Dako LSAB2 System-HRP Codice K0672 15 mL Codice

Dako
LSAB2 System-HRP
Codice K0672 15 mL
Codice K0673 15 mL
Codice K0675 110 mL
Uso previsto
Per uso diagnostico In Vitro.
Queste istruzioni si applicano al sistema universale Dako Labelled Streptavidin-Biotin2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB2 System,
HRP). Questo sistema è destinato all'uso con anticorpi primari di topo o coniglio reperiti dall'utente. Consente di effettuare l'identificazione
qualitativa di antigeni mediante microscopia ottica e immunoistochimica su tessuti inclusi in paraffina, tessuti criostatati e preparati cellulari,
al fine di facilitare la diagnosi di malattie patologiche. È possibile utilizzare tessuti trattati con una varietà di fissativi, tra cui etanolo, B-5,
Bouin, formalina di zinco e formalina neutra tamponata.
Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica) di
Dako o alle istruzioni sul sistema di rivelazione per le procedure IHC per: 1) Principio della procedura, 2) Materiali necessari ma non forniti,
3) Conservazione, 4) Preparazione dei campioni, 5) Procedura per la colorazione, 6) Controllo della qualità, 7) Risoluzione dei problemi,
8) Interpretazione della colorazione, 9) Limiti generali.
Cenni introduttivi
Il sistema LSAB2 System, HRP si basa sulla tecnica avidina-biotina marcata (LAB) modificata in cui un anticorpo secondario biotinilato
forma un complesso con le molecole di streptavidina coniugate con perossidasi.1 A confronto con il metodo ABC, è stato riportato che il
metodo LAB/LSAB è da quattro a otto volte più sensibile.2 Giorno, et al,2 attribuiscono l'aumento di sensibilità alla dimensione più piccola del
complesso di (strept)avidina marcato con l'enzima del metodo LAB/LSAB a confronto con il complesso enzimatico di avidina-biotina del
metodo ABC. L'interpretazione clinica della colorazione positiva o dell'assenza di colorazione deve essere integrata con studi morfologici e
istologici eseguiti con i controlli opportuni. La valutazione deve tenere conto dell'anamnesi del paziente e deve basarsi su ulteriori esami
diagnostici eseguiti da un operatore qualificato.
Principio della procedura
Il sistema LSAB2 System, HRP rappresenta una procedura IHC sensibile e versatile che consente l'elaborazione simultanea di diversi
campioni con anticorpi primari di coniglio o di topo in meno di un'ora. L'attività di perossidasi endogena può essere inibita incubando il
campione per 5 minuti con il 3% di perossido di idrogeno. Dopodichè, il campione viene incubato con un anticorpo primario di coniglio o di
topo, adeguatamente caratterizzato e diluito, quindi sottoposto ad una sequenza di incubazioni di 10 minuti con un anticorpo di collegamento
biotinilato (contenente immunoglobuline anti-coniglio e anti-topo) e streptavidina marcata con perossidasi. La colorazione viene completata
dopo un'incubazione eseguita con il cromogeno-substrato (AEC o DAB). Per AEC in K0672, si tratta di un'incubazione di 10 minuti con l'uso
di un cromogeno-substrato (AEC) (3-amino-9-etilcarbazole) che genera un precipitato di colore rosso in corrispondenza del sito dell'antigene.
Per DAB in K0673, si tratta di un'incubazione di 5–10 minuti con l'uso di un cromogeno-substrato (DAB) (3-3'-diaminobenzidina) che genera
un precipitato di colore marrone in corrispondenza del sito dell'antigene.
Reagenti forniti
Codice K0672
Il kit comprende i seguenti materiali, sufficienti per 150 sezioni di tessuto, considerando 100 µl per sezione:
Quantità
1x15 mL
Descrizione
Blocco della perossidasi
Perossido di idrogeno al 3% in acqua.
1x15 mL
Anticorpo di collegamento
Immunoglobuline di capra anti-coniglio e anti-topo, isolate per affinità e marcate con biotina,
in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente una proteina stabilizzante e 0,015
mol/L di sodio azide.
1x15 mL
Streptavidina-HRP
Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina
stabilizzante e agenti antibatterici.
1x15 mL
Cromogeno-substrato AEC
AEC in N,N-dimetilformammide (DMF) e tampone acetato, pH 5,0, contenente perossido di
idrogeno, stabilizzanti, enhancer e un agente antimicrobico. Conservare a 2–8°C.
(107442-003)
302289IT_001 p. 1/8
Codice K0673
Il kit comprende i seguenti materiali, sufficienti per 150 sezioni di tessuto, considerando 100 µl per sezione:
Quantità
Descrizione
1x15 mL
Blocco della perossidasi
Perossido di idrogeno al 3% in acqua.
1x15 mL
Biotinylated Link
Immunoglobuline di capra anti-coniglio e anti-topo, isolate per affinità e marcate con biotina, in
soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente una proteina stabilizzante e 0,015
mol/L di sodio azide.
Streptavidina-HRP
1x15 mL
Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina
stabilizzante e agenti antibatterici.
Substrato
1x18 mL
Tampone imidazolo-HCl a pH 7,5 contenente perossido di idrogeno e un agente antibatterico.
Cromogeno DAB
1x1 mL
3,3'-diamminobenzidina in soluzione cromogena.
Accessori
1
1
Provetta per analisi calibrata
Pipetta Pasteur in plastica
Codice K0675(11)
Il kit comprende i seguenti materiali, sufficienti per 1100 sezioni di tessuto, considerando 100 µl per sezione:
Quantità
1x110 mL
Descrizione
Biotinylated Link
Immunoglobuline di capra anti-coniglio e anti-topo, isolate per affinità e marcate con biotina, in
soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente una proteina stabilizzante e 0,015
mol/L di sodio azide.
1x110 mL
Streptavidina-HRP
Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina
stabilizzante e agenti antibatterici.
Codice K0675(89)
Il kit comprende i seguenti materiali, confezionati per l'uso con lo strumento Dako Autostainer (codice S3400):
Quantità
10x11 mL
Descrizione
Biotinylated Link
Immunoglobuline di capra anti-coniglio e anti-topo, isolate per affinità e marcate con biotina, in
soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente una proteina stabilizzante e 0,015
mol/L di sodio azide.
10x11 mL
Streptavidina-HRP
Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina
stabilizzante e agenti antibatterici.
(107442-003)
302289IT_001 p. 2/8
Materiali necessari ma non forniti
Panni assorbenti
Anticorpi: anticorpi serie N pronti all'uso o concentrati, diluiti in Antibody Diluent (codice S0809 o S3022)
Antibody Diluent (codice S0809 o S3022)
Tessuti di controllo, positivo e negativo
Colorazione di contrasto; acquosa, ad esempio Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (codice S3309)
Vetrini coprioggetto
Acqua distillata
Forno essiccante, in grado di mantenere una temperatura di 60°C o inferiore.
Etanolo, assoluto e al 95%
Microscopio ottico (20x–800x)
Mezzi di montaggio, ad esempio Faramount (codice S3025) o Glycergel (codice C0563)
Reagenti di controllo negativo
Vetrini, polilisinati oppure silanizzati del tipo Silanized Slides (codice S3003)
Vaschette o bagni per la colorazione
Contaminuti (per intervalli di 2–10 minuti)
Spruzzette
Soluzione tampone di lavaggio
Xilene, toluene o derivati dello xilene
Per il sistema K0675 LSAB2 (110 mL), è necessario aggiungere i seguenti reagenti all'elenco sopra riportato:
perossido di idrogeno, 3% di soluzione o Peroxidase Block (codice S2001)
soluzione cromogeno-substrato, quale AEC Substrate-Chromogen (codice K3464, 110 mL, pronta per l'uso) o Liquid DAB (codice K3466)
Materiali opzionali, non forniti
Tamponi:
Wash buffer (codice S3006) per l'utilizzo automatizzato e manuale
Phosphate buffered saline (codice S3024)
Tris-buffered saline (codice S3001 o S1968)
Enzimi proteolitici:
Pepsin (codice S3002)
Proteinase K (codice S3004 o S3020)
Proteolytic Enzyme, RTU (codice S3007)
Altri materiali:
Vetrini di controllo positivo (disponibili presso Dako)
Target Retrieval Solution (codice S1699 o S1700)
Target Retrieval Solution, High pH (codice S3307 o S3308)
Target Retrieval Solution, pH 9 (codice S2367 o S2368)
Camera umidificata
Idrossido di ammonio, 15 mol/L, diluito a 0,037 mol/L
Precauzioni
Specifiche del prodotto
1. Per uso professionale.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura. Sebbene alle concentrazioni
indicate non sia classificato come prodotto a rischio, il contenuto di NaN3 può reagire con il rame e il piombo delle tubature
formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per
prevenire l’eventuale accumulo di azide.3,4
3. I cromogeni substrato AEC e DAB sono sensibili alla contaminazione ad opera di molteplici agenti ossidanti, quali metalli, batteri,
polvere e strumenti di vetro comunemente usati in laboratorio. Per impedire la contaminazione e la scadenza prematura, evitare
l'esposizione delle soluzioni AEC o DAB a potenziali fonti di contaminazione e non pipettare mai direttamente dal flacone. Erogare
prima il volume necessario in un contenitore pulito, quindi pipettare dal contenitore. Non rimettere la soluzione AEC o DAB
inutilizzata nel contenitore originale.
4. I reagenti forniti sono stati diluiti in modo ottimale. Ulteriori diluizioni potrebbero causare la perdita di colorazione antigenica.
Qualunque variazione deve essere convalidata dall'utente. Le differenze che esistono tra i laboratori (per quanto riguarda il modo
di trattare il tessuto o di eseguire le procedure tecniche) possono determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono
necessari controlli interni periodici.
5. Non sostituire con reagenti appartenenti ad altri numeri di lotto o a kit di altri produttori.
6. Tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati potrebbero produrre risultati erronei. Le eventuali modifiche dovranno
essere convalidate dall’utente.
7. Gli enzimi e i cromogeni possono subire alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Evitare di conservare i componenti del kit e
di eseguire la colorazione in condizioni di luce intensa, ad esempio sotto la luce diretta del sole.
Generali
1. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
2. Ridurre al minimo la contaminazione batterica dei reagenti, altrimenti si potrebbero ottenere risultati errati.
3. Evitare di spruzzare reagenti o di generare aerosol.
4. Di regola, non è consentito ai minori di 18 anni di lavorare con questo prodotto. È necessario preparare con attenzione gli utenti
sulla corretta procedura, sulle proprietà rischiose del prodotto e sulle norme di sicurezza necessarie.
5. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle. Smaltire i reagenti inutilizzati
nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali previste in materia.
6. Su richiesta, è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti.
(107442-003)
302289IT_001 p. 3/8
Dichiarazioni sui rischi e sulla sicurezza
K0672 - Cromogeno-substrato AEC pronto per l'uso: 1-<10% N,N-dimetilformammide / Simbolo di pericolo: Tossico
R61
S35
S45
S53
Può danneggiare i bambini non ancora nati.
Questo prodotto e il relativo recipiente devono essere smaltiti con le opportune precauzioni.
In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l’etichetta).
Evitare l’esposizione – procurarsi speciali istruzioni prima dell’uso.
Riservato agli utenti professionisti.
K0673 - Cromogeno DAB: 1-5% di tetracloruro di bifenil-3,3’,4,4’-tetrailtetraammonio / Simbolo di pericolo: Nocivo
R40
R43
R68
S35
S36/37
Possibilità di effetti cancerogeni – prove insufficienti.
Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle.
Possibilità di effetti irreversibili.
Questo prodotto e il relativo recipiente devono essere smaltiti con le opportune precauzioni.
Usare indumenti protettivi e guanti adatti.
Conservazione
I reagenti dell'LSAB2 System, HRP devono essere conservati a 2–8°C. Non congelare. Non utilizzare dop o la data di scadenza stampata
sulle fiale dei reagenti e sulla confezione del kit. In caso di conservazione dei reagenti in condizioni diverse da quelle specificate, è
necessaria la convalida da parte dell'utente.5
Le soluzioni cromogeno-substrato AEC e DAB non sono stabili a temperature superiori a 8°C. Utilizzare e conservare le soluzioni
cromogeno-substrato AEC e DAB all'interno dell'intervallo di temperatura consigliato 2–8°C. Queste sol uzioni possono essere utilizzate
subito dopo il prelievo dal frigorifero. Dopo l'uso, riportare nel più breve tempo possibile alla temperatura di conservazione di 2–8°C.
Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l'instabilità di questi prodotti. Pertanto, è opportuno analizzare un controllo positivo
e un controllo negativo contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione imprevista, che non sia
giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un probabile problema del kit per analisi, contattare
l'Assistenza Tecnica Dako.
Preparazione dei reagenti
Per ragioni di praticità, prima di procedere alla colorazione è opportuno preparare i reagenti elencati di seguito.
Soluzione tampone di lavaggio
TBST, 0,05 mol/L Tris Buffered Saline with Tween (codice S3006) rappresenta il tampone di lavaggio consigliato per le procedure di
rilevazione IHC manuali e automatizzate. TBS, 0,05 mol/L Tris buffered Saline (codice S1968) e PBS, 0,02 mol/L Phosphate Buffered
Saline (codice S3024) sono anche queste soluzioni di tampone di lavaggio adatte per la colorazione manuale. Si sconsiglia l'uso di
soluzioni contenenti sodio azide come tamponi di lavaggio. La sodio azide inattiverebbe la perossidasi di rafano (HRP) provocando una
colorazione negativa.
Conservare la soluzione inutilizzata a 2–8°C. Getta re la soluzione tampone, se appare torbida. È possibile utilizzare acqua distillata
per sciacquare il perossido di idrogeno, la soluzione cromogeno-substrato e la colorazione di contrasto.
Anticorpo primario
È disponibile una vasta gamma di anticorpi primari serie N pronti per l'uso e di reagenti di controllo negativo per l'utilizzo con i sistemi
LSAB2 Systems. Presso Dako, sono disponibili anche gli anticorpi concentrati; tuttavia, l'utente deve determinare in modo sperimentale
le diluizioni ottimali. Preparare le diluizioni con il prodotto Antibody Diluent (codice S0809) contenente tampone Tris-HCI 0,05 mol/L, pH
7,2–7,6, e albumina di siero bovino (BSA) all'1%. La BSA agisce come blocco della proteina ed elimina la necessità di un'incubazione
separata con il reagente di blocco della proteina. Antibody Diluent with Background Reducing Components (codice S3022) è adatto
anche per essere utilizzato come diluente. Si sconsiglia di utilizzare del diluente senza trasportatore di proteina.
Per la maggior parte degli anticorpi primari impiegati con i sistemi LSAB2 Systems, è sufficiente un'incubazione di 10 minuti.
Reagente di controllo negativo
Un reagente di controllo negativo ideale dovrebbe contenere un anticorpo che non manifesti alcuna reattività specifica con i tessuti
umani (non reattivo con tessuti umani) nella stessa matrice/soluzione dell'anticorpo primario. L'anticorpo non reattivo con i tessuti
umani dovrebbe appartenere alla stessa sottoclasse e alla stessa specie animale dell'anticorpo primario e dovrebbe essere diluito alla
stessa concentrazione di immunoglobuline o proteine che è propria dell'anticorpo primario diluito, utilizzando lo stesso diluente. In base
al tipo di anticorpo primario/antisiero utilizzato, potrebbe essere adatto per l'uso il siero normale/non immune delle stesse specie come
primario ad una concentrazione della proteina equivalente al primario diluito nello stesso diluente. Il periodo di incubazione del
reagente di controllo negativo deve corrispondere a quello dell'anticorpo primario/antisiero.
Quando si usano gli anticorpi di serie N pronti all'uso Dako, il reagente di controllo negativo consigliato è Universal Negative Control.
Questi controlli sono ottimizzati per l'uso con anticorpi di serie N pronti all'uso di topo (codice N1698) o di coniglio (codice N1699).
Soluzione substrato-cromogeno
Il sistema K0672 LSAB2 System contiene l'AEC pronta all'uso, pronta per l'applicazione sui campioni di tessuto o cellulari. Il sistema
K0673 LSAB2 System contiene DAB, da prepararsi come segue. Aggiungere 1 goccia (o 20 µl) del cromogeno DAB per ogni mL di
tampone substrato. Utilizzare la provetta per analisi graduata, fornita con il kit, per misurare la quantità di tampone substrato necessaria.
Mescolare con cura e applicare la soluzione utilizzando la pipetta fornita con il kit. Dopo l'uso, lavare accuratamente la provetta per
analisi graduata e la pipetta con acqua distillata. La soluzione di lavoro DAB inutilizzata è stabile per un massimo di 2 settimane, se
conservata a 2–8°C. Se si osserva la formazione di un precipitato, mescolare bene prima dell'uso. Ready-to-use AEC SubstrateChromogen Solution (codice K3464, 110 mL) o Liquid DAB (codice K3466) sono consigliati per l'uso con il sistema LSAB2 System,
HRP, 110 mL (codice K0675). Seguire le istruzioni fornite con ogni sistema cromogeno-substrato per la preparazione del cromogenosubstrato.
(107442-003)
302289IT_001 p. 4/8
Colorazione di contrasto
Il cromogeno DAB genera un prodotto finale insolubile in alcol e può essere utilizzato con ematossilina a base di alcol. Quando si
utilizza il cromogeno-substrato AEC, il prodotto finale colorato della reazione di colorazione è alcol solubile e deve essere utilizzato
solamente con colorazioni di contrasto acquose, quali Mayer’s Hematoxylin. Dopo la colorazione di contrasto con ematossilina,
effettuare un risciacquo accurato in acqua distillata e immergere i vetrini contenenti il tessuto in un bagno di soluzione ammoniacale
0,037 mol/L. La soluzione ammoniacale 0,037 mol/L viene preparata miscelando 2,5 mL di idrossido di ammonio 15 mol/L
(concentrato) in 1 litro di acqua. La soluzione ammoniacale 0,037 mol/L inutilizzata può essere conservata in un flacone perfettamente
sigillato a temperatura ambiente (20–25°C) per 12 m esi. Consultare le istruzioni fornite dai produttori per eventuali colorazioni di
contrasto alternative.
Mezzi di montaggio
Come mezzi di montaggio acquoso si consigliano i prodotti Faramount Aqueous Mounting Medium, pronto per l'uso (codice S3025) o
Glycergel Mounting Medium (codice C0563). Liquefare Glycergel prima dell’uso, riscaldando il mezzo fino a 40 ±5°C circa.
Preparazione dei campioni
Fare riferimento alla sezione “General Instructions for Immunohistochemical Staining” (Istruzioni generali per la colorazione
immunoistochimica) e/o al foglio contenente le specifiche sull'anticorpo.
Prima che la colorazione IHC abbia luogo, i tessuti devono essere fissati e trattati. La fissazione impedisce l'autolisi e la putrefazione dei
tessuti asportati, preserva l'antigenicità, migliora l'indice di rifrazione dei costituenti del tessuto e aumenta la resistenza degli elementi
cellulari al trattamento del tessuto. Il tessuto viene sottoposto a disidratazione, diafanizzazione degli agenti disidratanti, infiltrazione di mezzi
inclusivi, inclusione e infine sezionamento. I fissativi più comuni per i preparati di tessuto destinati alle procedure IHC sono descritti nella
sezione “General Instructions for Immunohistochemical Staining” (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica). Queste
informazioni sono fornite esclusivamente come linee guida. Le procedure ottimali dovranno essere definite e verificate dall’utente.
Procedura per la colorazione
Note sulla procedura
Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente le istruzioni fornite di seguito e studiare il contenuto del sistema.
I reagenti e le istruzioni fornite in questo sistema di analisi sono state studiate per assicurare una prestazione ottimale. L'ulteriore
diluizione dei reagenti del sistema o una variazione dei tempi o delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei.
Tutti i reagenti del sistema, ad eccezione del cromogeno-substrato AEC, devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20–25°C)
prima dell'immunocolorazione. Analogamente, tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Il cromogenosubstrato AEC può essere usato subito dopo il prelievo dalla conservazione a freddo, senza dover raggiungere la temperatura
ambiente prima dell'uso. Dopo l'utilizzo, riportare ad una temperatura di conservazione di 2–8°C. Temp erature di conservazione
superiori a 8°C possono compromettere la stabilità del cromogeno-substrato AEC.
Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante la procedura di colorazione. Sezioni di tessuto essiccato possono presentare un
fenomeno di colorazione aspecifica. Coprire i vetrini per proteggerli dalle correnti d'aria. Se le incubazioni devono protrarsi nel tempo,
collocare i tessuti in un ambiente umido.
Nel caso sia necessario interrompere il protocollo di colorazione, i vetrini possono essere conservati in un bagno tampone dopo
l'incubazione dell'anticorpo di collegamento (Fase 3) per un'ora a temperatura ambiente (20–25°C) senz a alterazione della colorazione.
La sensibilità del LSAB2 System, HRP può essere ulteriormente aumentata allungando i tempi di incubazione della fasi 2, 3 e
4 di 30 ±5 minuti l'uno.
Protocollo di colorazione
FASE 1 BLOCCO DELLA PEROSSIDASI
Picchiettare per eliminare il liquido in eccesso. Utilizzando carta bibula (ad esempio Kimwipe o carta di tessuto assorbente),
asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere il liquido in eccesso e mantenere i reagenti all’interno
dell’area prescritta.
Applicare una quantità di Peroxidase Block sufficiente a coprire il campione.
Incubare per 5 (±1) minuti.
Sciacquare delicatamente con acqua distillata o soluzione tampone da una spruzzetta (fare attenzione a non indirizzare il
flusso direttamente sul tessuto) e collocare in un bagno tampone fresco.
FASE 2
ANTICORPO PRIMARIO O REAGENTE DI CONTROLLO NEGATIVO
Picchiettare per eliminare il liquido in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente.
Applicare una quantità di anticorpo primario o di reagente di controllo negativo sufficiente per coprire il campione.
Incubare per 10 (±1) minuti, se non diversamente specificato.
Sciacquare delicatamente con soluzione tampone da una spruzzetta (fare attenzione a non indirizzare il flusso direttamente
sul tessuto) e collocare in un bagno tampone fresco.
FASE 3
BIOTINYLATED LINK
Picchiettare immediatamente per eliminare il tampone in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente.
Applicare una quantità sufficiente di gocce GIALLE dell'anticorpo di collegamento in modo da coprire il campione.
Incubare per 10 (±1) minuti.
Sciacquare i vetrini come nella fase 2.
Nel caso sia necessario interrompere il protocollo di colorazione, i vetrini possono essere conservati in un bagno tampone
dopo l'incubazione dell'anticorpo di collegamento (Fase 3) per un'ora a temperatura ambiente (20–25°C) senza alterazione
della colorazione.
(107442-003)
302289IT_001 p. 5/8
FASE 4
STREPTAVIDINA-HRP
Asciugare i vetrini come descritto precedentemente.
Applicare una quantità sufficiente di gocce ROSSE del reagente Streptavidina in modo da coprire il campione.
Incubare per 10 (±1) minuti.
Sciacquare i vetrini come descritto precedentemente.
FASE 5
SOLUZIONE CROMOGENO-SUBSTRATO
Rimuovere le soluzione cromogeno-substrato AEC o DAB dalla conservazione a 2–8°C. Per la preparazione DAB, fare
riferimento alla sezione Preparazione dei reagenti.
Asciugare i vetrini come descritto precedentemente.
Applicare una quantità sufficiente di soluzione cromogeno-substrato AEC o DAB in modo da coprire il campione. Riportare il
cromogeno-substrato AEC o DAB alla conservazione refrigerata.
Incubare per 10 (±1) minuti per AEC e per 5–10 minuti per DAB.
Sciacquare delicatamente con acqua distillata da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul
tessuto). Raccogliere il cromogeno-substrato AEC o DAB da eliminare in un contenitore per materiali pericolosi e smaltire in
modo appropriato.
FASE 6
COLORAZIONE DI CONTRASTO CON EMATOSSILINA (FACOLTATIVA)
Immergere i vetrini in un bagno di ematossilina. Incubare per due-cinque (2–5) minuti, a seconda dell'intensità
dell'ematossilina utilizzata.
Sciacquare delicatamente in un bagno di acqua distillata.
Immergere i vetrini 10 volte in un bagno di soluzione ammoniacale 0,037 mol/L (facoltativo).
Sciacquare i vetrini in un bagno di acqua distillata o deionizzata per due-cinque (2–5) minuti.
FASE 7
MONTAGGIO
È possibile montare i campioni e applicare i vetrini coprioggetto con un mezzo di montaggio acquoso, come ad esempio
Faramount (code S3025) o Glycergel (code C0563).
Nota: il prodotto della reazione AEC è solubile in solventi organici, pertanto non è compatibile con i mezzi di montaggio permanenti a
base di toluene o xilene.
Nota: è possibile montare DAB con qualsiasi mezzo di montaggio permanente.
Nota: è possibile leggere i vetrini in qualunque momento; tuttavia, se i vetrini sono esposti alla luce intensa per una settimana, si
potrebbe assistere a un certo grado di scolorimento. Per evitare che ciò accada, conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente
(20–25°C).
Controllo della qualità
Le differenze che esistono tra i laboratori (per quanto riguarda il modo di trattare il tessuto o di eseguire le procedure tecniche) possono
determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono necessari controlli interni periodici.
Per ulteriori informazioni, consultare le linee guida sul controllo della qualità stabilite dal College of American Pathologists (CAP) Certification
Program for Immunohistochemistry e i riferimenti bibliografici 6–8. Per informazioni dettagliate sulla sensibilità e sull'immunoreattività, fare
riferimento al foglietto illustrativo dei singoli anticorpi primari.
Per ulteriori informazioni sui controlli positivi e negativi, fare riferimento alla pubblicazione "General Instructions for Immunohistochemical
Staining" (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica).
Interpretazione dei risultati della colorazione
Per conoscere le linee guida sull'interpretazione dei risultati, fare riferimento a "General Instructions for Immunohistochemical Staining"
(Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica).
Limiti generali
Per conoscere i limiti generali della procedura, fare riferimento a "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Istruzioni generali
per la colorazione immunoistochimica).
Limiti specifici del prodotto
I reagenti del sistema LSAB2 System forniti da Dako sono diluiti in modo ottimale per essere impiegati secondo il protocollo IHC descritto, su
sezioni di tessuto incluse in paraffina, criostati e strisci di sangue. Qualsiasi variazione apportata alle procedure di analisi consigliate rischia
di provocare risultati non validi. È indispensabile documentare l'uso di controlli adeguati. Gli utenti che modificano le procedure di analisi
consigliate sono tenuti ad assumersi la piena responsabilità per l'interpretazione dei risultati dei pazienti nelle circostanze in causa.
È stata osservata un'attività endogena di legame all'avidina (EABA) nelle sezioni congelate di fegato (nodulo epatico intero) e di rene
(epitelio tubulare), nonché nei tessuti linfoidi congelati e fissati in formalina (istiociti paracorticali).9-12 L'EABA può essere eliminata con una
sequenza di incubazioni di 20 minuti, prima con lo 0,1% di avidina, poi con lo 0,01% di biotina in un tampone 0,05 M Tris-HCl, pH 7,2–7,6,
prima di colorare o utilizzare il sistema Biotin Blocking System (codice X0590).
L'attività endogena di perossidasi o pseudoperossidasi è osservabile nelle emoproteine quali l'emoglobina, la mioglobina, il citocromo e la
catalasi, nonché negli eosinofili.13,14 Nel tessuto fissato in formalina, questa attività può essere inibita incubando i campioni con il 3% di
perossido di idrogeno per cinque minuti prima dell'applicazione dell'anticorpo primario. Gli strisci di midollo osseo e sangue e i tessuti
congelati possono essere trattati con Peroxidase Blocking Reagent (codice S2001). Questa procedura non elimina comunque il pigmento
rossiccio-marrone delle emoproteine. In alternativa, è possibile utilizzare una soluzione di metanolo e perossido di idrogeno. Alcuni antigeni
possono denaturarsi per effetto di questo trattamento.
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I reagenti potrebbero provocare reazioni impreviste in tessuti che non sono mai stati analizzati in passato. Inoltre, non si esclude la
possibilità che si verifichino reazioni impreviste in gruppi di tessuti già analizzati in passato, vista l'elevata variabilità biologica
dell'espressione antigenica nelle neoplasie o in altri tessuti patologici.8 Contattare l'Assistenza Tecnica Dako per comunicare le reazioni
impreviste, fornendo tutta la documentazione del caso.
I tessuti delle persone infette dal virus dell'epatite B e contenenti l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) possono essere interessati da
una colorazione aspecifica con la perossidasi di rafano.15
Risoluzione dei problemi
Problema
1. Nessuna colorazione
dei vetrini.
2.
3.
Colorazione debole di
tutti i vetrini.
Colorazione di fondo
eccessiva in tutti i
vetrini, compresi i
vetrini di controllo
negativo.
Probabile causa
1a. I reagenti non sono
stati utilizzati
nell'ordine corretto.
1b. È presente sodio
azide nel bagno
tampone.
1c. Il reagente
cromogeno-substrato
è stato mescolato non
correttamente.
2a. Le sezioni trattengono
troppa soluzione dopo
il bagno di lavaggio.
2b. I vetrini non sono stati
incubati con i reagenti
per una quantità di
tempo sufficiente.
2c. Colorazione di
contrasto non
compatibile o mezzi di
montaggio che
dissolvono il prodotto
di reazione.
3a. I campioni
contengono un'attività
di perossidasi
endogena elevata.
3b. La paraffina è stata
rimossa parzialmente.
3c. I vetrini sono stati
risciacquati male.
3d. Reazione substrato
più veloce del
normale, causata da
una temperatura
ambiente
eccessivamente alta.
3e. Le sezioni si sono
asciugate durante la
procedura di
colorazione.
3f. Legami aspecifici dei
reagenti con la
sezione di tessuto.
4.
Le sezioni di tessuto
si staccano dai vetrini.
5.
Colorazione specifica
troppo intensa.
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3g. Anticorpo primario
troppo concentrato.
4a. Uso di vetrini errati.
5a. Anticorpo primario
troppo concentrato.
Intervento consigliato
1a. Rivedere l'applicazione dei reagenti.
1b. Utilizzare un tampone fresco, privo di
azide.
1c. Creare una soluzione cromogenosubstrato fresca in base al protocollo
del kit.
2a. Eliminare la soluzione in eccesso
picchiettando delicatamente prima di
asciugare attorno alla sezione.
2b. Rivedere i tempi di incubazione
consigliati.
2c. Per i vetrini immunocolorati AEC,
utilizzare unicamente colorazioni di
contrasto e mezzi di montaggio
acquosi.
3a. Incubare i vetrini con perossido di
idrogeno fresco.
3b. Utilizzare bagni di xilene o toluene
freschi.
3c. Utilizzare soluzioni fresche in bagni
tampone e bagni di lavaggio.
3d. Abbreviare i tempi di incubazione con
la soluzione substrato-cromogeno.
3e. Utilizzare la camera umidificata.
Asciugare solo tre o quattro vetrini per
volta prima di applicare il reagente.
3f.
Utilizzare i diluenti per anticorpo Dako
oppure aggiungere l'1% di BSA al
diluente per anticorpo. In alternativa, è
possibile utilizzare il tampone 0,05
mol/L Tris contenente 0,3 mol/L NaCl e
0,1% Tween 20, pH 7,2-7,6 (codice
S3306) come tampone di lavaggio.
Inoltre, potrebbe essere necessaria
l'incubazione di un reagente di blocco
della proteina separato (codice X0909)
prima dell'applicazione dell'anticorpo
primario.
3g. Diluire maggiormente l'anticorpo
primario.
4a. Utilizzare vetrini polilisinati per la
maggior parte delle colorazioni. Per gli
anticorpi primari che richiedono
tecniche di recupero del bersaglio,
utilizzare i vetrini Silanized Slides.
5a. Eseguire delle diluizioni seriali
dell'anticorpo primario per determinare
la diluizione ottimale.
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5b. L'incubazione
dell'anticorpo
primario, del
collegamento
biotinilato o della
streptavidina-HRP è
troppo lunga.
5b. Determinare il protocollo di colorazione
adeguato per l'anticorpo, ad es. durata
dell'incubazione dell'anticorpo primario,
durata dell'incubazione del
collegamento biotinilato e della
streptavidina-HRP.
Nota: se il problema non è imputabile a nessuna di queste cause, o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare
l'Assistenza Tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti.
Ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla preparazione dei campioni sono contenute in Immunohistochemical Staining
Methods10 (disponibile presso Dako), Atlas of Immunohistology16 e Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor
Diagnosis.17
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Edizione 05/07
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