NOVA Lite™ Skin Antibody Primate Esophagus

NOVA Lite® Skin Antibody
708330
Primate Esophagus Autoantibody Screen Assay
Per uso diagnostico In Vitro
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
NOVA Lite® SA è un test immunofluorescenza indiretta per lo screening e la determinazione semi-quantitativa
degli autoanticorpi diretti verso la cute nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-cute può essere
utilizzata assieme ad altre analisi sierologiche e ai riscontri clinici come ausilio nella diagnosi di malattie
cutanee autoimmuni, soprattutto il pemfigo ed il pemfigoide.
Riassunto e Spiegazione del test
La definizione “autoanticorpi cutanei” include una varietà di autoanticorpi che reagisce con costituenti della
superficie cutanea e mucosa. Questi autoanticorpi si riscontrano con frequenza elevata in pazienti con
malattie autoimmuni della cute, specialmente nel pemfigo e nel pemfigoide.
Gli autoanticorpi che reagiscono contro un antigene intercellulare della cute e della mucosa si riscontrano in
praticamente tutti i casi di pemfigo.1 Il titolo di questi anticorpi segue il decorso della malattia e diminuisce
dopo una terapia efficace.2,3,4
Il pemfigoide bolloso, un’altra malattia cutanea autoimmune importante, è caratterizzato sierologicamente
dalla presenza di anticorpi diretti contro la membrana basale della cute e della mucosa. Gli anticorpi diretti
contro la membrana basale si riscontrano nel 70-80% dei pazienti affetti da pemfigoide.5,6,7 La correlazione
fra la gravità della malattia ed il titolo anticorpale non è ovvia come nel pemfigo, ma esiste. Nei periodi di
remissione, spontanea o in seguito a terapia, gli anticorpi diretti contro la membrana basale diminuiscono, in
genere a livelli talmente bassi da non essere più rilevabili.7 Nella maggior parte dei casi di ricaduta riappaiono
gli autoanticorpi diretti contro la membrana basale.
Il metodo utilizzato più di frequente per la determinazione degli autoanticorpi cutanei è la
immunofluorescenza indiretta. I substrati più comuni sono sezioni sottili di cute e mucosa di topo o di primati.
Il substrato migliore è l’esofago dei primati.8,9,10 Oltre al tipo di substrato, esistono altri fattori di vitale
importanza per la performance dell’analisi per la determinazione degli autoanticorpi cutanei: 1) il fissativo
utilizzato per preparare il vetrino con il substrato 2) la specificità ed il rapporto fluoresceina/proteina (F/P) del
coniugato utilizzato marcato FITC. È noto, infatti, che alcuni fissativi o loro combinazioni distruggono certi
antigeni cutanei e si dovrebbe quindi evitarne l’utilizzo. Il rapporto F/P di un coniugato determina la sensibilità
ed il grado di colorazione di fondo. La specificità di un coniugato è di vitale importanza. La maggioranza degli
autoanticorpi appartiene alla sottoclasse delle IgG. Quando si riscontrano autoanticorpi in donatori di sangue
sani, questi appartengono quasi sempre alle sottoclassi IgM ed IgA e solo molto raramente IgG.11 Per questo
motivo i coniugati specifici per le IgG sono più specifici per la malattia. Il substrato scelto per il NOVA Lite®
Skin Antibody è una sezione di stomaco di primato fissata in maniera ottimale. Il coniugato è costituito da
anti-IgG umane purificate per affinità.
Principio della Metodica
Nel test all’immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell’antigene e gli
anticorpi che non hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con un coniugato specifico
marcato con fluoresceina e successivamente il reagente che non si è legato viene lavato via. Quando i
campioni positivi agli autoanticorpi vengono osservati con un microscopio a fluorescenza, mostrano una
fluorescenza color verde chiaro che corrisponde alle aree delle cellule o dei nuclei dove si è legato
l’autoanticorpo.
1
Reagenti
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Vetrini per anticorpi cutanei (esofago di primati), vetrino ad 8 pozzetti, con disidratante
Coniugato anti-IgG umano (capra), marcato alla fluoresceina in tampone contenente Blu di Evans ed
azoturo di sodio allo 0,09%, 7 ml
Pemfigoide positivo 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi da siero
umano diretti verso il pemfigoide, prediluto, 0,5 ml
Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09%, senza
anticorpi di siero umano anti pemfigoide, prediluto, 0,5 ml
Concentrato PBS II (40x), sufficiente per 1000 ml
Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09%, 7 ml
Coprivetrini
Avvertenze
1.
2.
3.
4.
Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state
testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HBsAg e per anticorpi antiHCV mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Pemfigoide positivo ed Controllo
Negativo Sistemi IFA devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.12
La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se
ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo
o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di
acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi.
Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti.
I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le
normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica.
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Questo prodotto è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.
Un lavaggio incompleto o non accurato dai pozzetti IFA può causare un un’elevato background.
L'adattamento di questo test per l'uso con un processatore automatico di campioni ed altri dispositivi
di manipolazione di liquidi, in tutto od in parte, può portare differenze nei risultati dei test rispetto a
quelli ottenuti eseguendo la procedura manuale. E' responsabilità di ogni laboratorio validare la loro
procedura automatizzata affinché fornisca risultati dei test entro limiti accettabili.
La prestazione del test è influenzata da diversi fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei
reagenti, la luminosità della lampada del microscopio usato, l'accuratezza e riproducibilità della
tecnica di pipettamento, la precisione del lavaggio e la lunghezza dei tempi d'incubazione durante il
test. E' richiesto di prestare particolare attenzione alla consistenza per ottenere risultati accurati e
riproducibili.
Nel tempo, il Coniugato anti IgG Umana può cambiare colore a causa di esposizione alla luce. In ogni
caso, il cambiamento del colore non ha effetto sulla prestazione del test.
Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite.
Condizioni di conservazione
1.
2.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2 - 8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.
Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 4 settimana a 2 - 8°C.
2
Raccolta dei campioni
Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L’aggiunta al campione di sodio azide o di altri
conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica,
trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso
di sieri fortemente emolizzati o lipemici.
Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell’CLSI (NCCLS)
raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura
ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in
frigorifero a 2 - 8°C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni,
congelare a ≤-20°C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di
essere testati.
Procedura
Materiali forniti
10
1
1
1
1
1
1
8-pozzetti Vetrini Pelle anticorpi
7 ml Coniugato anti-IgG umano
0,5 ml Pemfigoide positivo
0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA
25 ml Concentrato PBS II (40x)
7 ml Liquido di montaggio
10 Coprivetrini
Materiali richiesti ma non forniti
Micropipette in grando di erogare volume di 15 – 1000µl
Acqua distillata o deionizzata
Bottiglie di plastica a spruzzo o pipette Pasteur
Camera umida
Beuta da 1l per diluire il PBS II
Vaschette Coplin
Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495 nm e filtro barriera 515 nm
Metodica
Prima di incominciare
1.
2.
3.
Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20 – 26°C) e mescolarli bene.
Diluire il concentrato PBS II: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS II 1:40 aggiungendo il
contenuto del flacone contenente il concentrato PBS II in 975 ml di acqua distillata o deionizzata e
mescolare accuratamente. Il tampone PBS II viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e come
tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato al massimo per 4 settimane 2 - 8°C.
Diluire i campioni del paziente:
a.
Screening iniziale: diluire i campioni 1:10 con il tampone PBS II diluito (ovvero, aggiungere
100 µl di siero a 900 µl di tampone PBS II).
b.
Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per
tutti i campioni positivi con il tampone PBS II diluito (ovvero 1:20, 1:40,... 1:2560).
Esecuzione del test
1.
2.
Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino del
substrato prima di toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una camera
umida adeguata. Aggiungere 1 goccia (70-90µL) dei controlli positivi e negativi non diluiti
rispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (70-90µL) del campione diluito del paziente
nei rimanenti pozzetti.
Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per 30 + 5 minuti in una camera umida (un tovagliolo di
carta inumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umidità
adeguate). Non lasciare asciugare il substrato durante la procedura d’esame.
3
3.
4.
5.
6.
Lavare i vetrini: dopo l’incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta per
lavare via delicatamente il siero utilizzando il tampone PBS II diluito. Orientare il vetrino e la direzione
del flusso del tampone PBS II in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i vari
pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Se
voluto, disponga gli vetrini i in un vaso di Coplin dell'amplificatore diluito di PBS II per fino a 5 minuti.
Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS II in eccesso. Porre nuovamente il
vetrino nella camera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugato
fluorescente. Incubare i vetrini per ulteriori 30 + 5 minuti.
Lavare i vetrini: ripetere la fase 3.
Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguenti
procedure sono raccomandate:
a.
Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta.
b.
Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino.
c.
Eliminare il tampone PBS II in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con il
bordo del coprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che il
collante scorra fino al bordo superiore del vetrino senza formare bolle d’aria.
Controllo di qualità
Il Pemfigoide positivo ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in
modo da assicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può
preparare dell’ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a
< -70oC. I risultati dell’analisi devono soddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati
validi. Se uno qualunque non viene soddisfatto, si dovrebbe considerare non valido il risultato dell’esame e si
dovrebbe ripetere il test.
1.
Il Pemfigoide positivo non diluito deve essere > 3+.
2.
Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo.
Interpretazione dei risultati
Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se la colorazione specifica delle aree
intercellulari, della membrana basale e di altre strutture è uguale o minore rispetto al controllo negativo. I
campioni possono mostrare vari gradi di colorazione di fondo dovuta ad anticorpi eterofili o ad altre reazioni
specifiche dovute agli anticorpi anti-reticolina, antinucleo, anti-endomisio o anti-muscolo liscio.
Reazione positiva per gli anticorpi intercellulari e della membrana basale. Un campione può essere
considerato positivo se si osserva una colorazione specifica delle zone intercellulari o della membrana basale
della mucosa esofagea.
Determinare il grado o l’intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri:
4+
Fluorescenza verde chiaro brillante
3+
Fluorescenza verde chiara accesa
2+
Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile
1+
La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazione
delle zone della membrana basale e/o intercellulare dalla fluorescenza di fondo
Limitazioni del test
1.
2.
3.
La presenza di autoanticorpi cutanei è suggestiva di alcune malattie cutanee bollose autoimmuni ma
non dovrebbe essere considerata quale indicazione diagnostica. Il risultato della ricerca degli
autoanticorpi dovrebbe essere valutato in combinazione con altre analisi sierologiche o bioptiche e
con la storia clinica del paziente.
Oltre agli autoanticorpi cutanei altri autoanticorpi possono reagire con il substrato esofageo. Alcuni di
questi includono autoanticorpi anti-nucleo (ANA), anti-mitocondrio (AMA), anti-muscolo liscio ed anti
muscolo scheletrico. La presenza di questi anticorpi dovrebbe essere notata, e la loro presenza
dovrebbe essere confermata e titolata su altri substrati approvati.
Si dovrebbe notare che in seguito a danni tissutali, alcuni pazienti ustionati producono anticorpi
debolmente reattivi che si legano anche ad aree intercellulari. Questi cosiddetti anticorpi “similpemfigo” danno una colorazione debole e disomogenea della mucosa, sono di natura transitoria e
non reagiscono con la cute del paziente in vivo.13,14,15
4
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Dato che la mucosa esofagea può contenere delle sostanze derivate dai gruppi sanguigni, gli
isoanticorpi dei gruppi sanguigni anti-A ed anti-B possono reagire con l’esofago.16 Il pattern di
reattività può imitare, in alcuni pazienti, il pattern osservato con gli autoanticorpi per il pemfigo
intercellulare (anche se gli anticorpi dei gruppi sanguigni coloreranno i capillari sanguigni della
muscolatura della sezione esofagea). La reattività dovuta agli anticorpi dei gruppi sanguigni può
essere assorbita con antigeni dei gruppi sanguigni.17
La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio a
fluorescenza utilizzato, la forza e l’età della lampadina, l’ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato e
l’osservatore.
Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numero
maggiore di artefatti di colorazione.
Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materiale
per scrivere può causare artefatti.
Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante.
L’utilizzo di vaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti.
I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del
paziente e del risultato degli altri test sierologici.
Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.
Valori attesi
Il substrato NOVA Lite® Skin Antibody è stato utilizzato per analizzare campioni provenienti da pazienti affetti
da pemfigo e da pemfigoide ed anche 100 campioni provenienti da donatori di sangue scelti in maniera
casuale. I risultati appaiono qui di seguito:
Gruppo di pazienti
Pemfigo
Pemfigoide
Normali
Numero
24
18
100
Numero di positivi
intercellulare
membrana basale
20
0
0
12
0
0
5
Bibliografia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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6
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628330ITA
December 2012
Revision 17
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