A liciclobacillo Rile v azione Re al-Tim e PCR
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A liciclobacillo Rile v azione Re al-Tim e PCR
Gli Aliciclobacilli sono batteri Gram positivi, termofili, acidofili, aerobi obbligati e sporigeni. In genere, il batterio colonizza il suolo, ma può anche infestare frutta e raccolti; alcune specie poi possono causare deterioramento di bevande a causa della produzione di guaiacolo (A. acidoterrestris) o di 2-methyltetraidrothiofen-3-one (A. acidocaldarius) la cui particolarità è l’aroma sgradevole. La crescita di Aliciclobacillo in bevande e salse di Pomodoro è per sua natura non rilevabile visivamente: la fermentazione avviene senza produzione di CO2, pertanto lattine e Tetra-brik non mostrano rigonfiamenti né si manifesta lo scolorimento della conserva/succo. Pertanto l’alterazione del prodotto viene riconosciuta solo nel momento di apertura della confezione per mano del consumatore. La conseguenza diretta è un serio danno di immagine per il produttore. Il controllo puntuale della presenza e della crescita dell’organismo durante i processi di lavorazione, è quindi di fondamentale importanza ma particolarmente difficile data la forte resistenza delle spore alle alte temperature (92°C per 10 secondi). Lo screening degli ingredienti per le spore di Aliciclobacillo è pertanto divenuto uno degli strumenti chiave per prevenire i deterioramenti, specialmente nella produzione di succhi di frutta. È altrettanto importante, da un punto di vista di controllo qualità, un monitoraggio regolare dei prodotti finiti per assicurare che i controlli siano efficaci e per rilevare preventivamente potenziali contaminazioni. Queste esigenze hanno portato allo sviluppo di un range di metodi, basati sulle tecniche colturali tradizionali e le tecnologie rapide. Scartare il surnatante 24-96 ore 25°C o 45°C Campionamento Pellet batterico Aliciclobacillo Rilevazione Real-Time PCR Arricchimento in BAT Broth Estrazione del DNA con ION-Force Real-Time PCR Impostare la reazione PCR Purificazione del DNA Trattamento termico del campione Generon ha sviluppato PATHfinder Alicyclobacillus una soluzione tecnica completa basata sulla Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). Industrie del settore conserviero possono adesso verificare la presenza dell’Aliciclobacillo in campioni ambientali, prodotti crudi, semilavorati e prodotti finiti, in meno di due ore dopo l’arricchimento. L’approccio analitico di Generon è basato su uno studio approfondito della letteratura scientifica sulla genetica e fisiologia del bacillo. I PATHfinder Alicyclobacillus Assay contengono primers e sonde marcate per rilevare un gene fondamentale per la biosintesi degli acidi grassi ω-cicloalifatici che conferiscono la resistenza delle spore al calore; sono perciò meno soggetti a cross-reattività con altri batteri rispetto a quanto accade con l’approccio classico di rilevazione del gene 16S. I metodi di rilevazione consigliati, a seconda della composizione del campione e del tempo trascorso dalla lavorazione, sono estratti dai metodi IFU (International fruit and vegetable juice association) per la rilevazione di Aliciclobacillo in succhi di frutta (2003). Lo shock termico è effettuato incubando a 80°C per 10 minuti. Materiali crudi (incluse acque trattate) Prodotti finiti Prodotti finiti provenienti dal mercato è richiesto un trattamento di Campionamento diretto del Pre-incubazioni del campione shock termico, seguito da prodotto dopo il processo di e trattamenti con shock termici una semina diretta pastorizzazione senza sono opzionali. Se si sospetta (opzionale), filtrazione o necessità di shock termico: è un deterioramento ma non arricchimento in un mezzo richiesta una pre-incubazione viene rilevato Aliciclobacillo liquido del materiale del campione in un mezzo dopo la semina diretta, sono sottoposto al trattamento. liquido. Crescita per 7 giorni a consigliati uno shock termico e Crescita per 4 giorni a 45°C in 45°C in BAT Broth. l’arricchimento. Crescita per 7 giorni a 45°C in BAT Broth. BAT Broth. Gli Aliciclobacilli (soprattutto A. acidoterrestris perché cresce a temperature inferiori ai 30°C) rappresentano una minaccia specifica per l’intera industria delle conserve, dai produttori dei concentrati agli imbottigliatori di succhi ad altre industrie che producono bevande come succhi di frutta(arancia, mela, pomodoro, uva bianca, pera, mango, ananas), succhi misti, succhi concentrati (arancia, albicocca. pesca, pera, mela, mango, cocco). Una rassegna della letteratura ha mostrato diversi livelli di rischio di contaminazione a seconda della tipologia di succhi (per esempio: succo di mela concentrato - fino al 75%; succo di arancia concentrato - fino al 80%). Per l’industria delle salse di pomodoro, invece, la minaccia principale è rappresentata da A. acidocaldarius in quanto i trattamenti termici applicati ai pomodori sono più severi rispetto a quello cui vengono sottoposti i frutti. Le spore di A. acidocaldarius sono le uniche in grado di rimanere vitali dopo questi trattamenti e pertanto crescere e degradare il prodotto. Trattamenti termici industriali correlati con le specie di Alicyclobacillus che causano aromi sgradevoli Alicyclobacillus acidocaldarius Alicyclobacillus spp. Trattamenti termici industriali Alicyclobacillus spp. Alicyclobacillus acidoterrestris Ciò si riflette anche nella possibilità di differenziare A. acidoterrestris da A. acidocaldarius attraverso l’incubazione delle colture a 30°, 45° e 65ºC. A. acidoterrestris non cresce a 65ºC e A. acidocaldarius non cresce a 30ºC. PATHfinder Alicyclobacillus Assay consente la rilevazione di entrambi quando il passaggio di arricchimento è eseguito a 45°C; se invece l’arricchimento avviene a 30°C solo A. acidoterrestris può proliferare ed essere rilevato dal saggio. Concentrati Semilavorati Frutta Fasi della produzione dei succhi di frutta e punti di controllo per monitorare la contaminazione da Aliciclobacillo Fase produttiva Punto di controllo Raccolta e trasporto della frutta Frutta caduta Igiene dei container di frutta, stoccaggio intermedio e trasporto Ricezione della frutta e maneggiamento Sporcizia della frutta o materia vegetale estraneo (es. fogliame) Pulizia della frutta e smistamento Acqua di lavaggio e risciacquo Spremitura e estrazione dei succhi Acqua di estrazione dei succhi Acqua per la pulizia delle attrezzature Chiarificazione/filtrazione dei succhi Igiene efficiente e integrità delle membrane Rimozione di colore o amarezza Igiene efficiente delle resine Pastorizzazione Temperatura, durata e procedura Concentrazione Condizioni termiche Riempimento e conservazione Temperatura di conservazione Condizioni termiche Prodotti Finiti Gestione dello spazio di testa Stoccaggio di materiale crudo Temperatura di conservazione Formulazione Qualità degli ingredienti usati (es.: sciroppo di zucchero) Monitoraggio precursori Guaiacolo Conservazione Condizioni termiche Gestione dello spazio di testa Pastorizzazione Condizioni termiche Riempimento Condizioni termiche Stoccaggio e distribuzione Condizioni termiche I nuovi PATHfinder Alicyclobacillus acidoterrestris e acidocaldarius Assay consentono la rilevazione specifica dei principali agenti deterioranti anche quando l’arricchimento è eseguito a 45°C. I due saggi possono anche essere usati in multiplex per una diagnosi completa circa la presenza di questi batteri nel campione. I PATHfinder Assay di Generon possono essere usati su qualsiasi strumento Real-Time PCR (ad eccezione dei sistemi Light Cycler I e II) sebbene specificamente sviluppati e validati per il sistema Bio-Rad CFX Deep-Well. Informazioni utili all’ordine Kit di rilevazione Tutti i kit includono oligo mix + polimerasi + controlli positive e negativi • PMB48A-AT PATHfinder Alicyclobacillus acidoterrestris Assay – 100 test • PMB48A-AC PATHfinder Alicyclobacillus acidocaldarius Assay – 100 test Questi kit includono un controllo di amplificazione interna positivo rilevabile con canale HEX. Disponibile anche nel formato 50 test • PMB48A-M PATHfinder A.acidoterrestris (FAM) + acidocaldarius (HEX) Multiplex Assay – 100 tests Il kit include un controllo di amplificazione interna positivo rilevabile con canale Texas Red. Disponibile anche nel formato 50 test Materiale di riferimento e di controllo del processo • PMB48X-AT PATHfinder sureXtra Alicyclobacillus acidoterrestris – 50 vials • PMB48X-AC PATHfinder sureXtra Alicyclobacillus acidocaldarius – 50 vials Il calore inattiva i pellet batterici a una quantità cellulare nota (fino a 106 CFU/fiala) contenenti una sequenza target per A. acidoterrestris per assicurare uno stretto controllo dell’efficacia del processo di estrazione del DNA. Kit di estrazione del DNA • EXD001 ION-Force FAST DNA Extractor Accessori per l’estrazione • ACC2063 Microcentrifuga 14500 rpm • ACC2003 Vortex a velocità variabile • ACC6037 Termoblocco riscaldante per microtubi Responsabili commerciali di zona Emilia Romagna, Marche Altre regioni Stefano Callea Daniela Superchi Alessandro Ruffato Simone Ruffato Francesco Rossi Caterina Novi - [email protected] - [email protected] - [email protected] - [email protected] - [email protected] - [email protected] Generon srl Stradello Aggazzotti,104 – Modena - +39 059 8637161 +39 059 7353024 [email protected] www.generon.it - 349 5503780 - 342 3390552 - 349 0651399 - 349 5291261 - 344 2685914 - 345 6581422 Rev.2_070416 Piemonte, Liguria e VDA Lombardia Triveneto