Settembre 2001 Vol.1, N. 3 Questo terzo numero di Sterility News è

Settembre 2001
Vol.1, N. 3
Questo terzo numero di Sterility News è dedicato ad una delle caratteristiche
fondamentali degli indicatori biologici, cioè la popolazione di spore in essi contenute.
Saranno forniti alcuni approfondimenti indispensabili per meglio comprendere ed
applicare questo parametro, al fine di garantire un controllo adeguato del Vostro processo
di sterilizzazione. Buona lettura a tutti!
Gli indicatori biologici sono prodotti a base di spore batteriche, le quali vengono
opportunamente selezionate per consentire un controllo efficace e specifico dei diversi
tipi di sterilizzazione. A seconda del procedimento applicato la legislazione richiede
l’utilizzo di determinate specie batteriche e con particolari concentrazioni di spore, tutti
dati che sono riportati nelle farmacopee europea (EP) ed americana (USP) (Tab.1).
Tabella 1
Sterilizzazione
Microrganismo
Calore Secco 160°C
Vapore 121 °C
Ossido di Etilene
Popolazione
EP
USP
B. subtilis var niger
> 1 x 105
104 – 109
B. stearothermophilus
> 5 x 105
104 – 109
B. subtilis var niger
> 5 x 105
104 – 109
In gen 106
B. pumilus
> 1 x 107
Non indicato
In gen 106
600 mg/l 54°C 60 RH%
Radiazioni γ
1
I dati esposti in Tabella 1 evidenziano notevoli differenze fra le richieste della EP e
quelle della USP. Come già accennato nei precedenti numeri di Sterility News queste
differenze sono causate dai diversi approcci delle due legislazioni nei riguardi del ciclo di
sterilizzazione. La USP è più flessibile poiché permette di adeguare il ciclo di
sterilizzazione a seconda delle esigenze del prodotto, mentre la EP è più rigida in
quanto il prodotto viene sottoposto ad un ciclo che è più strettamente definito. In
entrambi i casi l’indicatore biologico deve essere sempre accompagnato da un certificato
di analisi sul quale è riportata, assieme ad altri parametri utili, la popolazione nominale
delle spore. Per gli indicatori biologici prodotti da SGM Biotech la popolazione viene
determinata eseguendo un saggio su quattro indicatori, così come richiesto da ISO e da
EN, nonostante per USP sia già sufficiente eseguirlo su soli tre indicatori. Per rendere
più precisa la conta batterica il saggio viene eseguito su spore sottoposte ad uno shock
termico, per questo motivo la popolazione è indicata sul certificato come “heat shocked
population”.
La popolazione degli indicatori biologici è un fattore basilare per valutare l’efficacia della
sterilizzazione ed è in relazione con lo Sterility Assurance Level (SAL). SAL rappresenta
la probabilità che un microrganismo rimanga vitale dopo che il campione è stato
sottoposto alla sterilizzazione. Nell’industria farmaceutica questa probabilità è indicata
con 10-6, definendo un prodotto come sterile se, dopo la sterilizzazione, non risulta vitale
più di un microrganismo su un milione. Il concetto di SAL è legato a quello della
riduzione logaritmica del numero di spore, cioè
Spore Log Reduction (SLR). Una
riduzione logaritmica di spore (1 SLR) si verifica nell’arco del D-value, che è descritto
appunto come il tempo necessario per ridurre di un logaritmo (o del 90%) la popolazione
di spore, a determinate condizioni di sterilizzazione. A partire dal SAL desiderato è
possibile calcolare quante riduzioni logaritmiche sono necessarie per raggiungerlo,
applicando la seguente formula:
SLR = log popolazione + log SAL
(1)
NB: nella formula sopraindicata ed in quelle che seguono l’esponente del SAL (-6) va moltiplicato
per –1 (diventando così 6).
2
Esempio:
SAL desiderata: 10-6
Popolazione di spore dell’indicatore biologico: 106
SLR = log popolazione + log SAL = log 106 + log 106 = 6 + 6 = 12
Quindi, se l’indicatore ha popolazione 106, sono adeguate 12 riduzioni logaritmiche per
garantire SAL 10-6.
Dal momento che 1 SLR si realizza nell’arco di tempo del D-value, per raggiungere la
sterilità il ciclo deve avere una durata pari a 12 x D-value (minuti).
Il numero di SLR si può comunque ottenere utilizzando il valore F0, che tiene conto delle
variazioni di temperatura che si verificano durante il processo.
In questo caso la formula per calcolare SLR è la seguente:
SLR = F0 / D-value
(2)
Esempio:
D-value: 2 minuti
Popolazione di spore dell’indicatore biologico: 106
F0: 24 minuti
SLR = F0 / D-value = 24/2 = 12
Fondendo le formule (1) e (2) si ottiene: log popolazione + log SAL = F0 / D-value
Tramite questa uguaglianza si possono determinare i singoli parametri coinvolti.
Essendo noti lo Sterility Assurance Level, F0 e la popolazione, si può ricavare il D-value
corrispondente. Altrettanto si può fare, di volta in volta, per gli altri parametri.
All’interno della European Norm si trova un’altra importante regola che consente la
valutazione delle caratteristiche degli indicatori biologici ed è la seguente:
log popolazione x D-value ≥ 10
Esempio:
Popolazione di spore dell’indicatore biologico: 105
log popolazione x D-value ≥ 10
log 105 x D-value ≥ 10
5 x D-value ≥ 10
D-value ≥ 2 minuti
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Applicando questa formula è quindi possibile stabilire quale sia il corretto abbinamento
tra D-value e popolazione.
Il produttore deve fornire, come parte delle informazioni dichiarate, il valore nominale
della popolazione di spore dell’indicatore biologico. L’utilizzatore ha però la possibilità di
verificare il valore dichiarato, eseguendo un saggio di popolazione. Il numero di spore
trovato è difficilmente uguale al valore dichiarato poiché diversi fattori possono
influenzare i risultati. Si tratta infatti di eseguire prove semplici ma che possono risentire
sia della tecnica usata, terreno di coltura, pipette ecc., sia della manualità dell’operatore.
Quindi, al fine di ottenere risultati accettabili e confrontabili, è indispensabile seguire
attentamente le procedure fornite dal produttore; su richiesta Biologik-B può fornire i
protocolli standardizzati, redatti dalla SGM Biotech per i vari indicatori biologici
disponibili. Di seguito è riportata, a grandi linee, la procedura relativa al saggio di
popolazione sulle Spore Strip. In questo caso l’indicatore è costituito da strip di carta che
devono essere finemente triturate al fine di recuperare nel miglior modo possibile le
spore. Vi sono due modi per sminuzzare le strip, utilizzando un apposito mixer, oppure
perline di vetro. In entrambi i casi vi è una ben definita procedura da seguire.
Spore Strip: esempio di procedura del saggio di popolazione
1) dal lotto che deve essere analizzato selezionare casualmente 4 indicatori biologici;
Metodo con mixer
2) estrarre asetticamente dalle bustine le strip con le spore ed inserirle nel contenitore
del mixer, contenente acqua distillata sterile (il mixer utilizzato dalla SGM nel suo
laboratorio di controllo qualità è disponibile presso la Biologik-B);
3) frullare fino ad ottenere una sospensione omogenea;
4) trasferire un’aliquota della sospensione in un contenitore sterile, evitando di intasare
la pipetta con le fibre della carta (il miglior risultato si ottiene utilizzando la pipetta da 2
ml, meno precisa ma più grande di quella da 1 ml);
4
Metodo con perline di vetro
2) estrarre asetticamente dalle bustine le strip con le spore ed inserirle in una provetta di
vetro, contenente acqua distillata sterile e tre perline di vetro, anch’esse sterili;
3) rimescolare la provetta sul vortex in modo da macerare finemente la carta delle strip;
4) aggiungere acqua sterile e vortexare ancora;
Per entrambi i metodi
5) sottoporre il campione a shock termico riscaldandolo alle condizioni raccomandate dal
produttore. Raffreddare usando un bagno di ghiaccio;
6) a partire dal campione sottoposto a shock termico preparare alcune serie di diluizioni
(il numero delle diluizioni dipende dalla popolazione iniziale degli indicatori). Dall’ultima
provetta di ciascuna serie prelevare una quantità di liquido sufficiente per seminare
diverse piastre Petri, quindi aggiungere il terreno di coltura precedentemente sciolto e
scaldato a bagnomaria;
7) lasciare solidificare ed incubare le piastre alla temperatura consigliata e per il tempo
indicato.
Metodo con mixer
Trasferimento
di un’aliquota
Shock termico
Semina
Incubazione
Strip
Mixer
Diluizioni seriali
Metodo con perline di vetro
Semina
Vortex
Shock termico
Incubazione
Strip
Perline di vetro
Diluizioni seriali
Al termine dell’incubazione deve essere eseguita la conta delle Unità Formanti Colonie
(CFU). Affinché questa sia precisa è necessario che il numero delle colonie per piastra
5
sia compreso tra 30 e 300, avvicinandosi possibilmente al valore medio. Quindi, una
volta determinato il numero medio delle colonie lo si moltiplica per il fattore di diluizione
ottenendo la popolazione media degli indicatori biologici considerati.
Secondo USP, ISO e European Norms il saggio è considerato valido se la popolazione
trovata rientra nel range –50% – +300% del valore dichiarato sul certificato.
USP esprime questo range in termini logaritmici: il saggio è valido se il logaritmo della
popolazione media trovata è compreso tra il logaritmo della popolazione dichiarata - 0,3
ed il logaritmo della popolazione dichiarata + 0,48.
I risultati del saggio possono essere influenzati dal trattamento meccanico delle spore su
carrier ed altrettanto possono fare le diverse pratiche di laboratorio e la manualità dei
singoli operatori. E’ possibile utilizzare procedure alternative a quelle consigliate dal
produttore, ma in questi casi le specifiche condizioni devono essere validate
dall’utilizzatore. Anche il metodo con cui si rimuovono le spore dal carrier deve essere
validato e deve includere la disintegrazione del supporto, in un liquido che non
interferisca con la crescita dei microrganismi, o altre metodiche, come l’ultrasonicazione.
Infine, è necessario fare particolare attenzione all’accuratezza della conta delle piastre.
Essa dipende da una varietà di fattori, inclusi gli errori di diluizione, di pipettaggio e di
calibrazione delle pipette automatiche, dalla manualità dell’operatore e dal numero di
colonie per piastra.
Gli indicatori biologici sono accompagnati da un certificato di analisi emesso dal
produttore in occasione del loro rilascio. Tale certificato deve riportare le seguenti
caratteristiche riguardanti la popolazione:
♦ la
♦
specie batterica utilizzata
il numero di ATCC (American Type Culture Collection)
♦ la
concentrazione nominale delle spore
♦ la
dichiarazione di purezza della specie batterica
♦
la data di produzione e la durata degli indicatori
Inoltre, sulla certificazione deve essere specificato se il produttore abbia sottoposto le
spore a shock termico al fine di determinarne la concentrazione.
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In questa pagina si trova un esempio di certificato di analisi della SGM Biotech per le
Spore Strip, in cui sono evidenziati in grassetto i parametri riguardanti la popolazione.
BIOLOGICAL INDICATOR
CERTIFICATE OF ANALYSIS
Reorder No. SGMS/6
Bacillus stearothermophilus ATCC 7953
For:
Steam sterilization
Culture: Soybean casein digest broth
Storage: Controlled room temperature. Store away from sterilants. Do not dessicate
Disposal: Autoclave at 121°C for not less than 30 minutes
Purity:
No evidence of contaminants using standard plate count techniques
Lot No.: Bst-203P
Manufacture Date:
1999 February 03
Expiration:
24 months from Manufacture Date
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Heat Shocked Population:
1.0 x 10 Spores/Unit
Assayed Resistance:
(1)
D-Value
2.0
Steam (121° C)
Z-value 9.8° C
Ethylene Oxide
(600 ± 30 mg/l, 60% ± 10% RH, 54 ± 1°C)
Dry Heat (160° C)
(2)
Survival
8.0
(2)
Kill
20.0
minutes
minutes
minutes
D-value reproducible only when exposed in an AAMI BIER vessel and cultured under the exact
conditions used to obtain results reported here. MPN and Survivor Curve method used.
Units are manufactured in compliance with SGM Biotech’s quality standards, USP, EN866 and ISO
11138 guidelines and all appropriate subsections.
(1)
(2)
D-value calculated using Spearman-Karber method.
Survival/Kill values are calculated according to USP and ISO 11138.
4
9
4
5
Errata Corridge: Numero 1 di Sterility News, Tabella 2, riga 3, colonna 4: 10 -10 anziché 10 -10 .
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Approfondimenti su uno dei parametri fondamentali
che caratterizzano gli indicatori biologici:
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