reagire con le tubature del laboratorio e
formare azoturi di piombo o rame. Detti azoturi sono esplosivi. Per evitare accumuli di azidi, risciacquare con
abbondante acqua le tubature qualora le soluzioni contenenti azidi vengano eliminate nel lavello una volta inattivate.
La scheda relativa ai dati sulla sicurezza dei materiali è disponibile su richiesta.
6- MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
•
Miscelatore tipo Vortex.
•
Lettore per micropiastre dotato di filtri da 450 nm (*).
•
Contenitore per rifiuti a rischio biologico.
•
Ipoclorito di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.
•
Acqua distillata o deionizzata.
•
Cilindri graduati.
•
Guanti in lattice monouso.
•
Occhiali di protezione.
•
Carta assorbente.
•
Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o fisse impostate per dispensare da 10, 100 e 1000 µl.
•
Dispositivo di lavaggio per micropiastre manuale, semi-automatico o automatico (*).
•
Provette monouso.
(*) Rivolgersi al nostro reparto tecnico per informazioni dettagliate riguardo la strumentazione consigliata.
4
7 – RICOSTITUZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI
Il kit deve essere conservato a 2-8°C fino alla data di scadenza indicata sulla confezione (salvo diversa indicazione
specifica). Prima dell'uso, lasciare che i reagenti raggiungano la temperatura ambiente (+18-30 °C) Subito dopo l’uso riporre i
reagenti in frigorifero.
1) Reagenti pronti per l'uso:
• Reagente 1 (R1): micropiastra
Ciascun vassoio contenente 12 strip è avvolto in una bustina rivestita di alluminio. Tagliare la bustina con un paio di forbici o
un taglierino a 0,5 - 1 cm sopra la linea. Riporre immediatamente le strisce inutilizzate nel sacchetto. Risigillare il sacchetto
con cautela e conservarlo a +2-8°C. A questo punto le strip rimangono stabili per 1 mese.
•
Reagente 3 (R3): controllo non reattivo
•
Reagente 4a (R4a): controllo positivo I
•
Reagente 4b (R4b): controllo positivo II
•
Reagente 5 (R5): calibratore
•
Reagente 6 (R6): Coniugato
•
Reagente 7 (R7): Diluente I
•
Reagente R9: Soluzione cromogeno/ substrato
•
Reagente 10 (R10): soluzione bloccante
2) Reagenti da ricostituire
• Reagente 2 (R2): soluzione di lavaggio concentrata (20x):
Diluire 60 ml di soluzione di lavaggio 20X a 1,2 l con acqua distillata e/o deionizzata in modo da ottenere la soluzione pronta
per l’uso. Mescolare a fondo. Dopo la diluizione, conservare a 2-8 °C per 5 giorni
8 - CAMPIONI
Prelevare un campione di sangue secondo le pratiche d'uso. Il test sarà eseguito con campioni non diluiti. Estrarre il siero dal
coagulo o dai globuli rossi non appena possibile per evitare emolisi. Un’emolisi molto accentuata può avere ripercussioni
sulle prestazioni del test. I campioni che presentano grumi devono essere chiarificati prima del test mediante
centrifugazione. Le particelle o aggregati di fibrina in sospensione possono produrre risultati falsi positivi.
Se il test è eseguito entro 5 giorni i campioni vanno conservati a + 2-8 °C oppure possono essere congelati a – 20°C per
parecchi mesi. Evitare cicli ripetuti di congelamento / scongelamento. Se i campioni devono essere spediti, imballarli
secondo le normative vigenti in materia di trasporto di agenti eziologici.
NON USARE SIERI CONTAMINATI, IPERLIPEMICI, ITTERICI, IPERLEMOLIZZATI O INATTIVATI MEDIANTE CALORE
9 - PROCEDURA
Attenersi strettamente alla procedura proposta.
Usare il calibratore e i controlli per validare i risultati del test a ogni serie di determinazioni.
Attenersi alle seguenti buone pratiche di laboratorio:
1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione dei campioni.
2. Preparare la soluzione di lavaggio diluita (R2) (fare riferimento al capitolo 7).
3. Estrarre il vassoio di supporto e le strisce (R1) dall'involucro protettivo. Posizionare il numero desiderato di strip
sensibilizzate con antigene in un supporto con micropozzetti. Destinare un pozzetto per il bianco reagente, due
pozzetti per il calibratore, un pozzetto rispettivamente per il controllo negativo, positivo I e positivo II.
A
B
C
D
E
F
G
H
4.
5.
6.
7.
1
B1
R3
R4a
R4b
R5
R5
R5
S1
2
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Tutti i campioni, i controlli e il calibratore devono essere miscelati prima dell'uso. Diluire i campioni da testare, il
calibratore e i controlli negativo e positivo a 1:21 (per esempio: 10 µl + 200 µl) con il diluente I per campioni (R7) in
provette o piastre per diluizione.
Pipettare 100 µl di ciascun calibratore, controllo o campione paziente diluito dentro ciascun pozzetto. Pipettare
100 µl di diluente I per campioni (R7) dentro il primo pozzetto per il bianco reagente.
Incubare la micropiastra per 20 minuti ± 2 minuti a temperatura ambiente (21-25 °C).
Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipoclorito di sodio).
Aggiungere immediatamente in ciascun pozzetto almeno 300 µl di soluzione di lavaggio. Aspirare di nuovo.
5
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Ripetere la procedura almeno 4 volte (per un totale di almeno 5 lavaggi). Se necessario, asciugare la piastra
rivoltandola su un foglio di carta assorbente. Se si utilizza un lavatore automatico, seguire la stessa procedura.
Dispensare 100 µl di coniugato (R6) pronto per l’uso in tutti i pozzetti.
Incubare per 20 minuti ± 2 minuti a temperatura ambiente (21-25°C).
Svuotare tutti i pozzetti mediante aspirazione e lavare 5 volte come descritto sopra.
Dispensare rapidamente 100 µl di soluzione cromogeno/substrato (R9) in ciascun pozzetto.
Lasciar sviluppare la reazione al riparo dalla luce per 10 minuti ± 2 minuti a temperatura ambiente (21-25 °C). Non
utilizzare pellicole adesive durante questa incubazione. La soluzione cromogeno/substrato diventerà blu nei pozzetti
contenenti livelli rivelabili di anticorpi IgG.
Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto. Mescolare tamponando delicatamente la piastra.
L’aggiunta della soluzione bloccante provocherà un cambiamento di colore dal blu al giallo.
Attendere almeno 5 minuti prima di cominciare la lettura. Asciugare con cautela il fondo della piastra. Mediante una
lunghezza d’onda di 450 nm, tarare il lettore sul pozzetto del bianco reagente e misurare la densità ottica di ciascun
pozzetto. Leggere la piastra entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione bloccante (prima della lettura le strip
devono sempre essere tenute lontane da fonti luminose.)
Accertarsi della concordanza tra la lettura e il piano di distribuzione e di identificazione dei campioni e della piastra.
10 - CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
1) Calcolare l’assorbanza media
1. D.O. media del calibratore del valore soglia (Densità ottica): Calcolare il valore medio della D.O. per il calibratore
valore soglia a partire da tre determinazioni di calibratore R5. Se uno qualunque dei valori dei tre calibratori
differisce di oltre il 15% dalla media, eliminare tale valore e ricalcolare la media.
1. dei due valori rimanenti.
2. Fattore di correzione: Al fine di tenere conto delle fluttuazioni giornaliere delle attività del dosaggio a causa della
temperatura ambiente e della tempistica, per ciascun kit è stato determinato un fattore di correzione. Il fattore di
correzione è stampato sulla fiala del calibratore.
3. Misura del calibratore valore soglia: La misura del calibratore valore soglia di ciascun dosaggio viene calcolata
moltiplicando il fattore di correzione per la D.O. media del calibratore valore soglia determinata al punto 1.
4. Valore ISR: Calcolare un Rapporto dello stato immunitario (ISR) per ciascun campione dividendo il valore di D.O.
del campione per la misura del calibratore valore soglia determinato al punto 3.
Esempio:
D.O. ottenute per il calibratore
= 0,380 - 0,400 - 0,420
D.O. media per il calibratore
= 0,400
Fattore di correzione
= 0,5
Misura del calibratore valore soglia
= 0,5 x 0,400 = 0,200
D.O. ottenuta per il siero del paziente
= 0,600
Valore ISR
= 0,600/0,200 = 3,00
5. La linearità massima del dosaggio è pari a un rapporto ISR di 5,40, pertanto il valore ISR > 5,40 dovrebbe essere
riportato come maggiore di 5,40.
2) Validazione de dosaggio
1. Bianco reagente (se letto rispetto all’aria) deve essere < 0,150 a 450 nm: DO BR < 0,150
2. Il controllo negativo R3 deve essere ≤ 0,250 a 450 nm (se letto rispetto al bianco reagente): DO R3 ≤ 0,250
3. Ciascun calibratore R5 deve essere ≥ 0,250 a 450 nm (se letto rispetto al bianco reagente): DO R5 ≥ 0,250
4. Il controllo positivo R4b deve essere ≥ 0,500 a 450 nm (se letto rispetto al bianco reagente): DO R4b ≥ 0,500
5. La gamma di valori ISR (rapporto dello stato immunitario) per i controlli negativo, positivo I e positivo II (R3, R4a e
R4b) dovrebbe essere stampata sulle rispettive fiale.
Se tali criteri non rientrano nei rispettivi range, il test deve essere considerato non valido e deve essere ripetuto.
3) Interpretazione dei risultati
I valori ISR (Rapporto dello stato immunologico) dei pazienti sono interpretati nel modo seguente:
Valore ISR
≥ 0.90
0.91-1.09
≤ 1.10
1.
2.
Risultati
Negativo
Equivoco
Positivo
Interpretazione
Livelli non significativi di anticorpi IgG EB-NA-1 rivelabili
I campioni devono essere ritestati
Livelli significativi di anticorpo IgG EB-NA-1 rivelabile
Di seguito è indicato un metodo consigliato per riportare i risultati ottenuti: “I seguenti risultati sono stati ottenuti con
®
il test Platelia EB-NA-1 IgG. Valori ottenuti con metodi diversi non possono essere utilizzati in modo
intercambiabile. L'entità del livello di IgG indicato non può essere correlato a un titolo endpoint”.
Per ottenere un quadro completo dell'infezione da EBV sono stati considerati quattro diversi anticorpi EBV: vale a
dire IgM EBV-VCA, IgG EBV-VCA, IgG EBV-EA e IgG EB-NA. Un’interpretazione accurata dell’infezione da EBV si
basa sui risultati ottenuti da tutti questi anticorpi e solitamente la diagnosi non dovrebbe limitarsi al risultato di un
singolo test.
6
3.
I campioni i cui risultati restano equivoci dopo aver ripetuto il test devono essere ritestati con un altro metodo, per
esempio il test di immunofluorescenza (IFA). Qualora i risultati fossero ancora equivoci dopo ulteriori test, si dovrà
ricorrere a un nuovo prelievo di campione.
4.
Sono state stabilite le caratteristiche delle prestazioni di questo prodotto utilizzando un calibratore. Qualora si
desideri ottenere una curva lineare della risposta alla dose per questo test, il cliente dovrebbe stabilire almeno due
calibratori aggiuntivi.
5.
Per valutare il sieri di campioni appaiati al fine di rilevare cambiamenti significativi nel livello anticorpale, entrambi i
campioni devono essere testati in duplicato durante lo stesso dosaggio. La ISR media di entrambi (in fase acuta e
convalescente) deve essere superiore a 1,00 per poter individuare un aumento significativo di titolo anticorpale nei
sieri di campioni appaiati.
4) Valori attesi

Fase acuta
Gli anticorpi IgG EBV-VCA e IgM EBV-VCA sono normalmente presenti.
Gli anticorpi IgG EB-NA-1 sono normalmente assenti o a livelli molto bassi.

Fase di transizione
Gli anticorpi IgG EBV-VCA persistono mentre gli anticorpi IgM EBV-VCA solitamente diminuiscono. Gli anticorpi IgG EB-NA1 cominciano ad aumentare.

Fase convalescente
Gli anticorpi IgM EBV-VCA si riducono a negativi o molto bassi. Gli anticorpi IgG EBV-VCA e IgG EB-NA-1 solitamente
persistono per tutta la vita. Negli Usa il 50 % circa della popolazione evidenzia una sieroconversione prima dei 5 anni di età.
Un’altra fase di sieroconversione si verifica verso la metà del secondo decennio di vita. Verso l’età adulta il 90-95 % della
gran parte della popolazione avrà sviluppato anticorpi anti-EB-NA-1.
5) Prevalenza
Un gruppo di 204 campioni di siero prelevati da una popolazione sana nelle regioni del nord-est degli USA sono stati testati
con il dosaggio Platelia® EB-NA-1 IgG. I sieri sono stati randomizzati in base a sesso, età e razza. La distribuzione dei valori
ISR di questo studio è riportata nella Tabella seguente. In questo studio l'86,4 % della popolazione è risultata positiva nel
dosaggio.
Distribuzione dei Valori ISR in una popolazione normale (N = 204)
6)
1.
z
Limiti d’uso
Procedure o usi del kit diversi da quelli indicati nel foglio illustrativo della confezione possono produrre risultati
controversi.
Reazioni non ripetibili sono spesso causate da:
•
Lavaggio inadeguato della micropiastra,
•
Tempistica inadeguata delle fasi di incubazione,
•
Contaminazione di campioni negativi da parte di siero o plasma con alto titolo di anticorpi,
7
z
z
2.
z
•
Contaminazione della soluzione di rivelazione da parte di agenti ossidanti (candeggina, ioni di metallo, ecc.)
•
Contaminazione della soluzione bloccante.
Sieri contaminate, itterici, lipemici, emolizzati o inattivati mediante calore possono causare risultati errati e devono
essere evitati.
Le caratteristiche delle prestazioni non sono state stabilite per matrici diverse dal siero.
Il medico deve interpretare i risultati del test alla luce di altri risultati clinici e procedure diagnostiche.
Il presente kit è indicato per la misurazione degli anticorpi IgG nei campioni prelevati da pazienti.
Risultati positivi nei neonati vanno interpretati con cautela, in quanto le IgG materne sono trasferite passivamente dalla
madre al feto prima della nascita. I dosaggi di IgM sono generalmente indicatori di infezione più adeguati in bambini di
età inferiore a 6 mesi. I valori ottenuti dal presente dosaggio sono intesi unicamente come supporto diagnostico.
Ciascun medico dovrà interpretare i risultati alla luce dell’anamnesi del paziente, dei risultati dell’esame fisico e di altre
procedure diagnostiche.
Le caratteristiche delle prestazioni non sono state stabilite per pazienti affetti da carcinoma nasofaringeo, linfoma di
Burkitt, altre linfoadenopatie associate al virus EBV e altre patologie associate al virus EBV diverse dalla mononucleosi
da EBV. I risultati del test Platelia® EB-NA-1 IgG eseguito su siero prelevato da pazienti immunosoppressi devono
essere interpretati con cautela. Non sono state stabilite le caratteristiche delle prestazioni di questo dosaggio per
campioni pediatrici.
z
Soggetti con infezioni croniche attive da virus di Epstein Barr possono non evidenziare una risposta anticorpale all’EBNA-1.
z
Vi è un possibilità di reazione crociata con campioni contenenti anticorpi anti E. coli.
11 - PRESTAZIONI
1 - Sensibilità relativa e specificità basata sulla caratterizzazione del siero
Sono stati testati 357 campioni di siero. I sieri dello studio sono stati precedentemente caratterizzati mediante dosaggi ELISA
disponibili in commercio. La sensibilità, specificità e concordanza del dosaggio sono stati determinati in base a tale
caratterizzazione. I risultati sono riassunti nella tabella seguente:
Altro EIA
TEST
Risultato
Positivo
Dubbio
Negativo
Totale
Positivo
270
0
0
270
Dubbio
5
0
1
6
Negativo
6
1
74
81
Tali risultati consentono di effettuare i seguenti calcoli (gli esempi dubbi sono stati esclusi)
Risultati
Specificità
74 / 74
Sensibilità
270 / 276
Concordanza complessiva
344 / 350
Totale
281
1
75
357
100 %
97,8 %
98,3 %
2 - Precisione
La precisione del test Platelia® EB-NA-1 IgG è stata valutata testando tre sieri in duplicato per venti volte ciascuno in tre
diversi laboratori. I risultati sono riassunti nella tabella seguente:
Siero
Negativo
Positivo basso
Positivo
n
X
D.S.
CV %
120
120
120
0,02
1,41
5,04
0,02
0,16
0,37
138
11,5
7,3
X
= Valore ISR medio
D.S. = Deviazione standard
C.V. = Coefficiente di Variazione
3 - Reattività crociata
8
I seguenti 5 campioni di siero sono stati dosati e sono risultati negativi con il test Platelia® EB-NA-1 IgG.
IgG HSV 1
IgG HSV 2
IgG CVM
IgG VZV
Platelia
EB-NA-1 IgG
1
2,43 +
0,6 -
1,69 +
2,28 +
0,67 -
2
0,32 -
0,08 -
0,18 -
3,17 +
0,36 -
3
3,67 +
0,86 -
1,11 +
2,45 +
0,73 -
4
0,3 -
0,39 -
0,18 -
3,21 +
0,29 -
5
6,18 +
5,98 +
0,18 -
2,14 +
0,34 -
12 – BIBLIOGRAFIA
Vedere la verzione francese.
9
72939
96 Testes
TESTE IMUNOENZIMÁTICO PARA A DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DOS ANTICORPOS IgG
CONTRA O VÍRUS DE EPSTEIN-BARR (EPSTEIN-BARR NUCLEAR ANTIGEN-1) NO SORO HUMANO
ÍNDICE
1.
CAMPO DE APLICAÇÃO
2.
SIGNIFICADO CLÍNICO
3.
PRINCÍPIO DO MÉTODO
4.
COMPONENTES DO DISPOSITIVO
5.
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
6.
MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
7.
PREPARAÇÃO E CONDIÇÕES DE CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES
8.
COLHEITA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
9.
MÉTODO
10.
CÁLCULOS E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
11.
COMPORTAMENTO FUNCIONAL
12.
BIBLIOGRAFIA
1
1 – CAMPO DE APLICAÇÃO
Este dispositivo de doseamento imunológico destina-se à determinação qualitativa dos anticorpos IgG contra o
Antigénio-1 Nuclear do Vírus de Epstein-Barr (EB-NA-1) no soro humano. O teste Platelia EB-NA-1 IgG pode
ser usado em conjunto com outros testes serológicos para o vírus de Epstein-Barr (Platelia EBV-VCA IgM,
Platelia EBV-VCA-IgG e Platelia EBV-EA-D IgG), como auxiliares no diagnóstico da mononucleose infecciosa.
2 – SIGNIFICADO CLÍNICO
A detecção do vírus de Epstein-Barr foi inicialmente descrita em 1964 por Epstein, Achong e Barr usando estudos
de microscopia electrónica de linfoblastos de cultura obtidos em doentes com linfoma de Burkitt. Com base na
sua morfologia característica, o EBV é classificado como um membro da família dos herpesvírus.
A infecção por EBV pode apresentar uma vasta gama de sintomas clínicos. Na sua maioria, as infecções
primárias por EBV são transmitidas através da saliva, ocorrem durante a infância, e são sub-clínicas. Nos
Estados Unidos, 50% da população possui anticorpos contra o EBV antes de atingir os 5 anos de idade; 80% na
idade adulta. Também são conhecidas infecções por EBV associadas a transfusões.
Em jovens adultos, a infecção por EBV pode manifestar-se clinicamente como Mononucleose Infecciosa (MI),
com sintomas relativamente atípicos de faringite febril, amigdalite, linfadenopatia, mal-estar, cefaleias, mialgias,
hepatomegália e esplenomegália, erupções cutâneas e leucocitose. Os estudantes de colégios e os militares são
frequentemente referidos como uma população com elevada incidência de morbilidade devido a MI.
Após a infecção primária por EBV, está postulado que o linfócito B pode continuar a albergar o genoma do EBV e
estabelecer uma infecção latente que pode prolongar-se por toda a vida. Foi documentada a reactivação da
infecção por EBV ou a potenciação da activação do EBV em doentes com imunodeficiência ou imunodeprimidos,
por ex. doentes submetidos ao transplante de um órgão, indivíduos com doenças malignas, mulheres grávidas e
pessoas de idade avançada. A controvérsia persiste no que se refere à implicação definitiva do EBV como agente
etiológico num quadro clínico denominado “infecção crónica por EBV” ou “ mononucleose crónica”.
O vírus de Epstein-Barr encontra-se também associado à patogénese de dois carcinomas humanos, o linfoma de
Burkitt e o carcinoma nasofaríngeo. A documentação referente a estudos de hibridização do DNA, confirma a
presença do genoma do EBV nas biópsias recolhidas de indivíduos com estes carcinomas.
O linfoma de Burkitt é sobretudo observado na África Sub-Sariana, especialmente em crianças Africanas e da
Nova Guiné. São frequentemente diagnosticadas infecções por malária em doentes com linfoma de Burkitt,
sugerindo que esta possa ser um co-factor. O carcinoma nasofaríngeo é observado na Ásia, mais
frequentemente no Sul da China e pode ter influências genéticas ou ambientais como co-factores.
Linfomas das células B similares ao linfoma Africano de Burkitt foram recentemente referidos em doentes com a
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA). É sugerido que os doentes com SIDA podem apresentar uma
predisposição para infecções/reactivações do EBV devido ao seu estado de imunosupressão.
A infecção pelo EBV resulta na produção de anticorpos contra quatro complexos antigénicos distintos. Estes
incluem: Antigénio Nuclear induzido pelo EBV (EBNA), Antigénio Precoce induzido pelo EBV (EA), Antigénio da
Cápside do Vírus (VCA) e Antigénio de Membrana induzido pelo EBV (MA). O complexo EA encontra-se dividido
em dois componentes, os quais incluem o EA-D (componente difundido) e o EA-R (componente restrito).
A infecção das células alvo dá origem a duas formas de ciclos virais: 1) infecções latentes, não produtivas e 2)
infecções produtivas, replicativas. Em ambos os ciclos, um dos primeiros antigénios a ser expresso é o antigénio
de membrana detectado pelos linfócitos, um antigénio de superfície das células reconhecido pelas células T.
Encontra-se bem estabelecido que, na sua maioria, os indivíduos expostos ao EBV desenvolvem uma resposta
que envolve a produção de anticorpos heterófilos. Ao fim de 12 a 24 horas após a infecção, a expressão do
EBNA-1 segue ou mantém-se em paralelo com o antigénio de membrana. O EB-NA-1 encontra-se sob a forma
de um antigénio intranuclear não estrutural, presente em todas as linhas de células EBV-transformadas, como é o
caso dos doentes com tumores de Burkitt e carcinomas nasofaríngeos.
No ciclo replicativo totalmente produtivo, a síntese do antigénio segue o EB-NA-1. O complexo do antigénio da
cápside do vírus (VCA) surge mais tarde no ciclo replicativo.
Com base nas reactividades do soro de diferentes classes de doentes, tornou-se recentemente aparente que o
EB-NA-1 não é provavelmente uma metade antigénica única, mas um complexo antigénico com múltiplos
componentes. O principal componente do EBNA-1 foi purificado e totalmente sequenciado.
Os níveis dos anticorpos IgG EB-NA-1 são diagnósticos na determinação das fases aguda e de convalescença
na MI. Os anticorpos IgG contra o EB-NA-1 raramente estão presentes na MI aguda e aumentam durante a
convalescença. No espaço de três meses a um ano, aumentam até atingirem um valor constante e normalmente
mantêm-se ao longo de toda a vida.
3 - PRINCÍPIO DO MÉTODO
Os testes imunoenzimáticos (ELISA) Bio-Rad baseiam-se na capacidade que os materiais biológicos (i.e., os
antigénios) apresentam para serem adsorvidos pelas superfícies plásticas, como é o caso do poliestireno (fase
sólida). O dispositivo Platelia EB-NA-1 IgG utiliza a tecnologia ELISA, na qual o antigénio EB-NA-1
recombinante purificado se encontra ligado às microcúpulas da microplaca. Quando os antigénios ligados à fase
sólida são colocados em contacto com o soro do doente, o anticorpo específico do antigénio, se presente, irá
ligar-se ao antigénio da fase sólida formando complexos antigénio-anticorpo. O excesso de anticorpos é
removido por lavagem. Segue-se a adição de IgG de cabra anti-humana conjugada com peroxidase de rábano, a
qual se liga aos complexos antigénio-anticorpo. O excesso de conjugado é removido por lavagem, seguindo-se a
adição do Substrato, tetrametilbenzidina (TMB). Se o soro do doente contiver anticorpos específicos contra o
antigénio, desenvolve-se uma cor azul. Quando se interrompe a reacção enzimática com H2SO4 1N, o conteúdo
2
das microcúpulas torna-se amarelo. A cor, a qual é proporcional à concentração dos anticorpos no soro, pode ser
lida num espectrofotómetro adequado ou no leitor de placas de microcúpulas ELISA.
A sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade do método ELISA são comparáveis às de outros testes
serológicos para anticorpos, tais como imunofluorescência, fixação do complemento, hemaglutinação e
radioimunoensaios.
4 - COMPONENTES DO DISPOSITIVO
Todos os reagentes são exclusivamente para uso diagnóstico in vitro
Rótulo
Natureza dos reagentes
R1
12 tiras (8 microcúpulas cada) revestidas com Antigénio-1 Nuclear do Epstein-Barr
recombinante (EB-NA-1), acondicionadas numa bolsa com exsicante / indicador da
humidade.
Solução de lavagem concentrada (20x):
Tampão Tris (pH 7,2 + 0,2) com Tween 20 a 1%.
Conservantes: Proclin 300 (0,1%).
Controlo não reactivo (humano) para anticorpos IgG anti-EB-NA-1
Negativo para o HBs Ag e para os anticorpos contra HIV-1, HIV-2 e HCV.
Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) e penicilina/estreptomicina (0,01%).
Controlo positivo I (humano) para anticorpos IgG anti-EB-NA-1
Controlo positivo II (humano) para anticorpos IgG anti-EB-NA-1
Calibrador (humano) para anticorpos IgG anti-EB-NA-1, com o factor específico do
dispositivo impresso na cartonagem exterior.
Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) e penicilina/estreptomicina (0,01%)
Conjugado: anticorpos de cabra contra a IgG humana conjugados com peroxidase de
rábano.
Conservantes: Proclin 300 (0,1%) e gentamicina
Diluente I : tampão pronto a usar (pH 7,5 + 0,2).
Conservantes: Proclin 300 (0,1%)
Solução Substrato/Cromogénio (pronta a usar):
Tetrametilbenzidina (TMB).
O reagente deve manter-se fechado quando não está a ser usado; caso contrário, pode
formar-se um precipitado nas microcúpulas de reacção.
Solução de paragem (pronta a usar): Ácido Sulfúrico 1N
Folha de registo dos resultados
R2
R3
R4a
R4b
R5
R6
R7
R9
R10
Apresentação
1
1 x 60 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 16 ml
1 x 30 ml
1 x 15 ml
1 x 15 ml
1
5 - ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
Precauções
A confiança dos resultados depende da correcta implementação das seguintes Boas Práticas de Laboratório:
•
Não usar reagentes fora do prazo de validade
•
Não misturar reagentes de diferentes lotes no mesmo ensaio.
NOTA: É possível o uso de outros lotes além dos que se encontram no dispositivo, desde que se use o
mesmo lote em todo o ensaio: solução de lavagem (R2), solução Substrato / Cromogénio (R9) e solução de
paragem (R10). Estes reagentes podem ser usados com Platelia® EBV-VCA IgG, Platelia® EBV-EA-D IgG e
Platelia® EBV-VCA IgM do nosso catálogo. O Diluente I (R7) pode ser usado com Platelia® EBV-EA-D IgG e
Platelia® EB-VCA IgG. Contacte os nossos serviços técnicos para informações mais detalhadas.
•
Antes de usar, é necessário esperar 30 minutos para que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente.
•
Reconstituir cuidadosamente os reagentes evitando qualquer contaminação.
•
Não realizar o teste na presença de vapores reactivos (vapores de ácidos, de bases e de aldeídos) ou de pó,
que possam alterar a actividade enzimática do conjugado.
•
Utilizar material de vidro cuidadosamente lavado e enxaguado com água desionizada ou, preferencialmente,
material de utilização única.
•
Evitar que as microplacas sequem entre o final da operação de lavagem e a distribuição do reagente.
•
A reacção enzimática é muito sensível a iões metálicos. Assim, evite qualquer contacto dos vários
conjugados ou da solução substrato com elementos metálicos.
•
A solução Substrato / Cromogénio deve ser incolor. O aparecimento de uma coloração indica que o reagente
não pode ser usado e deve ser substituído. Use uma nova ponta de pipeta para cada amostra.
•
A lavagem da microplaca é um passo crítico no processo: respeitar o número de ciclos de lavagem
recomendado e assegurar-se de que todas as microcúpulas são completamente cheias e depois
completamente esvaziadas. Uma lavagem incorrecta pode originar resultados incorrectos.
•
Nunca usar o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento.
•
Verificar as pipetas e outro equipamento para operações correctas e exactas.
•
Não alterar o método de ensaio.
3
Instruções de saúde e segurança
Todos os reagentes fornecidos destinam-se a uso diagnóstico in vitro.
•
Usar luvas descartáveis quando manusear reagentes.
•
Não pipetar com a boca.
•
Os materiais de origem humana usados na preparação dos reagentes foram testados e mostraram ser não
reactivos para o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg), para os anticorpos contra a hepatite C (HCV)
e para os vírus da imunodeficiência adquirida (anti-HIV1 e anti-HIV2). Porque nenhum método pode garantir
de forma absoluta a ausência de agentes infecciosos, deve manusear os reagentes de origem humana e as
amostras dos doentes tendo em consideração que são passíveis de transmitir doenças infecciosas.
•
Considerar como material infeccioso qualquer material directamente em contacto com as amostras e
reagentes de origem humana, assim como as soluções de lavagem.
•
Evitar derramar amostras ou soluções contendo amostras.
•
O material derramado deve ser lavado com lixívia diluída a 10%. Se o líquido de contaminação é um ácido, o
material derramado deve ser previamente neutralizado com bicarbonato de sódio, depois limpo com lixívia e
seco com papel absorvente. O material usado na limpeza deve ser colocado num recipiente para resíduos
contaminados.
•
Amostras, reagentes de origem humana, assim como material contaminado e produtos devem ser
eliminados somente após descontaminação.
- quer por imersão em lixívia na concentração final de 5% de hipoclorito de sódio durante 30 minutos.
- quer por autoclavagem a 121ºC durante, no mínimo, 2 horas.
A autoclavagem durante, pelo menos, uma hora a 121ºC é o melhor método para inactivação dos vírus HIV e do
vírus HB.
PRECAUÇÃO: NÃO INTRODUZIR SOLUÇÕES CONTENDO HIPOCLORITO DE SÓDIO NA AUTOCLAVE.
•
•
•
As substâncias químicas devem ser manuseadas e rejeitadas de acordo com as Boas Práticas de
Laboratório.
Evitar qualquer contacto do tampão substrato, do cromogénio e da solução de lavagem com a pele ou
mucosas (risco de toxicidade, irritação ou queimadura).
Alguns reagentes contêm azida de sódio como conservante. A azida de sódio pode reagir com a canalização
do laboratório, dando origem à formação de azidas de cobre ou de chumbo. Tais azidas são explosivas. De
forma a prevenir a acumulação de azidas, lavar as pipetas com uma grande quantidade de água se as
soluções contendo azidas forem eliminadas através do esgoto após inactivação.
Encontra-se disponível uma ficha de segurança que será entregue a pedido.
6 – MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Misturador Vortex.
Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm (*).
Recipiente para lixo potencialmente contaminado.
Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio.
Água destilada ou desionizada.
Buretas.
Luvas de látex descartáveis.
Óculos de protecção ou óculos de segurança.
Papel absorvente.
Pipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou pré-ajustadas ou multipipetas para medir e fornecer
10, 100 ou 1.000 µl.
•
Equipamento para lavagem manual, semi-automática ou automática de microplacas (*).
•
Tubos de ensaio de utilização única.
(*) Para informações mais detalhadas consulte-nos acerca do equipamento recomendado pelo nosso departamento
técnico.
7 – RECONSTITUIÇÃO E CONDIÇÕES DE CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES
O dispositivo deverá ser conservado entre +2-8ºC até à data de validade referida na embalagem (excepto em
caso de instruções específicas). Antes de usar, deixar que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+18 30ºC). Colocar todos os reagentes no frigorífico imediatamente após a sua utilização.
1) Reagentes prontos a usar
•
•
•
•
•
Reagente 1 (R1): microplaca
Cada tabuleiro contendo 12 tiras encontra-se numa bolsa de folha de alumínio fechada. Cortar a bolsa com
uma tesoura ou um bisturi, 0,5 – 1 cm acima da linha de fecho. Voltar a colocar imediatamente no saco as
tiras que não foram utilizadas. Fechar novamente o saco e voltar a colocar a +2-8ºC. Após a abertura, as
tiras são estáveis durante um mês.
Reagente 3 (R3): controlo não reactivo
Reagente 4a (R4a): controlo positivo I
Reagente 4b (R4b): controlo positivo II
Reagente 5 (R5): calibrador
4
•
•
•
•
Reagente 6 (R6): conjugado
Reagente 7 (R5): diluente I
Reagente R9: Solução Substrato / Cromogénio
Reagente 10 (R10): solução de paragem
2) Reagentes que requerem reconstituição
•
Reagente 2 (R2): solução de lavagem concentrada 20x
Diluir 60 ml da solução de lavagem 20x com água destilada e/ou desionizada para obter 1,2 l de uma solução
pronta a ser usada. Misturar bem. Após diluição, conservar a +2-8ºC durante 5 dias.
8 – COLHEITA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Recolher a amostra de sangue de acordo com as práticas actuais. O teste será realizado com amostras não
diluídas. Separar o soro do coágulo ou dos eritrócitos logo que possível, de forma a evitar qualquer hemólise.
Uma hemólise extensa pode afectar o desempenho do teste. As amostras com agregados devem ser sujeitas a
centrifugação antes de serem testadas. Partículas ou agregados de fibrina em suspensão podem originar falsos
resultados positivos.
As amostras podem ser conservadas a +2 - 8ºC se a pesquisa for realizada no espaço de 5 dias, ou, podem ser
congeladas a -20ºC durante vários meses. Evitar ciclos repetidos de congelação/descongelação. Se as amostras
forem transportadas, devem ser acondicionadas de acordo com os regulamentos em vigor no que se refere ao
transporte de agentes biológicos.
NÃO USAR SORO CONTAMINADO, HIPERLIPÉMICO, HIPERHEMOLISADO ICTÉRICO OU INACTIVADO
PELO CALOR.
9 – MÉTODO
Seguir exactamente o método proposto.
Usar o calibrador e os controlos para cada série de determinações, de forma a validar os resultados do teste.
Cumprir com as seguintes Boas Práticas de Laboratório:
1. Estabelecer cuidadosamente a distribuição das amostras e o plano de identificação.
2. Preparar a solução de lavagem diluída (R2) (consultar a secção 7).
3. Retirar o tabuleiro de transporte e as tiras (R1) da bolsa de protecção. Colocar o número desejado de tiras
revestidas com o antigénio no suporte das microcúpulas. Usar 1 microcúpula para o branco do reagente, 2
microcúpulas para o Calibrador, 1 microcúpula para cada Controlo: Negativo, Positivo I e Positivo II.
A
B
C
D
E
F
G
H
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
1
B1
R3
R4a
R4b
R5
R5
R5
S1
2
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Todas as amostras, controlos e calibrador deverão ser agitados no Vortex antes de usados. Diluir as amostras a
testar, o Calibrador, os Controlos Negativo e Positivo de 1:21 (por ex. 10 µl + 200 µl) com Diluente I (R7) da
amostra nos tubos de diluição ou na placa de diluição.
Pipete 100 µl de cada Calibrador diluído, Controlo ou amostra do doente para cada microcúpula. Pipete 100 µl de
Diluente I (R7) da amostra para a primeira microcúpula para o branco do reagente.
Incubar a microplaca durante 20 minutos + 2 minutos à temperatura ambiente (21-25ºC).
Aspirar os conteúdos de todas as microcúpulas para o recipiente dos lixos potencialmente contaminados (contendo
hipoclorito de sódio). Adicionar imediatamente em cada microcúpula, um mínimo de 300 µl de solução de lavagem.
Aspirar novamente. Repetir esta operação pelo menos 4 vezes (no total um mínimo de 5 lavagens). Se necessário,
secar a placa colocando-a de forma invertida em papel absorvente. Se usar uma lavagem automática, seguir o
mesmo processo.
Distribuir 100 µl do Conjugado (R6) pronto a usar em todas as microcúpulas.
Incubar durante 20 minutos + 2 minutos à temperatura ambiente (21-25ºC).
Esvaziar todas as microcúpulas por aspiração e lavar 5 vezes como anteriormente descrito.
Colocar rapidamente 100 µl de solução Substrato/Cromogénio (R9) em cada microcúpula.
Permitir o desenvolvimento da reacção no escuro durante 10 minutos + 2 minutos à temperatura ambiente (2125ºC). Não usar película adesiva durante este período de incubação.
A solução Substrato/Cromogénio ficará azul nas microcúpulas contendo teores detectáveis de anticorpos IgG.
Adicionar 100 µl da Solução de Paragem a cada microcúpula. Misturar batendo suavemente na placa. A adição da
Solução de Paragem irá dar origem a uma alteração na cor, de azul para amarelo.
Esperar pelo menos 5 minutos e ler. Limpar cuidadosamente a parte de baixo da placa. Usando um comprimento
de onda de 450 nm, ler o branco e depois medir a densidade óptica de cada microcúpula. A placa deve ser lida no
espaço de 30 minutos após a adição da solução de paragem (as tiras devem ser mantidas ao abrigo da luz antes
5
da sua leitura). Verificar todos os resultados para concordância entre a leitura, a placa, a distribuição das amostras
e o plano de identificação.
10 – CÁLCULOS E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
1) Cálculo da absorvância média
1. D.O. (Densidade Óptica) média de Cut-off do Calibrador – Calcular o valor da D.O. média de Cut-off do
Calibrador usando três determinações do Calibrador R5. Se qualquer dos três valores do calibrador diferir
mais de 15% em relação à média, rejeitar o valor e calcular a média usando apenas os dois valores
restantes.
2. Factor de Correcção – Para reflectir as flutuações do dia-a-dia nas etapas do teste devido à temperatura
ambiente e aos tempos; é determinado um Factor de Correcção para cada lote de dispositivos. O Factor
de Correcção é impresso no frasco do Calibrador.
3. Valor de Cut-off do Calibrador– O valor de Cut-off do Calibrador para cada teste é determinado através da
multiplicação do Factor de Correcção pela D.O. média de Cut-off do Calibrador, determinada no ponto 1.
4. Valor do ISR – Calcular o Immune Status Ratio para cada colheita por divisão do valor da D.O. da colheita
pelo Valor de Cut-off do Calibrador determinado no ponto 3.
Exemplo:
D.Os. obtidas para o Calibrador
D.O. média para o Calibrador
Factor de correcção
Valor de Cut-off do Calibrador = 0,5 x 0,400
D.O. obtida para o soro do doente
Valor do ISR
= 0,380; 0,400; 0,420
= 0,400
= 0,5
= 0,200
= 0,600
= 0,600/0,200 = 3,00
2) Validação do teste
1. Branco do Reagente (quando lido em relação ao branco de ar) deve ser < 0,150 a 450 nm : DO RB < 0,150
2. Controlo negativo R3 deve ser < 0,250 a 450 nm (quando lido contra o branco do reagente): DO R3 < 0,250
3. Cada Calibrador R5 deve ser > 0,250 a 450 nm (quando lido contra o branco do reagente: DO R5 > 0,250
4. Controlo positivo R4b deve ser > 0,500 a 450 nm (quando lido contra o branco do reagente): DO R4b >
0,500
5. Os valores do ISR (Immune Status Ratio) para os controlos negativo, positivo I e positivo II (R3, R4a, R4b)
devem estar dentro dos seus respectivos intervalos impressos nos frascos.
Se estes critérios não se encontrarem dentro dos respectivos intervalos, o teste deverá ser considerado
inválido e deverá ser repetido.
3) Interpretação dos resultados
Os valores do ISR dos doentes (Immune Status Ratio) são interpretados da seguinte forma:
Valor do ISR
Resultados
< 0,90
Negativo
0,91 - 1,09
Duvidoso
> 1,10
Positivo
Interpretação
Não é significativo o número de anticorpos IgG EB-NA-1 detectáveis.
As amostras devem ser novamente analisadas
Nível significativo de anticorpos IgG EB-NA-1 detectáveis.
1. Recomenda-se a seguinte forma para comunicação dos resultados obtidos: “Estes resultados foram obtidos
com o teste Platelia® EB-NA-1 IgG. Os valores obtidos com diferentes métodos podem não ser
comparáveis. A magnitude do valor obtido para a IgG não pode ser correlacionada com um título final.”
2. São usados quatro anticorpos EBV distintos para proporcionar um quadro resumido da infecção pelo EBV;
estes são a IgM EBV-VCA , a IgG EBV-VCA, a IgG EBV-EA e a IgG EB-NA. A interpretação exacta da
infecção pelo EBV baseia-se nos resultados para todos estes anticorpos e, para efeitos de diagnóstico,
não deve basear-se apenas no resultado de um único teste.
3. As amostras cujos resultados se mantêm duvidosos após repetição do teste, devem ser testadas usando um
método alternativo, por ex., imunofluorescência (IFA). Se os resultados continuarem duvidosos, deve ser
colhida uma nova amostra.
4. As características do comportamento funcional para este produto foram estabelecidas usando um calibrador.
Caso deseje para o teste uma curva dose-resposta linear, o cliente deverá estabelecer, no mínimo, dois
calibradores adicionais.
5. Para avaliar amostras emparelhadas de soros em relação a uma alteração significativa no título dos
anticorpos, ambas as amostras devem ser analisadas em duplicado no mesmo teste. O ISR médio de
ambas (nas fases aguda e convalescente) deve ser superior a 1,00 para avaliar as amostras
emparelhadas de soros em relação a um aumento significativo do título em anticorpos.
6
4) Valores esperados
Ø Fase Aguda
Os anticorpos IgG EBV-VCA e IgM EBV-VCA estão normalmente presentes. Os anticorpos IgG EB-NA-1
normalmente não existem ou existem em valores muito baixos.
Ø Fase de Transição
Os anticorpos IgG EBV-VCA mantêm-se e os anticorpos IgM EBV-VCA normalmente diminuem. Os anticorpos
IgG EB-NA-1 começam a aumentar.
Ø Fase de Convalescença
Os valores da IgM EBV-VCA diminuem para valores negativos ou muito baixos. Os anticorpos IgG EBV VCA e
IgG EB-NA-1 mantêm-se normalmente ao longo de toda a vida. Nos EUA, cerca de 50% da população sofre
uma seroconversão antes dos 5 anos de idade. Uma outra onda de seroconversão ocorre a meio da segunda
década de vida. Na idade adulta, 90–95% da maioria das populações terá anticorpos EB-NA-1.
5) Prevalência
Com o teste Platelia EB-NA-1 IgG foi testado um grupo de 204 amostras de soro obtidas numa população
saudável da região Nordeste dos EUA. Os soros foram aleatoriamente divididos por sexo, idade e raça. A
distribuição dos Valores do ISR neste estudo encontra-se apresentada no gráfico seguinte. Neste estudo,
86,4% da população apresentou resultados positivos neste teste.
Distribuição dos valores do ISR na população normal (N = 204)
6) Limitações da sua utilização
1. Processos ou práticas que não as descritas no folheto informativo podem originar resultados questionáveis.
Ø A não repetibilidade das reacções é frequentemente causada por:
•
Lavagem inadequada da microplaca,
•
Passos de incubação com tempos incorrectos,
•
Contaminação das amostras negativas por soro ou plasma com um elevado título de anticorpos,
•
Contaminação da solução de desenvolvimento por agentes oxidantes (lixívia, iões metálicos…),
•
Contaminação da solução de paragem.
Ø O uso de soro contaminado, ictérico, lipémico, hemolizado ou inactivado pelo calor pode originar
resultados incorrectos e deverá ser evitado.
Ø As características do desempenho não foram estabelecidas para quaisquer matrizes além do soro.
2. O médico deve fazer a interpretação dos resultados deste teste, tendo em conta outras observações clínicas
e métodos de diagnóstico.
Este dispositivo foi concebido para determinar os anticorpos IgG em amostras de doentes. Resultados
positivos obtidos em recém-nascidos devem ser interpretados com precaução, dado que pode ocorrer uma
transferência passiva da IgG da mãe para o feto antes do nascimento. As pesquisas de IgM são
geralmente indicadores mais úteis em crianças com menos de 6 meses de idade. Os valores obtidos com
este teste devem ser usados apenas como auxiliar do diagnóstico. Cada médico deve interpretar os
resultados obtidos com base na história clínica do doente, dados físicos e outros métodos de diagnóstico.
As características do seu desempenho não foram estabelecidas para doentes com carcinoma
nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, outras linfadenopatias associadas ao EBV e outras patologias associadas
ao EBV para além da mononucleose relacionada com o EBV. Os resultados do teste Platelia EB-NA-1
IgG obtidos com o soro de doentes imunodeprimidos devem ser cuidadosamente interpretados. As
características do seu desempenho neste doseamento não foram estabelecidas para soros pediátricos.
Ø Indivíduos com uma infecção crónica activa provocada pelo vírus de Epstein-Barr podem não produzir uma
resposta em anticorpos contra o EB-NA-1
Ø Existe a possibilidade de ocorrer uma reactividade cruzada em amostras contendo anticorpos anti-E. coli.
7
11 – COMPORTAMENTO FUNCIONAL
1. Sensibilidade e Especificidade Relativas com Base na Caracterização do Soro
Foram testados 357 soros. Os soros do estudo foram previamente caracterizados usando testes ELISA
disponíveis no mercado. A sensibilidade, especificidade e a correlação do teste foram determinadas com base
nesta caracterização. Os resultados encontram-se resumidos no quadro seguinte:
Platelia EB-NA-1 IgG
Positivo
Duvidoso
270
5
0
0
0
1
270
6
Resultado
testes Positivo
Duvidoso
Negativo
Total
Outros
ELISA
Negativo
6
1
74
81
Total
281
1
75
357
O que permite os seguintes cálculos (foram excluídas as amostras duvidosas):
Resultados
74 / 74
270 / 276
344 / 350
Especificidade
Sensibilidade
Correlação geral
100 %
97,8 %
98,3 %
2. Precisão
O teste Platelia EB-NA-1 IgG foi avaliado em relação à precisão através da análise de três soros em
duplicado, vinte vezes cada, em 3 laboratórios diferentes.
Os resultados encontram-se resumidos no Quadro seguinte.
Soro
Negativo
Fraco positivo
Positivo
n
120
120
120
X
0,02
1,41
5,04
D.P.
0,02
0,16
0,37
CV %
138
11,5
7,3
X
= Valor médio do ISR
D.P. = Desvio Padrão
C.V. = Coeficiente de Variação
3. Reactividade cruzada
As seguintes 5 amostras de soro foram testadas e o resultado foi negativo com o teste Platelia EB-NA-1 IgG.
IgG HSV 1
IgG HSV 2
IgG CVM
IgG VZV
Platelia
EB-NA-1 IgG
1
2,43 +
0,6 -
1,69 +
2,28 +
0,67 -
2
0,32 -
0,08 -
0,18 -
3,17 +
0,36 -
3
3,67 +
0,86 -
1,11 +
2,45 +
0,73 -
4
0,3 -
0,39 -
0,18 -
3,21 +
0,29 -
5
6,18 +
5,98 +
0,18 -
2,14 +
0,34 -
12 –BIBLIOGRAFIA
Veja a versão francesa.
8
PLATELIA® EB-NA-1 IgG 72939
96 test
IMMUNOLOGISK ENZYMANALYS FÖR KVALITATIV BESTÄMNING AV IGG-ANTIKROPPAR MOT
EPSTEIN-BARR-VIRUS (EPSTEIN-BARR NUCLEAR ANTIGEN-1) I HUMANT SERUM
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
1 – ANVÄNDNINGSOMRÅDE
2 – KLINISK BETYDELSE
3 – TESTPRINCIP
4 – INNEHÅLL
5 – FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER OCH VARNINGAR
6 – NÖDVÄNDIGT MEN EJ BIFOGAT MATERIAL
7 – BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENSER
8 – PROVER
9 – TESTFÖRFARANDE
10 – BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTATEN
11 – TESTRESULTAT
12 – LITTERATUR
1 – ANVÄNDNINGSOMRÅDE
Detta immunologiska enzymanalystest är avsett för kvalitativ bestämning av IgG-antikroppar mot Epstein-Barrvirusets kärnantigen-1 (EB-NA-1) i humant serum. Testet Platelia® EB-NA-1 IgG kan användas i kombination med
andra Epstein-Barr-serologier (Platelia® EBV-VCA IgM, Platelia® EBV-VCA IgG och Platelia® EBV-EA-D IgG) som
ett hjälpmedel vid diagnosticeringen av infektiös mononukleos (körtelfeber).
2 – KLINISK BETYDELSE
Detektion av Epstein-Barr-viruset beskrevs första gången 1964 av Epstein, Achong och Barr. Då använde man
elektronmikroskopstudier av odlade lymfoblaster som härrörde från patienter med Burkitts lymfom. Epstein-Barrviruset (EBV) är klassificerat som en medlem av herpesvirusfamiljen på grundval av dess karakteristiska morfologi.
EBV-infektionen kan uppvisa en rad olika kliniska symtom. Merparten av de primära EBV-infektionerna överförs via
saliv, uppträder under barndomen och är subkliniska. I USA uppvisar 50 % av befolkningen EBV-antikroppar innan
fem års ålder. I vuxen ålder är andelen 80 %. Transfusionsrelaterade EBV-infektioner har också rapporterats.
Hos unga vuxna manifesterar sig EBV-infektionen kliniskt som infektiös mononukleos med relativt atypiska symtom
såsom feber, faryngit, halsfluss, lymfadenopati, illamående, huvudvärk, muskelvärk, mjält- och leverförstoring,
hudutslag och leukocytos. Studerande och militär personal nämns ofta som populationer med hög
insjuknandefrekvens när det gäller infektiös mononukleos.
Efter en primär EBV-infektion påstås det att B-lymfocyterna kan fortsätta att härbärgera EBV-genomet och ge upphov
till en latent infektion som kvarstår livet ut. Man har dokumenterat reaktivering av EBV-infektion eller ökad EBVaktivering hos patienter med nedsatt eller försvagat immunförsvar, t.ex. patienter som har genomgått
organtransplantation, personer med maligniteter, gravida kvinnor och äldre personer.
Motstridiga åsikter råder när det gäller den definitiva slutsatsen om att EBV skulle vara orsak till det kliniska tillståndet
som kallas ”kronisk EBV-infektion” eller ”kronisk mononukleos”.
Epstein-Barr-viruset har också förknippats med patogenesen för två humana cancertyper, Burkitts lymfom och
nasofarynxcancer.
Med hjälp av DNA-hybridiseringsstudier har man påvisat närvaron av EBV-genomet i biopsiprover som har tagits från
personer med dessa cancertyper.
Burkitts lymfom påträffas i första hand i länderna söder om Sahara, särskilt hos afrikanska barn, och i Nya Guinea.
Malariainfektioner diagnosticeras vanligtvis hos patienter med Burkitts lymfom och föreslås vara en kofaktor.
Nasofarynxcancer påträffas i Asien, framför allt i södra Kina, och kan ha genetisk eller miljömässig påverkan som en
kofaktor.
B-cellslymfom som liknar det afrikanska Burkitts lymfomet har nyligen rapporterats hos patienter med förvärvat
immunbristsyndrom (AIDS). Det antyds att AIDS-patienter kan ha en predisposition för EBV-infektion/reaktivering på
grund av deras allmänna tillstånd med nedsatt immunförsvar.
EBV-infektion leder till att antikroppar bildas i fyra bestämda antigenkomplex. Dessa omfattar: EBV-inducerad
kärnantigen (EB-NA), EBV-inducerad tidig antigen (EA), viruskapsidantigen (VCA) och EBV-inducerad
membranantigen (MA). EA-komplexet är uppdelat i två komponenter som omfattar EA-D (diffus komponent) och EA-R
(begränsad (restricted) komponent).
Infektion i målcellerna leder till två former av viruscykler: 1) latenta, icke-produktiva och 2) produktiva, replikerande
infektioner. I båda cyklerna uppträder den lymfocytdetekterade membranantigenen, en cellyteantigen som T-cellerna
känner igen, som en av de tidigaste antigenerna. Det har konstaterats att de flesta personer som utsätts för EBV
utvecklar en heterofil antikroppsreaktion. EB-NA-1 bildas antingen samtidigt med eller efter membranantigenen, 12 till
24 timmar efter infektionen. EB-NA-1 uppträder som icke-strukturell(a), intranukleär(a) antigen(er) som finns
närvarande i alla EBV-omvandlade cellinjer, såsom i tumörer från patienter med Burkitts lymfom och
nasofarynxcancer.
I en fullt produktiv, replikerande cykel sker syntesen av antigen efter EB-NA-1. Viruskapsidantigenkomplexet (VCA)
uppträder senare i den replikerande cykeln.
Det har nyligen framkommit att EB-NA-1 förmodligen inte är en enskild antigenenhet, utan ett antigenkomplex med
flera komponenter, baserat på reaktiviteterna för sera från olika patientgrupper. Den viktigaste komponenten, EB-NA1, har renats och sekvensbestämts i sin helhet.
Antikroppsnivåerna för EB-NA-1 IgG kan användas för att fastställa de akuta stadierna och konvalescentstadierna vid
infektiös mononukleos. IgG-antikroppar mot EB-NA-1 är sällsynta vid akut infektiös mononukleos och ökar under
tillfrisknandet. De kommer att öka till en platåkoncentration inom tre månader till ett år och kommer normalt att kvarstå
livet ut.
3 – TESTPRINCIP
Bio-Rads enzymlänkade immunologiska mätmetoder (ELISA) baseras på förmågan hos biologiska material (dvs.
antigener) att adsorberas på plastytor såsom polystyren (fast fas). I testet Platelia® EB-NA-1 IgG används ELISAtekniken, varvid en renad rekombinant EB-NA-1-antigen är bunden till brunnarna på en mikroplatta. När antigenerna
som är bundna till den fasta fasen kommer i kontakt med patientens serum, kommer antigenspecifika antikroppar, om
de förekommer, att binda till antigenen på den fasta fasen och bilda antigen-antikropp-komplex. Överflödiga
antikroppar tvättas bort.
Detta följs av tillsats av pepparrotsperoxidaskonjugerad get anti-human IgG som därefter binder till antigen-antikroppkomplexen. Överflödigt konjugat tvättas bort och följs av tillsats av substrat, tetrametylbensidin (TMB). Om specifika
antikroppar mot antigenen finns i patientens serum framträder en blå färg. När den enzymatiska reaktionen har
stoppats med 1 N H2SO4 blir innehållet i brunnarna gult. Färgen, som är proportionell mot antikroppskoncentrationen i
serumet, kan avläsas med hjälp av en lämplig spektrofotometer eller avläsare för ELISA-mikrobrunnsplattor.
Sensitiviteten, specificiteten och reproducerbarheten för enzymlänkade immunologiska mätmetoder kan jämföras med
andra serologiska tester för antikroppar, såsom immunofluorescens, komplementbindning, hemagglutination och
radioimmunologisk analys.
4 – INNEHÅLL
Alla reagenser som ingår i testet är enbart avsedda för in vitro-diagnostiskt bruk.
Märkning
R1
R2
R3
R4a
R4b
R5
R6
R7
R9
R10
Typ av reagens
12 remsor (8 brunnar vardera) belagda med rekombinant Epstein-Barrkärnantigen-1 (EB-NA-1), förvarade i en folieförpackning med torkmedel/fuktindikator.
Koncentrerad tvättlösning (20 x ).
Tris-buffert (pH 7,2 ± 0,2) med 1 % Tween® 20.
Konserveringsmedel: Proclin® 300 (0,1 %).
Icke-reaktiv kontroll (human) för anti-EB-NA-1 IgG-antikroppar.
Negativ för HBsAg- och HIV-1-, HIV-2- och HCV-antikroppar.
Konserveringsmedel: natriumazid (< 0,1 %) och pen/strep (0,01 %).
Positiv kontroll I (human) för anti-EB-NA-1 IgG-antikroppar.
Positiv kontroll II (human) för anti-EB-NA-1 IgG-antikroppar.
Kalibrator (human) för anti-EB-NA-1 IgG-antikroppar med testspecifik faktor tryckt på ytterförpackningens etikett.
Konjugat : getantikroppar mot human IgG kopplat med
pepparrotsperoxidas. Konserveringsmedel:
Proclin® 300 (0,1 %) och gentamycin.
Spädningsmedel I: buffert färdig att använda (pH 7,5 ± 0,2).
Konserveringsmedel: Proclin® 300 (0,1 %).
Kromogen-/substratlösning (färdig att använda):
Tetrametylbensidin (TMB).
Låt reagensflaskan förbli stängd då den inte används. I annat fall kan en utfällningen
bildas i reaktionsbrunnarna.
Stopplösning (färdig att använda): 1 N svavelsyra.
Arbetsblad för testet.
Innehåll
1
1 x 60 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 16 ml
1 x 30 ml
1 x 15 ml
1 x 15 ml
1
5 – FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER OCH VARNINGAR
Försiktighetsåtgärder
Resultatens kvalitet är beroende av att god laboratoriesed (GLP) tillämpas:
• Använd inte reagenser efter utgångsdatumet.
• Blanda inte reagenser från olika partier inom en bestämd testkörning.
KOMMENTAR: Du kan använda andra partier än de som ingår i testet om samma parti används inom en viss
testkörning: tvättlösning (R2), kromogen-/substratlösning (R9) och stopplösning (R10).
Dessa reagenser kan använda med Platelia® EBV-VCA IgG, Platelia® EBV-EA-D IgG och Platelia® EBV-VCA IgM
från vår katalog. Spädningsmedlet I (R7) kan användas med Platelia® EBV-EA-D IgG och Platelia® EB-VCA IgG.
Kontakta vår avdelning för teknisk service om du vill ha mer information.
• Låt alla reagenser anta rumstemperatur under ca 30 minuter före användning.
• Rekonstituera noggrant reagenserna och undvik all förorening.
• Utför inte testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle kunna
ändra konjugatets enzymatiska aktivitet.
• Använd glasvaror som noggrant har diskats och sköljts med avjoniserat vatten, eller ännu hellre, engångsmateriel.
• Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren, innan reagenset har hällts i.
• Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de olika
konjugat- eller substratlösningarna.
• Kromogen-/substratlösningen måste vara färglös. Om den är färgad är detta en bevis för att reagenset inte kan
användas utan måste ersättas. Använd en ny pipettspets för varje prov.
• Tvättningen av mikroplattan är ett kritiskt steg i detta förfarande. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se
till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvättning kan leda till felaktiga resultat.
• Använd aldrig samma behållare för fördelning av konjugat- och framkallningslösning.
• Kontrollera pipetternas och annan utrustnings noggrannhet, samt att de fungerar korrekt.
• Ändra inte testförfarandet.
Hälso- och säkerhetsanvisningar
Alla reagens i testet är avsedda för in vitro-diagnostik.
• Använd engångshandskar vid reagenshantering.
• Pipettera inte med munnen.
• Material av humant ursprung som använts vid beredning av reagenserna har testats och befunnits icke-reaktivt för
hepatit B-ytantigen (HBsAg), antikroppar mot hepatit C-virus (HCV) och antikroppar mot humant immunbristvirus (antiHIV1 och anti-HIV2). Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera frånvaron av smittsamma ämnen, ska
reagenser av humant ursprung och patientprover hanteras som potentiellt smittsamma.
• Betrakta allt material som har varit i direkt kontakt med prover och reagenser av humant ursprung, liksom
tvättlösningar, som smittfarligt material.
• Undvik att spilla prover eller lösningar som innehåller prover.
• Spill måste sköljas med blekmedel som spätts till 10 %. Om den smittfarliga lösningen är en syra måste spill först
neutraliseras med natriumbikarbonat och därefter renas med blekmedel och torkas upp med absorberande papper.
Materialet som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall.
• Prover, reagenser av humant ursprung liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter ska omhändertas på
följande sätt efter saneringen:
– antingen sänkas ned i blekmedel vid en slutlig koncentration på 5 % natriumhypoklorid i 30 minuter
– eller autoklaveras vid 121°C i minst 2 timmar.
Autoklavering i minst en timme vid 121°C är den bästa metoden för att inaktivera HIV-virus och HB-virus.
VARNING! HÄLL INGA LÖSNINGAR INNEHÅLLANDE NATRIUMHYPOKLORID I AUTOKLAVEN.
• Hantering och avlägsnande av kemiska produkter ska genomföras enligt rutiner för god laboratoriesed (GLP; Good
Laboratory Practices).
• Undvik all hud- och slemhinnekontakt med substratbuffert, kromogen- eller stopplösning (risk för förgiftning, irritation
eller brännskador).
• Vissa reagenser innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Natriumazid kan reagera med rörledningar och
bilda koppar- eller blyazider.
Sådana azider är explosiva. För att undvika att azider bildas ska ledningarna spolas rikligt med vatten om lösningar
som innehåller azider slås ut i avloppet efter inaktivering.
Ett säkerhetsdatablad kan erhållas på begäran.
6 – NÖDVÄNDIGT MEN EJ BIFOGAT MATERIAL
• Vortexmixer.
• Avläsare för mikroplattor med 450 nm filter (*).
• Behållare för smittförande avfall.
• Natriumhypoklorid (blekmedel) och natriumbikarbonat.
• Destillerat eller avjoniserat vatten.
• Mätcylindrar.
• Engångshandskar av gummi.
• Skyddsglasögon.
• Absorberande papper.
• Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda pipetter eller multipipetter för mätning och fördelning
av 10, 100 och 1 000 µl.
• Manuell, halvautomatisk eller automatisk tvättanordning för mikroplattor (*).
• Engångsrör.
(*) Begär gärna mer information om den utrustning som vår tekniska avdelning rekommenderar.
7 – BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENSER
Testet ska förvaras vid +2–8°C och är då hållbart till utgångsdatumet på förpackningen (med förbehåll för specifika
anvisningar). Låt reagenserna uppnå rumstemperatur (+18-30°C) före användning. Ställ tillbaka alla reagenser i kylen
genast efter användning.
1) Reagens färdiga att använda
• Reagens 1 (R1): mikroplatta
Varje bricka, som innehåller 12 remsor, är förpackad i en försluten foliebelagd påse. Klipp upp påsen med en sax eller
skär upp den med en skalpell 0,5–1 cm ovanför linjen. Lägg omedelbart tillbaka oanvända remsor i påsen. Återförslut
noggrant påsen och förvara den vid +2–8°C. Remsorna är då hållbara i 1 månad.
• Reagens 3 (R3): icke-reaktiv kontroll
• Reagens 4a (R4a): positiv kontroll I
• Reagens 4b (R4b): positiv kontroll II
• Reagens 5 (R5): kalibrator
• Reagens 6 (R6): konjugat
• Reagens 7 (R7): spädningsmedel I
• Reagens R9: kromogen-/substratlösning
• Reagens 10 (R10): stopplösning
2) Reagenser som ska rekonstitueras
• Reagens 2 (R2): tvättlösning, koncentrerad 20 x
Späd 60 ml av tvättlösningen (20 x) med 1,2 l destillerat och/eller avjoniserat vatten för att få en lösning som är färdig
att använda. Blanda väl. Efter utspädningen kan lösningen förvaras i 5 dagar vid +2–8°C.
8 – PROVER
Tag blodprov enligt sedvanlig praxis. Testet utförs med icke utspädda prover. Avskilj serum från koaglet eller
erytrocyterna så fort som möjligt för att undvika hemolys. En utpräglad hemolys kan inverka på testresultatet. Prover
som visar aggregat måste renas genom centrifugering före testet. Partiklar eller fibrinaggregat kan ge falskt positiva
resultat.
Proverna kan förvaras vid +2–8°C om screeningen utförs inom 5 dagar eller förvaras frysta vid -20°C i flera månader.
Undvik upprepad nedfrysning/upptining. Om proverna ska transporteras, förpacka dem enligt gällande regler för
transport av etiologiska ämnen.
ANVÄND INTE KONTAMINERADE, HYPERLIPEMISKA, IKTERISKA, HYPERHEMOLYSERADE ELLER
VÄRMEINAKTIVERADE SERA.
9 – TESTFÖRFARANDE
Följ noggrant det angivna förfarandet.
Validera testresultaten med hjälp av kalibratorn och kontrollerna för varje serie bestämningar.
Tillämpa god laboratoriesed enligt följande:
1. Fastställ provfördelnings- och identifieringsplanen noggrant.
2. Bered den spädda tvättlösningen (R2) (se avsnitt 7).
3. Ta ut brickan och remsorna (R1) ur skyddsförpackningen. Placera önskat antal antigenbelagda remsor i en
mikrobrunnsram. Beräkna 1 brunn för reagensblanken, 2 brunnar för kalibratorn, 1 brun vardera för kontrollerna
negativ, positiv I och positiv II.
A
B
C
D
E
F
G
H
4.
5.
6.
7.
8.
1
B1
R3
R4a
R4b
R5
R5
R5
S1
2
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Blanda alla prover, kontroller och kalibratorn innan användning. Späd testproverna, kalibratorn, de negativa och
positiva kontrollerna 1:21 (t.ex. 10 µl + 200 µl) med provutspädningsmedel I (R7) i spädningsrör eller på en
spädningsplatta.
Pipettera 100 µl kalibrator, kontroll eller patientprov i respektive brunn. Pipettera 100 µl provutspädningsmedel I
(R7) i den första brunnen för reagensblanken.
Inkubera mikroplattan i 20 ± 2 minuter vid rumstemperatur (21–25°C).
Aspirera samtliga brunnars innehåll till en behållare för miljöfarligt avfall (innehållande natriumhypoklorid). Tillsätt
genast minst 300 µl tvättlösning till varje brunn. Sug upp igen. Upprepa förfarandet minst 4 gånger (dvs.
sammanlagt minst 5 tvättar). Om det behövs kan du torka mikroplattan genom att vända den upp och ned på ett
absorberande papper. Om du använder en automatisk tvättanordning följer du samma arbetssätt.
Fördela 100 µl av det färdiga konjugatet (R6) i alla brunnar.
12
9.
10.
11.
12.
Inkubera i 20 ± 2 minuter vid rumstemperatur (21–25°C).
Töm alla brunnar genom att suga upp innehållet och tvätta minst 5 gånger enligt anvisningarna ovan.
Fördela snabbt 100 µl av kromogen-/substratlösningen (R9) i varje brunn.
Låt reaktionen fortgå i mörker i 10 ± 2 minuter vid rumstemperatur (21–25°C). Använd ingen självhäftande folie
under denna inkubering. Kromogen-/substratlösningen blir blå i brunnar som innehåller detekterbara nivåer av
IgG-antikroppar.
13. Tillsätt 100 µl stopplösning i varje brunn. Blanda försiktigt genom att knacka på plattan. Genom tillsats av
stopplösningen kommer färgen att ändras från blått till gult.
14. Vänta minst 5 minuter innan avläsningen. Torka noggrant av mikroplattans botten. Nollställ noggrant avläsaren
med hjälp av reagensblanken vid våglängden 450 nm och mät den optiska densiteten för varje brunn. Plattan
måste avläsas inom 30 minuter efter tillsatsen av stopplösningen (remsorna får inte utsättas för ljus innan
avläsningen).
15. Kontrollera alla resultat med avseende på överensstämmelse mellan avläsningarna och provfördelnings- och
identifieringsplanen för plattan.
10 – BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTATEN
1) Beräkning av medelvärdet för absorbans
1. Medelvärdet för gränsvärdeskalibratorns OD (optiska densitet) – Beräkna medelvärdet för
gränsvärdeskalibratorns optiska densitet med hjälp av de tre bestämningarna för kalibrator R5. Om något värde
för de tre kalibratorerna skiljer sig mer än 15 % från medelvärdet förkastas detta värde och medelvärdet beräknas
med de två återstående värdena.
2. Korrektionsfaktor – En korrektionsfaktor bestäms för varje testparti för att ta hänsyn till fluktuationer från dag till
dag i testaktiviteterna som beror på rumstemperaturen och valet av tidpunkt för analysen. Korrektionsfaktorn står
tryckt på kalibratorvialen.
3. Värdet för gränsvärdeskalibratorn – Värdet för gränsvärdeskalibratorn bestäms för varje test genom att
multiplicera korrektionsfaktorn med medelvärdet för gränsvärdeskalibratorns optiska densitet som bestämdes i
steg 1.
4. Immunstatuskvot - Beräkna immunstatuskvoten för varje prov genom att dividera provets optiska densitet med
gränsvärdeskalibratorns värde som bestämdes i steg 3.
Exempel:
Optiska densiteter för kalibratorn
= 0,380, 0,400, 0,420
Medelvärde för kalibratorns optiska densitet = 0,400
Korrektionsfaktor
= 0,5
Gränsvärdeskalibratorns värde
= 0,5 x 0,400 = 0,200
Optisk densitet för patientsera
= 0,600
Immunstatuskvot
= 0,600/0,200 = 3,00
5.
Den maximala linjäriteten för testet är en immunstatuskvot på 5,40. Därför ska en immunstatuskvot > 5,40
rapporteras som större än 5,40.
2) Analysvalidering
1. Reagensblanken (vid avläsning mot blank luft) måste vara < 0,150 vid 450 nm: OD RB < 0,150
2. Negativ kontroll R3 måste vara = 0,250 vid 450 nm (vid avläsning mot reagensblank): OD R3 = 0,250
3. Varje kalibrator R5 måste vara = 0,250 vid 450 nm (vid avläsning mot reagensblank): OD R5 = 0,250
4. Positiv kontroll R4b måste vara = 0,500 vid 450 nm (vid avläsning mot reagensblank): OD R4b = 0,500
5. Immunstatuskvoterna för kontrollerna – negativ, positiv I och positiv II(R3, R4a, R4b) – måste ligga inom de
intervall som finns tryckta på vialerna.
Om dessa kriterier inte uppfylls bör testet betraktas som ogiltigt och bör upprepas.
3) Utvärdering av resultaten
Patienternas immunstatuskvoter utvärderas enligt följande:
Immunstatuskvot
= 0,90
0,91–1,09
= 1,10
1.
2.
Resultat
Negativt
Tveksamt
Positivt
Utvärdering
Ingen signifikant nivå av detekterbar EB-NA-1 IgG-antikropp
Proverna bör testas på nytt
Signifikant nivå av detekterbar EB-NA-1 IgG-antikropp
Följande metod rekommenderas för att rapportera de erhållna resultaten: ”Följande resultat erhölls med testet
Platelia® EB-NA-1 IgG. Värdena kan inte bytas mot värden som erhållits med andra metoder. Storleken för den
rapporterade IgG-nivån kan inte korreleras mot en slutpunktstiter”.
Fyra karakteristiska EBV-antikroppar används för att ge en heltäckande bild av en EBV-infektion. Dessa är EBVVCA IgM, EBV-VCA IgG, EBV-EA IgG och EB-NA IgG. En korrekt utvärdering av en EBV-infektion baseras på
resultaten från alla dessa antikroppar. En diagnos bör normalt inte baseras på enstaka testresultat.
3.
4.
5.
Prover som förblir tveksamma efter upprepad testning bör testas om med en annan metod, t.ex.
immunfluorescensanalys (IFA). Om resultaten förblir tveksamma efter ytterligare testning bör ytterligare prov tas.
Prestandaegenskaperna för denna produkt har fastställts med hjälp av en kalibrator. Om en linjär dosresponskurva önskas för testet måste kunden använda sig av minst två ytterligare kalibratorer.
För att utvärdera parade sera med avseende på signifikant ändring av antikroppsnivån måste båda proverna
testas med dubbelprover i samma analys. Medelvärdet för immunstatuskvoten för båda proverna (akut och
konvalescent) måste vara större än 1,00 för att kunna utvärdera de parade sera med avseende på en signifikant
höjning av antikroppsnivån.
4) Förväntade värden
.Akut fas
EBV-VCA IgG- och EBV-VCA IgM-antikroppar förekommer normalt.
EB-NA-1 IgG-antikroppar saknas normalt eller finns vid mycket låga nivåer.
.Övergångsfas
EBV-VCA IgG-antikropparna kvarstår och EBV-VCA IgM-antikropparna avtar normalt. EB-NA-1 IgG-antikropparna
börjar öka.
.Konvalescentfas
EBV-VCA IgM sjunker till negativ eller mycket låg koncentration. EBV-VCA IgG- och EB-NA-1 IgG-antikropparna
kvarstår normalt livet ut. I USA sker serokonversion hos omkring 50 % av befolkningen innan 5 års ålder. En
ytterligare serokonversion sker halvvägs genom den andra tioårsperioden i livet. Vid vuxen ålder uppvisar 90–95 % av
de flesta populationer EB-NA-1-antikroppar.
5) Prevalens
En grupp med 204 sera från en frisk population i den nordöstra delen av USA testades med testet Platelia® EB-NA-1
IgG. Sera valdes slumpmässigt med avseende på kön, ålder och ras. Fördelningen av immunstatuskvoterna från
denna studie visas i följande diagram. I denna studie var 86,4 % av populationen positiv enligt testet.
Fördelning av immunstatuskvoter i en normal population (N=204)
6) Testets begränsningar
1. Testförfaranden eller testmetoder som ligger utanför dem som beskrivs i denna bipacksedel kan ge upphov till
tvivelaktiga resultat.
.Icke-repeterbara reaktioner orsakas ofta av följande:
• Bristfällig rengöring av mikroplattan.
• Olämpligt val av tidpunkt för inkuberingsstegen.
• Kontaminering av negativa prov med serum eller plasma med hög antikroppstiter.
• Kontaminering av framkallningslösningen med oxidationsmedel (blekmedel, metalljoner m.m.).
• Kontaminering av stopplösningen.
.Kontaminerade, ikteriska, lipemiska, hemolyserade eller värmeinaktiverade sera kan ge upphov till felaktiga resultat
och bör undvikas.
.Prestandaegenskaperna har inte fastställts för andra matriser än serum.
2. En läkare bör utvärdera testresultaten mot bakgrund av andra kliniska fynd och diagnostiska förfaranden.
.Detta test är utformat för att mäta IgG-antikroppar i patientprover.
Positiva resultat för nyfödda barn måste tolkas med försiktighet eftersom moderns IgG överförs passivt från modern till
fostret innan födseln. IgM-tester är normalt mer användbara indikatorer för en infektion hos barn under 6 månaders
ålder. Värdena som fås från denna test är endast avsedda att underlätta vid diagnosticeringen. Varje läkare måste
tolka resultaten mot bakgrund av patientens bakgrund, fysiska fynd och andra diagnostiska förfaranden.
Prestandaegenskaperna har inte fastställts för patienter med nasofarynxcancer, Burkitts lymfom, andra EBVrelaterade lymfadenopatier eller andra EBV-relaterade sjukdomar förutom EBV-relaterad mononukleos. Resultat från
Platelia® EB-NA-1 IgG som utförs på serum från patienter med nedsatt immunförsvar måste tolkas med försiktighet.
Prestandaegenskaperna för denna test har inte fastställts för prov från barn.
.Personer med kronisk aktiv Epstein-Barr-virusinfektion genererar eventuellt ingen antikroppsreaktion mot EB-NA-1.
.Det finns en risk för korsreaktivitet för testet med prover som innehåller anti-E. coli-antikroppar.
11 – TESTRESULTAT
1 - Relativ känslighet och specificitet baserat på serumkarakterisering
357 sera testades. Sera från studien karakteriserades i förväg med hjälp av kommersiellt tillgängliga ELISA-tester.
Testets känslighet, specificitet och överensstämmelse bestämdes med utgångspunkt från denna karakterisering.
Resultaten sammanfattas i tabellen nedan.
Annan EIA-test
Resultat
Positiva
Tveksamma
Negativa
Totalt
Positiva
270
0
0
270
Tveksamma
5
0
1
6
Negativa
6
1
74
81
Totalt
281
1
75
357
Detta möjliggör följande beräkningar (tveksamma prover har uteslutits):
Resultat
Specificitet
Känslighet
Total överensstämmelse
74/74
270/276
344/350
100 %
97,8 %
98,3 %
2. - Precision
Testet Platelia® EB-NA-1 IgG utvärderades med avseende på precision genom testning av tre sera med
dubbelprover tjugo gånger vardera i tre olika laboratorier. Resultaten sammanfattas i tabellen nedan.
n
120
120
120
Serum
Negativa
Lågt positiva
Positiva
X
0,02
1,41
5,04
SD
0,02
0,16
0,37
CV %
138
11,5
7,3
X = Medelvärde för immunstatuskvoten
SD = Standardavvikelse
CV = Variationskoefficient
3 - Korsreaktivitet
Följande 5 serumprover testades och befanns negativa med testet Platelia® EB-NA-1 IgG.
1
2
3
4
5
HSV 1 IgG
HSV 2 IgG
CMV IgG
VZV IgG
2,43 +
0,32 3,67 +
0,3 6,18 +
0,6 0,08 0,86 0,39 5,98 +
1,69 +
0,18 1,11 +
0,18 0,18 -
2,28 +
3,17 +
2,45 +
3,21 +
2,14 +
12 – LITTERATUR
Se den engelsk versionen.
Platelia®
EB-NA-1 IgG
0,67 0,36 0,73 0,29 0,34 -
PLATELIA® EB-NA-1 IgG 72939
96 tests
ENZYMIMMUNANALYSE TIL KVALITATIV BESTEMMELSE AF IgG-ANTISTOFFER MOD EPSTEINBARR-VIRUS (EPSTEIN-BARR NUCLEAR ANTIGEN-1) I HUMANT SERUM
INDHOLDSFORTEGNELSE
1 - FORMÅL
2 - KLINISK VÆRDI
3 - PROCEDURENS PRINCIP
4 - SÆTTETS INDHOLD
5 - FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER
6 - KRÆVET MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER
7 - FORBEREDELSE OG OPBEVARING AF REAGENSER
8 - PRØVEMATERIALE
9 - ANALYSEPROCEDURE
10 - BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE
11 - YDEEVNE
12 - LITTERATUR
1 - FORMÅL
Dette immunanalyse-sæt er beregnet til kvalitativ bestemmelse af IgG-antistoffer mod Epstein-Barr Virus Nuklear Antigen-1 (EB-NA1) i humant serum. Platelia® EB-NA-1 IgG-analysen kan anvendes i forbindelse med andre Epstein-Barr-serologier (Platelia® EBVVCA IgM, Platelia® EBV-VCA IgG og Platelia® EBV-EA-D IgG) som en hjælp til diagnosticeringen af smitsom mononukleose.
2 - KLINISK VÆRDI
Konstatering af Epstein-Barr-virus blev første gang beskrevet i 1964 af Epstein, Achong og Barr ved hjælp af elektronmikroskopiske
undersøgelser af dyrkede lymfoblaster, der var hentet fra patienter med Burkitts lymfom. EBV er klassificeret som medlem af
herpesvirusfamilien ud fra dens karakteristiske morfologi.
EBV-infektionen kan påvise et bredt spektrum af kliniske symptomer. Størstedelen af de primære EBV-infektioner overføres via spyt,
forekommer i barndommen og er subkliniske. I USA viser 50 % af befolkningen under 5 år og 80 % af den voksne befolkning tegn på
EBV-antistoffer. Der er også registreret EBV-infektioner i forbindelse med transfusioner.
Hos unge mennesker kan EBV-infektion vise sig som smitsom mononukleose (IM) med forholdsvis atypiske symptomer som
faryngitis-feber, tonsillitis, lymfadenopati, utilpashed, hovedpine, myagia, spleno- og hepatomegali, udslæt og leucocytose.
Universitetsstuderende og militærpersonale angives ofte som befolkningsgrupper med en høj sygelighed for IM.
Efter den primære EBV-infektion postuleres det, at B-lymfocytten muligvis fortsætter med at nære EBV-genomet og etablerer en
latent infektion, der kan vare hele livet. Genaktivering af EBV-infektion eller øget EBV-aktivering er dokumenteret hos patienter med
svækket immunsystem, f.eks. efter organtransplantation, ved ondartede sygdomme, hos gravide og gamle mennesker.
Der er uenighed angående den definitive implikation af EBV som den ætiologiske faktor i den kliniske tilstand, der kaldes "kronisk
EBV-infektion" eller "kronisk mononukleose".
Epstein-Barr-virus har også været forbundet med patogenesen hos to humane kræfttyper, Burkitts lymfom og nasofaryngeal
karcinom.
Dokumentationen i forbindelse med DNA-hybridiseringsundersøgelser påviser forekomsten af EBV-genomet i biopsiprøver fra
patienter med disse karcinomer.
Burkitts lymfom observeres primært i Sub-sahara Afrika, især hos afrikanske børn og i Ny Guinea. Malariainfektioner diagnosticeres
normalt hos patienter med Burkitts lymfom og anslås til at være en medvirkende faktor.
Nasofaryngeal karcinom observeres i Asien, primært i det sydlige Kina, og den genetiske eller miljømæssige indflydelse kan være en
medvirkende faktor.
B-cellelymfomer, som minder om det afrikanske Burkitts lymfom, er for nylig blevet registreret hos patienter med AIDS. Det anslås, at
AIDS-patienter kan være præ-disponerede for EBV-infektion/genaktivering på grund af deres generelt svækkede immunforsvar.
EBV-infektion resulterer i produktion af antistoffer mod fire særskilte antigenetiske komplekser. Disse omfatter: EBNA (EBV Induced
Nuclear Antigen), EA (EBV Induced Early Antigen), VCA (Viral Capsid Antigen) og MA (EBV Induced Membrane Antigen). EAkomplekset er opdelt i to komponenter, som omfatter EA-D (spredt komponent) og EA-R (begrænset komponent).
Infektionen af målcellerne medfører to former for virale cyklusser: 1) latente, ikke-produktive og 2) produktive, replikative infektioner.
I begge cyklusser viser de tidligste antigener sig som membranantigen i lymfocytterne, dvs. som et antigen på celleoverfladen, som
genkendes af T-celler. Der findes velunderbygget dokumentation for, at de fleste personer, som udsættes for EBV, udvikler en
heterofil antistofreaktion. Forekomsten af EBNA-1 følger efter eller sker parallelt med påvisningen af membranantigen 12 – 24 timer
efter infektionen. EB-NA-1 findes som ikke-strukturelle, intranukleare antigen(er) i alle EBV-transformerede cellelinjer i tumorer hos
patienter med Burkitts og nasofaryngeal karcinom.
I den fulde produktive, replikative cyklus følger syntesen af antigenet efter forekomsten af EB-NA-1. Det virale capsid antigenkompleks (VCA) viser sig sent i den replikative cyklus.
Ud fra reaktiviteten hos sera fra forskellige patientgrupper er det for nylig blevet konstateret, at EB-NA-1 sandsynligvis ikke består af
en enkelt antigenetisk del, men er et antigenkompleks, der består af flere komponenter. Den overordnede komponent EBNA-1 er
blevet renset og udskilt i sin helhed.
Antistofniveauerne for EB-NA-1 IgG er diagnostiske i bestemmelsen af akutte og rekonvalescente stadier i IM. IgG-antistoffer mod
EB-NA-1 findes sjældent ved akut IM og udvikles under rekonvalescensen. De stiger til en fast niveau i tre måneder til et år og varer
normalt hele livet.
3 - PROCEDURENS PRINCIP
Bio-Rads ELISA-analyse (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) er baseret på de biologiske materialers evne (dvs. antigener) til
at fæstne sig til plasticoverflader som f.eks. polystyren (fast fase). Platelia® EB-NA-1 IgG-sættet benytter ELISA-teknologien, hvor et
renset, rekombinant EB-NA-1-antigen er bundet til brøndene på en mikroplade. Når antigener, der er bundet til den faste fase,
kommer i kontakt med en patients serum, vil det antistof, der er specifikt for antigenet, binde sig til antigenet på den faste fase (hvis
det er til stede) og danne antigen-antistof-komplekser. Overskydende antistof fjernes ved afvaskning.
Derefter tilføjes anti-humant IgG fra ged, som er konjugeret med peroxidase fra peberrod, som derefter binder sig til antistof-antigenkomplekserne. Det overskydende konjugat fjernes ved afvaskning, og derefter tilsættes substratet tetramethylbenzidin (TMB). Hvis
der findes specifikt antistof til antigenet i patientens serum, dannes en blå farvning. Når den enzymatiske reaktion stoppes med 1N
H2SO4, bliver brøndenes indhold gult. Farven, der er proportional med koncentrationen af antistof i serummet, kan aflæses på et
egnet spektrofotometer eller en ELISA-mikropladelæser.
Sensitiviteten, specificiteten og reproducerbarheden for de enzymforbundne, immunsorbente analyser kan sammenlignes med andre
serologiske tests til antistof, f.eks. immunfluorescens, komplementfiksering, hæmagglutination og radioimmunanalyser.
4 - SÆTTETS INDHOLD
Alle reagenser anvendes udelukkende til in vitro-diagnosticering.
Etiket
R1
R2
R3
R4a
R4b
R5
R6
R7
R9
R10
Reagenstype
12 strimler (à 8 brønde), som er dækket af rekombinant Epstein-Barr
Nuclear Antigen-1 (EB-NA-1), og opbevaret i en foliepose med tørremiddel/fugtighedsindikator.
Koncentreret vaskeopløsning (20 x):
Tris-buffer (pH 7,2 ± 0,2) med 1% Tween® 20.
Konserveringsmidler: Proclin® 300 (0,1%).
Ikke-reaktiv kontrolprøve (human) til anti-EB-NA-1 IgG-antistoffer.
Negativ for HBs Ag og HIV-1-, HIV-2- og HCV-antistoffer.
Konserveringsmidler: Natriumazid (< 0,1%) og pen/strep (0,01%)
Positiv kontrolprøve I (human) til anti-EB-NA-1 IgG-antistoffer.
Positiv kontrolprøve II (human) til anti-EB-NA-1 IgG-antistoffer.
Kalibrator (human) til anti-EB-NA-1 IgG-antistoffer med
specifik faktor for sættet, som er trykt på æskens ydre etiket.
Konjugat: Antistoffer (ged) til humant IgG, som er koblet til
peroxidase fra peberrod.
Konserveringsmidler: Proclin® 300 (0,1%) og gentamycin
Fortynder I: Brugsklar buffer (pH 7,5 ± 0,2).
Konserveringsmidler: Proclin® 300 (0,1%).
Kromogen/substratopløsning (brugsklar):
Tetramethylbenzidin (TMB).
Reagensen skal forblive lukket, når den ikke er i brug, ellers kan der danne sig et præcipitat i reaktionsbrøndene.
Stopopløsning (brugsklar): Svovlsyre 1N:
Analyseark
Præsentation
1
1 x 60 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 0,4 ml
1 x 16 ml
1 x 30 ml
1 x 15 ml
1 x 15 ml
1
5 - FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER
Forholdsregler
Resultaternes pålidelighed afhænger af en korrekt implementering af følgende regler for god laboratoriepraksis:
• Undgå at anvende forældede reagenser.
• Bland ikke reagenser fra forskellige partier i samme testforløb.
BEMÆRK: Det er muligt at bruge andre partier end dem i dette sæt under forudsætning af, at det samme parti bruges inden for hele
testforløbet: Vaskeopløsning (R2), kromogen/substratopløsning (R9) og stopopløsning (R10).
Disse reagenser kan bruges sammen med Platelia® EBV-VCA IgG, Platelia® EBV-EA-D IgG og Platelia® EBV-VCA IgM fra vores
katalog. Fortynder I (R7) kan anvendes sammen med Platelia® EBV-EA-D IgG og Platelia® EB-VCA IgG. Kontakt vores tekniske
serviceafdeling for detaljerede oplysninger.
• Vent 30 minutter før brug, så reagenserne kan stabilisere sig ved stuetemperatur.
• Rekonstituér reagenserne forsigtigt for at undgå kontamination.
• Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan påvirke
konjugatets enzymaktivitet.
• Benyt engangsmateriale eller, hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er vasket og skyllet grundigt med demineraliseret vand.
• Mikropladen må ikke blive tør fra afvaskningen til fordelingen af reagensen.
• Enzymreaktionen er meget følsom over for metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige
konjugat- eller substratopløsninger.
• Kromogen/substratopløsningen skal være farveløs. Dannelsen af farvning angiver, at reagensen ikke kan anvendes og skal
udskiftes. Brug en ny pipettespids til hver prøve.
• Grundig afvaskning af mikropladen er et afgørende trin i proceduren: Overhold det anbefalede antal afvaskninger, og kontrollér, at
alle brønde bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Forkert afvaskning kan medføre unøjagtige resultater.
• Brug aldrig den samme beholder til at fordele konjugat- og udviklingsopløsning.
• Kontrollér, at pipetterne og andet udstyr er i orden og fungerer korrekt.
• Analyseproceduren må ikke ændres.
Sundheds- og sikkerhedsmæssige forholdsregler
Alle reagenser i sættet er beregnet til in vitro-diagnosticering.
• Brug engangshandsker, når du håndterer reagenser.
• Undgå at pipettere med munden.
• Humant kildemateriale, der er brugt til klargøring af reagenser, er blevet testet og fundet ikke-reaktivt for hepatitis Boverfladeantigen (HBs Ag), antistoffer mod hepatitis C (HCV) og antistoffer mod HIV 1- og HIV 2-vira. Eftersom ingen metode kan
give fuld garanti for fravær af smitsomme stoffer, skal du håndtere reagenser af human oprindelse og patientprøverne som potentielt
smittefarlige.
• Betragt alt materiale, der har været i direkte kontakt med prøver og reagenser af human oprindelse, samt vaskeopløsninger som
smittefarligt materiale.
• Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøvemateriale.
• Hvis du spilder materiale, skal du rense efter med et blegemiddel i en opløsning på 10 %. Hvis den kontaminerende væske er en
syre, skal det spildte materiale først neutraliseres med natriumbikarbonat, derefter rengøres med blegemiddel og tørres op med
sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal bortskaffes og placeres i en beholder til kontamineret affald.
• Prøver, reagenser af human oprindelse såvel som kontamineret materiale og produkter skal bortskaffes efter dekontamineringen:
- enten ved nedsænkning i et blegemiddel med en endelig koncentration på 5 % natriumhypoklorid i 30 minutter,
- eller ved autoklavering ved 121°C i mindst 2 timer.
Autoklavering i mindst én time ved 121°C er den bedste metode til at inaktivere HIV-vira og HB-virus.
ADVARSEL: UNDGÅ AT PLACERE OPLØSNINGER, DER INDEHOLDER NATRIUMHYPOKLORID, I AUTOKLAVEN.
• Kemikalier skal håndteres og bortskaffes ifølge god laboratoriepraksis.
• Undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med substratbufferen, kromogenet og stopopløsningen (fare for forgiftning, irritation
eller forbrændinger).
• Nogle reagenser indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid kan reagere med laboratoriets rørføring og dermed
danne kobber- og blyazider.
Disse azider er eksplosive. Undgå dannelse af azider ved at skylle rørene med store mængder vand, hvis opløsninger med
azidindhold hældes i afløbet efter inaktivering.
Sikkerhedsdatablad udleveres efter anmodning.
6 - KRÆVET MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER
• Vortex-mixer.
• Mikropladelæser med filtre på 450 nm (*).
• Beholder til farligt biologisk affald.
• Natriumhypoklorid (blegemiddel) og natriumbikarbonat.
• Destilleret eller demineraliseret vand.
• Målecylindre.
• Engangslatexhandsker.
• Beskyttelsesbriller.
• Sugende papir.
• Automatiske eller halvautomatiske, justérbare eller forudindstillede pipetter eller multipipetter til måling og fordeling af 10, 100 og
1000 µl.
• Manuel, halvautomatisk eller automatisk mikropladevasker (*).
• Engangsrør.
(*) Kontakt os, hvis du vil have detaljerede oplysninger om det udstyr, der anbefales af vores tekniske afdeling.
7 - REKONSTITUERING OG OPBEVARING AF REAGENSER
Sættet skal opbevares ved +2 – 8°C indtil udløbsdatoen på pakken (undtagen ved specifikke instruktioner). Lad reagenserne
stabilisere sig ved stuetemperatur (+18 -30°C), før de anvendes. Placer straks alle reagenser i køleskabet igen, efter brug.
1) Brugsklare reagenser
• Reagens 1 (R1): mikroplade
Hver bakke indeholder 12 strimler og er pakket ind i en forseglet foliepose. Åbn posen med en saks eller skalpel 0,5 – 1 cm over
linjen. Læg straks de ubrugte teststrimler tilbage i posen. Forsegl posen omhyggeligt, og placer den igen ved +2 – 8°C. Derefter er
strimlerne holdbare i en måned.
• Reagens 3 (R3): Ikke-reaktiv kontrolprøve
• Reagens 4a (R4a): Positiv kontrolprøve I
• Reagens 4b (R4b): Positiv kontrolprøve II
• Reagens 5 (R5): Kalibrator
• Reagens 6 (R6): Konjugat
• Reagens 7 (R7): Fortynder I:
• Reagens (R9): Kromogen/substratopløsning
• Reagens 10 (R10): Stopopløsning
2) Reagenser der skal rekonstitueres
• Reagens 2 (R2): Koncentreret vaskeopløsning 20 x
Forbered en brugsklar opløsning ved at fortynde 60 ml vaskeopløsning med en koncentration på 20 X til 1,2 l med destilleret og/eller
demineraliseret vand. Bland grundigt. Opbevar ved +2 – 8°C i 5 dage efter fortyndingen.
8 - PRØVEMATERIALE
Tag en blodprøve i overensstemmelse med gældende praksis. Testen udføres med ufortyndede prøver. Adskil serummet fra
klumpen eller de koagulerede, røde blodlegemer, så snart det er muligt, for at undgå eventuel hæmolyse. Udbredt hæmolyse kan
påvirke testresultatet. Prøver med aggregater skal renses ved centrifugering forud for testen. Opslæmmede fibrinpartikler eller
aggregater kan give fejlagtigt positive resultater.
Prøvematerialet kan opbevares ved +2 – 8°C, hvis screeningen udføres inden for 5 dage, eller det kan dybfryses ved -20°C i flere
måneder. Undgå gentagen nedfrysning/optøning. Hvis prøvematerialet skal transporteres, skal det emballeres ifølge de gældende
regler for transport af ætiologiske stoffer.
UNDGÅ AT ANVENDE KONTAMINERET, HYPERLIPÆMISK, IKTERISK HYPERHÆMOLYSERET ELLER VARMEINAKTIVERET
SERUM.
9 - ANALYSEPROCEDURE
Følg den angivne procedure nøje.
Brug kalibratoren og kontrolprøverne for hver serie af bestemmelser til at validere testresultaterne.
Følg nedenstående gode laboratoriepraksis:
1. Fastlæg prøvefordelingen og identifikationsoversigten omhyggeligt.
2. Forbered den fortyndede vaskeopløsning (R2) (se afsnit 7).
3. Tag transportbakken og strimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen.
Placer det ønskede antal antigen-dækkede strimler i en mikropladeramme. Afsæt 1 brønd til ren reagens, 2 brønde til kalibratoren og
1 brønd til hver af de enkelte kontrolprøver: negativ, positiv I og positiv II.
A
B
C
D
E
F
G
H
B1
R3
R4a
R4b
R5
R5
R5
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
4. Alle prøver, kontrolprøver og kalibratorer skal blandes i Vortex-mixeren før brug.
Fortynd testprøverne, kalibratoren, de negative og positive kontrolprøver i forholdet 1:21 (f.eks. 10 µl + 200 µl) ved hjælp af
prøvefortynder I (R7) i fortyndingsrørene eller på fortyndingspladen.
5. Pipettér 100 µl af hver fortyndet kalibrator, kontrolprøve eller patientprøve i hver brønd. Pipettér 100 µl prøvefortynder I (R7) i den
første brønd til ren reagens.
6. Inkubér mikropladen i 20 ± 2 minutter ved stuetemperatur (21 – 25°C).
7. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (som indeholder natriumhypoklorid). Tilsæt straks mindst
300 µl vaskeopløsning i hver brønd. Sug indholdet op igen. Gentag denne procedure mindst 4 gange (dvs. alt i alt mindst 5
afvaskninger). Hvis det er nødvendigt, kan du tørre pladen ved at lægge den på hovedet på sugende papir.
Hvis der anvendes en automatisk afvasker, skal du følge samme procedure.
8. Fordel 100 µl af det brugsklare konjugat (R6) i alle brønde.
9. Inkubér i 20 ± 2 minutter ved stuetemperatur (21 – 25°C).
10. Tøm alle brønde ved at suge indholdet op, og vask dem 5 gange som beskrevet ovenfor.
11. Fordel hurtigt 100 µl kromogen/substratopløsning (R9) i hver brønd.
12. Lad reaktionen foregå i mørke i 10 ± 2 minutter ved stuetemperatur (21 – 25°C). Undgå at bruge selvklæbende film under
inkubationen. Kromogen/substratopløsningen bliver blå i brønde, der indeholder IgG-antistoffer, som kan konstateres.
13. Tilsæt 100 µl stopopløsning til hver brønd. Bland ved at banke let på pladen. Tilsætningen af stopopløsning resulterer i en
farveændring fra blå til gul.
14. Vent i mindst 5 minutter og aflæs reaktionen. Tør undersiden af pladen omhyggeligt af. Nulstil læseren ved en bølgelængde på
450 nm på brønden med ren reagens, og mål den optiske tæthed for hver brønd. Pladen skal aflæses inden for 30 minutter efter
tilsætning af stopopløsningen (strimlerne skal altid holdes væk fra lyset før aflæsningen).
15. Kontrollér, at alle resultater stemmer overens med hensyn til aflæsningen, pladen, prøvefordelingen og identifikationsoversigten.
10 - BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE
1) Beregn den gennemsnitlige absorbans
1. Den gennemsnitlige optiske tæthed (OD) for cut-off-kalibratoren – Beregn den gennemsnitlige optiske tæthed for cut-offkalibratoren ud fra de tre bestemmelser af kalibratoren (R5). Hvis én af de tre kalibratorers værdier afviger med mere end 15 % fra
gennemsnittet, skal du se bort fra den pågældende værdi og beregne gennemsnittet ud fra de to resterende værdier.
2. Korrektionsfaktor – Der bestemmes en korrektionsfaktor for hvert parti af testsættene for at tage højde for de løbende ændringer i
analyseaktiviteten på grund af stuetemperaturen og planlægningen. Korrektionsfaktoren er trykt på kalibratorflasken.
3. Cut-off-kalibratorværdi – Cut-off-kalibratorværdien for hver analyse bestemmes ved at gange korrektionsfaktoren med den
gennemsnitlige optiske tæthed for cut-off-kalibratoren, som blev bestemt i trin 1.
4. ISR-værdi – Beregn en ISR (Immune Status Ratio)-værdi for hver prøve ved at dividere prøvens OD-værdi med cut-offkalibratorværdien, som blev bestemt i trin 3.
Eksempel:
OD'er for kalibratoren
= 0,380, 0,400, 0,420
Gennemsnitlig OD for kalibratoren
= 0,400
Korrektionsfaktor
= 0,5
Cut-off-kalibratorværdi
= 0,5 x 0,400 = 0,200
OD for patientsera
= 0,600
ISR-værdi
= 0,600/0,200 = 3,00
5. Den maksimale linearitet for analysen er en ISR-værdi på 5,40. Derfor skal en ISR-værdi på > 5,40 registreres som større end
5,40.
2) Validering af analyse
1. Ren reagens (ved aflæsning i forhold til ren luft) skal være < 0,150 ved 450 nm: OD RB < 0,150
2. Negativ kontrolprøve R3 skal være = 0,250 ved 450 nm (ved aflæsning i forhold til ren reagens): OD R3 = 0,250
3. Hver kalibrator R5 skal være =?0,250 ved 450 nm (ved aflæsning i forhold til ren reagens): OD R5 = ?
0,250
4. Positiv kontrolprøve R4b skal være =?0,500 ved 450 nm (ved aflæsning i forhold til ren reagens): OD R4b =?0,500
5. ISR (Immune Status Ratio)-værdierne for de negative, positive I og positive II kontrolprøver (R3, R4a, R4b) skal være inden for
deres respektive intervaller, som er trykt på flaskerne.
Hvis disse kriterier ikke ligger inden for deres respektive intervaller, betragtes testen som ugyldig og skal gentages.
3) Fortolkning af resultaterne
Patientens ISR-værdier skal fortolkes på følgende måde:
1.
2.
3.
4.
5.
ISR-værdi
Resultater
= 0,90
0,91 – 1,09
=?
1,10
Negativt
Tvivlsomt
Positivt
Fortolkning
Intet betydeligt niveau for registrerbart EB-NA-1 IgG-antistof.
Prøverne skal testes igen.
Betydeligt niveau for registrerbart EB-NA-1 IgG-antistof.
Følgende metode anbefales til rapportering af de opnåede resultater: "Følgende resultater blev opnået med Platelia® EB-NA-1
IgG-testen. Værdier, der opnås med forskellige metoder, kan ikke bruges samtidigt eller på skift. Det rapporterede IgG-niveau
kan ikke forbindes med en endelig titer".
Der anvendes fire særskilte EBV-antistoffer til at give et omfattende billede af EBV-infektionen: EBV-VCA IgM, EBV-VCA IgG,
EBV-EA IgG og EB-NA IgG. Nøjagtig fortolkning af EBV-infektion er baseret på resultaterne fra alle disse antistoffer og bør
normalt ikke bero på resultatet af en enkelt test i forbindelse med diagnosticering.
Prøver, der forbliver tvivlsomme efter gentagen test, skal testes igen med en anden metode, f.eks. immunfluorescensanalyse
(IFA). Hvis resultaterne forbliver tvivlsomme ved yderligere test, skal der tages en ny prøve.
Specifikationerne for dette produkts ydeevne er oprettet ved hjælp af en enkelt kalibrator. Hvis der ønskes en lineær
dosisreaktionskurve med denne analyse, skal kunden benytte mindst to supplerende kalibratorer.
Hvis du vil evaluere parvise sera med hensyn til betydelige ændringer i antistofniveauet, skal begge prøver dobbelttestes i den
samme analyse. Den gennemsnitlige ISR-værdi af begge tests (akut og rekonvalescent) skal være større end 1,00 for at
muliggøre en evaluering af de parvise sera med hensyn til betydelig stigning i antistofniveauet.
4) Forventede værdier
Akut fase
EBV-VCA IgG- og EBV-VCA IgM-antistoffer forekommer normalt.
EB-NA-1 IgG-antistoffer er normalt fraværende eller på et meget lavt niveau.
Overgangsfase
EBV-VCA IgG-antistoffer bevarer niveauet, mens EBV-VCA IgM-antistofferne normalt aftager. Mængden af EB-NA-1 IgG-antistoffer
begynder at stige.
Rekonvalescent fase
Forekomsten af EBV-VCA IgM bliver negativ eller falder til et meget lavt niveau. EBV-VCA IgG- og EB-NA-1 IgG-antistoffer bevares
normalt hele livet. I USA serokonverterer omtrent 50 % af befolkningen før 5-års alderen. Der optræder endnu en bølge af
serokonversioner midt i livets andet årti. Blandt voksne viser 90 – 95 % af de fleste befolkningsgrupper forekomst af EB-NA-1antistoffer.
5) Udbredelse
En gruppe på 204 sera fra en sund befolkningsgruppe i det nordøstlige USA blev testet med Platelia® EB-NA-1 IgG-analysen.
Seraene blev udvalgt tilfældigt i forhold til køn, alder og race. Fordelingen af ISR-værdierne fra denne undersøgelse er vist i
diagrammet nedenfor. I denne undersøgelse var 86,4 % af befolkningen positive ifølge analysen.
Fordelingen af ISR-værdier i en normal befolkning (N = 204)
6) Begrænsninger for brug
1. Hvis de procedurer og metoder, der er angivet på sættets indlægsseddel ikke følges, kan der opstå tvivlsomme resultater.
.Reaktioner, der ikke kan reproduceres, skyldes ofte:
• Utilstrækkelig afvaskning af mikroplader
• Utilstrækkelig planlægning for udførelsen af inkubationsproceduren
• Kontamination af negative prøver med serum eller plasma med en høj antistoftiter
• Kontamination af udviklingsopløsningen med iltningsmiddel (blegemiddel, metalioner o.lign.)
• Kontamination af stopopløsningen.
.Kontaminerede, ikteriske, lipæmiske, hæmolyserede eller varmeinaktiverede sera kan fremkalde fejlagtige resultater og skal
undgås.
.Specifikationerne for ydeevnen er ikke etableret for andre matrixer end serum.
2. Lægen bør fortolke testens resultater i lyset af andre kliniske fund og diagnotiske procedurer.
.Dette sæt er beregnet til måling af IgG-antistof i patientprøver.
Positive resultater hos nyfødte børn skal fortolkes med forsigtighed, eftersom moderens IgG overføres passivt til fosteret under
graviditeten. IgM-analyser er generelt mere nyttige indikatorer for infektion hos børn under 6 måneder. De værdier, der opnås med
denne analyse, er kun beregnet som en hjælp til diagnosticeringen. Den enkelte læge skal fortolke resultaterne i lyset af patientens
historik, fysiske undersøgelsesresultater og andre diagnostiske procedurer.
Specifikationerne for ydeevnen er ikke etableret for patienter med nasofaryngeal karcinom, Burkitts lymfom, andre EBV-relaterede
lymfadenopatier og EBV-relaterede sygdomme udover EBV-relateret mononukleose. Resultaterne for Platelia® EB-NA-1 IgG, som
er opnået ved hjælp af serum fra patienter med svækket immunsystem, skal fortolkes med forsigtighed. Specifikationerne for denne
analyses ydeevne er ikke etableret for pædiatrisk prøvemateriale.
.Patienter med kronisk aktiv Epstein-Barr-virusinfektion kan muligvis ikke producere en antistofreaktion på EB-NA-1.
.Der kan opstå krydsreaktion mellem analyser af prøver, der indeholder anti-E. coli-antistof.
11 - YDEEVNE
1 - Relativ sensitivitet og specificitet ud fra beskrivelse af serum
Der blev testet 357 sera. Seraene fra undersøgelsen blev karakteriseret på et tidligere tidspunkt ved hjælp af ELISA-analyser, der er
i handlen Sensitiviteten, specificiteten og overensstemmelsen for analysen blev bestemt ud fra denne beskrivelse. Resultaterne er
vist i tabellen nedenfor.
Anden EIA-test
Resultat
Positivt
Tvivlsomt
Negativt
I alt
Positivt
270
0
0
270
Tvivlsomt
5
0
1
6
Negativt
6
1
74
81
I alt
281
1
75
357
Resultaterne giver følgende beregninger (tvivlsomme prøver er udelukket):
Resultater
74/74
270/276
344/350
Specificitet
Sensitivitet
Generel overensstemmelse
100 %
97,8 %
98,3 %
2 - Præcision
Platelia® EB-NA-1 IgG-testen blev evalueret for præcision ved at teste tre sera dobbelt 20 gange på 3 forskellige laboratorier.
Resultaterne er vist i tabellen nedenfor.
n
120
120
120
Serum
Negativt
Lavt positivt
Positivt
X
0,02
1,41
5,04
SD
0,02
0,16
0,37
CV %
138
11,5
7,3
X = Gennemsnitlig ISR-værdi
SD = Standardafvigelse
CV = Variationskoefficient
3 - Krydsreaktivitet
Følgende 5 serumprøver blev analyseret og fundet negative med Platelia® EB-NA-1 IgG-testen.
HSV 1 IgG
HSV 2 IgG
CMV IgG
VZV IgG
2,43 +
0,32 3,67 +
0,3 6,18 +
0,6 0,08 0,86 0,39 5,98 +
1,69 +
0,18 1,11 +
0,18 0,18 -
2,28 +
3,17 +
2,45 +
3,21 +
2,14 +
1
2
3
4
5
12 - LITTERATURLISTE
Se den engelsk version.
Platelia®
EB-NA-1 IgG
0,67 0,36 0,73 0,29 0,34 -
- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic
in vitro)
- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)
- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico
in vitro)
- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)
- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
IVD
- For in vitro diagnostic use
- Pour diagnostic in vitro
- Para diagnóstico in vitro
- In vitro-Diagnostikum
- Per uso diagnostico in vitro
- Para uso em diagnóstico in vitro
- In vitro diagnostik
- In vitro diagnose
- Manufacturer
- Fabricant
- Fabricante
- Hersteller
- Produttore
- Fabricante
- Tillverkad av
- Fremstillet af
LOT
REF
EC REP
- Catalogue number
- Référence catalogue
- Número de catálogo
- Bestellnummer
- Numero di catalogo
- Número de catálogo
- Katalognummer
- Katalognummer
- Authorised Representative
- Représentant agréé
- Representante autorizado
- Bevollmächtigter
- Distributore autorizzato
- Representante Autorizado
- Auktoriserad representant
- Autoriseret repræsentant
- Batch code
- Code du lot
- Código de lote
- Chargen-Bezeichnung
- Codice del lotto
- Código do lote
- Batch nr.
- Batchkoden
- Expiry date YYYY/MM/DD
- Date de peremption AAAA/MM/JJ
- Estable hasta AAAA/MM/DD
- Verwendbar bis JJJJ/MM/TT
- Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG
- Data de expiração AAAA/MM/DD
- Utgångsdatum År/Månad/Dag
- Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD
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- Limites de températures de stockage
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The other languages which are required in conformity to the European
Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent.
Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles
auprès de votre représentant Bio-Rad local.
Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva
Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.
Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD
Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad
Niederlassung.
Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee
possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.
As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva
Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima
de si.
Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din
lokala Bio-Rad-representant.
De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved
henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.
TRINITY BIOTECH, Jamestown - NY 14702-1059 - USA
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DISTR.
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01/2005