RIASSUNTO I probiotici vengono definiti dalla FAO e dalla WHO come

RIASSUNTO I probiotici vengono definiti dalla FAO e dalla WHO come

RIASSUNTO
I probiotici vengono definiti dalla FAO e dalla WHO come “organismi vivi che, se somministrati in
quantità adeguata, apportano beneficio alla salute dell'ospite”. Per tale ragione, negli ultimi anni, essi
sono stati ampiamente impiegati sia in campo biomedico sia in acquacoltura, come potenziali agenti bioterapeutici nella cura di molte malattie e al fine di migliorare lo sviluppo dell’organismo allevato.
Numerose ricerche scientifiche effettuate negli ultimi decenni hanno ampliato le conoscenze sulle
funzioni dell’intestino, ponendo l’attenzione, in particolare, sul microbiota intestinale, la cui
composizione e la cui attività influenzano le funzioni metaboliche e l’omeostasi dell’ospite. Pertanto, il
microbiota intestinale è stato definito un vero e proprio organo metabolicamente attivo, molto importante
per la salute dell’organismo.
Recentemente, numerosi studi hanno messo in evidenza che una composizione alterata del microbiota
intestinale, caratterizzata da riduzione di batteri benefici e aumento di batteri pro-infiammatori e patogeni,
può essere implicata nello sviluppo di obesità, di resistenza all'insulina e di diabete, sia nell’uomo che nei
roditori; tuttavia i meccanismi sottesi a tali disordini non sono ancora del tutto noti. I risultati finora
ottenuti hanno evidenziato i numerosi effetti positivi esercitati dai probiotici, i quali, grazie alla loro
interazione con il microbiota intestinale e con le cellule dell’intestino e alla produzione di metaboliti
derivanti dalla loro attività microbica, sono in grado di controllare l’omeostasi energetica e di migliorare
il benessere dell’ospite.
La presente tesi di Dottorato è volta a determinare il ruolo del probiotico Lactobacillus rhamnosus IMC
501 nella regolazione di segnali coinvolti nel metabolismo lipidico, nel metabolismo del glucosio, nel
metabolismo osseo e nell’appetito, attraverso la modulazione del microbiota intestinale, in zebrafish.
Zebrafish (Danio rerio) è un modello ampiamente utilizzato in ambito biomedico grazie all’alta sintenia
del suo genoma con quello umano, alla presenza di patologie che si incontrano anche nell’uomo e al
completo sequenziamento del suo genoma; tali caratteristiche lo rendono un eccellente modello per lo
studio della genetica e dello sviluppo, per la comprensione delle malattie umane e per lo screening di
farmaci terapeutici.
Nel primo esperimento, embrioni di zebrafish provenienti dagli stessi parentali sono stati raccolti e
mantenuti in vasche da 3 L in condizioni controllate (26-28 °C, fotoperiodo 12/12 L/D). Gli embrioni
sono stati divisi in due vasche, un gruppo controllo e un gruppo trattato. Il gruppo controllo è stato
alimento solo con dieta commerciale, mentre il gruppo trattato è stato alimentato con dieta commerciale e
Lactobacillus rhamnosus IMC 501 alla concentrazione di 106 CFU ml-1 e successivamente, da entrambi i
gruppi sperimentali sono state campionate larve a diversi stadi di sviluppo partendo da: 72 hpf (hatching),
96 hpf (hour post fertilization), 6 dpf (days post fertilization), 8 dpf.
Attraverso un approccio multidisciplinare è stato possibile valutare l’effetto del probiotico L. rhamnosus
sul microbiota intestinale e sulla regolazione dei pathway che regolano metabolismo lipidico, glucidico e
appetito.
Analisi di high-throughput sequence della regione V3 del 16s rDNA batterico effettuate sulle larve a 6
dpf e 8 dpf, hanno messo in evidenza la capacità del probiotico di indurre cambiamenti nella
composizione del microbiota intestinale. Infatti il probiotico ha determinato un aumento di specie
benefiche appartenenti al phylum Firmicutes (prevalentemente lactobacilli and Streptococcus
thermophilus) e ha ridotto l’abbondanza di specie potenzialmente patogene appartenenti al phylum
Actinobacteria (in particolare Mycobacterium spp.), al phylum Proteobacteria (in particolare, Legionella,
Plesiomonas and Pseudomonas) e ai phyla Fusobacteria, Planctomycetes, Bacteroides.
I cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale avvenuti in seguito alla somministrazione di
L. rhamnosus, hanno indotto una modulazione a livello trascrizionale di geni coinvolti nella regolazione
del metabolismo lipidico, glucidico e dell’appetito. In particolare, per quanto riguarda il metabolismo
lipidico, i risultati ottenuti mediante analisi biomolecolari, hanno riportato una riduzione significativa
dell’espressione dei geni fit2, agpat4 e dgat2, i cui prodotti sono coinvolti nella produzione di trigliceridi
ed un aumento significativo dei livelli di espressione di mgll, il cui prodotto è un enzima coinvolto
nell’idrolisi dei trigliceridi. Inoltre il probiotico ha ridotto significativamente i livelli di espressione di
hnf4α coinvolto nella produzione del colesterolo. Infine, nelle larve trattate con probiotico, è stato
registrato un significativo aumento dei livelli di espressione di cck, coinvolto nella contrazione della
cistifellea e nel rilascio di bile, implicata nell’emulsificazione dei grassi.
Per quanto concerne il metabolismo glucidico, i risultati ottenuti hanno evidenziato un aumento
significativo dei livelli di espressione genica di nucb2/nesftain-1 glp-1 e pre-pro-insulin coinvolti nella
riduzione del glucosio nel sangue.
Inoltre, i dati ottenuti hanno messo in evidenza la capacità del probiotico di modulare l’appetito. Infatti, è
stata riscontrata una riduzione significativa dei livelli di espressione di geni oressizzanti come cb1, npy e
goat, e un aumento significativo dei livelli di espressione di geni anoressizzanti leptin e mc4r.
In aggiunta, i dati ottenuti da analisi di cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC),
condotte su larve a 6 dpf, hanno messo in evidenza una diminuzione significativa del contenuto totale di
trigliceridi e colesterolo nei trattati con probiotico rispetto al controllo. Grazie all’utilizzo dei fluorofori
BODIPY 505/515 e BODIPY D3828, che mettono rispettivamente in evidenza acidi grassi non polari e
acidi grassi a catena corta, è stato osservato, nelle larve a 6 dpf trattate con probiotico, un aumento
significativo del contenuto di acidi grassi non polari nella cistifellea e, nelle larve a 8 dpf trattate con
probiotico, un aumento di acidi grassi a catena corta, sia nella cistifellea che nell’intestino.
Le immagini di intestini di larve allo stadio di sviluppo a 6 dpf e a 8 dpf ottenute al microscopio a
trasmissione (TEM) hanno rilevato la capacità del probiotico di modificare l’architettura dell’epitelio
intestinale; infatti è stato riscontrato un aumento significativo della lunghezza degli enterociti e dei
microvilli, che ha determinato un incremento della superficie di assorbimento intestinale e una
diminuzione della quantità di gocce lipidiche.
In aggiunta, a 8 dpf è stato registrato un aumento significativo della lunghezza delle larve trattate con
probiotico, mentre un incremento significativo del peso è stato rilevato sia a 6 dpf che 8 dpf.
Nel secondo esperimento, embrioni di zebrafish sono stati divisi in due vasche, un gruppo controllo e un
gruppo trattato. Il gruppo controllo è stato alimentato solo con dieta commerciale, mentre il gruppo
trattato è stato alimentato con dieta commerciale e Lactobacillus rhamnosus IMC 501 alla concentrazione
di 106 CFU ml-1 e, successivamente, da entrambi i gruppi sperimentali sono state campionate larve a
diversi stadi di sviluppo, partendo da 9 dpf, 16 dpf, 23 dpf.
I risultati morfologici ed istochimici hanno mostrato la capacità di L. rhamnosus di accelerare la
formazione delle ossa attraverso un aumento significativo dell'espressione di geni chiave coinvolti nella
ossificazione, come runx2, sp7, mgp, gla e bglap, e attraverso la riduzione significativa dei livelli di
espressione del sost, inibitore della formazione dell’osso. I dati ottenuti mediante analisi di Western blott
hanno messo in evidenza, nelle larve trattate con il probiotico, un aumento delle MAP-chinasi 1 e 3
(Mapk1 e Mapk3), coinvolte nella differenziazione di osteoblasti e di osteociti. In particolare, si è
registrato un aumento significativo di Mapk1 a partire da 16 dpf e di Mapk3 a 23 dpf.
Per condurre il terzo esperimento, sono state formulate diete contenti diverse percentuali di lipidi (15%,
10% e 5%). La dieta con il 15% di lipidi supera la quantità di grassi necessaria a soddisfare i requisiti
energetici del pesce, mentre la dieta con il 10% di lipidi è isocalorica e fornisce la giusta quantità di lipidi
necessari a soddisfare il fabbisogno energetico; la dieta con 5% di lipidi, infine, rappresenta una dieta
ipocalorica con percentuale di lipidi minore rispetto a quella sufficiente a garantire il corretto fabbisogno
energetico. Ad ogni dieta è stato aggiunto il probiotico L. rhamnosus, in questo modo sono state ottenute
sei diete differenti (15%, 10%, 5% e 15% + L. rhamnosus, 10% + L. rhamnosus, 5% + L. rhamnosus).
Adulti di zebrafish sono stati alimentati ad libitum due volte al giorno per un mese, quindi sono stati
campionati. Attraverso uno studio multidisciplinare è stato possibile valutare le proprietà ipolipidemiche
del probiotico L. rhamnosus su zebrafish alimentato con diete contenenti diversa percentuale lipidica, e
valutare come il diverso contenuto lipidico nelle diete influenza il microbiota intestinale. I risultati
ottenuti da analisi biomolecolari hanno dimostrato la capacità del probiotico di modulare
significativamente i livelli di espressione di geni coinvolti nella regolazione del metabolismo lipidico e
dell’appetito. Infatti, il probiotico, nei pesci alimentati con 15%, 10% e 5% di lipidi, ha indotto riduzioni
significative a livello trascrizionale di hnf4α e npcl1a1, il primo coinvolto nella produzione di colesterolo
e il secondo coinvolto nell’uptake di lipidi da parte degli enterociti.
Inoltre, L. rhamnosus, nei pesci alimentati con il 15% e il 10% di lipidi, ha agito determinando un
aumento significativo dei livelli di espressione di geni anoressigenici come nucb2/nesfatin-1, glp-1 e
diminuendo significativamente il gene oressizante npy, suggerendo un ruolo importante del probiotico nel
controllo dell’appetito.
Immagini, ottenute al TEM, di intestini di zebrafish alimentati con diete contenenti il 15% e 10% di lipidi,
hanno messo in evidenza che un eccessivo contenuto di lipidi nella dieta determina un grave stato di
infiammazione intestinale che aumenta l’infiltrazione di popolazioni di granulociti e macrofagi
nell’epitelio dell’intestino. Tuttavia, attraverso l’analisi di ulteriori immagini al TEM, relative ad intestini
di zebrafish alimentati con le stesse diete (15% e 10%) arricchite con il probiotico, è stata evidenziata una
minor presenza di granulociti e macrofagi, e ciò ha consentito di mettere in luce la capacità del probiotico
di attenuare lo stato infiammatorio nell’intestino, causato dall’elevato contenuto di grassi nelle diete.
Infine, è stata registrata una diminuzione significativa del peso di zebrafish alimentati con le diete
contenti 15% e 10% di lipidi arricchite con il probiotico, rispetto ai gruppi alimentati con diete prive di
probiotico, mentre il probiotico non ha determinato nessun effetto significativo sul peso di zebrafish
alimentati con il 5% di lipidi. Sono state inoltre effettuate analisi high-throughput sequence e di HPLC, le
prime al fine di valutare il cambiamento del microbiota intestinale, le seconde affinché possano essere
valutate le differenze in contenuto di trigliceridi e colesterolo nei pesci i quali sono stati alimentati con
diete a diverso profilo lipidico e ai quali è stato somministrato probiotico.
I risultati ottenuti nella presente tesi di Dottorato contribuiscono a chiarire il ruolo svolto dai probiotici
sul microbiota intestinale di zebrafish, mettendo in luce un nuovo network di geni attraverso il quale il
probiotico espleta una funzione ipolipidemica e ipoglicemica e di riduzione dell’appetito, nonché di
accelerazione della formazione delle ossa.
I risultati qui descritti potrebbero avere validità scientifica diversa: se da un lato rappresentano un punto
di partenza per futuri studi sul metabolismo e potrebbero evidenziare un nuovo ruolo potenziale per il
probiotico nel trattamento di disturbi metabolici, dall'altro essi forniscono una visione utile per
biotecnologie sostenibili, applicabili per un aumento della produttività del settore dell'acquacoltura e
maricoltura.