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UNIVERSITÀ CATTOLICA DEL SACRO CUORE
FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA “A. GEMELLI”
ISTITUTO DI NEUROCHIRURGIA
Relazione finale del progetto di ricerca dal titolo:
Espressione della variante III dell’EGFR
nel Glioblastoma multiforme: significato prognostico
ed influenza sulla risposta alla temozolomide.
Proponente del progetto:
Dr. Quintino Giorgio D’Alessandris
Dottorando di Ricerca
Istituto di Neurochirurgia
Università Cattolica del Sacro Cuore
Largo A. Gemelli 8 – 00168 Roma
Telefono: +39 06 30154120
Cellulare: +39 339 1971409
Fax: +39 06 3051343
e-mail: [email protected]
-1-
Centri e Ricercatori coinvolti
Università Cattolica del Sacro Cuore, Facoltà di Medicina e Chirurgia “A. Gemelli”,
Roma
Istituto di Neurochirurgia
- Prof. Giulio Maira
- Prof. Roberto Pallini (coordinatore del gruppo di ricerca)
- Dott. Nicola Montano
- Dott. Quintino Giorgio D’Alessandris
Istituto di Anatomia Patologica
- Prof. Luigi Maria Larocca
- Dott. Maurizio Martini
- Dott.ssa Tonia Cenci
Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Ematologia, Oncologia e Medicina
Molecolare, Roma
- Prof. Ruggero De Maria
- Dott.ssa Lucia Ricci-Vitiani
- Dott.ssa Federica Pelacchi
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Introduzione
Il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR) è un recettore tirosin-kinasico di 170
kDa il cui gene è localizzato sul cromosoma 7p11.2. Si tratta di un recettore
transmembrana con un dominio extracellulare, i cui ligandi sono il fattore di crescita
epiteliale (EGF) ed il transforming growth factor alfa (TGF- ), ed un dominio
intracellulare con attività protein-kinasica. Il legame dell’EGF al suo recettore ne causa la
dimerizzazione, che a sua volta attiva la via di segnalazione che coinvolge la
fosfatidilinositolo-3 kinasi (PI3K), il fosfatidilinositolo trifosfato (PIP3) ed infine attiva
Akt, una tirosinkinasi fondamentale nella sopravvivenza cellulare e nella resistenza
all’apoptosi (van den Bent et al, 2007).
L’amplificazione del gene per l’EGFR è l’alterazione genetica più comune nel
glioblastoma multiforme (GBM) primario, con una frequenza di circa il 40% (Gan et al,
2008). Una percentuale variabile di GBM che overesprimono EGFR (63-75%) presenta
inoltre delle mutazioni del gene stesso, fra le quali la più frequente è la cosiddetta
variante III (EGFRvIII), nella quale vengono deleti gli esoni dal 2 al 7, causando la
perdita di 267 aminoacidi nel dominio extracellulare. Questo recettore mutato, incapace
di legarsi al fattore di crescita, risulta però costitutivamente attivato, più resistente ai
processi di degradazione intracellulari e probabilmente capace di attivare una maggior
numero di vie di segnalazione intracellulari, per l’abilità di formare omodimeri o
eterodimeri non solo con l’EGFR wild-tipe ma anche con altri membri della
superfamiglia ErbB (Gan et al, 2008). Infatti, diversi studi sia in vitro che in vivo hanno
evidenziato una maggiore capacità di invasione, proliferazione e tumorigenesi nelle
cellule EGFRvIII positive (Nikishawa, 1994; Huang, 1997).
Ciò premesso, dagli studi clinici su pazienti affetti da GBM non emerge un dato univoco
sul significato prognostico dell’espressione dell’EGFRvIII nel tumore (Tab. 1). In alcuni
lavori i pazienti affetti da GBM EGFRvIII positivi sembrano avere una prognosi peggiore
(Pelloski et al, 2007); in altri il dato è statisticamente non significativo (Brown et al,
2009); in altri ancora l’espressione di EGFRvIII, in associazione con PTEN, una fosfatasi
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importante nell’antagonizzare PI3K, appare un fattore predittivo positivo per la risposta
ad Erlotinib, un farmaco inibitore tirosin-kinasico (Mellinghoff et al, 2005). Inoltre, dopo
lo studio di Stupp et al del 2005, la terapia adiuvante con temozolomide (TMZ, un
farmaco alchilante) è diventata uno standard di cura nel GBM, ma non è tuttora chiaro se
l’espressione di EGFRvIII sia un fattore predittivo di risposta al farmaco.
Obiettivi e disegno dello Studio
Obiettivo complessivo del progetto è stato analizzare il significato prognostico e
predittivo di risposta alla chemioterapia con TMZ dell’espressione di EGFRvIII nel
GBM. In dettaglio, è stata valutata l’espressione di EGFRvIII in 73 pazienti affetti da
GBM primario, trattati mediante asportazione chirurgica, radioterapia e chemioterapia
concomitante ed adiuvante con TMZ (Stupp et al, 2005) presso l’Istituto di
Neurochirurgia dell’Università Cattolica del Sacro Cuore in Roma. Dei 73 pazienti, 14
sono stati rioperati per recidiva tumorale; in questi casi è stato quantificato il livello di
EGFRvIII nel tumore primario e nella recidiva. Il dato dell’espressione di EGFRvIII è
stato correlato con le altre variabili cliniche e biomolecolari e con la sopravvivenza del
paziente. Inoltre, è stata correlata l’espressione di EGFRvIII con la sensibilità alla
chemioterapia con TMZ, mediante analisi in vitro della sensibilità al farmaco di linee
cellulari staminali di glioblastoma (GBM CSCs) con differente espressione di EGFRvIII.
Materiali e metodi
Arruolamento dei pazienti: Sono stati arruolati 73 pazienti affetti da GBM primario di
nuova diagnosi, operati presso l’Istituto di Neurochirurgia dell’Università Cattolica
del Sacro Cuore - Policlinico Universitario “A. Gemelli” in Roma. Tutti i pazienti
hanno firmato un consenso informato approvato dal Comitato Etico dell’Università
Cattolica del Sacro Cuore prima dell’arruolamento. L’età media dei pazienti alla
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diagnosi era 59,9 anni (range: 20-80, deviazione standard 11,4); 45 erano di sesso
maschile e 28 femminile. L’entità dell’asportazione chirurgica è stata valutata sia
intraoperatoriamente dal chirurgo sia mediante il controllo RMN encefalo con
Gadolinio e.v. ad 1 mese dall’intervento. Tutti i pazienti sono stati trattati dopo
l’intervento con radioterapia sul cavo chirurgico (2 Gy per frazione, una volta al dì, 5
giorni a settimana, dose totale 60 Gy) e TMZ concomitante ed adiuvante (Stupp et al,
2005). Quattordici pazienti (9 di sesso maschile e 5 femminile) sono stati rioperati per
recidiva tumorale dopo un intervallo di tempo di 7-58 mesi dalla diagnosi. Di ogni
singolo paziente sono stati registrati i seguenti dati: età, sesso, sede e dimensioni del
tumore, Karnofsky performance status, classe RPA-RTOG, entità dell’asportazione
chirurgica (totale o parziale), tempo di recidiva, durata del follow-up. La
sopravvivenza globale (overall survival, OS) è stata calcolata come l’intervallo di
tempo trascorso dal primo intervento chirurgico alla morte o alla fine del follow-up.
Analisi dell’espressione dell’EGFRvIII sul tumore primario (Figura 1): Dopo essere
state deparaffinizzate, le sezioni di 10 m di spessore sono state digerite mediante
esposizione per tutta la notte a 55°C in 200 µl di TENS 1x (10 mMTris pH 7.4, 10
mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS) con 100 mg/ml di proteinasi K; l’RNA è stato
quindi estrato con RNeasy mini kit (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore.
Dopo l’estrazione dell’RNA, il cDNA è stato sintetizzato come precedentemente
descritto (Martini et al., 2008). I primer e le condizioni di PCR sono analoghe a quelle
utilizzate da Yoshimoto et al. (2008). L’amplificazione di -actina è stata usata come
controllo interno.
Analisi quantitativa dell’espressione dell’EGFRvIII sul tumore primario e sulla
recidiva: Nei pazienti rioperati per recidiva, è stata eseguita un’analisi quantitativa
dell’espressione dell’EGFRvIII mediante real-time RT-PCR, su campioni di tumore
primario e di recidiva microdissezionati con laser, con la tecnica SYBR green
chemistry. I reagenti sono stati descritti in un precedente lavoro (Martini et al, 2008).
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Le condizioni di reazione sono state 95°C per 5 minuti, seguite da 40 cicli a 95°C per
10 secondi e 60°C per 30 secondi, e da 80 cicli a 55 + 0.5 °C per ciclo per l’analisi
della curva di miscelamento in un iCycler-iQ multicolor Real-Time PCR detection
system (Bio-Rad, Milan, Italy). Ogni saggio è stato eseguito tre volte e i dati sono
stati processati mediante iCycler-iQ optical system software (Bio-Rad). -actina è
stata utilizzata come riferimento per la normalizzazione dei cambiamenti relativi
dell’espressione di mRNA. La sensibilità della metodica testata nel nostro laboratorio
è risultata minore di 10-2.
Analisi della metilazione di MGMT: è stata eseguita sul DNA estratto da sezioni
deparaffinizzate di 10
m di spessore, mediante PCR metilazione-specifica per
MGMT, come descritto in un precedente lavoro (Pallini et al, 2008). In breve, le
sezioni paraffinizzate sono state trattate due volte con xilene, quindi lavate con
etanolo. L’estrazione del DNA è stata effettuata mediante QIAamp tissue kit (Qiagen,
Hilden, Germany) secondo le indicazioni del produttore. Per l’estrazione del DNA
sono state scelte aree contenenti almeno il 70% di cellule patologiche, per
minimizzare la contaminazione da parte delle cellule normali. Il DNA modificato con
bisolfito (100–200 ng) è stato amplificato in una miscela contenente 1X PCR buffer
[20 mM TRIS (pH 8.3), 50 mMKCl, 1.5 mM MgCl2], dNTPs (200 mM ognuno),
primer (20 pM ognuno), e 0.5 U Taq polimerasi platinum (Invitrogen, Milan, Italy) in
un volume finale di of 25 µl. Le condizioni di PCR erano: una denaturazione iniziale a
95°C per 8 min, seguita da 35 cicli a 95°C per 60s, a 60°C per 60s e a 72°C per 60s. I
prodotti per la PCR sono stati sottoposti ad elettroforesi in gel di agarosio al 2.5%,
colorati con brumuro di etidio e visualizzati mediante illuminazione UV. L’analisi
MS-PCR è stata ripetuta due volte per tutti i campioni. DNA normale di linfociti
ipermetilato con SssI metiltransferasi (New England Biolabs, Beverly, MA) e trattato
con bisolfito è stato utilizzato come controllo non metilato e metilato, acqua come
controllo negativo e DNA non trattato come controllo interno di PCR. Come gruppo
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di controllo è stata condotta una PCR metilazione-specifica su DNA granulocitario di
10 volontari sani.
Analisi dell’espressione di Ki67 and PTEN: L’analisi immunoistochimica di PTEN è
stata effettuata su sezioni tissutali di 3 µm di spessore utilizzando l’anticorpo
monoclonale murino anti-umano PTEN (clone 28H6, Novo Castra, Newcastle, UK)
dopo una fase di smascheramento antigenico in forno a microonde per 10 minuti in
tampone citrato (0.01 M; pH 6) a 750 W. Le sezioni sono state quindi incubate in una
soluzione di anticorpo primario alla diluizione di 1:50 per 30 minuti. Il perossido
d’idrogeno, le immunoglobuline sieriche biotinilate e i complessi avidina-biotina sono
stati utilizzati in accordo alle istruzioni del produttore (Dako LSAB; Dakopatts,
Golstrup, Denmark). Come cromogeno si è usata DAB preparata al momento; come
colorante di contrasto è stata impiegata ematossilina. Sono state utilizzate sezioni di
milza come controllo positivo, mentre per il controllo negativo non è stato utilizzato
l’anticorpo
primario.
È
stata
effettuata
una
valutazione
semiquantitativa
dell’espressione di PTEN sulla base dell’intensità della colorazione. L’espressione
immunoistochimica di PTEN è stata considerata positiva quando le cellule tumorali
hanno motrato una forte positività nucleare, analoga a quella del controllo positivo, e
ridotta quando la colorazione nucleare era assente o ridotta rispetto allo stesso
controllo. Con analoga metodica, l’indice di proliferazione dei tumori primitivi è stato
valutato impiegando l’anticorpo monoclonale diretto contro l’antigene Ki-67 (MIB-1,
Dako), che viene espresso esclusivamente nel nucleo delle cellule in fase proliferativa.
Tale indice è stato determinato come la percentuale dei nuclei positivi in rapporto al
numero totale di nuclei in 10 campi microscopici non sovrapposti ad alto
ingrandimento (400x).
Analisi della sensibilità in vitro alla temozolomide: questa analisi è stata eseguita
utilizzando GBM CSCs ottenute da pazienti operati presso l’Istituto di Neurochirurgia
dell’Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma. Le condizioni di coltura e la
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metodica di validazione delle GBM CSCs sono state descritte in un precedente lavoro
(Pallini et al, 2008). In breve, il campione tumorale dissezionato è stato coltivato in
medium privo di siero con l’aggiunta dei fattori di crescita EGF e bFGF, ottenendo
così cluster cellulari (neurosfere) in uno stato indifferenziato. Il potenziale
tumorigenico di queste cellule è stato confermato mediante iniezione sottocutanea o
ortotopica in topi immunodeficienti. Per lo studio, sono state utilizzate linee cellulari
ad un passaggio compreso fra il 5° ed il 10°. Le colture sono state saggiate per
l’espressione di EGFRvIII con metodica PCR, analogamente a quanto descritto in un
precedente paragrafo. Le GBM CSC, dissociate meccanicamente, sono quindi state
trattate con TMZ a dosaggio crescente (125
M, 250
M, e 500
M, Schering-
Plough, Kenilworth, NJ) dopo 24 ore di incubazione a 37° in 5% CO2. La vitalità
cellulare è stata valutata dopo 24, 48, 72, e 96 ore di trattamento utilizzando Cell Titer
Glo luminescent assay (Promega) L’espressione di Bcl-XL in due linee cellulari
provenienti dal medesimo paziente è stata valutata semiquantitativamente con
metodica PCR, utilizzando -actina per normalizzare i risultati.
Analisi statistica: è stata effettuata utilizzando i software STATA 10 (StataCorp LP,
College Station, TX, USA) e GraphPad-Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego,
CA, USA). Le curve di sopravvivenza sono state disegnate secondo il metodo di
Kaplan-Meier e la differenza di sopravvivenza fra gruppi di pazienti è stata condotta
utilizzando il test log-rank. La comparazione statistica di variabili continue è stata
effettuata mediante Mann-Whitney U-test; la comparazione di variabili discrete è stata
eseguita utilizzando la metodica del chi-square, mediante il Fisher’s exact test. È stata
infine condotta un’analisi multivariata per valutare l’effetto dei singoli marker
molecolari sulla sopravvivenza globale, utilizzando il Cox proportional hazards
model, includendo i principali fattori prognostici clinici fra cui età alla diagnosi (≤ 60
versus > 60 anni), KPS (< 70 versus ≥ 70), classe RPA e radicalità chirurgica
(asportazione totale versus parziale), e l’indice proliferativo (Ki67 ≤ 20% versus >
20%). Un valore di p minore di 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Risultati
Obiettivo 1. Valutazione dell’impatto dello status di EGFRvIII sulla prognosi
Abbiamo valutato l’espressione di EGFRvIII nel GBM utilizzando la metodica della RTPCR; ciò rappresenta un elemento di grande importanza ed originalità del nostro lavoro,
in quanto tale metodica ha una sensibilità e specificità nettamente superiori
all’immunoistochimica, come chiaramente dimostrato da Yoshimoto et al (2008).
L’espressione di EGFRvII, nella nostra casistica, emerge come un importante fattore
prognostico positivo nel GBM (p=0,0023, Tab. 2 e Fig. 2A). Come si è già notato (Tab.
1) precedenti lavori hanno attribuito ad EGFRvIII o un ruolo prognostico negativo o
nessun ruolo; dagli studi preclinici è invece noto che EGFRvIII conferisce in vitro ed in
modelli animali un vantaggio proliferativo ed una resistenza alla chemioradioterapia. È
interessante notare tuttavia che nessuno degli studi che indicano una prognosi peggiore
nei pazienti con GBM positivo per EGFRvIII fornisce contestualmente una spiegazione
bio-molecolare del dato. È inoltre interessante notare che nella nostra casistica, a
differenza di molte delle precedenti, tutti i pazienti sono stati trattati con TMZ, in accordo
al protocollo terapeutico di Stupp et al (2005). In un paragrafo successivo studieremo il
significato biologico di questa osservazione.
Il significato prognostico positivo di EGFRvIII non è legato ad un differente indice
proliferativo nelle due coorti di pazienti EGFRvIII positivi e negativi, in quanto
l’espressione di Ki67 è sovrapponibile nei due gruppi (26,6% ± 13,6% e 25,6% ± 12,3%,
rispettivamente; p= 0,75). Analizzando più in dettaglio il significato prognostico positivo
di EGFRvIII, abbiamo evidenziato una migliore prognosi nel sottogruppo EGFRvIII
positivo / Ki67 ≤ 20% (p = 0,0275), nel sottogruppo EGFRvIII positivo / normale status
di PTEN (p = 0,0223), e nel sottogruppo EGFRvIII positivo / promoter MGMT metilato
(p=0,0108). Non sorprende che il sottogruppo di pazienti con GBM EGFRvIII positivo
ed un basso indice proliferativo sia prognosticamente favorito. Anche il dato del
significato positivo dell’associazione fra espressione di EGFRvIII e normale status di
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PTEN appare in linea con le conoscenze di biologia molecolare. PTEN infatti è un
inibitore fisiologico del pathway EGFR-PI3K per la sua capacità di defosforilare PIP3;
agisce pertanto come un gene oncosoppressore, modulando gli effetti dell’attivazione
costitutiva di EGFRvIII. Infine, la metilazione del promoter di MGMT è un noto fattore
prognostico e predittivo positivo nel GBM.
Obiettivo 2. Valutazione degli eventuali fattori clinici che influenzano la prognosi
Un’età minore o uguale a 60 anni, un KPS maggiore o uguale a 70 ed una classe RPA III
o IV emergono nel nostro studio come fattori prognostici positivi statisticamente
significativi (p=0,0069, p=0.0035, p=0,0007, rispettivamente; Tab. 2 e Fig. 3) in accordo
con le casistiche storiche. L’asportazione totale, al contrario, non è associata ad un
aumento statisticamente significativo della sopravvivenza, sebbene esista un trend in tal
senso (Tab. 2). Tale dato va interpretato nell’ambito di un vasto dibattito esistente in
letteratura; infatti, sebbene nella maggior parte delle casistiche si dimostri un ruolo
prognostico positivo dell’asportazione totale, non esistono dati di classe I sull’argomento
(Kuhnt et al, 2011).
Obiettivo 3. Valutazione degli eventuali fattori biomolecolari che influenzano la
prognosi
Del ruolo prognostico positivo dell’espressione di EGFRvIII si è parlato in un precedente
paragrafo. L’ipermetilazione del promoter di MGMT (p=0,0437) ed un indice
proliferativo Ki67 < 20% (p=0,0286) hanno mostrato una ruolo prognostico positivo
(Tab. 2 e Fig. 2B-C). Il primo dato è in accordo con lo studio di Stupp et al (2005). Il
secondo riveste una notevole importanza, in quanto la letteratura internazionale non è
concorde su tale punto (Olson et al., 2009). Lo status di PTEN, da solo, non ha invece un
ruolo prognostico nel GBM (Tab. 2).
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Per confermare i risultati dei primi 3 obiettivi, è stata eseguita un’analisi multivariata per
la OS, includendo età, KPS, entità dell’asportazione chirurgica, Ki67, espressione di
EGFRvIII, metilazione del promoter di MGMT e status di PTEN. L’età > 60 anni
(p=0,0182), un KPS > 70 (p=0,0055), un Ki67<20% (p= 0,0032), e l’espressione di
EGFRvIII (p=0,0128) si sono confermati fattori prognostici indipendenti per l’OS nel
GBM.
Obiettivo 4. Valutazione della diversa espressione di EGFRvIII nel tumore primario e
nella recidiva
Quattordici pazienti sono stati sottoposti a reintervento per recidiva di GBM. Il tempo di
recidiva variava fra 7 e 58 mesi (mediana: 15 mesi). In questi pazienti è stata condotta
un’analisi quantitativa dell’espressione di EGFRvIII sia nel GBM primario che nella
recidiva, con metodica real-time RT-PCR. Come si può evincere dalla Figura 4A, vi è
una deplezione media di EGFRvIII nel tumore recidivo rispetto al primario di circa il
50% (range = 40,4%-77,6%, p=0,01). Inoltre, la sopravvivenza dopo la recidiva è in
correlazione lineare diretta sia con il valore assoluto di EGFRvIII alla recidiva (p=0,034,
Fig. 4B) che con il rapporto fra il valore di EGFRvIII alla recidiva e nel tumore primario
(p=0,029). Complessivamente, questi dati indicano che il significato prognostico positivo
dell’espressione di EGFRvIII si mantiene anche nelle recidive di GBM; peraltro le stesse
recidive, avendo sviluppato dei meccanismi di resistenza alle terapie adiuvanti ed avendo
per se una prognosi peggiore rispetto al GBM in prima diagnosi, esprimono livelli di
EGFRvIII ridotti rispetto al GBM primario.
Obiettivo 5. Valutazione dell’influenza della terapia con temozolomide sulla prognosi
dei pazienti in dipendenza dallo status dell’EGFRvIII
Come notato in precedenza, tutti i pazienti della nostra casistica, differentemente dalle
casistiche storiche, sono stati sottoposti a chemioterapia adiuvante con TMZ. Pertanto,
abbiamo ipotizzato che il valore prognostico positivo dell’espressione di EGFRvIII fosse
- 11 -
dovuto ad una maggiore sensibilità alla chemioterapia con TMZ determinata da questo
marcatore biomolecolare. Vi sono dei dati preclinici a sostegno di questa ipotesi, fra cui
uno studio che dimostra che cellule di GBM positive per EGFRvIII sono sensibili alla
TMZ associata o meno ad un inibitore tirosinkinasico (Johns et al, 2003); inoltre, è noto
che le cellule che hanno una cascata oncogenica costitutivamente attiva, come accade in
caso di espressione di EGFRvIII, diventano “dipendenti” da questa cronica stimolazione
e possono essere più sensibili ai chemioterapici, con un meccanismo noto come pathway
addiction (Weinstein 2002).
Per valutare questa ipotesi abbiamo utilizzato coppie appaiate di linee di GBM CSCs,
ottenute dalla coltura di differenti aree di un medesimo campione di tumore primario, con
l’obiettivo di rispecchiare l’eterogeneità fenotipica intrinseca nel GBM eliminando il bias
legato alle variabilità fra paziente e paziente. Come dimostrato da numerosi gruppi di
ricerca, fra cui il nostro, le GBM CSCs rappresentano il migliore modello preclinico per
lo studio del tumore, in quanto ne ricapitolano fedelmente le caratteristiche (Pallini et al,
2008). Abbiamo selezionato tre coppie appaiate di linee cellulari provenienti da tre
pazienti, con differente espressione di EGFRvIII, MGMT e PTEN. Le prime due coppie
erano formate ciascuna da una linea positiva ed una negativa per EGFRvIII, mentre la
coppia ottenuta dal terzo paziente era formata da linee entrambe negative per EGFRvIII. I
cloni in esame sono stati esposti in vitro a concentrazioni crescenti di TMZ. Inoltre, nelle
stesse cellule, è stata valutata l’espressione di Bcl-xL, un importante fattore antiapoptotico, prima e dopo l’esposizione al chemioterapico.
Come si può evincere dalla Figura 5, una concentrazione di TMZ 125 M non è in grado
di interferire significativamente con la crescita cellulare; tuttavia, con dosi di TMZ più
elevate (fino a 500 M), si osservano un’inibizione della crescita ed un tasso di morte
cellulare sensibilmente superiori nelle linee positive per EGFRvIII rispetto a quelle
negative per lo stesso marcatore. Tale risultato, ottenuto utilizzando le GBM CSCs,
dimostra chiaramente che l’espressione di EGFRvIII è correlata ad una maggiore
sensibilità alla chemioterapia con TMZ. Ad ulteriore conferma di questo dato, come si
evince dalla Figura 5B, l’espressione di Bcl-xL (normalizzata in rapporto con la -actina)
- 12 -
è marcamente ridotta nelle linee cellulari EGFRvIII positive, responsive alla TMZ,
contrariamente alle linee EGFRvIII negative, non responsive a TMZ. Bcl-xL è uno dei
membri anti-apoptotici della famiglia di Bcl-2, un gruppo di proteine implicato nella
regolazione del pathway mitocondriale di apoptosi, importante nella morte cellulare
indotta da TMZ (Das et al., 2004). Alcuni lavori pre-clinici hanno mostrato una maggior
espressione di Bcl-xL in cellule di GBM immortalizzate (della linea U87) esprimenti
EGFRvIII rispetto alla controparte EGFRvIII negativa, sia in condizioni di base (Nagane
et al., 1996) che dopo esposizione al chemioterapico cisplatino (Nagane et al., 1998); non
vi sono tuttavia in letteratura studi circa la risposta di Bcl-xL all’esposizione alla TMZ
nel GBM in rapporto all’espressione di EGFRvIII. In definitiva, i risultati del nostro
studio colmano un vuoto di letteratura, indicando un’induzione preferenziale
dell’apoptosi da parte di TMZ nelle cellule staminali di GBM EGFRvIII positive,
mediata da una riduzione di Bcl-xL, ed una resistenza all’apoptosi TMZ-relata nel cloni
EGFRvIII negativi.
Conclusioni dello studio e prospettive di ricerca
I dati che abbiamo ottenuto indicano che l’espressione della variante costitutivamente
attiva di EGFR, EGFRvIII, conferisce al GBM una prognosi migliore. Questo dato,
all’apparenza contraddittorio, può essere in parte collegato alla maggiore sensibilità e
specificità della metodica utilizzata nel nostro studio (RT-PCR) rispetto a quella
utilizzata nella maggior parte dei precedenti studi (immunoistochimica). Tuttavia, una
valida spiegazione biomolecolare della nostra scoperta risiede nella maggiore sensibilità
delle cellule EGFRvIII positive all’apoptosi indotta dalla TMZ, come chiaramente
evidenziato utilizzando il modello delle GBM CSCs, gold standard della ricerca
biologica sui tumori in generale e sul GBM in particolare.
Il nostro studio, in linea con i principi della medicina traslazionale, conferma che la
determinazione del profilo bio-molecolare del GBM debba essere considerata
- 13 -
attualmente lo standard neuro-oncologico, come avviene già da alcuni anni presso la
nostra Istituzione. La conoscenza del profilo bio-molecolare del GBM del singolo
paziente può infatti migliorare il percorso di cura del paziente stesso, non solo fornendo
informazioni più attendibili sulla prognosi, ma in prospettiva contribuendo ad impostare
un trattamento chemioterapico “individualizzato”.
Pubblicazioni realizzate con il presente studio
I risultati del presente lavoro sono in fase di pubblicazione sulla prestigiosa rivista
internazionale Neoplasia (2010 Impact Factor: 5,476).
La Fondazione “G. Alazio” è stata ringraziata tra i finanziatori del lavoro.
- 14 -
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Figure e Tabelle
Figura 1. RT-PCR per la valutazione dell’espressione di EGFRvIII su tessuto tumorale
paraffinizzato fissato in formalina. (A) RT-PCR per EGFRvIII eseguita su otto casi
esemplificativi di GBM; EGFRvIII è positiva nei campioni 1, 4 e 5. I controlli negativo
(-) e positivo (+) sono costituiti rispettivamente da acqua e plasmide contenente
EGFRvIII. MW, molecular weight marker. (B) Tratto della sequenza di cDNA di
EGFRvIII mostrante la delezione degli esoni 2-7 caratteristica di EGFRvIII.
- 22 -
Figura 2. Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier per l’espressione di EGFRvIII (A),
per la metilazione del promoter di MGMT (B) e per l’espressione di Ki67 (C) nell’intera
popolazione in studio.
Figura 3. Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier per l’età (A), il performance status
(B) e la classe RPA (C) nell’intera popolazione in studio.
- 23 -
Figura 4. (A) Espressione di EGFRvIII mRNA nel tumore primario e nella recidiva nei
14 pazienti rioperati. (B) Correlazione fra espressione di EGFRvIII mRNA nella recidiva
e sopravvivenza dalla recidiva.
- 24 -
Figura 5. (A), (C), (D) Curve di sopravvivenza delle 3 coppie appaiate di linee di GBM
CSCs dopo esposizione a dosi crescenti di TMZ. (B) espressione di BCL-xL (in rapporto
a -actina) nella coppia appaiata mostrata in (A), dopo esposizione a TMZ 500 M.
- 25 -
Tabella 1. Prospetto degli studi di correlazione fra espressione di EGFRvIII e prognosi nel GBM.
Autore, anno
n
casi
Tecnica di analisi
Risultati
Meccanismo proposto
Feldkamp et al,
1999
12
IHC, RT-PCR,
Western blot
Prognosi peggiore (ns)
Nessuno
Shinojima et al,
2003
87
IHC
Prognosi peggiore (s)
Amplificazione di EFGR
Aldape et al,
2004
105
IHC, RT-PCR
Nessun valore prognostico
Prognosi peggiore in AA
EGFRvIII come marker di cellule
simil-GBM in AA
Heimberger et
al, 2005
196
IHC
Prognosi peggiore nei pazienti
che sopravvivono >1 anno
Proliferazione cellulare (ns),
coinvolgimento ependimale (ns)
Liu et al, 2005
160
RT-PCR
Nessun valore prognostico
Età maggiore in AA
Heimberger et
al, 2005
54
IHC
Nessun valore prognostico
Nessuno
Mellinghoff et
al, 2005
50
IHC, RT-PCR,
Western blot
Prognosi migliore nel braccio
trattato con erlotinib
Coespressione di PTEN
Pelloski et al,
2007
509
IHC
Prognosi peggiore (s)
Nessuno
Viana-Pereira et
al, 2008
27
IHC
Nessun valore prognostico
Nessuno
Brown et al,
2008
81
IHC
Nessun valore prognostico
Nessuno
Nessuno
Van den Bent et
al, 2009
49
IHC
Nessun valore prognostico
prognosi peggiore nel braccio
trattato con erlotinib
Thiessen et al,
2010
16
Real-time RT-PCR
Nessun valore prognostico
Nessuno
Reardon et al,
2010
20
IHC
Nessun valore prognostico
Nessuno
AA, astrocitoma anaplastico; IHC, immunoistochimica; RT-PCR: reverse trascriptase polymerase chain reaction;
ns, non significativo; s, significativo.
- 26 -
Tabella 2. Correlazione fra sopravvivenza (OS) e parametri
clinici e biomolecolari
OS mediana
Parametro
n
p
(mesi)
Intera coorte
73
9
Età, anni
≤ 60
> 60
36
37
18
9
0,0069
KPS
≥ 70
< 70
35
38
15
9
0,0035
Asportazione chirurgica
Totale
59
Parziale
14
11
19
0,3822
Classe RTOG RPA
III-IV
22
V
35
VI
16
29
11
8
0,0007
EGFRvIII
+
-
32
41
19
10.5
0,0023
MGMT
M
UM
32
41
14
11
0,0437
PTEN
+
-
43
30
11
11
0,4175
Ki 67
≤ 20%
> 20%
32
41
14
9
0,0286
OS, sopravvivenza; KPS, Karnofsky Performance Status; RTOG, Radiation Therapy Oncology Group; RPA,
recursive partitioning analysis; M, metilato; UM, non metilato.
- 27 -