076 - Dipartimento di Chimica

VALIDAZIONE DI METODI HPLC PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA
DI ADDITIVI VIETATI IN ALIMENTI AD USO ZOOTECNICO
APPLICAZIONE: OLAQUINDOX
Gili M.1 , Strambaci B.1, Gamba V.2, Abete M.C.3
1
Laboratorio Ricerca Residui, Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e
Valle d’Aosta, Via Bologna 148, 10154 Torino.
2
Reparto Bromatologico, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia
Romagna, Via Bianchi 7/9, 25124 Brescia.
3
C.Re.A.A., Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Via
Bologna 148, 10154 Torino.
I prodotti di origine animale subiscono una continua evoluzione connessa alle tendenze di
mercato e alle richieste del consumatore. Ciò comporta la ricerca di continue soluzioni da
parte dei produttori operanti nel settore dell’industria mangimistica atte alla realizzazione di
alimenti zootecnici che appaghino le esigenze dei consumatori. Per far fronte ad alcune
problematiche sanitarie, frequenti soprattutto negli allevamenti intensivi, nella formulazione
di mangimi, sono sovente impiegati come additivi principi attivi, quali antibiotici e
coccidiostatici. Nell’impiego di tali sostanze è però necessario tener conto delle potenziali
ricadute negative sulla sicurezza degli alimenti, in relazione alla loro presenza residuale.
Negli ultimi anni, l’Unione Europea ha revisionato l’elenco degli adittivi autorizzati,
eliminando alcuni promotori di crescita quali carbadox e olaquindox (Regolamento CE n.
2788/98) e diversi coccidiostatici quali nicarbazina, metilclorpindolo, amprolium e
dimetridazolo (Regolamento CE n. 2205/01). In ottemperanza alle norme cogenti, il Ministero
della Salute prevede, nell’ambito dei Piani di monitoraggio (PNR e PNAA), l’esecuzione di
controlli ufficiali per la ricerca analitica di queste molecole.
A tal fine, nel nostro laboratorio sono stati sviluppati e validati metodi interni in grado di
evidenziare e quantificare la presenza anche a basse concentrazioni degli additivi vietati.
Nel presente lavoro si riporta il protocollo di validazione, conforme alla normativa vigente,
utilizzato per la determinazione di olaquindox in alimenti ad uso zootecnico mediante HPLC.
Durante il processo di validazione sono stati valutati i seguenti indici di prestazione su
mangimi per conigli, mangimi per suini e acque di abbeverata:
• Linearità della risposta, mediante tre curve indipendenti di soluzioni standard in solvente, a
cinque livelli nel range 0.5÷20 ng/µL corrispondenti a 2.5÷100 mg/Kg in matrice, con
costruzione della retta di taratura mediante l’algoritmo dei minimi quadrati non pesati, e
verifica della linearità (R ≥ 0.999, distribuzione dei fattori di risposta yi/xi, nell’intervallo
y/xmedio ± 10%).
• Limite di rilevazione (LOD), determinato sperimentalmente su 6 campioni negativi di ogni
matrice. Il valore di LOD, espresso come concentrazione di analita per unità di matrice, è
pari a 0.2 mg/Kg (mangimi) e 0.03 mg/Kg (acqua di abbeverata).
• Limite di quantificazione (LOQ): Il LOQ calcolato, pari a 0.11 mg/Kg (acqua) e 0.7
mg/Kg (mangimi), risulta nettamente inferiore al limite di rilevabilità riportato nel PNR
2004 (10 mg/Kg).
• Specificità, su 6 campioni di ogni matrice; la scelta dei campioni ha privilegiato mangimi
composti o complementari additivati (es. robenidina, avilamicina, flavofosfolipol,
ionofori). L’analisi dei singoli cromatogrammi, nell’intervallo ∆t = ± 2,5% tR , ha permesso
di stabilire l’assenza di interferenti, escludendo l’eventualità di falsi positivi e di errori di
quantificazione.
• Recupero %, determinato mediante 6 prove indipendenti a tre livelli del campo di misura
compreso il LOQ, pari a 83%
• Ripetibilità ristretta: il valore di RSD% medio, determinato mediante 6 prove indipendenti
a tre livelli del campo di misura compreso il LOQ, è pari a 7 % e risulta in accordo alla
legge di Horwitz.
• Robustezza, valutando come fattori critici il tempo di estrazione e la temperatura di
evaporazione dell’estratto del campione.
• Stabilità delle soluzioni di standard
• Stima dell’incertezza di misura del metodo
L’incerteza di misura è stata calcolata in accordo alla “Linea guida per la valutazione e
l’espressione dell’incertezza di misura dei metodi chimici” del Gruppo di Lavoro
II.ZZ.SS., attraverso le seguenti fasi:
1. Identificazione dei contributi all’incertezza di misura
2. Calcolo dei contributi: Incertezza di ripetibilità, pesata, volume, titolo dello standard,
preparazione della soluzione di standard, curva di taratura, recupero.
3. Calcolo dell’incertezza composta
4. Calcolo dell’incertezza estesa del metodo
Il metodo validato secondo questi criteri risulta conforme ai requisiti richiesti dalla norma
ISO 17025 e, attraverso la predisposizione di carte di controllo del recupero, consente ai
laboratori deputati ai controlli ufficiali la verifica del mantenimento delle condizioni di
ripetibilità e accuratezza.