Possibile ruolo protettivo sostenuto da Lisina al codone 222 del

Contributi pratici
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Possibile ruolo protettivo sostenuto da
isina al codone 222 del gene
della PrP caprina
e confronto con l’analogo umano
S. Colussi
M.V. Riina
M.G. Maniaci
S. Peletto
R. Corvonato
S. Trisorio
M. Caramelli
P.L. Acutis
CEA - I.Z.S. del
Piemonte, Liguria,
Valle d’Aosta, Torino
Le Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili
(EST), o malattie da prioni, rappresentano
un gruppo di malattie neurodegenerative,
ad esito fatale, caratterizzate dall’accumulo
nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) di una
isoforma patologica (PrPSc) della proteina
prionica cellulare (PrPC). Tale proteina, definita da Prusiner prione (proteinaceus infectious particle o entità proteica infettante)
costituirebbe, seconda la teoria più accreditata, l’agente eziologico di queste patologie. Le EST si presentano come stati patologici infettivi nei quali non si rilevano processi infiammatori e risposte immunitarie, sono
caratterizzati da un periodo di incubazione
più o meno lungo e da una lenta e progressiva neurodegenerazione.
Le indagini post-mortem rivelano alterazioni
spongiotiche della sostanza grigia, astrocitosi e perdita neuronale; in alcuni casi si
osservano placche amiloidi per deposizio-
ne di sostanza fibrillare. Le malattie da prioni possono colpire l’uomo, gli animali domestici e i selvatici.
Nelle EST che colpiscono l’uomo sono presenti tre tipi eziologici: malattie infettive quali kuru, malattia di Creutzfeldt-Jakob iatrogena (CJD), nuova variante di Creutzfeldt-Jakob (nvCJD); malattie genetiche quali CJD familiare, Insonnia Familiare Fatale (IFF), malattia
di Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), sindrome di Alpers; malattie idiopatiche come
CJD sporadica (sCJD) e IFF sporadica.
Negli animali sono invece comprese la scrapie degli ovi-caprini e del muflone, l’encefalopatia trasmissibile del visone (TME), la
malattia del dimagrimento cronico del cervo (CWD), l’encefalopatia spongiforme del
bovino (BSE), l’encefalopatia spongiforme
dei bovidi selvatici, l’encefalopatia spongiforme del gatto e dei felidi (FSE).
Nell’uomo e nell’ovino la suscettibilità alle
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malattie da prioni è influenzata da polimorfismi del gene della PrP dell’ospite.
Nella zona codificante del gene della PrP
umana sono state trovate mutazioni puntiformi ai codoni P102L, P105L, G114V,
A117V, M129V, Y145X, R148H, Q160X,
D178N, V180I, T183A, T188K, E196K,
F198S, E200K, V203I, R208H, V210I,
E211Q, Q217R, E219K, M232R e inserzioni
di varia lunghezza.
Alcune di queste mutazioni sono causa di
EST ad eziologia genetica mentre altre intervengono nel condizionare il fenotipo o
la suscettibilità alle EST idiopatiche e infettive. Il codone più importante nell’uomo è
il 129, che può presentare Metionina o Valina (M o V) e dare origine ai genotipi M/M,
M/V, V/V.
Nel caso della CJD sporadica, le combinazioni tra i due tipi esistenti di PrPSc ed i genotipi al codone 129 hanno permesso di
differenziare la malattia in quattro entità
fenotipiche.
Il codone 129 interviene anche nel condizionare la suscettibilità, la quale sembra
maggiore in caso di omozigosi, sia verso la
sCJD che verso la CJD acquisita.
Per quanto riguarda la nuova variante della
CJD, tutti i casi clinici riportati si sono verificati in persone omozigoti per Metionina
al 129. Rimane da verificare se i restanti genotipi comportino vera resistenza oppure
un prolungamento del periodo di incubazione, che darà luogo alla comparsa di casi
nel futuro più o meno prossimo: nel 2004 è
stato riportato un caso di vCJD preclinica
in un individuo eterozigote al codone 129.
Per quanto riguarda le EST umane ereditarie, la situazione è ancora più complessa,
essendo possibile l’identificazione di gruppi e sottogruppi diversi di malattia, legati a
diverse mutazioni puntiformi ed al polimorfismo al codone 129. In particolare, l’associazione tra una stessa mutazione puntiforme e i diversi alleli al codone 129 può
determinare variazioni fenotipiche tali da
dare origine non solo a malattie di durata e
caratteristiche clinico-patologiche differenti, ma anche a differenti malattie: ne è esempio la mutazione al codone 178 (da
Acido Aspartico ad Asparagina) che dà
luogo a CJD se associata a Valina al 129
oppure a IFF in associazione con Metionina
al 129.
Tra le mutazioni causa di EST genetiche vi è
la presenza di Lisina (K) al codone 219,
che è invece stata invocata come unico fattore protettivo nell’uomo nei confronti della sCJD.
Negli ovini il gene PrP è interessato da mutazioni puntiformi in più codoni; solo i polimorfismi dei codoni 136, 154 e 171 hanno un chiaro effetto sulla suscettibilità alla
scrapie.
Queste tre triplette nucleotidiche codificano
per sette alleli: A136R154Q171 (ARQ), VRQ,
TRQ, ARR, AHQ, ARH, ARK.
Di interesse è l’allele ARR, in quanto associato a resistenza.
Il genotipo ARR/ARR viene attualmente
selezionato positivamente nelle popolazioni ovine degli Stati membri dell’Unione
Europea, nell’ambito di un piano di selezione per la resistenza alle EST, disciplinato in Italia dal D.M. 17 dicembre 2004.
Sebbene la scrapie interessi anche i caprini, con le stesse problematiche di controllo che si pongono per gli ovini, non è stato
ancora possibile in questa specie determinare una forte associazione tra scrapie e
genetica.
Nei caprini sono stati identificati i polimorfismi ai seguenti codoni: V21A, L23P, G37V,
G49S, W102G, T110N, T110P, G127S,
L133Q, M137I, I142M, H143R, N146S,
N146D, R151H, R154H, P168Q, R211Q,
I218L, Q220H, Q222K e S240P.
Un’ulteriore variante allelica della capra interessa la regione del gene che codifica
per la ripetizione di sequenze octa e nona-peptidiche.
Alcune mutazioni più di altre hanno destato l’interesse dei ricercatori per il possibile
ruolo protettivo svolto. Goldmann et al.
(1998), ad esempio, lo ipotizzano per la
variante caratterizzata dalla delezione di
sequenze octapeptidiche con mutazione
G102. Lo stesso autore, infettando sperimentalmente capre con BSE e ceppi di
scrapie CH1641, SSBP/1 e ME7, ha osservato un prolungamento del periodo di incubazione, a seguito di somministrazione per
via intracerebrale, e la sopravvivenza, in caso di inoculazione sottocutanea o orale, di
capi con la mutazione caratterizzata dalla
presenza di Metionina al codone 142.
In Grecia, l’elevata frequenza con cui l’Arginina al codone 143 e l’Istidina al 154 so8 / 363
no state individuate nelle capre greche
non affette da scrapie, ha indotto a ritenere che rivestano una sorta di ruolo protettivo nei confronti della malattia.
Recentemente il nostro gruppo ha pubblicato uno studio caso-controllo in cui sono
stati indagati i polimorfismi del gene della
PrP in 177 caprini, 25 dei quali positivi alla
scrapie, provenienti da 6 focolai.
Da questo studio si è rilevato che nessuna
delle tre suddette mutazioni può essere
associata a resistenza alla scrapie.
Le mutazioni al 143 e 154 hanno mostrato
un’uguale frequenza in capre sane e affette
da scrapie mentre la mutazione al 142 è
stata trovata ad una frequenza troppo bassa per ottenere associazioni statisticamente significative, sebbene tutti gli animali
portatori di tale polimorfismo fossero soggetti sani. Lo studio ha però messo in luce
un possibile ruolo protettivo dato dalla
presenza di Lisina al codone 222, la quale
è stata riscontrata in 25 animali (7,1%), nessuno dei quali affetto da scrapie, con distribuzione significativamente differente tra
casi e controlli (Chi-quadro = 4,79; P value
= 0,029).
L’associazione ipotizzata tra K222 e resistenza alla scrapie nella capra si basa ancora su un numero basso di animali esaminati, ma ha destato la nostra attenzione perché essa è analoga alla mutazione K219
presente nell’uomo (la PrP caprina presenta infatti uno sfasamento di 3 aminoacidi in
più rispetto alla PrP umana).
Come già detto, tale mutazione sembra
conferire protezione nei confronti della
sCJD, come emerso da studi effettuati sulla
popolazione umana giapponese e coreana. Nella popolazione giapponese sana è
stata stimata una frequenza di K219 del 6%.
L’analisi di 20 pazienti affetti da sCJD certa
e di altri 65 affetti da sCJD probabile non
ha mai messo in evidenza la presenza di
Lisina al codone 219; l’elaborazione dei
dati mostra che tale distribuzione differente di K219 tra soggetti sani e malati risulta
statisticamente significativa.
Soggetti sani e affetti da malattie neurodegenerative non CJD mostrano invece un’analoga distribuzione della mutazione.
Stesso risultato si è ottenuto da uno studio
su 150 pazienti coreani affetti da sCJD risultati tutti omozigoti per Acido Glutam-
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mico (E219). Tale mutazione è stata ricercata anche nella popolazione italiana mediante uno studio caso-controllo che ha fornito
però esito negativo, in quanto tale polimorfismo non è stato rilevato né nei casi né nei controlli.
Indicazioni sul possibile ruolo protettivo della mutazione K219
derivano anche da studi effettuati in vitro su colture cellulari, dai
quali è risultata una maggiore resistenza alla conversione in PrPSc
della PrPC mutata rispetto alla forma fisiologica non mutata.
L’associazione a resistenza della mutazione al codone 219, sebbene al momento circoscritta alla popolazione giapponese e coreana, costituisce quindi un rilevante supporto al ruolo protettivo
della mutazione K222 caprina.
Studi biomolecolari intervengono a fornire una possibile spiegazione del meccanismo con cui avverrebbe la mancata conversione della PrPC con Lisina al 219/222 in PrPSc. Tali posizioni aminoacidiche sono parte del sito di interazione tra PrPC ed un fattore non
ancora ben definito, denominato proteina X, che interverrebbe in
modo fondamentale nel meccanismo di conversione modificando
la struttura secondaria della PrPC. Si formerebbe infatti inizialmente un legame tra PrPC e proteina X a cui successivamente si legherebbe la PrPSc determinando così la formazione di un trimero e la
conversione della proteina prionica cellulare in patologica.
A conversione avvenuta la proteina X verrebbe resa nuovamente
disponibile per ulteriori conversioni.
La presenza di Lisina sembrerebbe determinare una fortissima affinità di legame tra PrPC e proteina X tale da competere con succes-
so, in un individuo eterozigote, con l’interazione tra proteina X e
PrPC non mutata.
Questa interazione/competizione comporta due effetti: il primo
effetto consta nell’indisponibilità della proteina X alla formazione
di un legame con la proteina non mutata a cui consegue assenza
di conversione. Il secondo effetto determina l’interazione tra PrPC
mutata / proteina X / PrPSc con formazione del complesso ternario
all’interno del quale la proteina X rimarrebbe legata e non più
disponibile per ulteriori cicli di replicazione del prione; questa
modalità d’azione viene definita come dominante negativa.
I polimorfismi ai codoni 219 umano e 222 caprino potrebbero
quindi inibire la conversione della PrPC conferendo completa resistenza alla sCJD e alla scrapie o aumentando il periodo di incubazione al punto da impedire la manifestazione della malattia durante l’intera vita dei soggetti che presentano queste mutazioni.
La conferma dell’associazione a resistenza alla scrapie di K222
nella capra sarebbe di notevole importanza ai fini dell’implementazione di un piano di selezione analogo a quello attuato per gli
ovini. Attualmente abbiamo in corso ulteriori studi volti ad indagare tale associazione mediante prove di conversione proteica in
vitro e con la raccolta di ulteriori dati in focolai di scrapie caprina.
La bibliografia è disponibile sul sito
www.ilprogressoveterinario.it
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