D.Daffonchio
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D.Daffonchio
- GRIFA - Dottorato in Chimica, Biochimica ed Ecologia dei Fitofarmaci - Marie Curie Training Site - PEACE - Università Politecnica delle Marche - Facoltà di Agraria - Università Cattolica del Sacro Cuore - Formazione Permanente - SCUOLA ESTIVA - FITOFARMACI E AMBIENTE 2003 Valutazione del rischio delle piante GM: effetti sulla biodiversità microbica e valutazione del trasferimento genico orizzontale ai microrganismi Daniele Daffonchio DISTAM, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche via Celoria 2, 20133, Milano e-mail: [email protected] Nel 1986 sono stati effettuati i primi trial sperimentali in ambienti aperti con piante modificate geneticamente (GMP) Da allora sono stati condotti più di 15000 esperimenti in campo con diverse GMP tra cui: •GMP resistenti ad erbicidi •GMP autoprotette da insetti parassiti VANTAGGI •GMP resistenti a batteri patogeni •GMP resistenti a virus •maggiori rese •meno micotossine •miglior prodotto •meno antiparassitari Quale è l’impatto delle GMP sull’uomo e sull’ambiente? RISCHI •allergie •Resistenza insetti •impatto biodiversità •HGT •Tipologie di GMP resistenti ad erbicidi ed autoprotette •Le GMP influenzano la struttura e la funzionalità delle comunità microbiche nell’ambiente? •I transgeni possono essere trasferiti dalle GMP ai microrganismi nei sistemi ambientali complessi? QUALI SONO I RISCHI DI IMPATTO AMBIENTALE? • Case studies: mais, colza, erba medica, patata • Considerazioni ambientali • Metodi di studio HGT • Case studies: barbabietola nptII, tabacco transplastomico aadA • Considerazioni ambientali CONSIDERAZIONI FINALI GMP RESISTENTI AD ERBICIDI ED AUTOPROTETTE COSTRUZIONE E TIPI DI GMP DNA donatore: Costrutto transgenico in E. coli -Transgene; -Promotore eucariota; -Terminatore eucariota; -Enhancers, ecc.; -Marcatori di selezione; -Sistemi di autoexcisione markers Tessuto vegetale ricevente Trasformazione mediante: •Agrobacterium tumefaciens •Particle gun GMP “nucleari” Trasformazione mediante: •Particle gun •Iniezioni con femtosiringhe GMP “transplastomiche” SOIA RESISTENTE AL GLYPHOSATE Considerata la possibilità di HGT di geni di resistenza ad antibiotici, la tendenza è di eliminarli dai costrutti. Ad esempio nel caso della soia resistente al glyphosate prodotta dalla Monsanto il gene nptII per la resistenza alla kanamicina non è presente nel costrutto finale. nptII Plasmide PV-GMGT04 Transgene nella linea 40-3-2 di soia DNA soia MAIS Bt AUTOPROTETTO CONTRO Ostrinia nubilalis B. thuringiensis subsp. thuringiensis berliner 1715 Il mais Bt è autoprotetto da Ostrinia nubilalis grazie al clonaggio nel suo genoma del gene cry1Ab del batterio Bacillus thuringiensis Spora Cristallo insetticida Membrana Recettore B. thuringiensis forma un cristallo parasporale proteico la tossina Cry tossica per molte specie di insetti. L’attività insetticida è principalmente dovuta al cristallo parasporale proteico che si accumula fino al 25% del peso secco della cellula. MAIS Bt AUTOPROTETTO CONTRO Ostrinia nubilalis Rilevamento mediante PCR dei transgeni del mais Bt 176 autoprotetto da Ostrinia nubilalis MAIS Bt AUTOPROTETTO CONTRO Ostrinia nubilalis Ragione bassa espressione: instabilità mRNA a causa di: •molti poliA e segnali di taglio mRNA. •segnali prematuri di terminazione di trascrizione. •Strutture secondarie •sequenze di splicing •i geni cry ricchi in A/T •differenze di ‘codon usage’ Modifica della sequenza per mutagenesi o sintesi chimica ha aumentato di circa 100 volte i livelli di espressione (250-2000 ng/mg proteine). Ulteriori miglioramenti attraverso clonaggio dei geni cry nei plastidi senza significative modifiche della sequenza (espressione fino a 50000 ng/mg di proteina). + bla (amp) PATATA T4 La patata T4 rilascia nella rizosfera il lisozima del fago T4 e quindi migliora il controllo di batteri fitopatogeni come Erwinia carotovora Promotore Cassetta NptII (KanR) Peptide segnale αamilasi di orzo: 35S CaMV Terminatore Lisozima T4 Nos 3’ secrezione apoplasto E’ stato messo a punto un metodo per misurare il tasso di morte dei batteri esposti alle radici della patata T4 Il saggio si basa sulla colorazione differenziale tra cellule vive e morte PATATA T4 Il numero di cellule batteriche morte sulla superficie radicale della patata T4 è molto maggiore di quello sulla Patata wild type Tale differenza si manifesta in tutte le fasi della crescita della pianta INDUZIONE DI RESISTENZE? INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING Molti microrganismi attivano alcune vie metaboliche inclusi alcuni meccanismi di patogenesi solo quando sono in concentrazione elevata nel sistema e superano un certo numero di cellule per unità di volume o superficie Questo meccanismo denominato “Quorum sensing” è mediato nei batteri gram- da alcune molecole segnale sintetizzate in piccole concentrazioni da ciascuna cellula della popolazione: gli acyl-homoserin lattoni (AHL) N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone AHL Ad es. in Erwinia carotovora pv. carotovora l’espressione delle pectinasi che iniziano il processo di patogenesi è mediato dagli AHL INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING Alcuni microrganismi come molti Bacillus thuringiensis sono in grado di produrre enzimi le AHLlattonasi che inattivano gli AHL permettendo la distruzione dei segnali chimici che mediano la patogenesi Test con Chromobacterium violaceum INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING Ceppi di Erwinia carotovora clonati Biosaggio per misurare l’attività di con un’AHL-lattonasi perdono la degradazione degli AHL in E.coli virulenza rispetto ai ceppi wild type ricombinante clonato con un’AHL-lattonasi INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING Sono state costruite GMP (tabacco e patata) clonate con AHL-lattonasi per essere autoprotette nei confronti di patogeni batterici. L’espressione di aiiA veniva rilevata in tutti i costrutti soprattutto in quelli con il peptide segnale INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING Le GMP (tabacco e patata) clonate con AHL-lattonasi sono molto resistenti ad Erwinia carotovora anche quando inoculata a livelli massicci. Tabacco aiiA iiA Pat ate a Wi ld T ype Wild Type La strategia di inibizione dei meccanismi di “Quorum sensing” dovrebbe stimolare in maniera minore lo sviluppo di resistenti in quanto il patogeno non è eliminato ma solo inibito in una sua attività •Le GMP influenzano la struttura e la funzionalità delle comunità microbiche nell’ambiente? •I transgeni possono essere trasferiti dalle GMP ai microrganismi nei sistemi ambientali complessi? QUALI SONO I RISCHI DI IMPATTO AMBIENTALE? • Case studies: mais, colza, erba medica, patata • Metodi di studio HGT • Case studies: barbabietola nptII, tabacco transplastomico aadA GMP E BIODIVERSITA’ MICRORGANISMI MAIS BT Transgeni nel mais Bt: •Cry1Ab: attività insetticida •Bar: resistenza gluphosinate • blaTEM1: resistenza ampicillina Cry1Ab è espressa nei tessuti verdi fino a 4.000 ng/mg di proteine Koziel et al., 1993 Bio/Technology, 11:194-200 ? Cry1Ab è rilasciata negli essudati radicali e può persistere nel suolo Saxena et al., 1999 Nature, 402:480; Saxena and Stotzky 2000, FEMS Microbiol. Ecol. 33:35-39 Il mais Bt ha un maggiore contenuto di lignina rispetto all’isogenico non Bt Saxena and Stotzky 2001, Am. J. Bot. 88:1704-1706 I residui di mais Bt sono meno degradabili in suolo Stotzky 2003 ESF-AIGM 30 MAIS BT E DIVERSITA’ MICROBICA INSECT GUT PHYTOSPHERE ENSILED CORN MAIZE SILAGE FERMENTED FLOUR RHIZOSPHERE COW RUMEN La diversa composizione dei tessuti e degli essudati può influenzare la struttura della comunità microbica? RIZOSFERA RIZOSFERA MAIS BT •Cariche batteriche •Profili catabolici comunità •Tipizzazione molecolare batteri isolati Suolo NO DIFFERENZE SIGNIFICATIVE Bt Par PC3 = 5.6% •Analisi struttura della comunità microbica totale mediante ARISA PC1 = 42.6% PC2 = 9.4% DIFFERENZE SIGNIFICATIVE La comunità batterica rizosferica del mais Bt è diversa da quella della controparte non transgenica Le differenze sembrano essere in parte imputabili al pattern di essudazione MAIS INSILATO INSILATO MAIS BT •Cariche batteriche •Tipizzazione molecolare LAB isolati NO DIFFERENZE SIGNIFICATIVE •ARISA ed LH-PCR evidenziano comunità batteriche differenti tra insilati preparati con mais Bt e il parentale Bt Par •ARISA fingerprinting •LH-PCR fingerprinting B7 I7 I20 B0 B20 PC3 = 9.0 % I13 B30 B2B7 B13 B20 I13 I30 I20 I7 I2 Iso I0 Bt I30 PC3 (5.3 %) I0 I2 PC2 (3 4.7 %) B0 (47 1 PC . ) 6% B30 B2 PC1 = B13 36.7 % =1 PC2 4. 8 % MAIS INSILATO: LH-PCR DELLA COMUNITA’ BATTERICA 250 2000 275 300 325 350 375 400 425 0d 1000 0 2000 2d LH-PCR della comunità batterica totale e sovrapposizione con i LABisolati Par mais Bt mais Enterobacter sp. 1000 Bacillus megaterium 0 2000 7d Bacillus coagulans Lactobacillus brevis W. confusa or P. acidilactici 1000 W. confusa or P. pentosaceus 0 2000 13 d W. confusa or L. fermentum Enterococcus faecium 1000 0 2000 20 d 1000 0 2000 1000 0 30 d L’LH-PCR mostra la successione dei LAB Seguiti da Enterobacter e Bacillus RUMINE BOVINO RISA DELLE POPOLAZIONI BATTERICHE RUMINALI At0 At1 At2 At2 Bt0 Bt1 Bt2 Ct0 Ct1 Bt2 Ct0 Ct2 Dt0 Dt0 Dt1 Dt2 •Quattro bovine di razza frisona in asciutta alimetate con mais insilato Bt e Parentale non transgenico •Contenuto ruminale analizzato mediante RISA DIFFERENZE TRA LE DIETE DIETE E TRA GLI ANIMALI DIETE Campioni dall’animale che ha subito dislocazione dell’abomaso ANIMALI A B C No differenze tra le diete Bt Iso Differenze tra gli animali •L’analisi statistica dei profili RISA della microflora adesa all’alimento digerito differenzia la microflora batterica nei diversi animali ma non differenzia le diete D POPOLAZIONE BATTERICA IN OGNI ANIMALE Mais Bt Iso L’analisi cluster dei profili RISA della microflora adesa all’alimento digerito in ciascun animale differenzia le popolazioni selezionate dalle due diete In tutti gli ambienti analizzati il mais transgenico Bt seleziona popolazioni batteriche diverse rispetto alla controparte non transgenica Risultati simili sono stati osservati con altre GMP come colza resistemte al glufosinate e erba medica che produce una lignino perossidasi Mn-dipendente fungina Di Giovanni et al., 2000 Microb.Ecol. 37:129-139 Profili DGGE rRNA 16S rizosfera COLZA Profili catabolici isolati rizosfera ERBA MEDICA Rimane comunque da stabilire se queste differenze sono determinate dall’”effetto transgene” piuttosto che dall’”effetto cultivar” I fattori ambientali (cultivar, suolo, stagione, ecc.) influenzano la composizione della comunità batterica rizosferica della patata più del lisozima del fago T4 prodotto dalle varianti transgeniche Heuer et al., 2002 AEM 68:1325-1335 HGT GMP-MICRORGANISMI INTERAZIONI GMP E MICRORGANISMI RILEVANZA HGT •Antibiotico resistenza • Resistenza erbicidi •Modello di studio speciazione e barriere evolutive PRESUNTI HGT INTERDOMINIO •Es. Glutamina sintetasi II di Bradirhizobium japonicum sembra derivare da un eucariota (Carlson e Chelm 1986. Nature 322:568-570) COME SI STUDIA? Il processo più probabile di HGT tra GMP e batteri è la trasformazione naturale HGT tra GMP e batteri dimostrato per i geni nptII (KanR) e aadA (SpeR) MARKER RESCUE TRANSFORMATION (Gebhard and Smalla, 1998; De Vries and Wackernagel, 1998; Nielsen et al., 2000) GMP Trasformazione naturale e ricombinazione omologa La ricombinazione omologa tra un gene selezionabile presente nella GMP e una sequenza ricevente inattiva presente nel microrganismo permette di rilevare l’evento di HGT e stabilirne le frequenze BATTERI NATURALMENTE COMPETENTI •Acinetobacter naturalmente competente • npt II gene • ∆npt II HGT da GMP “nucleari” HGT da GMP “transplastomiche” HGT da GMP “transplastomiche” in residuosfera COSTRUTTO BARBABIETOLA + Oltre ai frammenti attesi possono essere trasferiti altre sequenze di DNA (Gebhard and Smalla, 1998) = TRASFORMANTI COSTRUTTO RICEVENTE (Acinetobacter sp. BD413) CEPPI REPORTER DI Acinetobacter sp. BD413/ADP1 Progetto EU TRANSBAC QLK3-CT-2001-02242 Gene Flow from Transgenic Plants: Evaluation and Biotechnology Φ #$ $ %& #$ $ %& Φ ! !" " # " ! ' ' (( ( ) *+ ) !" # " " LOCALIZZAZIONE HGT IN SITU #$ $ %& TRASFORMANTI? ANALISI IN SITU MARKER RESCUE TRANSFORMATION N N linker aminoacidico DOMINIO ANTIBIOTICO RESISTENZA AadA linker aminoacidico LOCALIZZAZIONE DOMINIO FLUORESCENTE Gfp DOMINIO FLUORESCENTE Gfp C DOMINIO ANTIBIOTICO RESISTENZA AadA C Gage 2002 J.Bacteriol. 184:7042-7046 HGT GMP-MICRORGANISMI L’HGT GMP-MICRORGANISMI PUO’ AVVENIRE MA QUALI SONO I RISCHI REALI? PROBLEMA D’INDAGINE SPERIMENTALE FITNESS E SELEZIONE BIBLIOGRAFIA Dong et al., 2001. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase. Nature 411:813-817 Dong et al., 2000. AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. PNAS 97:3526-3531. Lee et al., 2002. 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Garavaglia, C. Sorlini • A. Abruzzese, G. Sacchi • A.Tamburini, G. Succi • C. Viti, L. Giovannetti • M. Bazzicalupo, E. Biondi DIPROVE, Università di Milano • K. M. Nielsen • P. Simonet, A. Pontiroli • C. Tebbe DEPT. OF FARMACY, Università di Tromso IST. ZOOTECNIA, Università di Milano DIBA, Università di Firenze DBAG, Università di Firenze UMR CNRS 5557, Università di Lione 1 FAL, Braunschweig • EU TRANSBAC QLK3-CT-2001-02242 Gene Flow from Transgenic Plants: Evaluation and Biotechnology • MIUR COFIN 2000 Study of soil microbial community: effects of transgenic plants on soil microflora • MINISTERO DELL’AMBIENTE-CNR Biodiversità e organismi geneticamente modificati