Immunoematologia e trasfusione

 Il locus AB0 presenta 4 alleli: A1, A2, B, 0 Ciò
comporta l’esistenza di 6 fenotipi e 10 genotipi.
•
LE SPECIFICITÀ ABH SONO LEGATE ALLA COMPONENTE SACCARIDICA E
AL TIPO DI LEGAMI CHE QUATTRO ZUCCHERI ASSUMONO SULLA PARTE
TERMINALE DI UNA CATENA SACCARIDICA DEFINITA SOSTANZA DI BASE
SULLA QUALE SI HA LA BIOSINTESI DEGLI ANTIGENI ABH, MA ANCHE DI
ALTRI COME I LEWIS, P, I e i.
GENE
GLYCOSYL
TRASFERASE
IMMUNODOMINANT
SUGAR
H
L-Fucosyltransferase
L-Fucose
A
N-Acetyl-galactosaminyl- N- Acetyltransferase
galactoseamine
B
D- Galactosyltransferase D-Galactose
L’assenza degli antigeni A e B nel fenotipo O
derivano dalla delezione di una singola base
nucleotidica nella porzione del DNA codificante le
transferasi e responsabile dello spostamento della
cornice di lettura con conseguente sintesi di una
proteina sprovvista di attività transferasica.
ALLELI
A
B
O
258
G
G
Delezione
523
C
G
C
700
G
A
G
793
C
A
C
Base n°
Legenda
G=guanina
C=citosina A=adenina
Differenze nucleotidiche riscontrate fra gli alleli ABO
Gli antigeni eritrocitari o gruppi sanguigni
•
polisaccaridici
•AB0
•Lewis
•P
•H
•I
•
proteici
•Rh
Rh protein family
Proteine
Antigeni
Localizzazione genica
Famiglia delle proteine Rh
RhD
D
1p36.13-p34.3180
RhCcEe
Ce,CE,ce,cE
1p36.13-p34.3180
6p21.1-p1117,75,174
RhAG
Proteine accessorie
LW
LW
19p13.3181
IAP
Non conosciuta
3q1385
GPB
‘N, ‘S, s, U
4q28-q31
Band 3
Diego
17q12-q21182
Avent N., Blood 2000
Rh protein family
Il 40% di omologia indica una relazione
ancestrale
12 domini transmembrana con le
estremità N-terminale e C-terminale
rivolti verso la porzione
intracitoplasmatica
I primi 41 aminoacidi all’estremità Nterminale sono identici
RhD differisce da RhCE solo per 30-35
aa lungo l’intera sequenza della
proteina.
Nonostante questa omologia le
proteine RhCcEe non esprimono
l’antigene D e viceversa
Avent N., Blood 2000
Soggetti RhRh-negativi
Nella popolazione Caucasica i soggetti RhD- hanno la
delezione del gene RhD
In altre popolazioni come i Giapponesi o gli Africani il
fenotipo D- non è legato alla perdita del gene.
Avent N., Blood 2000
Sistema LEWIS
Gli Ag sono correlati con quelli AB0; i
G.R.acquisiscono il fenotipo adsorbendoli
dal plasma; il gene è distinto ma correlato
con quello del carattere di “secretore”
Sistema P
La maggioranza degli uomini è P1+; le
reazioni trasfusionali sono rare ma gravi
Sistema MN
Gli Ag sono glicoforine; gli Ac anti-M o N
umani sono rari; se IgG→eritroblastosi
Sistema KELL e Sistema Duffy
Possono causare reazioni
trasfusionali gravi, evitabili con
la prova crociata maggiore
Gli antigeni K e Fy(a) / (b)
sono buoni immunogeni ed
evocano la produzione di
anticorpi di isotipo IgG
I principali obiettivi del trasfusionista sono
due:
il primo è prevenire la reazione
trasfusionale identificando i pazienti
immunizzati e fornendo loro sangue
compatibile;
il secondo è prevenire la produzione di
anticorpi, scegliendo i donatori più
simili, come caratteristiche gruppoematiche, al paziente.
COMPATIBILITY TESTING
What is Compatibility Testing?
• Pre Transfusion Protocol to insure the
Patients health and the survival of
transfused red cells. It includes:
– Patient Identification, Labeling, Collection
of patient sample, ABO, Rh, Crossmatch
search for irregular antibodies.
PROVE DI COMPATIBILITA’
Prove crociate
IL SIERO DEL PAZIENTE VIENE INCUBATO A
37C°CON I GLOBULI ROSSI DELLE UNITA’
DI SANGUE DA TRASFONDERE
CONSENTE DI RILEVARE:
L’ INCOMPATIBILITA’ PER IL SISTEMA ABO
ED EVENTUALI Ab DIRETTI CONTRO
Ag a FREQUENZA MOLTO BASSA
Steps In Compatibility Testing
Review available Recipient Records FOR:
–
–
–
PREVIOUS ABO & Rh
Any PRIOR UNEXPECTED Antibodies
Any PRIOR ADVERSE REACTIONS to
transfusion
Correct identification of Donor Unit by
Confirming
1. The unit ID with the ID on the donor
unit’s records
2. The unit’s ABO & Rh on the record for
consistency with that of the patient
Gli anticorpi verso gli antigeni eritrocitari
•
anticorpi naturali
• anticorpi irregolari
Comprendono: l’anti-A dei soggetti B, l’anti B dei
soggetti A e l’anti-A, anti-B e anti-AB dei soggetti 0.
Oltre questi ricordiamo, gli anticorpi irregolari anti-A1
che si ritrovano nei soggetti con fenotipo A2 e A2B e
l’anti-H che si può ritrovare in alcuni soggetti A1, A1B, B
ed in tutti i soggetti con fenotipo Bombay.
Anti-A1: i sieri dei soggetti B e 0 contengono una miscela
di anti-A e anti-A1. L’anti-A1 è anche presente nel 2% dei
soggetti A2 e nel 25% nei soggetti A2B
Anti-H: esistono 3 tipi di anti-H, uno attivo a 37°C che si
osserva nei soggetti con fenotipo Bombay, uno “freddo”
con optimum termico a 4°C (nei soggetti A1, A1B o B non
secretori di sostanze gruppo specifiche) e uno che viene
formato come autoanticorpo.
Anticorpi Irregolari
Per “ricerca di anticorpi irregolari”, si
intende quell’insieme di procedure
atte alla evidenziazione della
presenza di anticorpi “inattesi” nel
siero di un paziente.
Ricerca di anticorpi:
1. Prove di compatibilità
2. Coombs diretto
3. Prova indiretta del gruppo sanguigno
Test di Coombs
•Test di emoagglutinazione in vitro utilizzato
per evidenziare anticorpi eritrocitari
•Test diretto
•Test indiretto
ANTIGRAM
L’ANTIGRAM di un pannello eritrocitario
ad 11 cellule costituito da aliquote di
emazie del gruppo 0 provenienti da
singolo donatore selezionate per la loro
composizione antigenica ci mostra i più
frequenti anticorpi che si possono trovare
nel siero di un paziente.
REAZIONI TRASFUSIONALI
ACUTE
IMMUNOLOGICHE
emolitiche
febbrili non emolitiche
Allergiche (cutanee e
anafil.)
edema polmonare non
cardiogeno (TRALI)
NON
IMMUNOLOGICHE
contaminazione
batterica
sovraccarico
circolatorio
emolisi fisica/chimica
danni da conservazione
EDEMA POLMONARE NON CARDIOGENO
transfusion related acute lung
injury (TRALI)
Grave sindrome respiratoria, caratterizzata dal
classico quadro radiologico e sintomatologico
senza insufficienza cardiaca, che interviene
durante o entro 6 ore dal termine della
trasfusione con una frequenza variabile 1:5000 1:190000 eventi trasfusionali (le forme lievi
frequentemente non vengono diagnosticate)
E’ causato da una reazione tra leucoagglutinine del
donatore e leucociti del ricevente con formazione di
aggregati leucocitari che, intrappolati nel microcircolo
polmonare, ne alterano la permeabilità vasale
REAZIONI TRASFUSIONALI
RITARDATE
IMMUNOLOGICHE
emolitiche ritardate
alloimmunizzazione
leucociti piastrine
porpora post-trasfusionale
da HPA1-a
NON IMMUNOLOGICHE
emosiderosi indotta dalle
trasfusioni
trasmissione malattie
infettive (virali)
REAZIONI IMMUNOLOGICHE
EMOLITICHE RITARDATE
SINTOMI
febbre, ittero, ANEMIA inattesa (7-10gg dopo
l’infusione) puo’ essere necessaria un’altra trasfusione
talvolta asintomatiche
EZIOLOGIA
anticorpi IgG
risposta anamnestica
• Rh,Kell,Duffy, Kidd, MNS
anticorpi siero - eluato
Complicanze infettive
• virali:
epatite B, C
HIV1-2
Mononucleosi infettiva
CMV
HTLV 1 -2
Parvovirus
•batteriche
endogene (dal sangue del donatore)
treponema,brucella,rickettsia,yersinia,campylobacter,staph.aureus,
strept.viridans
esogene (dalla cutedel donatore o dall’ambiente)
staph.epidermidis,micrococcus,sarcina,pseudomonas,flavobacterium
bacillus
•parassiti
•malaria,tripanosoma,toxoplasma,babesia,leishmania
• La disponibilità di sangue è limitata
• da ciò deriva la necessità di stabilire i
criteri per un uso congruo di tale
risorsa
Pazienti di competenza chirurgica
Abitualmente viene richiesta una quantità di sangue eccedente le reali necessità, con
conseguente sequestro delle unità non utilizzate da parte dei reparti per almeno
due o tre giorni e conseguente invecchiamento del sangue stesso e quindi a
rischio di scadenza. La soluzione a questo problema è l’assegnazione “a
disposizione” e la prova rapida di compatibilità.
Pazienti di competenza medica
Ai pazienti di competenza medica è raccomandata la seguente strategia:
1. Tipizzazione eritrocitaria per il maggior numero di antigeni prima di iniziare le
trasfusioni.
2. Prova di compatibilità per ogni unità assegnata.
3. Ricerca di anticorpi irregolari.
4. Controllo autologo.
Donne in gravidanza
Devono essere sottoposte alle seguenti indagini:
1. Tipizzazione eritrocitaria.
2. Ricerca di allo-anticorpi irregolari.
3. Nel caso di compatibilità A B 0 eventualmente cross-match con le emazie del
marito.
Donatori di sangue
La ricerca di anticorpi irregolari si esegue per i seguenti motivi.
Evidenziare la presenza di anticorpi.
Nel caso in cui sangue di gruppo 0 venga impiegato per un ricevente di altro
gruppo.
GLI EMOCOMPONENTI
Gli emocomponenti sono i prodotti della
separazione degli elementi costituitivi del sangue
e vengono ottenuti sia da una donazione tradizionale di sangue
intero sia da una donazione mediante aferesi con separatore
cellulare.
Gli emocomponenti si distinguono in due grandi
categorie:
USO TRASFUSIONALE
USO TOPICO
Emocomponenti: Classificazione
Per uso
Trasfusionale
Concentrati eritrocitari
convenzionali o modificati
Concentrati piastrinici
convenzionali o modificati
Plasma fresco congelato
Concentrati leucocitari
Concentrati di c. staminali da
sangue periferico
Emocomponenti
Sangue placentare
Per uso
Topico
Colla di fibrina
Gel piastrinico
Emocomponenti: Uso più frequente
Preparazione di C.E. ; P.F.C. ; C.P. (da Buffycoat)
Partendo da una donazione di 450 ml di sangue intero in sacca quadrupla
Prima centrifugazione (a.T.A.)
Parte superiore della
sacca
Strato intermedio tra il
plasma e i globuli rossi
Parte inferiore
della sacca
Alta velocità
Emocomponenti
Caratteristiche
Plasma povero di
piastrine
200
200--250 ml di plasma
(contiene la maggior parte
del plasma da congelare.)
Buffy - coat
Globuli Rossi
50 ml Contenenti:
10% di globuli rossi 70% di
leucociti
80% delle piastrine
160
160--180 ml di globuli rossi + 100
ml di S.A.G.M (contengono circa
il 30
30%
% di leucociti)
Seconda Centrifugazione (a.T.A.)
Emocomponenti
Parte superiore della
sacca
Bassa velocità
Caratteristiche
Concentrato Piastrinico
Da BuffyBuffy-coat
1) Da singolo B.C.
1) 50 ml contenenti:
50
50--60 x 109 piastrine
2) Da pool di 44-6 B.C.
B.C
2) 350350-400 ml contenenti:
280
280--360 x 109 piastrine
Parte inferiore
della sacca
B.C. povero di
piastrine
Contiene circa il 10
10%
% di globuli
rossi e il 70
70%
% di leucociti donati
CONCENTRATI ERITROCITARI E PIASTRINICI
MODIFICATI
C. Eritrocitari leucodepleti
C. Eritrocitari lavati
Concentrati Eritrocitari
Modificati
C. Eritrocitari irradiati
C. Eritrocitari congelati
C. Eritrocitari per uso pediatrico
C. Eritrocitari “universali”
C. Piastrinici leucodepleti
Concentrati Piastrinici
Modificati
C. Piastrinici lavati
C. Piastrinici irradiati
C. Piastrinici congelati
Quando si trasfonde ?
• Emazie
• Piastrine
•Plasma
Chemioterapia
Trapianto
Anemia Aplastica
Mielodisplasie
Insufficienza midollare
Chemioterapia
Trapianto
Anemia Aplastica
Mielodisplasie
Insufficienza midollare
CID
Trombocitopatie
CID
HUS-TTP
sovradosaggio di:
anticoagulanti orali
agenti trombolitici
In caso di emorragia acuta …..
La trasfusione di emazie dovrebbe in teoria essere
effettuata tanto rapidamente quanto è necessario per
correggere il deficit di trasporto di ossigeno nella
emorragia acuta
una unità di emazie aumenterà il livello di emoglobina di
1 g/dl in una persona di 70 chilogrammi (3-4 ml/kg di
emazie concentrate).
TRASFUSIONE DI GLOBULI ROSSI NELL’ANEMIA CRONICA
L’obiettivo della trasfusione di globuli rossi in questi pazienti è di ridurre gli
effetti deleteri dell’anemia portando il tasso di emoglobina o l’ematocrito al di
sopra del livello stabilito.
Sintomi dell’anemia insorgono di solito quando il tasso di emoglobina scende al
di sotto di 4.5-5 g/dL.
I sintomi includono tachicardia, dispnea/tachipnea, sensazione di “testa vuota”,
sincope, astenia od intolleranza allo sforzo muscolare, angina, cefalea,
claudicatio ed affaticamento.
I sintomi possono esordire precocemente (ad esempio con tasso di emoglobina
di 7 g/dL) in pazienti con età avanzata e/o con ridotta funzionalità
cardiorespiratoria.
Pazienti con tasso di emoglobina superiore ad 8 g/dL raramente richiedono
trasfusione di globuli rossi.
Indicazioni per la trasfusione di un
concentrato
eritrocitario
Indicato per
incrementare l’apporto
di ossigeno ai tessuti :
Hb < 8g/dl o Ht < 24%
Hb < 9 g/dl in pazienti in programma per intervento
Hb < 10 g/dl in paziente sintomatico per anemia in cardiopatia
e/o pneumopatia
Neonati con Hb <13g/dl ed exsanguinotrasfusione.
Non sono indicati:
per espandere il volume ematico
in caso di carenza marziale e/o vitaminica in condizioni
cliniche stabili
Note di buona pratica clinica
Per valutare l’efficacia della trasfusione occorre
valutare le modificazioni dei parametri ematologici
e riportarli nella cartella clinica
La quantità di CE da trasfondere può essere calcolata
con la seguente formula :
Corrected Count Increment
Q. tà sangue da trasfondere = 251 x peso Pz. in Kg x
l’incremento di Hb desiderato/Ht medio unità da
trasfondere
Emazie congelate
•Congelate entro 7 giorni dal prelievo
Metodica ad “alto glicerolo”conservate da –60°C a -80°C
Metodica a “basso glicerolo” conservate in vapori di azoto
liquido a temperatura compresa tra -140°C e -150°C
Possono essere conservate per 10 anni
Scongelate, lavate e ricostituite, sospese in una soluzione
fisiologica. Conservate tra +2 e +6 °C per non più di 24 ore
CQ:
Ht compreso tra 0,65 e 0,75%
Hb >36g/unità
9
Leucociti < 1x10
Concentrati piastrinici
Indicati:
Per il trattamento e profilassi delle emorragie dovute a carenza qualitativa
o quantitativa delle piastrine
Per i pazienti medici stabili e senza complicazioni il valore soglia è 10.000/
µL
Terapia dell’emorragia nei pazienti medici con piastrine 20.000/µL
Per i pazienti chirurgici il valore soglia è 50.000/ µL
Se il conteggio è compreso tra 50.000 e 100.000/ µL la trasfusione di
piastrine è indicata solo in condizioni particolari (procedure a cielo
coperto, neurochirurgia, campi operatori altamente vascolarizzati).
CQ:
Contenuto in piastrine = 45-85 x 109
Plasma = 50-60 ml.
Leucociti < 1x109
Eritrociti<1x109
Ph tra 6,4-7,4
Consevate tra 20°°-24°°C in continua agitazione per 5gg
Non indicati:
•Nelle piastrinopenie da eccessiva
distruzione (porpora trombocitopenica
idiopatica, porpora trombotica
trombocitopenica, sindrome uremicaemolitica, coagulazione intravascolare
disseminata)
nella circolazione extracorporea e nella
trasfusione massiva a scopo profilattico
come profilassi se il conteggio è
>10.000/microlitro e il paziente è in
condizioni
stabili
Trasfusione di Piastrine
Valutazione clinica della risposta
alla trasfusione piastrinica
Viene effettuata tramite la formula del corretto
incremento (Correct Count Increment)
CCI = incremento della conta piastrinica
(migliaia/µL) x superficie corporea in mq /numero di
piastrine trasfuse (x 1011)
La trasfusione viene considerata:
efficace CCI >7500
parzialmente efficace CCI 5000-7500
inefficace CCI <5000
Plasma per uso clinico
•Prodotto da sangue intero o da aferesi di donatori periodici e volontari
Congelato entro 6 ore dalla donazione
Congelato in maniera uniforme, entro 1 ora
Conservato per 24 mesi se stoccato a - 40°C Scongelato in bagno con continua
agitazione a temperatura tra + 30° e + 37°C
Utilizzato nel più breve tempo possibile, non oltre 24 ore se conservato tra 2°- 6°C
CQ:
Deve contenere almeno il 70% del contenuto originale di Fattore VIII
Proteine totali > 50 g/L
Assenza di anticorpi irregolari clinicamente significativi
9
Emazie residuo < 6 x10
9
Leucociti residuo <0,1x10
9
Piastrine residuo < 50x10
Assenza di precipitati visibili
Sterilità
Pretransfusion INR Predicts the
Effect of FFP
Change in INR/unit FFP
0.9
0.6
0.3
0.1
(0.0)
0
(0.0)
(0.0)
-0.3
(0.1)
(0.1)
(0.4)
-0.6
-0.9
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Pre-transfusion INR
1.6
>1.6
Crioprecipitato
•Costituito dalla frazione crioglobulinica del plasma
fresco
Scongelato lentamente a 2°- 6°C per 12 ore e
concentrato ( per centrifugazione o sifonamento) in un
volume finale di 10-20 ml
Contiene fatt.VIII,fatt. di Von Willebrand, fibrinogeno,
fatt.XIII e fibronectina
CQ :
Fatt.VIII ≥ 70% del contenuto di partenza
Indicazioni alla raccolta di
sangue autologo.
Tipo intervento
Predeposito Recupero
Interventi di chirurgia vascolare
maggiore
Si
Si
Interventi a cuore aperto
Si
Si
Protesi totale d’anca
Si
Si
Protesi totale di ginocchio
Si
No
Interventi correttivi per scoliosi
Si
Si
Prostatectomia radicale
Si
Si
Placenta previa
Si
No
Gravidanza plurima
Si
No
Trapianto di fegato
Si
Si
Emocomponenti per uso non
trasfusionale
Gel di piastrine azione di stimolo sulla rigenerazione
tessutale derivato dall’associazione del concentrato
piastrinico ( fonte di fattori di crescita) con il
crioprecipitato ( fonte di fibrinogeno, fibronectina e altri
fattori procoagulanti)
Colla di fibrina azione adesiva ed emostatica derivato da
plasma (ricco fibrinogeno, fibronectina ed altre proteine
plasmatiche con scarsa presenza di piastrine)
Per essere utilizzati clinicamente devono essere attivati,
utilizzando cloruro di calcio ( o gluconato di calcio) e
trombina autologa o batroxobina
Piastrine e plasma rappresentano una fonte autologa o
omologa di fattori di crescita e proteine procoagulanti,
clinicamente impiegabili (PRP)
L’AFERESI
SEPARATORE A
FLUSSO DISCONTINUO
SEPARATORE A
FLUSSO CONTINUO
L’AFERESI
Densità
g/cm3
Diametro
Volume µm3
Plasma
1.026
Piastrine
1.058
2.5
16
Monociti
1.062
10.4
740
Linfociti
1.070
6.5
230
Neutrofili
1.082
8.0
270
Eritrociti
1.096
5.5
87
L’AFERESI
AFERESI PRODUTTIVA
SINGLE COMPONENT
PLT
PFC
MULTI COMPONENT
GR - PLT
PFC - PLT
DOPPIA PLT
GR - PFC
DOPPIA GR
CELLULE STAMINALI DA SANGUE
PERIFERICO
Vengono raccolti da donatore mediante leucoaferesi dopo
mobilizzazione nel torrente circolatorio con fattori di
crescita GM-CSF. Per ottenere un numero adeguato di
cellule CD 34 è necessario procedere afereticamente da 3 a 4
volte il volume ematico (200 ml/kg di peso).
Le cellule staminali da sangue periferico P.B.S.C.
(Peripheral Blood Stem Cell) vengono sospesi in
una soluzione contenente un crioprotettore (DMSO
(DMSO)
)
e proteine (plasma
(plasma--albumina
albumina)
) congelati e conservati
a -180 °C in fase gassosa di azoto.
Devono essere trasfuse
scongelamento a 37 °C.
subito
dopo
SANGUE PLACENTARE
Contiene i progenitori emopoietici indispensabili ai fini
del trapianto di midollo osseo sia autologo che
allogenico ed è in grado di determinare un completo
ripopolamento cellulare. Prelevato subito dopo la
resezione del cordone ombelicale viene congelato nel
più breve tempo possibile (in DMSO 10%). Viene
conservato in azoto liquido a -140 °C fino a 15 anni .
Volume sacca ≈: 60 ml; cellularità totali: >800*106;
determinazioni in citofluorimetria delle cellule CD34
Tipizzazione HLA. Tale volume però non consente
nell’ adulto di somministrare la dose minima
cellulare raccomandato (20
(20 milioni di cellule
nucleate/kg di peso c o r p o r e o). Per ovviare
a
questi inconvenienti sono possibili programmi di
espansione cellulare con aumenti in due settimane di
circa 100 volte il numero di cellule staminali.