Caratterizzazione strutturale delle cavità idrofobiche della

Rendiconti Seminario Facoltà Scienze Università Cagliari • Vol. 76, Fasc. 1-2 (2006)
Caratterizzazione strutturale
delle cavità idrofobiche della mioglobina
mediante spettroscopia NMR dello xenon
BENEDETTA ERA(*)
Abstract. The Xe-binding sites in myoglobin have been used both to support other
evidences for pathways between O2 binding sites, and to model the trajectory of small,
neutral gas molecules through the protein. In this work we show, by the use of 129Xe
NMR, that the occupancy of the proximal cavity in myoglobin (Mb) in solution is strictly
dependent on the cavity structure.
The study was performed on pig, sheep, cow, rabbit and horse Mbs. Ile142 in horse and
rabbit Mb, located in the proximal cavity (the major xenon binding site in horse Mb),
is replaced by Met142 in pig, sheep and cow Mbs. This study shows in pig, sheep and
cow Mb the presence of xenon in the proximal cavity, that, however, resulted less
populated than in horse and rabbit Mb, supporting the hypothesis of the presence of
more than one type of binding sites in pig, sheep and cow Mb in solution. This has been
attributed to a reduction of the hydrophobic character of the proximal cavity and/or an
increased hindrance. This comparison showed whether the sensitivity to the local
environment of the 129Xe NMR shifts could distinguish between specific and non-specific
xenon-protein interactions in Mb with similar cavities but different structural and
hydrophobic characteristic of the surface residues.
Le cavità idrofobiche rivestono un ruolo fondamentale nel controllo della dinamica
e della reattività dei ligandi nelle proteine globulari, in quanto rappresentano dei dockings
sites per i ligandi che si muovono all’interno della proteina [1, 2, 3]. L’accessibilità di tali
cavità è essenziale nel determinare il percorso seguito dai ligandi e quindi la loro
reattività. Per questo motivo mettere a punto un metodo d’indagine che permetta di
caratterizzare strutturalmente tali cavità può fornire importanti informazioni per la
definizione del ruolo che le proteine svolgono nel loro specifico contesto fisiologico.
(*) Dottorato di ricerca «Biologia animale, molecolare e dell’uomo». XVIII Ciclo. Coordinatore: Prof.
G.U. Floris.
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BENEDETTA ERA
Lo studio qui illustrato prevede l’analisi mediante spettroscopia NMR, delle cavità
idrofobiche all’interno della mioglobina, utilizzando come probe molecolare lo 129Xe. Lo
xenon è un elemento idrofobo che si lega alle cavità idrofobiche della proteina,
denominate da Tilton Xe1, Xe2, Xe3 e Xe4 [4]. La cavità Xe1, sito principale di legame
dello xenon nella Mb di capodoglio, è localizzato nel lato prossimale; il sito Xe2 si trova
tra le cavità Xe4 e Xe1. Il sito Xe3 è sulla superficie della proteina, distante 13.5 Å
dall’eme. La cavità Xe4 si trova sul lato distale dell’eme, distante da esso 8 Å. Nella prima
parte di questo lavoro [5] abbiamo preso in considerazione la mioglobina estratta dal
cuore di maiale. I parametri NMR dello 129Xe, quali lo spostamento chimico del segnale
e la velocità di rilassamento spin-reticolo in presenza della mioglobina di maiale sono
stati confrontati con quelli presenti in letteratura sulla mioglobina di cavallo [6]. Le prove
sono state eseguite con la mioglobina in forma meta (Fe3+) e nella forma legata al
monossido di carbonio (COMb). Successivamente la ricerca è stata estesa alla mioglobine
nella forma legata allo ione CN- (CNMb). I risultati sono stati analizzati utilizzando un
modello a due siti. Nel caso della Mb di cavallo il sito di legame principale dello xenon,
come osservato nella Mb di balena, risulta la cavità prossimale. Al contrario, nella Mb di
Maiale lo xenon non si lega principalmente nella cavità prossimale, ma dai risultati appare
chiaro che un’altra cavità o più di una sono implicate nel legame con lo xenon.
I dati sperimentali hanno mostrato differenze di affinità dello xenon nei confronti
delle due emoproteine: sembrerebbe, infatti, che lo xenon si leghi con minore affinità alla
cavità prossimale della mioglobina di maiale rispetto alla mioglobina di cavallo. L’origine di tali differenze fra le due mioglobine è stata attribuita alle proprietà strutturali delle
cavità, in particolare della cavità Xe1: il residuo aminoacidico in posizione 142 è
rappresentato dall’isoleucina (Ile) nella Mb di cavallo e dalla metionina (Met) nel maiale.
La riduzione del carattere idrofobico del sito Xe1, nella Mb di maiale, dovuto alla Met
potrebbe ridurre l’accessibilità di questa cavità agli atomi di xenon. Inoltre, la metionina
ha una catena laterale più lunga dell’isoleucina che riduce la dimensione della cavità.
Quindi, la combinazione del minor carattere idrofobico e dell’ingombro sterico sarebbe
la causa della più bassa affinità dello xenon per la Mb di maiale. Per confermare questi
risultati abbiamo esteso lo studio alle mioglobine purificate dal tessuto cardiaco del bue,
pecora e del coniglio che in posizione 142 presentano, rispettivamente, la metionina e
l’isoleucina. Come è evidente dalla Figura 1, il segnale dello 129Xe, alla pressione di 3 atm,
sia nella CNMb di maiale, di bue e di pecora è spostato verso campi bassi rispetto al
segnale di riferimento misurato in acqua, mentre nel caso della CNMb di cavallo e di
coniglio, il segnale risulta spostato verso campi alti. La presenza di una singola risonanza
in tutte le proteine considerate conferma che lo xenon è in rapido scambio tra gli ambienti
disponibili. Se osserviamo le variazioni del chemical shift (δ obs) in funzione dell’aggiunta
di xenon (Figura 2) notiamo che le curve che si riferiscono alla CNMb di cavallo e di
coniglio presentano un andamento verso campi bassi all’aumentare della concentrazione
di xenon, diversamente dalle curve della CNMb di maiale e di bue che hanno un
andamento verso campi alti. Nella Tabella sono mostrati i valori delle costanti di
CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE DELLE CAVITÀ IDROFOBICHE…
Figura 1. Spettri NMR dello 129Xe in presenza di
CNMb di bue, pecora, maiale, cavallo e coniglio.
Figura 2. Variazione del chemical shift osservato
(δδ obs) in funzione della concentrazione di xenon in
soluzioni di CNMb di maiale (o), pecora (◊ ), bue( ),
coniglio (° ) e cavallo (° ).
Tabella 1
K (M-1)
δin (ppm)
δout (ppm)
Maiale (0.94)
42 + 8
61 ± 12
1.84 ± 0.13
Pecora (0.90)
32 ± 6
58 ± 13
2.11 ± 0.11
Bue (1.06)
29 ± 6
51 ± 12
2.10 ± 0.11
Cavallo (1.01)
188 + 76
– 16 + 4
2.97 + 0.08
Coniglio (0.93)
131 + 21
– 22 + 4
2.93 + 0.05
[CNMb] (mM)
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BENEDETTA ERA
equilibrio dei complessi Xe – CNMb (K) e dei chemical shifts dello xenon legato (δ in)
nella cavità prossimale e dei chemical shifts dello xenon legato alla superficie della
molecola (δ out). I diversi valori dei due parametri nelle Mb di maiale, di bue e di pecora
rispetto a quelli osservati nelle Mb di cavallo e di coniglio indicano che le differenze tra
le proteine emergono a livello delle loro strutture interne e supportano l’ipotesi che la
presenza della metionina nelle mioglobine di maiale, di bue e di pecora determini
caratteristiche strutturali tali da rendere la cavità Xe1 meno affine al legame con lo xenon.
I dati ottenuti confermano che lo xenon è un ottimo probe per lo studio di sistemi proteici
in soluzione a causa della sua elevata sensibilità alle variazioni dell’ambiente circostante.
BIBLIOGRAFIA
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