Materiali e Metodi

MATERIALI e METODI
Filip Pošćić
Pag:
(1) Estrazione DNA
2
(2) Lettura al Fluorimetro per la determinazione della concentrazione del DNA
3
(3) Soluzioni per l’estrazione di DNA, l’elettroforesi e la PCR
5
(4) Verifica della qualità di DNA su gel di agarosio
7
(5) Preparazione della PCR
8
(6) Preparazione dei campioni per sequenziamento
9
(7) Formule chimiche dei prodotti usati nei protocolli
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(1) ESTRAZIONE DNA
(DOYLE & DOYLE modificato)
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Mettere in bagnetto a 65˚C la falcon contenente la soluzione CTAB + βMERCAPTOETANOLO. La soluzione
deve rimanere calda durante l’uso percui avvolgere la falcon in alluminio prima di matterla in bagnetto.
La quantità di campione da utilizzare per singola estrazione è di 0,06 – 0,5g variabili a seconda dell’efficienza
di estrazione.
Prendere il campione vegetale, porlo dove va meglio a seconda del campione (Eppendorf da 2 mL, mortaio o
altro) e tirarlo in AZOTO LIQUIDO. Pestellare con gli appositi pestelli. Pestellare violentemente! Deve
rimanere una polvere finissima tipo talco.
Il tirato va messo in eppendorf da 2 mL, facendo attenzione a non lasciarlo scongelare, e ad esso ancora
congelato si aggiungono 900 μL di CTAB a 65˚C (è una quantità variabile a seconda di quanto campione in
partenza io ho).
Mescolare. Si può mescolare con i pestelli oppure, dopo aver chiuso la eppendorf, a mano agitando fortemente.
Per poi lavare i pestelli essi si risciacquano con abbondante acqua e poi vanno immersi in etanolo.
A bagnomaria fare avvenire la lisi a 65-68˚C per un tempo di circa 2 ore mettendo le eppendorf nell’apposito
floating rack e immergendo quest’ultimo nel termostato. Mescolare ogni 5 -10 minuti. I passaggi dal 3. al 6.
sono critici. Bisogna lavorare veloci e sistemare campione per campione e non tutti insieme evitando così di
lasciarli scongelare. Inoltre, aggiunto il CTAB e mescolato, trasferire subito in bagnomaria.
Togliere dal bagnomaria, mettere in ghiaccio per 5 minuti ed aggiungere CLOROFORMIO-ALCOOL
ISOAMILICO (sotto cappa aspirante!) nella stessa quantità del CTAB aggiunto in precedenza (900 μL).
Attenzione: Il CLOROFORMIO-ALCOOL ISOAMILICO ha una tensione superficiale molto bassa per cui
tende ad uscire facilmente dal puntale sfasando così il volume nelle eppendorf.
Mescolare accuratamente: si può mescolare con la stessa pipetta con cui ho caricato oppure con un vortex
oppure agitando fortemente con le mani.
Centrifugare con centrifuga Eppendorf a 13-14000 rpm per 7-8 minuti.
Prendere la fase acquosa con una pipetta e metterla in eppendorf da 2 mL. Stare attenti a non toccare con il
puntale la fase alcolica contenente le proteine. (Tenere conto del volume prelevato!). Lavorare d’ora in poi
tenendo sempre le Eppendorf in ghiaccio.
Aggiungere SODIO ACETATO (sotto cappa aspirante!) ad una concentrazione finale di 0,3 M. Nel nostro
caso vanno bene 80 μL.
Aggiungere ISOPROPANOLO FREDDO nella quantità di circa 2/3 del volume contenuto nella Eppendorf
fino a questo punto. Nel nostro caso vanno bene 590 μL.
Mescolare accuratamente.
Riporre in freezer a -80˚C per 20 minuti circa.
Centrifugare con centrifuga Eppendorf a 13-14000 rpm per 20 minuti.
Togliere il surnatante versandolo in un beaker (il DNA rimane attaccato alle pareti).
Lavare con ETANOLO 70% FREDDO per 20 minuti utilizzando circa 500 μL
Togliere l’etanolo completamente sfruttando ripetute e leggere centrifughe e asportazioni con pipetta. La prima
centrifuga della serie si lascia andare per 8 minuti.
Mettere in stufa a 45˚C con tappo aperto fino a completa evaporazione dell’etanolo (circa 5-10 minuti).
Aggiungere 100 μL di TE1X (o H2O) e 1 μL di RNA-asi (1mg/mL).
Mettere in stufa a 37˚C per 1 ora colpettando ogni tanto l’Eppendorf (ogni 15 minuti circa).
Fare uno spin alla centrifuga per far scendere tutte le goccie. Aggiungere 200 μL di TE1X (o H 2O), 100 μL di
AMMONIO ACETATO 10M e 1,2 mL di ETANOLO ASSOLUTO FREDDO.
Mescolare e mettere a -80˚C per circa 20 minuti.
Centrifugare con centrifuga Eppendorf a 13-14000 rpm per 20 minuti.
Eliminare il surnatante sfruttando ripetute e leggere centrifughe e asportazioni con pipetta.
Mettere in stufa a 45˚C con tappo aperto fino a completa evaporazione.
Aggiungere 50 μL di acqua milli-Q sterile.
Conservare a -80 ˚C.
Leggere la concentrazione del DNA al Fluorimetro.
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(2) LETTURA AL FLUORIMETRO PER LA DETERMINAZIONE
DELLA CONCENTRAZIONE DEL DNA MEDIANTE
PICOGREEN E FLUORIMETRO PerkinElmer Wallak VICTOR2
1. Bisogna predisporre del PicoGreen dsDNA Quantitation Kit 200-2000 assays. Il kit include:
- soluzione madre di PicoGreen 200X,
- soluzione madre di DNA λ;
- soluzione TE 20X.
2. Si prepara ora la curva di taratura con DNA λ a concentrazione nota. Vengono qui riportate le quantità per una sola
sessione di lettura.
TE 1X (1400L) (si preparino più eppendorf con questa soluzione perchè se ne farà uso):
1330 L
70 L
H2O milli-Q sterile
TE 20X
Soluzione DNA standard #1 (75L) (una eppendorf):
73.5 L TE 1X
1.5 L Soluzione madre di DNA λ
Soluzione DNA standard #2 (140L) (una eppendorf):
136.5 L
3.5 L
TE 1X
Soluzione DNA standard #1
Si preparino ora le vere soluzioni usate per la misurazione. Di seguito sono riportate le quantità in L da aggiungere per
ognuna delle nove eppendorf:
Epp.
1
2
3
4
5
6
7
8
Concentrazione
finale DNA*
500.0 ng/mL
250.0 ng/mL
100.0 ng/mL
25.0 ng/mL
10.0 ng/mL
2.5 ng/mL
1.0 ng/mL
0.0 ng/mL
Soluzione DNA
standard #1
40.0
20.0
8.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
Soluzione DNA
standard #2
0.0
0.0
0.0
80.0
32.0
8.0
3.2
0.0
TE 1X
40.0
60.0
72.0
0.0
48.0
72.0
76.8
80.0
* La concentrazione finale viene raggiunta dopo l'aggiunta di Picogreen immediatamente prima della misurazione.
3. Si preparano ora le soluzioni di DNA standard e dei campioni per la quantificazione:
Soluzione Picogreen 1X:
79.6 L TE 1X
0.4 L Picogreen 200X
Questa soluzione deve essere preparata per un numero di campioni uguale a:
- 8 (soluzioni di DNA standard) + n soluzioni di DNA da quantificare.
Si ricordi di fare duplice copia per ogni campione (per motivi di controllo) e di pipettare bene.
Preparazione di ciascun campione da quantificare:
78.4 L TE 1X
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1.6 L Soluzione di DNA da quantificare (eventualmente già diluita)
Prima della misurazione si dovrebbero avere a disposizione:
- 8 soluzioni di DNA standard (ciascuna di 80 L);
- n soluzioni di DNA da quantificare (ciascuna di 80 L);
- 8 + n soluzioni di Picogreen 1X (ciascuna di 80 L).
4. Aggiungere 80 L di Picogreen 1X a ciascuna soluzione e trasferire tutto (160 L) nell'aposita piastra nera da 96
campioni del VICTOR2 In alternativa si poteva caricare tutto direttamente nella piastra nera.
Preparazione del VICTOR2 e analisi dati:
1. Accendere il VICTOR2 (interruttore sul retro della macchina a destra)
2. Accendere il computer
3. Avviare il software WALLAC 1420 manager a meno che non venga avviato autimaticamente
4. Cliccare sul pulsante «DEFINE PLATE MAP ….»
5. Seguire le istruzioni scegliendo come protocollo «picoGREEN (485nm/535 nm, 1.0s)», indicando i pozzetti della
piastra nella quale effettuare la misura e inserendo eventuali note che verranno associate ai risultati finali. Prima di
cliccare su FINISH, inserire la pistra nell'apposito alloggiamento del VICTOR 2. Cliccando su FINISH si avvia il
processo di misurazione.
6. Si possono osservare i dati raccolti in tempo reale durante il processo scegliendo l'opzione «Live dispay» sulla
finestra principale del software
7. Alla fine del processo si possono osservare i risultati cliccando sul menu «Tool» e scegliendo l'opzione «Results of
latest assay run». Si apre un dana sheet con i valori di fluorescenza associati ad ogni pozzetto
8. Esportare il dana sheet (menu «File», opzione «export»). Scegliere un nome per il file del tipo nomefile.xls
9. Avviare il software excel. Nel menu file scegliere l'opzione «apri» e selezionare il file salvato al punto 8
10. Copiare i valori di fluorescenza corrispondenti alle 8 soluzioni standard in un nuovo foglio excel. In una colonna
adiancente inserire i dati delle concentrazioni corrispondenti (500, 250, 100, 25, 10, 2.5, 1,0)
11. Selezionare le due serie di dati (concentrazioni, fluorescenza), cliccare sul menu «Strumenti», scegliere l'opzione
«analisi dati» e selezionare «regressione». Si apre una finestra in cui si immettono (selezionandole con il mouse sulla
finestra principale di excel) le celle della serie Y (fluoscerenza) e le cella della serie X (concentrazioni). Come opzione
di Output scegliere «nuovo foglio di lavoro». Dare OK
12. Sul nuovo foglio di lavoro Excel vengono quindi riportati i dati della regressione tra cui il coefficente angolare a e
l'intercetta all'origine b della retta di regressione
13. Le concentrazioni delle soluzioni da quantificare si calcolano usando la formula
concentrazione = [(fluorescenza – b)/a]*100
14. Salvare il file di excel cliccando sul menu «file opzione salva con nome»
15. Spegnere il VICTOR2 e gettare la piastra nei rifiuti solidi contaminati da etidio e altri mutageni.
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(3) SOLUZIONI PER L’ESTRAZIONE DI DNA,
L’ELETTROFORESI E LA PCR
Per l’estrazione di DNA:
1.
CTAB + MERCAPTOETANOLO per singolo campione:
Soluzione di CTAB + 0,2% di MERCAPTOETANOLO;
Nel nostro caso: 1000 μL di CTAB + 2 μL di MERCAPTOETANOLO per
campione.
2.
CTAB per 100 mL:
2 gr CTAB;
10 mL TRIS 1 M pH = 8,0 ;
4 mL EDTA 0,5 M pH = 8,0;
8,18 gr NaCl;
Portare a volume di 100 mL con H2O milli-Q sterile;
Filtrare con filtro da 0,2 μm.
3.
TRIS 1 M pH = 8,0 per 100 mL:
Pesare 12,11 g di TRIS e scogliere in 100 mL di H 2O milli-Q sterile;
Portare a pH = 8,0 con HCl.
4.
EDTA 0,5 M pH = 8,0 per 200 mL:
Pesare 37,22 g di EDTA e scogliere in 200 mL di H2O milli-Q sterile;
Portare a pH = 8,0 con HCl.
5.
CLOROFORMIO-ALCOOL ISOAMILICO (Rapporto 24:1) per 250 mL:
240 mL CLOROFORMIO;
10 mL ALCOOL ISOAMILICO.
6.
SODIO ACETATO 3 M pH = 5,2 per 100 mL:
Pesare 24,61 g di SODIO ACETATO e sciogliere in 80 mL H2O milli-Q sterile;
Scaldare;
Portare a pH = 5,2 con ACIDO ACETICO GLACIALE;
Portare a volume 100 mL con H2O milli-Q sterile;
Autoclavare.
7.
ISOPROPANOLO FREDDO
8.
ETANOLO ASSOLUTO FREDDO
9.
ETANOLO 70% per 200 mL:
140 mL ETANOLO ASSOLUTO;
60 mL H2O milli-Q sterile;
Mettere in bottiglia autoclavata.
10. TE1X per 200 mL:
10 mM TRIS (prelevare 2 mL TRIS da una soluzione 1M);
1 mM EDTA (prelevare 0,4 mL EDTA da una soluzione 0,5 M);
Portare a volume finale di 200 mL con H2O milli-Q sterile.
11. AMMONIO ACETATO 10 M per 100 mL:
Pesare 77,08 g NH4 ACETATO e sciogliere in 80 mL di H2O milli-Q sterile;
Portare a pH = 7,7 con ACIDO ACETICO GLACIALE (glaciale sta a indicare che
l’acido è puro al 99,98%);
Portare a volume 100 mL con H2O milli-Q sterile;
Filtrare con filtro 0,45 μm.
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Per l’elettroforesi:
12. TBE1X per 1 L:
Porre in un cilindro da 1 litro 100 mL di TBE10X;
Portare a volume con acqua milli-Ro.
13. TBE10X per 500 mL:
54 g TRIS BASE;
27,5 g ACIDO BORICO;
20 mL EDTA 0,5 M pH = 8,0;
Portare a 500 mL con acqua milli-Q sterile;
Porre in un recipiente sterile;
La bottiglia vuota va lavata accuratamente con acido acetico sotto cappa e poi
sciaquata con acqua milli-Ro prima dell’uso.
14. MARKER per 1 mL:
200 μL Leader 1Kb;
200 μL addensante (BBF);
600 μL TE1X o H2O milli-Q.
Per la PCR:
15. MIX dNTP (2,5 mM) per 400 L:
10 L
10 L
10 L
10 L
360 L
400 L.
100 mM A
100 mM T
100 mM C
100 mM G
H2O milli-Q sterile fresca
16. Preparazione primer nuovi liofilizzati:
Quando si ricevono primer nuovi liofilizzati, senza aprirli, fare una veloce spinata in
centrifuga e poi scoglierli con H2O milli-Q sterile per avere una concentrazione
finale di 100 M.
17. Primer MIX (FOR + REV) per PCR (10M) di 200 L:
100 M (la concentrazione nella provetta acquistata)
10 M (il MIX FOR + REV)
100M · X L = 10 M · 200 L  X = 20 L e allora:
20 L di primer FOR;
20 L di primer FOR;
160 L di H2O milli-Q sterile;
200 L totali.
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(4) VERIFICA DELLA QUALITÀ DI DNA SU GEL DI AGAROSIO
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Attenzione usare doppi guanti. Guanti bianchi e sopra quelli azzurri!
Accendere un piccolo bagno termostatato e impostare la temperatura a 56˚C;
Aggiungere nastro adesivo ai lati scoperti del gel-supporto ricordandosi di lasciare una linguetta per poter
successivamente strappare con facilità via il nastro adesivo;
Sistemare il pettine con le viti verso l’esterno del gel-supporto in modo che vi siano 2-3 mm di luce tra aghi del
pettine e fondo del supporto;
Preparare 40 mL (gel a 8 corsie) o 75 mL (gel a 15-20-30 corsie) o 200 mL (gel maxi) di TBE1X;
Aggiungere agarosio ad una concentrazione dello 0,8%. Pesare 320 mg per gel a 8 corsie; 600 mg per gel a 1520 corsie; 1,6 g per gel maxi;
Versare l’agar pesato in TBE1X e scaldare in microonde fino a bollitura. Si ricorda che mentre la bottiglia è
nel microonde il tappo deve essere svitato;
Agitare fino a completo dissolvimento;
Mettere a bagno a 56˚C, agitando ogni tanto; Questo passaggio si può saltare e raffreddare la soluzione
manualmente sotto acqua corrente fredda. Attenzione che l’acqua non entri nel contenitore. Ogni tanto sfiatare
un pò il contenitore. Non far raffreddare troppo altrimenti la soluzione gelifica nel contenitore;
Aggiungere ETIDIO BROMURO (EtBr) alla miscela agarosio-TBE1X in modo da ottenere una
concentrazione finale di 0,5 μg/mL di gel. Utilizzando una soluzione madre avente una concentrazione di 10
mg/mL, prelevo 2 μL per un gel da 8 corsie-40 mL; prelevo 3,75 μL per un gel da 15-20-30 corsie-75 mL;
prelevo 10 μL per un gel maxi-200 mL);
Mescolare piano senza fare bolle e versare in gel-supporto;
Portare le eventuali bollicine agli angoli del supporto con una spatola; prestare particolare cura alle zone
prossime al pettine e dunque ai futuri pozzetti. Per evitare di fare bolle versare la soluzione quando è ancora
calda;
Lavare il recipiente utilizzato prima che gelifichino i residui. La prima acqua con la quale si sciacqua il
recipiente deve essere versata in apposito contenitore per acque con EtBr.
Attendere 30-40 minuti prima di rimuovere il pettine. Il pettine si rimuove tenendo fermo il gel-supporto con i
pollici e sollevando con indice e medio il pettine con lento movimento verticale;
Togliere il nastro adesivo stando attenti affinché il gel non scivoli via o si danneggi;
Sistemare il gel-supporto nella cella e versare TBE1X fino a che il livello non superi di 1-2 mm il gel;
Togliere i guanti azzurri e lasciarli sul banco di lavoro riservato per l’EtBr. Buttare i guanti bianchi in apposito
contenitore; Lavarsi le mani con acqua e sapone;
Prendere un pezzo adeguatamente grande di parafilm sul quale si poggerà per ogni campione 1 μL di
addensante (blu di bromofenolo – BBF);
Aggiungere ora sopra ogni goccia di BBF 5 μL di campione di DNA pipettando e cambiando ogni volta
puntale prima di prelevare il successivo campione; Nei passaggi 18. e 19. lavorare velocemente perché il BBF
si secca all’aria;
Portato il parafilm con i campioni sopra il banco di lavoro riservato per l’EtBr. Indossare nuovamente doppi
guanti.
Riprendere più volte con il puntale il campione e caricarlo nel pozzetto senza creare bolle e senza inserirsi in
profondità con il puntale;
Chiudere la cella ed avviare l’elettroforesi a 75 V (in teoria 5-10 V per cm, i nostri gel sono solitamente lunghi
10 cm); quando l’addensante ha percorso il 60% della lunghezza del gel, il gel può essere prelevato, osservato
al transilluminatore a UV e/o fotografato. Il gel deve essere poi scaricato nel contenitore dei rifiuti tossici; il
tampone TBE1X può essere riciclato o raccolto in tanica se presenta una colorazione azzurrina. La cella e il
gel-supporto devono essere lavati con H2O e risciacquati con H2O milli-Ro.
MINI SUB CELL (8 pozzetti):
La procedura è sempre la stessa, ma:
1. Agarosio (0,8%) 0,28 g in 35 mL di TBE1X;
2. A 56˚C aggiungere 1,75 μL di Etidio Bromuro;
3. Per ogni pozzetto vanno 15 μL totali composti da:
1/5 addensante (3μL);
Volume di DNA desiderato;
Differenza in H2O milli-Q sterile a 15 μL.
PS. Se si usa la nuova metodica senza EtBr le procedure rimangono le stesse solo che invece dell’EtBr si mette il
nuovo colorante fluorescente che non è cancerogeno. Non si deve quindi lavorare su bancali inquinati da EtBr.
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(5) PCR
1.
2.
3.
Si prepari la tabella riportante il PCR plate:
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
E10
E11
E12
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
Immettere 1 μL di DNA campione (tamplate) nei pozzetti scelti e farlo in modo che la goccia tocchi il fondo
del pozzetto. Controllare se tutti i pozzetti prescelti sono stati riempiti. Tenere conto del numero di campioni
(n).
Si prepari il MIX con tutti i reagenti necessari per la PCR:
PCR
Tamplate
Buffer
MgCl2
dNTP
Primers
DMSO
H2O
Taq. pol.
TOTALE
4.
5.
6.
7.
μL
1
2,5
1
2
4
1,25
12,95
0,3
25 μL
٠ (n+1)
///
μL
Buffer: 10X PCR Buffer (contiene già 15 mM MgCl2) – della Roche;
MgCl2: 25 mM – della Roche;
dNTP: 2,5 mM;
Primers: mix 10 M di FOR e REV;
Taq. pol: – della Roche.
Il mix va preparato moltiplicando i singoli componenti del mix per n+1. Attenzione: la Taq polimerasi va
messa all’ultimo e subito dopo l’uso rimessa in congelatore a –20 °C.
In ogni pozzetto vanno immessi 24 μL del mix.
Coprire con i tappi o coperchio adatto e con un movimento veloce della mano far scendere tutte le goccie in
fondo ai pozzetti.
Riporre nella macchina da PCR e avviare il programma prescelto. Per scegliere la T m solitamente si usa il
valore di Ta diminuito di 4 °C.
Per Zea mays solitamente si usa un ciclo Touch down:
7 cicli
31 cicli
Temperatura (°C) 95
94
65
72
94
58
72
72 4
Tempo (mm:ss) 5:00 0:45 0:45 1:15 0:45 0:45 1:15 7:00 
*
8.
Controllare se c’è dell’amplificato su elettroforesi. In caso positivo procedere alla fase della purificazione e del
sequenziamento.
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(6) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER SEQUENZIAMENTO
Purificazione:
Portare a volume 100 L con H2O milli-Q sterile ogni pozzetto contenente il campione che si desidera
sequenziare. (Dato che in ogni pozzetto originariamente c'erano 25 L e 5L sono stati successivamente tolti
per fare la corsa elettroforetica, si devono aggiungere 80 L);
2. Trasferire i campioni mediante pipetta singola o multipla in piastra da purificazione;
3. Riporre la piastra da purificazione su macchina da aspirazione a -22 mmHg e lasciarla sotto aspirazione per 10
minuti (controllare con il timer);
4. Sbattere la piastra da purificazione su carta per togliere i residui;
5. Aggiungere 50 L di H2O milli-Q sterile ad ogni pozzetto contenente il campione;
6. Riporre la piastra da purificazione su minishaker e impostarla su microtitter per 5 minuti (controllare con il
timer);
7. Trasferire tutti i campioni purificati in piastra (PCR PLATE STORY) per la conservazione dei campioni a 20°C. Tenere uno schema della piastra per indicare la posizione dei campioni;
8. Contrassegnare i pozzetti non usati della piastra da purificazione per un loro successivo uso.
1.
Sequenziamento:
1. Preparare uno schema dei campioni ove indicare di che campione si tratta, cosa si sequenzia e il primer usato (FOR o
REV) – è il file sample sheet;
2. Diluire i primers a 2 M. A tale scopo preparare due provettine: una per primer FOR e l'altra per il primer REV.
Prelevare 4 L dalla soluzione 100 M di primer e aggiungere 196 L di H2O milli-Q sterile per avere una soluzione di
200 L (se ne fa tanto per una riserva)(100 M · x L = 2 M · 200 L  x = 4 L);
3. In ciascun pozzetto immettere 1,6 L del relativo primer;
4. Prelevare dalla piastra PCR PLATE STORY 5 L di ogni campione e immetterli nella piastra da sequenziamento;
5. Prelevare 3,4 L della MIX per ogni pozzetto;
6. MIX per sequenziamento:
reagente
1X
450X
H2O
1,3 L
585 L
Buffer 5X
1,9 L
855 L
Big Dye
0,2 L
90 L
3,4 L
1530 L
;
7. Chiudere tutto in alluminio e riporre in ghiaccio;
8. Eseguire la PCR di sequenza;
9. Purificare la miscela di sequenza (tutto al buio!):
10. Spinnare il plate;
11. Aggiungere 2,5 L di EDTA 125 mM;
12. Aggiungere 25 L di EtOH 100%;
13. Sigillare per bene con nastro adesivo d’alluminio e mescolare per inversione 4-6 volte;
14. Incubare per 15 m a temperatura ambiente (nel frattempo preparare gli eventuali bilancini);
15. Centrifugare a 2900 RCF (g) per 55 m a 10˚C;
16. Togliere il nastro adesivo d’alluminio e capovolgere la piastra su carta assorbente dando dei leggeri colpetti;
17. Centrifugare la piastra capovolta su carta assorbente a 190 RCF (g) per 2 m;
18. Lasciare evaporare l’EtOH per 15 m;
19. Conservare a 4˚C oppure proseguire:
20. Aggiungere 8 L di formamide;
21. Applicare il tappo septa alla piastra;
22. Denaturare a 95˚C per 2 m senza chiudere il coperchio del termociclatore;
23. Mettere in ghiaccio e tenendo al buio portare al sequenziatore assieme al file sample sheet in chiavetta USB.
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Materiali e Metodi
Filip Pošćić
(7) FORMULE CHIMICHE DEI PRODOTTI
USATI NEI PROTOCOLLI
Cl
CH3
+
Br
N
H
Cl
CH3(CH2)X
CH3
Cl
CH3
Cloroformio
CH3
CTAB = Bromuro di
cetiltrimetilammonio
CH3
CH
HS
OH
OH
Isopropanolo
Mercaptoetanolo
OH
HO
CH3
CH2
OH
B
Etanolo
OH
HO
Acido Borico
O
HO
OH
OH
H3C
TRIS = tris (idrossimetil)
amino metano
Acido acetico
O
O
+
H3C
Na
+
H3C
NH4
O
O
Sodio acetato e Ammonio acetato
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NH2
Materiali e Metodi
Filip Pošćić
NH2
Br
+
CH3
N
H2N
Etidio Bromuro (EtBr)
O
O
Br
S
O
OH
Br
Br
Br
OH
Blu di bromofenolo (BBF)
EDTA e il relativo processo chelante. EDTA = acido
etilendiamminicotetracetico
OH
H3C
N
N
N
N
N
N
H
Il colorante HOECHST 33258
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