progetto di ricerca Caterina Giancotta-Liceo
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progetto di ricerca Caterina Giancotta-Liceo
PhD Student Dr.ssa Caterina Giancotta Dottorato di Ricerca in Scienze della Vita – XXX Ciclo Dipartimento di Scienze della Salute - Università “Magna Græcia” di Catanzaro et C.Spadafora; C .Lia; F. De Fazio ; A. Faragò; S. Timpani – Liceo Scientifico Enrico Fermi Sersale TITOLO DEL PROGETTO Nuove strategie terapeutiche, gli antiossidanti di origine naturale: Una nuova frontiera nel trattamento della’aterosclerosi. OBIETTIVO FINALE DEL PROGETTO Il presente progetto di ricerca ha l’obiettivo di: 1) Caratterizzare, in vivo, il danno endoteliale mediato dall’insorgenza di stress ossidativo indotto a livello vascolare da elevati livelli di lipidi; 2) Identificare e studiare le vie di trasduzione del segnale attivate dall’incremento dei radicali liberi nel processo aterosclerotico e l’eventuale attivazione di meccanismi di difesa endogeni della cellula endoteliale; 3) Valutare l’efficacia di trattamenti farmacologici innovativi sul processo di infiammazione, proliferazione neo-intimale e sulla conseguente disfunzione endoteliale; BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA NAZIONALE O INTERNAZIONALE (RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ESSENZIALI, SITI WEB, EVENTUALI RICERCHE IN CORSO Le malattie cardiovascolari, quali l’infarto, l’ictus e l’insufficienza cardiaca, rappresentano una delle principali cause di morte nel mondo sviluppato, e sono destinate a diventare uno dei problemi più significativi per la salute. In tale contesto, l’aterosclerosi rappresenta la causa principale delle malattie cardiovascolari. Le lesioni aterosclerotiche interessano principalmente le grandi e medie arterie elastiche e muscolari ed i principali fattori di rischio coinvolti nel suo sviluppo sono: diabete mellito, ipertensione, ipercolesterolemia, obesità e stile di vita (fumo, inattività fisica, abitudini alimentari) che determinano la così definita disfunzione endoteliale. La disfunzione endoteliale, che segue l’iperproduzione di ox-LDL, rappresenta l’evento chiave dello sviluppo di aterosclerosi. Gli effetti fisiopatologici che caratterizzano la disfunzione endoteliale sono: rilascio di citochine proinfiammatorie; aumentata espressione di molecole di adesione e di citochine chemiotattiche; proliferazione di SMCs e loro migrazione dalla tonaca media alla tonaca intima. Tali eventi provocano la formazione di neo-intima, che a sua volta può condurre ad occlusione vascolare e restenosi. L’aumentata produzione di radicali liberi è coinvolta nell’induzione della crescita e della migrazione delle SMCs vascolari, nella modulazione della funzione delle cellule endoteliali, nell’espressione di un fenotipo pro-infiammatorio e nel rimodellamento/alterazione della matrice extracellulare. Recentemente è stato inoltre dimostrato che lo stress ossidativo è capace di accelerare le modificazioni ossidative delle lipoproteine a bassa densità (LDL). L’aumento di concentrazione delle LDL ossidate esacerba quindi il rilascio di citochine pro-infiammatorie; l’aumentata espressione di molecole della classe delle immunoglobuline; l’attivazione di citochine chemiotattiche; la proliferazione e la migrazione delle cellule muscolari lisce ed infine la compromissione della vasodilatazione endotelio-dipendente. Recentemente, in presenza di disfunzione endoteliale indotta da ox-LDL, è stata descritta una ridotta disponibilità di ossido nitrico (NO) e questa è stata associata ad inibizione dell’attività dell’isoforma endoteliale della NO-sintetasi (eNOS). L’insieme di questi eventi è modulato dall’iper-espressione del principale recettore per le ox-LDL denominato Lectin like ox-LDL receptor-1 (LOX-1), responsabile del legame, dell’internalizzazione e della degradazione delle ox-LDL nelle cellule endoteliali. Tutti questi eventi giocano ruoli importanti nella patologia dell’aterosclerosi, suggerendo che le vie di trasduzione del segnale attivate dall’incremento dei radicali liberi possano rappresentare importanti target terapeutici. Numerosi studi sperimentali ed epidemiologici, suggeriscono che i polifenoli di origine vegetale ed in particolare i flavonoidi, potrebbero svolgere un ruolo preventivo nel processo aterosclerotico. Tali effetti sembrano essere correlati alle loro attività pleiotropiche , quali l’attività antinfiammatoria ed antiossidante, ma sono rari gli studi scientifici ben documentati. Riferimenti Bibliografici 1. Zeadin MG, Petlura CI, Werstuck GH. Molecular Mechanisms Linking Diabetes to the Accelerated Development of Atherosclerosis. Can J Diabetes. 2013 Oct;37(5):345-50. 2. Steinberg D. The Cholesterol Wars: The Skeptics vs. the Preponderance of Evidence. San Diego: Elsevier Academic Press, 2007. 3. Orekhov AN, Andreeva ER, Andrianova IV, Bobryshev YV. Peculiarities of cell composition and cell proliferation in different type atherosclerotic lesions in carotid and coronary arteries. Atherosclerosis. 2010 Oct;212(2):436-43. 4. Muscoli C, Sacco I, Alecce V, Palma E, Nistico` R, Costa N, Clementi F, Rotiroti D, Francesco Romeo, Daniela Salvemini, Jawahar L. Mehta, and Vincenzo Mollace. The Protective Effect of Superoxide Dismutase Mimetic M40401 on Balloon Injury-Related Neointima Formation: Role of the Lectin-Like Oxidized LowDensity Lipoprotein Receptor-1. J Pharmacol Exp Ther. 2004 Oct;311(1):44-50. 5. Mollace V, Ragusa S, Sacco I, Muscoli C, Sculco F, Visalli V, Palma E, Muscoli S, Mondello L, Dugo P, Rotiroti D and Romeo F. The protective effect of bergamot oil extract on lecitine-like OxyLDL Receptor-1 expression in balloon injury related neointima formation. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2008 June 13: 120129. 6. Kozlov S, Balachonova T, Machmudova H, Tripoten M, Andreevskaya M, Rogoza A, Kuharchuk V. Carotid atherosclerosis, endothelial disfunction, and arterial stiffness in young and middle-aged men with coronary artery disease. Int J Vasc Med. 2012;2012:950130. 7. Li D, Mehta JL. Oxidized LDL upregulates angiotensin II type 1receptor expression in cultured human coronary artery endothelial cells: the potential role of transcription factor NF-kappaB. Circulation. 2000;102:1970–6. 8. Szmitko PE, Wang CH, Weisel RD, Jeffries GA, Anderson TJ, Verma S. Biomarkers of vascular disease linking inflammation to endothelial activation: Part II. Circulation. 2003 Oct 28;108(17):2041-8. 9. Li D, Mehta JL. 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors protect against oxidized lowdensity lipoprotein-induced endothelial dysfunction. Endothelium. 2003;10(1):17-21. 10. Sawamura T, Kume N, Aoyama T, Moriwaki H, Hoshikawa H, Aiba Y, et al. An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein. Nature. 1997;386(6620):73–7. METODOLOGIA (Descrizione dettagliata della metodologia che si prevede di utilizzare, incluse le modalita’ di validazione) Ratti Wistar maschi, con peso di 300-350 gr, verranno anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di 0,08 ml/kg p.v. di Zoletil/Domitor. Il grado di anestesia verrà verificato mediante risposta motoria degli animali agli stimoli dolorosi. Si procederà ad esposizione chirurgica della carotide comune di destra e della rispettiva carotide esterna. Si effettuerà la legatura della carotide esterna con filo di seta nero 5-0. Si procederà quindi all’esecuzione di un arteriotomia longitudinale con bisturi 11 a livello della carotide esterna, in prossimità della legatura. Si procederà dunque all’inserimento di un catetere per endoembolectomia arteriosa Fogarty 2F attraverso la carotide esterna, entrando quindi nella carotide comune. In carotide comune il palloncino sarà gonfiato ad una pressione di 1,5 ATM e fatto passare per 3 volte all’interno dell’arteria, producendo una deendotelizzazione del vaso. Al termine della procedura, si legherà la carotide esterna a monte dell’arteriotomia, verranno rimossi i fili per l’emostasi e sarà suturata la cute. Gli animali inclusi nei gruppi in trattamento saranno sottoposti, per i 14 giorni consecutivi, ad iniezione sottocutanea o a gavage per consentire la veicolazione dei farmaci in sperimentazione. Inoltre, tutti gli animali inclusi nel protocollo sperimentale saranno sottoposti, al giorno 0, 7 e 14 ad esame ecografico dei tronchi carotidei, tramite utilizzo del VevoLAZR 2100. Questo tipo di analisi permetterà di valutare nel tempo ed in modo non invasivo la formazione di iperplasia neointimale della carotide sottoposta a balloon injury, rispetto alla controlaterale sana, e calcolare il rapporto neointima/media grazie all’alta risoluzione ed all’ausilio di uno specifico software proprio dello strumento in uso. Allo stesso modo sarà condotto su tutti gli animali esame tramite MRI 7-Tesla e micro-CT (Bruker Corporation) che consentiranno di valutare l’anatomia e le dimensioni di cuore e carotidi ed esame ecocardiografico (VevoLAZR 2100), che consentirà di calcolare i parametri specifici di funzionalità cardiaca. A distanza di 14 giorni saranno effettuati gli espianti dell’arteria carotide comune sottoposta a danno, della controlaterale sana e del cuore per le successive valutazioni istologiche, immunoistochimiche e biochimiche. I ratti Wistar oggetto del protocollo di ricerca saranno suddivisi nei seguenti gruppi: - Ratti di Controllo: non sottoposti a nessun trattamento; - Ratti Sham Operated: sottoposti a procedura chirurgica di esposizione della carotide comune ma non sottoposti a danno vascolare ; - Ratti con Balloon Injury: sottoposti alla procedura chirurgica di danno vascolare mediante catetere a palloncino; - Ratti con Balloon Injury e trattamento: sottoposti a procedura chirurgica descritta nel protocollo e candidati a ricevere eventuali trattamenti volti a ridurre il grado di restenosi vascolare , previa sperimentazione delle diverse concentrazioni di farmaci in vitro. - Ratti con Balloon Injury e trattamento: sottoposti a procedura chirurgica descritta nel protocollo e candidati a ricevere eventuali trattamenti volti a ridurre il grado di restenosi vascolare , previa sperimentazione delle diverse concentrazioni di nutraceutici in vitro. ARTICOLAZIONE DEL PROGRAMMA DI RICERCA L’iperplasia intimale, è una classica risposta della parete vascolare in seguito a lesione meccanica ed è una delle principali cause di restenosi dopo Angioplastica Percutanea Transluminale Coronarica (PTCA). L’iperplasia intimale rientra tra le Sindromi Coronariche Acute (SCA), la quale definizione è ampia ed articolata e comprende pazienti con sintomi riconducibili ad un’ischemia miocardica che hanno un infarto miocardico acuto o sono ad elevato rischio di necrosi cardiaca. L’occlusione parziale o completa del vaso coronarico dovuto alla rottura di una placca vulnerabile è il meccanismo fisiopatologico che sta alla base dell’evento coronarico acuto. La conseguenza è la riduzione della perfusione coronarica e quindi il danno miocardico. Gli eventi coronarici acuti condividono un meccanismo fisiopatologico comune: l’aterotrombosi, un processo che nasce dalla rottura di una placca aterosclerotica, attivazione delle piastrine e sovrapposizione di un trombo, parzialmente o totalmente occludente il vaso coronarico. La PTCA è una tecnica di rivascolarizzazione miocardica in pazienti con cardiopatia ischemica sintomatica, che secondo le linee guida può essere effettuata nella fase acuta di una sindrome coronarica (angina instabile, NSTEMI, STEMI) per ricanalizzare l’arteria coronarica responsabile della sindrome stessa, o in alternativa, in un paziente con angina instabile che presenta un restringimento coronarico significativo. La terapia riperfusiva è la componente principale dell’approccio terapeutico in quanto permette la completa ricanalizzazione del vaso ostruito e blocca quindi la progressione del danno miocardico. Per essere efficace deve essere effettuata nel modo più rapido e precoce possibile e si basa sulla PTCA primaria o la trombolisi. Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) giocano un ruolo fondamentale nella mediazione del danno tissutale. Le ROS, quali il superossido (O2-), il perossido di idrogeno (H2O2) e i radicali idrossilici (.OH) possono causare direttamente un danno cellulare, attraverso l’espressione di geni pro-infiammatori, aumentando il catabolismo dell’ossido nitrico (NO) verso la formazione di perossinitrito (ONOO-) ed accelerare l’ossidazione delle lipoproteine a bassa densità ( LDL). Sia le cellule endoteliali sia quelle muscolari lisce sono in grado di produrre ROS e conseguente danno ossidativo. Durante il processo di restenosi in seguito ad angioplastica, sia la perdita dell’endotelio, sia la trasformazione delle cellule muscolari lisce sembrano contribuire alla formazione neointimale. Pertanto probabile che due delle più importante cause di restenosi siano la perdita di fattori inibitori della crescita derivanti da endotelio e trasformazioni delle cellule muscolari lisce in un fenotipo capace di rispondere a fattori piastrinici e fattori derivanti dall’endotelio con la conseguente proliferazione. Si pensa che i ROS non siano solo coinvolti nella patogenesi dell’aterosclerosi, ma siano anche importanti mediatori delle risposte proliferative, ipertrofiche e fibrotiche che frequentemente si verificano nelle arterie dopo angioplastica percutanea coronarica transluminale che provocano un restringimento o una restenosi del lume. Come discusso precedentemente i pathway pro-infiammatori, che facilitano il rimodellamento vascolare, comprendono meccanismi di controllo redox-sensibili e quindi confermano il ruolo dello stress ossidativo come principale meccanismo coinvolto nella proliferazione neointimale. Un importante marcatore stabile utilizzato per osservare lo stress ossidativo è la formazione di nitrotirosina. In quanto, ONOO-, il più tossico dei derivati, è in grado di nitrare i residui di tirosina delle proteine. Dunque l’aumentata formazione di nitrotirosina è considerata un importante indicatore dell’aumentato stress ossidativo. Questo ha spinto gli studiosi all’utilizzo in via sperimentale di composti con elevata attività antiossidante nell’inibire la restenosi dopo PTCA. In associazione ai fattori di rischio cardiovascolari “classici”, i fenomeni infettivi ed infiammatori potrebbero svolgere un ruolo importante nello sviluppo del processo aterosclerotico coronarico e contribuire, in particolare, alla formazione neointimale dopo danno endoteliale. In vari modelli animali di aterosclerosi, i segni dell’infiammazione sono concomitanti con l’accumulo lipidico nella parete delle arterie. Per esempio, mediatori sia delle difese dell’ospite, sia dell’infiammazione, sono localizzati nelle lesioni aterosclerotiche più precoci, non solo nei modelli animali da esperimento, ma anche nell’uomo. Le basi biologiche dell’infiammazione in seguito a PTCA hanno fornito una nuova chiave di lettura dei meccanismi fisiopatologici, sottolineando il ruolo del reclutamento leucocitario. In condizioni normali le cellule vascolari non aderiscono all’endotelio vascolare. Tuttavia, abbastanza precocemente dopo l’inizio di una dieta aterogenica, le cellule endoteliali delle arterie iniziano ad esprimere sulla superficie molecole di adesione specifiche per varie classi di leucociti. In particolare la vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) che lega precisamente i tipi di leucociti trovati precocemente negli ateromi umani e sperimentalii. Recentemente , sono stati riconosciuti dei mediatori importanti nell’iniziazione e progressione delle malattie cardiovascolari come malattie periferiche vascolari, l’aterosclerosi e l’insufficienza cardiaca. Questa relazione si basa sull’evidenza dell’attivazione di fattori di trascrizione nucleare redox-sensibili (NF-κb) upregolate ,citochine, chemochine e molecole di adesione che a loro volta mediano la patofisiologia di queste malattie. Citochine proinfiammatorie come il tumor necrosis factor (TNF-α) e l’interleuchina (IL-1) attivano il segnale a cascata, mentre la funzione delle chemochine è quella di reclutare leucociti e monociti, neutrofili ed altre cellule circolanti effettrici sul sito del danno e di infiammazione. Infatti l’obiettivo di questo progetto è proprio quello di testare l’efficacia terapeutica di prodotti nutraceutici con attività antiossidante. Lo scopo non è quello di sostituire il farmaco utilizzato in terapia classica, ma cercare di coadiuvare quest’ultimo con uno scavenger dei radicali liberi in modo da diminuire la dose con conseguente riduzione degli effetti collaterali. Diversi sono i dati in letteratura che mostrano spiccate capacità antiossidanti di composti ricchi di polifenoli di origine naturale capaci di poter contrastare la crescita sub-intimale post angioplastica. Numerose evidenze sperimentali e cliniche hanno dimostrato che polifenoli di origine vegetale comunemente assunte con la dieta possono prevenire l’insorgenza di diversi tii di patologie in cui lo stress ossidativo ricopre un ruolo chiave. Studi epidemiologici hanno documentato il valore nutraceutico di composti ad azione antiossidante presenti in larga misuri in cibi tipici della dieta mediterranea. I composti fenolici e polifenolici sono largamente distribuiti nel mondo vegetale , ed è stata ampiamente documentata l’attività “scavenger” di radicali liberi in diversi sistemi sperimentali. Studi sperimentali ed epidemiologici suggeriscono che una dieta ricca ricca di polifenoli ed in particolare di flavonoidi, potrebbe svolgere un ruolo preventivo nel processo aterosclerotico. Tali effetti sembrano essere correlate alle loro proprietà pleiotropiche , quali l’attività antinfiammatoria ed antiossidante. Dati sperimentali dimostrano, infatti, che alcuni flavonoidi del genere Citrus riducono l’espressione dei recettori scavenger macrofagici e di iNOS, eNOS, COX-2, TNF-alpha ed IL-6 in linee cellulari macrofagiche . perciò I meccanismi alla basa dell’azione anti-aterogenica dei flavonoidi, potrebbero andare oltre le loro proprietà anti-ossidative, soprattutto se si considera che le molecole con un maggiore potere antiossidante , come per esempio la vitamina A, si sono rilevate inefficaci in molti studi clinici. Citrus Bergamia Risso and Poiteau (bergamotto) è una pianta appartenente alla famiglia delle Rutaceae, laragmente coltivata lungo la costa Jonica della Calabria. Il succo del bergamotto viene principalmente utilizzato per l’estrazione dell’olio essenziale che trova largo impiego nell’industria cosmetica, farmaceuica ed alimentare. Il succo di bergamotto presenta, rispetto ad altri succhi di Citrus , un elevato contenuto di flavonoidi, i quali possono prevenire l’insorgenza dell’aterosclerosi. Il succo di bergamotto , presenta rispetto ad altri succhi di Citrus , un elevato contenuto di flavonoidi; inoltre esibisce un peculiare profilo flavonoidico (neoeriocitrina,neohesperidina, naringina,poncirina, rutina, neodesmina, rhoifolina) caratterizzato da una elevata percentuale di poncirina. Studi condotti in vivo hanno documentato che naringina può rallentare l’aterogenesi e questa azione biologica sembra essere correlata con l’inibizione dell’espressione delle molecole di adesione intracellulare-1 ( ICAM-1). Inoltre è stato dimostrato che neoeriocitrina e rutina sono in grado di inibire l’ossidazione delle LDL in vivo. Nonostante ciò nessun dato in lettaratura riporta gli effetti della frazione flavonoica del succo di bergamotto sul metabolismo lipidico e sull’aterogenesi. OUTPUT DEL PROGRAMMA (DESCRIZIONE DEI POSSIBILI RISULTATI DELLA RICERCA PROPOSTA) È ormai stato ampiamente dimostrato che, dopo un angioplastica transluminale, spesso si verifica una restenosi che determina una riocclusione della lesione iniziale. Il ruolo predominante dei processi redox nei tessuti lesi e nelle cellule vascolari, suggerisce il loro coinvolgimento nella reazione di riparazione della parete danneggiata, quindi determinante nella restenosi postangioplastica. La rimozione dell’endotelio non solo altera il normale ambiente paracrino ormonale in cui si trovano le cellule muscolari lisce, ma mostra anche una superficie trombogenica cui possono aderire piastrine ed altri fattori circolanti, portando così alla formazione di un trombo. L’iperplasia consiste in un aumento del numero di cellule, generalmente risultante in un accrescimento di volume. L’iperplasia è dovuta ad un’eccessiva stimolazione ormonale o all’azione di fattori di crescita sulle cellule bersaglio. Durante la risposta riparativa, le cellule muscolari lisce, subiscono modificazioni che assomigliano ad un processo di de-differenziazione. La ricostruzione della parete vascolare danneggiata è una risposta riparativa fisiologica che comporta la formazione di una neointima. Il processo infiammatorio é essenziale nella formazione neointimale dopo angioplastica sperimentale e nel processo di restenosi intra-stent dopo angioplastica coronaria translumilale percutanea. Diversi studi sperimentali mostrano capacità antinfiammatorie ed antiossidanti dei polifenoli di origine vegetale, con attività inibitorie sul processo aterosclerotico. Sulla base di queste considerazioni l’obiettivo del nostro programma di ricerca sarà quello di valutare il potenziale farmacologico ed i meccanismi d’azione della frazione flavonoica del succo di Citrus Bergamia (bergamotto) nella prevenzione e nel trattamento dell’aterosclerosi. L’idea di puntare l’attenzione sul succo di bergamotto deriva alle osservazioni riportate nelle recenti pubblicazioni, le quali mostrano le proprietà anti-iperlipidemiche del succo e di altri derivati del bergamotto. La capacità della frazione non volatile dell’olio di inibire l’espressione del recettore LOX-1 , uno dei recettori maggiormente coinvolti nel processo di aterogenesi, suggerisce un potenziale farmacologico di questi composti nel trattamento di aterosclerosi. Da tale evidenze deriva una possibilità di impiego di farmaci antiossidanti selettivi in senso antiproliferativo ed anti-infiammatorio in quelle condizioni di alterazione della parete vasale che si associano ad aumentata formazione di specie radicaliche ed ad un aumento dell’infiammazione. L’utilizzo di molecole antiossidanti di origine naturale, privi di tossicità, rappresenta una possibile strategia terapeutica nella cura dei disordini vascolari in cui l’infiammazione ricopre un ruolo cruciale.