Enzygnost* Anti-HBc monoclonal - Medcorp Produtos Hospitalares

Transcript

Enzygnost* Anti-HBc monoclonal
Enzyme Immunoassay for qualitative Determination of Antibodies to
Hepatitis B (core)-Antigen in serum and plasma
Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B (core)-Antigen in Serum oder Plasma
Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps
anti-antigène de (core) de l’hépatite B dans le sérum ou le plasma
Metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli
anticorpi contro l’antigene dell’epatite B («core») nel siero e nel plasma
Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los
anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis B (core) en el suero o en
el plasma
Teste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos
contra o antigénio da hepatite B (core) no soro ou no plasma
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hasta 42
Português:
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a
Summary of Test Procedure
Kurzanleitung Testdurchführung
La technique en bref
Istruzioni in breve, esecuzione del test
Resumen de la técnica:
Resumo da técnica
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Bibliography/Literatur/Littérature/
Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia
Page/Seite/Pagina/Página 51
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Edition February 2004
Intended Use
Enzyme Immunoassay for qualitative determination of Antibodies to Hepatitis B (core)-Antigen
The enzyme immunoassay is processed using the BEP® II, BEP® III and BEP® 2000 ELISA
processors. The test was developed for testing individual samples, not for pooled samples. The
product is for in vitro diagnostic use only.
Summary and Explanation
Antibodies to hepatitis B (core) antigen (anti-HBc) are the first antibodies to appear in an acute
hepatitis B infection. They occur shortly after the antigens HBsAg and HBeAg1, and often persist
for life5. Consequently, the determination of anti-HBc in the serum can be utilized for monitoring
the course of a hepatitis B infection2. Furthermore, anti-HBc can serve as a marker for the differential diagnosis of hepatitis A, hepatitis B, and non-A/non-B hepatitis. When the anti-HBc assay
is used for screening purposes, a positive finding will indicate past contact with the hepatitis B
virus even in cases of sera negative for HBsAg and anti-HBs. Approximately 10% of all infections
can be detected only by the serological determination of anti-HBc3.
Prior to the administration of hepatitis B vaccine, the anti-HBc test yields information on the
immune status of the person to be vaccinated4.
In epidemiological studies the antibody to HBc antigen is a valuable parameter as it can be
detected over a longer period of time than the antibody to HBs antigen5.
Principle of the Method
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal is competitive one-step enzyme immunoassay for the in vitro
determination of antibodies to HBcAg in serum or plasma. The anti-HBc contained in the sample
and the Anti-HBc/POD Conjugate compete for binding to the HBcAg coated onto the wells of the
microtitration plate. Unbound reactants are washed out and the enzyme activity of the peroxidase
is then determined. The enzymatic conversion of hydrogen peroxide and chromogen is
terminated by the addition of dilute sulphuric acid. Due to the competitive principle of the test, the
colour intensity is inversely proportional to the concentration of anti-HBc in the sample.
Reagents
Materials provided
2 x 96
Enzygnost* Anti-HBc
Anti-HBc/POD Conjugate monoclonal
Conjugate Buffer (anti-HBc monoclonal)
Anti-HBc Control Serum, negative
Anti-HBc Control Serum, positive
Washing Solution POD**
Buffer/Substrate TMB**
Chromogen TMB**
Stopping Solution POD**
Empty bottle for Working Chromogen Solution
Adhesive foils
PE bag
Barcode table
Instructions for use
2 test plates
2 x 1.2 mL
4 x 12.5 mL
2 x 0.7 mL
2 x 0.5 mL
1 x 100 mL
1 x 30 mL
1 x 3 mL
1 x 100 mL
1 pcs.
6 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
Further packs: 100 x 96
** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit
(code no. OUVP).
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2
Edition February 2004
Composition
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (test plate): Microtitration plate coated with genetically
engineered hepatitis B core antigen.
Anti-HBc/POD Conjugate monoclonal: Monoclonal anti-HBc, peroxidase (POD)-conjugated.
Preservative: phenol (max. 1 g/L)
Conjugate Buffer (anti-HBc monoclonal) Tris Buffer containing Boviserin® and Tween 20.
Anti-HBc Control Serum, negative: Human serum, stabilised, nominal absorbance: ≥ 0.7 A
Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/L), gentamicin (approx. 100 mg/L)
Anti-HBc Control Serum, positive: Human serum, stabilised, nominal absorbance: ≤ 0.1 A
Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/L), gentamicin (approx. 100 mg/L)
Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution containing Tween.
Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/L) in acetate buffer solution
Preservative: n-butanol (approx. 1%)
Chromogen TMB: Tetramethylbenzidine dihydrochloride
Stopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acid
Warnings and Precautions
1. For In vitro diagnostic use.
2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera is tested for HBsAg,
anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2. Only donations with negative findings are used for
manufacture.
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained
from human blood should always be handled with due care, observing the precautions
recommended for biohazardous material6.
3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure.
4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at
least one hour at +121 °C. All aspirated liquids should be collected in two receptacles
connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating
pathogenic human viruses. The concentrations and times specified by the manufacturer must
be observed.
Preparation of theReagents
Bring all the reagents and samples to +18 to +25 °C before beginning the test (without removing
the test plate from its container).
For each test plate, dilute 20 mL of Washing Solution POD to 400 mL with distilled or deionized water.
Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 mL of Chromogen TMB with 10
mL of Buffer/Substrate TMB in the empty plastic bottle supplied with the kit (= Working
Chromogen Solution) and store closed and protected from light. Rinse the bottle thoroughly with
distilled water after use.
For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the
Chromogen TMB vial and of the Buffer/Substrate TMB vial.
Working Conjugate Solution: For each test plate add 0.5 mL of Anti-HBc/POD Conjugate to
an original vial (12.5 mL) of Conjugate Buffer (Anti-HBc monoclonal) (1+25). Shake gently to
mix, avoiding the formation of foam.
Storage and Stability
Stored unopened at +2 to +8 °C, all components of the Enzygnost* Anti-HBc monoclonal
combination pack remain stable up to the dates of expiry given on the labels.
For complete stability and storage data see Table 1 in the Appendix.
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3
Equipment required:
BEP® II:
For automatic dispensing of reagent and washing
For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for
BEP® III:
evaluation
BEP® 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test
Pipettes:
piston-type pipettes: 25, 100 and 1000 µL
Incubator:
Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods
All the equipment used in the test must have been validated.
Specimens
Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/ heparinized/citrated plasma)
obtained by standard laboratory techniques.
The samples should be stored for not more 3 days at +2 - +8 °C. If the samples are to be stored
for a longer period of time, they must be frozen.
Procedure
Procedure using the BEP® II
1. Assay scheme: Ascertain the number of wells required (= number of samples to be tested
plus 6 wells for controls). Strips not required for the test should be removed from the holder
and stored for later use (See Table 1 for stability data).
2. Dispense samples: Pipette 25 µL/well of negative Control, into 4 wells, 25 µL of positive
control into the next well and then fill the following wells with 25 µL/well of undiluted sample.
At the end of the series / plate pipette 25 µL of positive control once more and proceed to ”3.
Dispense conjugate“ as soon as possible, max. 15 min after completion of the sample
dispensing step.
As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the positive
control twice at the start of the series.
Pipetting scheme: Pipette 25 µL/well of the negative control into 4 wells, 25 µL/well of the
positive control into 2 wells, and fill the subsequent wells with 25 µL/well of undiluted sample.
3. Dispense conjugate: Pipette 100 µL of the Working Conjugate Solution into each well, seal
with fresh foil and immediately place into the incubator.
4. Incubate: Incubate at +37 °C ± 1 °C for 60 ± 5 min., then proceed immediately to the wash
step.
5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 mL/well of
Washing Solution POD.
6. Add substrate: Pipette 100 µL of Working Chromogen Solution into each well and seal the
plate with fresh foil.
7. Incubate: Incubate protected from light at +18 to +25 °C for 30 ± 2 min.
8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µL of Stopping Solution POD to each well, keeping
to the same timing as in „6. Add substrate“.
9. Read: Read at 450 nm within one hour.
The use of a photometer with two wavelengths (measurement and reference beams) is
recommended.
The absorbances of the control and patient samples are to be measured at a wavelength of 450
nm. The wavelength recommended for the reference reading is 650 nm (if necessary between
615 nm and 690 nm).
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4
Test procedure using the BEP® III
Before using the BEP® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2
at "Test procedure with the BEP® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates
(i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP® III. Note that partially filled test plates need to
be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then
processed fully automatically (see BEP® III instruction manual).
The settings for the incubation times in the BEP® III software may differ from the times on the
BEP® II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the
BEP® III.
Test procedure using the BEP® 2000
The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automatically by the analyzer (see BEP® 2000 instruction manual).
Test validation
The individual values of the absorbances for the control sera are used to calculate the mean
values if:
Aneg. ≥ 0.700
-0.010 ≤ Apos. ≤ 0.100
If one of the absorbance values of the Anti-HBc Control Serum, negative, is outside the
specification, this value can be neglected.
Both absorbance values of the positive control must comply with the specification. If these
conditions are not fulfilled, the test is to be repeated.
Evaluation
The evaluations are performed automatically if the BEP® 2000 or BEP® III is used. Please
consult the relevant instruction manuals. The following sections apply if the measurements are
carried out without using a software.
Calculate the mean absorbance value of the negative controls and then calculate the cut-off
value by multiplying the mean value by a factor of 0.4:
–
Aneg. x 0.4 = cut-off value
The equivocal range is defined as:
cut-off ± 10%
Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows:
Test result:
^ negative
1. Asample > cut-off + 10% =
^ positive
2. Asample < cut-off – 10% =
^ equivocal
3. cut-off - 10% ≤ Asample ≤ cut-off + 10% =
If an equivocal result is obtained the sample is to be retested in dual determination. If, in the
retest, both absorbance values are above or below the equivocal range, the initial equivocal
result can be ignored and the sample can be classed as negative or positive, respectively.
However, if the sample again reacts equivocally in one or both of the determinations of the retest,
to obtain final clarification it is recommended that a new sample should be tested which has been
collected 2 to 4 weeks after the first sample.
Limitations of the Procedure
1. Samples containing sodium azide must not be used!
2. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not affect the test result.
3. No interferences were observed with heat-treated samples (60 min, +56 °C).
4. Serum from insufficiently coagulated blood, and cellular blood components, may lead to
unreliable results.
5. Samples that are haemolytic or contain rheumatoid factors do not impair the test results.
6. Samples containing antibodies to CMV, and samples which are positive for anti-HBs, do not
interfere with the test result.
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7. Samples from patients with circulating immune complexes as well as samples containing
anti-mouse IgG were not observed to interfere with the test result.
8. Samples containing antibodies to hepatitis A virus, EBV, HIV, HCV as well as lipaemic and
icteric samples may exhibit elevated reactivity.
9. Samples from haemodialysis patients, transplant patients, patients with multiple blood
transfusions as well as from patients with raised transaminase values may exhibit elevated
reactivity.
10. When using thawed samples, ensure good homogenization of the material prior to use.
11. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other
kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot
numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Washing Solution
POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this
requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from
matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a
different number).
12. Buffer/Substrate TMB, the Working Chromogen Solution and the Stopping Solution POD
must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do
not use pipettes with metal parts in contact with the liquid!). Do not perform the substrate
reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen
Solution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, this
indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean
container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided.
13. The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on
a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in
contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial
contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor
the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to
unspecific reactions.
14. With highly reactive samples the dye may precipitate during the stopping reaction. This does
not interfere with the photometric evaluation.
15. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may
occur but this has no effect on the test result.
16. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product
performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported
by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the
responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents
on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these
instructions for use.
17. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical
history, clinical presentation and other findings.
Specific Performance Characteristics
Sensitivity and Specificity
The results for the sensitivity and specificity study are summarized in Tables 2+3 (in the Appendix).
The sensitivity of the test was studied using a total of 1266 anti-HBc positive samples and the
results obtained were 96.9 to 100% (initial testing) and 97.5% (retest result). It cannot be ruled
out that when the test is used on a large scale some samples may escape detection.
The specificity of the test was studied using a total of 6116 anti-HBc negative blood donation
samples and the specificity results obtained were 99.2% (initial testing) and 99.6% (retest
result). Different values may be obtained depending on the group of samples used, variations in
procedure, etc.
Current knowledge indicates that a positive result in the anti-HBc test is not a certain sign of HBV
infection, just as a negative test result does not reliably exclude HBV infection.
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Reproducibility
The results for intra-/inter-assay reproducibility are summarized in Table 4 (in the Appendix).
For intra-assay reproducibility the coefficients of variation obtained were 3.9 to 13.6%. For interassay reproducibility the coefficients of variation obtained were 5.6 to 15.3%. These are typical
data. Different values may however be obtained depending on variations in test procedure, etc.
* Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other
countries.
BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and
other countries.
Boviserin is a registered Trademark of Aventis Behring.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
USA Distributor: Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
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0197
Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonal
Stability and Storage
Storage
Stability•
+2 to +8 °C
4 weeks
Material/reagent
State
Enzygnost* Anti-HBc
monoclonal
(test plate)
once opened
Anti-HBc/POD Conjugate
monoclon.
once opened
+2 to +8 °C
≤ -20 °C
4 weeks
3 months
Conjugate Buffer
once opened
+2 to +8 °C
4 weeks
Working Conjugate
Solution
1 + 25
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
4 weeks
1 week
Anti-HBc Control Serum,
positive
Anti-HBc Control Serum,
negative
once opened
+2 to +8 °C
4 weeks
once opened
≤ -20 °C
3 months
Chromogen TMB
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
Buffer/Substrate TMB
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
Working Chromogen
Solution
1+10
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
closed container,
protected from light
5 days
8 hours
Washing Solution POD
(concentrate)
undiluted
once opened
1: 20
1: 20
+2 to +8 °C
expiry date
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
1 week
1 day
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
in the bag
with the desiccant
Stopping Solution POD
• use each component by the expiry date at the latest
Tab. 2 Sensitivity
The sensitivity studies performed at two independent centres (T, Tr) yielded the following data:
Sample panel
Number of samples
Initially positive
Retest positive
Acute HBV infection
Chronic HBV infection
Past HBV infection
Follow-up samples
50
100
196
115
50
99
190
115
50
99
191
115
(Tr) Acute HBV infection
Chronic HBV infection
Past HBV infection
Follow-up samples
80
521
73
131
79
516
73
131
79
516
73
131
(T)
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8
Tab. 3 Specificity
The specificity studies performed at four independent centres (T, J, R, W) yielded the following
data:
Sample panel
Number of sample
Initially reactive
Retest reactive
(T)
Normal negative sera
480
2
1
(J)
Normal negative
plasmas
1943
17
12
494
4
2
731
0
0
2468
28
9
(R)
(W) Normal negative
sera/plasmas
Tab. 4 Reproducibility
The studies on intra-assay reproducibility performed at two independent centres (T, Tr) yielded
the following data:
Sample
Repeats
Ratio
% CV
1
2
3
20
20
20
1.531
1.012
0.689
8.7
13.6
8.0
(Tr) 1
2
3
15
15
15
1.559
1.079
0.951
5.0
3.9
5.4
(T)
The studies on inter-assay reproducibility performed at three independent centres (T, J, Tr)
yielded the following data:
Repeats
Ratio
% CV
(T)
Sample
1
2
3
10
10
10
1.689
1.090
0.844
8.5
10.7
11.2
(J)
1
2
3
10
10
10
1.878
1.329
1.109
4.7
11.5
15.3
(Tr) 1
2
3
7
7
7
1.373
0.940
0.705
5.6
12.0
10.8
Ratio = absorbance / cut-off
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9
Tab. 5 Test procedure and programming
Menu programming
Test procedure
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
for the
BEP® II
Prepare reagents
BEP® 2000
4 x 25 µL Control Serum, negative
2 x 25 µL Control Serum, positive
25 µL per undiluted sample
BEP® II
BEP® III
100 µL
Conjugate
In the case of partially filled
plates: Add water-filled
strips to make up to
half a plate
60 min ± 5 min
(37 ± 1 °C)
Wash 4x: BEP® II
100 µL Working
Chromogen Solution
Automatic
processing
30 min ± 2 min
+18 °C to +25 °C
protected from light
MENU NO
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DISPENSE CONJUGATE
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
WASH AND DISPENSE
CHROMOGEN
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DISPENSE STOPPING SOLUTION
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µL Stopping Solution
after max. 1 h
Evaluate at 450 nm
(Referencewavelength: 650 nm)
Test result
OUWE G13 C0541 (879) CS/R
10
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
4
NO
4
0.700
0.4
0.100
-
Anwendungsbereich
Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B (core)-Antigen in Serum oder Plasma.
Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP® II, BEP® III
und BEP® 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von
gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden.
Diagnostische Bedeutung
Antikörper gegen das Hepatitis B (core)-Antigen (Anti-HBc) treten bei einer akuten Hepatitis BInfektion als erste Antikörper kurz nach den Antigenen HBsAg und HBeAg auf1 und persistieren
oft lebenslang5. Die Anti-HBc-Bestimmung im Serum kann demzufolge zur Überwachung des
Verlaufs einer Hepatitis B-Infektion herangezogen werden2. Zusätzlich kann Anti-HBc als ein
Marker zur Differentialdiagnose von Hepatitis A, Hepatitis B und Non A/Non B-Hepatitis dienen.
Wird die Anti-HBc-Bestimmung als Screening-Parameter verwendet, kann bei HBsAg und AntiHBs-negativen Sera ein positiver Anti-HBc-Befund doch noch auf einen früheren Kontakt mit
dem Hepatitis B-Virus hinweisen. Ca. 10% aller Infektionen sind nur durch die Anti-HBc-Bestimmung serologisch nachweisbar3.
Vor der Verabreichung eines Hepatitis B-Impfstoffes gibt der Nachweis von Anti-HBc Aufschluß
über den Immunstatus des Impflings4.
Für epidemiologische Untersuchungen ist der Antikörper gegen HBc-Antigen ein wertvoller Parameter, da er über einen längeren Zeitraum als der Antikörper gegen HBs-Antigen nachgewiesen werden kann5.
Prinzip der Methode
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal ist ein Enzymimmunoassay zur In-Vitro-Bestimmung von Antikörpern gegen HBcAg im Serum oder Plasma nach dem kompetitiven Einschritt-Prinzip. Das
Anti-HBc der Probe konkurriert mit dem Anti-HBc/POD-Konjugat um die Bindung an das an der
Oberfläche der Mikrotitrationsplatte fixierte HBcAg. Nach Auswaschen der Vertiefung wird die
gebundene Enzymaktivität der Peroxidase bestimmt. Die enzymatische Umsetzung von
Wasserstoffperoxid und Chromogen wird durch den Zusatz von verdünnter Schwefelsäure unterbrochen. Aufgrund des kompetitiven Prinzips des Tests ist die Farbintensität der in der Probe
vorhandenen Anti-HBc-Konzentration umgekehrt proportional.
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
2 x 96
Enzygnost* Anti-HBc
Anti-HBc/POD-Konjugat monoclonal
Konjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal)
Anti-HBc-Kontroll-Serum, negativ
Anti-HBc-Kontroll-Serum, positiv
Waschlösung POD**
Puffer/Substrat TMB**
Chromogen TMB**
Stopplösung POD**
Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung
Abklebefolien
PE-Beutel
Barcodewertetabelle
Packungsbeilage
2 Testplatten
2 x 1,2 ml
4 x 12,5 ml
2 x 0,7 ml
2 x 0,5 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 Stück
6 Stück
1 Stück
1 Stück
1 Stück
Weitere Handelspackung: 100 x 96
** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost*
TMB (Bestell-Nr. OUVP).
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Ausgabe Februar 2004
Zusammensetzung
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (Testplatte): Mit gentechnologischem Hepatitis B-core-Antigen beschichtete Mikrotitrationsplatte.
Anti-HBc/POD-Konjugat-monoclonal: Monoclonales Anti-HBc, Peroxidase (POD)-konjugiert.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Konjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal): Tris-Puffer mit Boviserin® und Tween 20.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Anti-HBc-Kontroll-Serum, negativ: Humanserum, stabilisiert, Extinktionsrichtwert: ≥ 0,7
Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l), Gentamicin (ca. 100 mg/l).
Anti-HBc/Kontroll-Serum, positiv: Humanserum, stabilisiert, Extinktionsrichtwert: ≤ 0,1
Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l), Gentamicin (ca. 100 mg/l).
Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l)
Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung.
Konservierungsmittel: n-Butanol (ca. 1%)
Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid
Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung
2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Kontroll-Sera vorgesehen war, wurde
auf HBsAg, auf Anti-HCV auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung
wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet.
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie
auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter
Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden6.
3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird
angeraten.
4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das
geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden.
Vorbereitung der Reagenzien
Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 °C erwärmen.
Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen.
Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml
verdünnen.
Chromogen-Gebrauchslösung: Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung)
und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen.
Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Zusammengießen der Flascheninhalte von
Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB nicht zulässig.
Konjugat-Gebrauchslösung: Pro Testplatte 0,5 ml Anti-HBc/POD-Konjugat zu einer
Originalabfüllung (12,5 ml) Konjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal) zugeben (1 + 25) und
unter leichtem Schütteln mischen, aber Schaumbildung vermeiden.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HBc monoclonal
bei einer Lagertemperatur von +2 bis +8 °C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten
verwendbar.
Die Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen.
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Erforderliche Geräte
BEP® II:
Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte
BEP® III:
Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung
BEP® 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung
Pipetten:
Kolbenhubpipetten: 25, 100 und 1000 µl
Inkubator:
Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden
Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein.
Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen)
verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollen maximal 3 Tage bei +2 bis +8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben
einzufrieren.
Testdurchführung
Testdurchführung mit BEP® II
1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Vertiefungen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1).
2. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 25 µl negative, in eine Vertiefung 25 µl positive
Kontrolle, in die folgenden Vertiefungen je 25 µl unverdünnte Probe und am Ende der Serie
bzw. Testplatte noch einmal 25 µl positive Kontrolle dosieren und die nachfolgende KonjugatDosierung (siehe Punkt 3.) baldmöglichst, max. 15 min nach Beendigung der Proben-Dosierung anschließen.
Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die positive Kontrolle
zweimal zu Beginn der Testreihe aufzutragen.
Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 25 µl negative und in 2 Vertiefungen je 25 µl positive
Kontrolle einfüllen; in die folgenden Vertiefungen je 25 µl unverdünnte Proben dosieren.
3. Konjugat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Konjugat-Gebrauchsverdünnung einfüllen, mit Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen.
4. Inkubation: 60 min ± 5 min bei +37 °C ± 1 °C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.
5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen absaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4
mal waschen.
6. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen,
Platte mit neuer Folie abkleben.
7. Substrat-Inkubation: 30 min ± 2 min bei +18 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren.
8. Stoppreaktion: Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei
den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten.
9. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren.
Die Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen (Meß- und Referenzstrahl) ist empfehlenswert.
Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge
der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen.
Testdurchführung mit BEP® III
Bei der Abarbeitung mit BEP® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung
(Punkt 1 und 2 der „Testduchführung BEP® II“) vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluß
daran werden die Testplatten offen, d. h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP® III eingegeben.
Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit „Wasserriegeln“ auf mindestens halbe
Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind.Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP® III-Bedienungsanleitung).
Die in der BEP® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen
Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP® II Prozessierung abweichen, sind
jedoch in der Kombination BEP®III/Enzygnost* validiert worden.
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Testdurchführung mit BEP® 2000
Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP® 2000-Bedienungsanleitung).
Testvalidierung
Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte
eingesetzt, wenn
Eneg. ≥ 0,700
-0,010 ≤ Epos. ≤ 0,100
Von den Extinktionswerten des Anti-HBc-Kontroll-Serums, negativ, kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden.
Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werden
diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen.
Testauswertung
Die Auswertungen erfolgen mit BEP® 2000 und BEP® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten.
Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet.
Zur Grenzwertberechnung wird der Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen mit dem Faktor 0,4 multipliziert.
–
E neg.. x 0,4 = Grenzwert (cut off)
Als grenzwertiger Bereich wird definiert:
Grenzwert ± 10%.
Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert:
Testergebnis:
^ negativ
1. EProbe > cut off +10% =
^ positiv
2. EProbe < cut off – 10% =
^ grenzwertig
3. cut off - 10% ≤ EProbe ≤ cut off + 10% =
Bei grenzwertigem Ergebnis wird die Probe erneut, dann jedoch als Doppelbestimmung getestet. Liegen in der Wiederholungstestung beide Extinktionswerte ober- bzw. unterhalb des
grenzwertigen Bereichs, so kann das initial grenzwertige Ergebnis vernachlässigt und die Probe
als negativ bzw. positiv betrachtet werden. Sollte die Probe in einer oder beiden Bestimmungen
des Wiederholungstests grenzwertig reagieren, empfiehlt sich zur endgültigen Abklärung die
Testung einer neuen, im Abstand von 2 bis 4 Wochen gewonnenen Probe.
Einschränkungen der Testdurchführung
1. Natriumazid-haltige Proben dürfen nicht verwendet werden!
2. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht.
3. Bei hitzebehandelten Proben (60 min, +56 °C) wurden keine Störungen beobachtet.
4. Ungenügend geronnenes Serum sowie zelluläre Blutbestandteile können zu unzuverlässigen Ergebnissen führen.
5. Rheumafaktorhaltige oder hämolytische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung.
6. Proben mit Antikörpern gegen CMV sowie Anti-HBs positive Proben beeinflussen das Testergebnis nicht.
7. Mit Proben von Patienten mit zirkulierenden Immunkomplexen sowie Anti-Maus IgG haltigen
Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.
8. Proben mit Antikörpern gegen Hepatitis A Virus, EBV, HIV, HCV sowie lipämische oder ikterische Proben können erhöhte Reaktivität zeigen.
9. Proben von Hämodialyse-Patienten, Transplantations-Patienten, Patienten mit mehrfacher
Bluttransfusion sowie Patienten mit erhöhten Transaminasen-Werten können erhöhte Reaktivität zeigen.
10. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten.
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11. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den
chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte
Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der
Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnungen, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind.
12. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in
Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit
flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von
Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der
Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den
vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden.
13. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.B. auf fixierter Schwimmhilfe oder
im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten.
14. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflußt.
15. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen.
16. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf
optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren.
17. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem
klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Leistungsmerkmale des Tests
Sensitivität und Spezifität
Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2+3 (im Anhang)
zusammengefaßt.
Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden insgesamt 1266 Anti-HBc-positive Proben untersucht
und eine Sensitivität von 96,9 bis 100% (initiale Testung) bzw. 97,5% (Retestung) ermittelt. Es kann
nicht ausgeschlossen werden, daß sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem
Nachweis entziehen können.
Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 6116 Anti-HBc-negative Blutspendeproben untersucht und eine Spezifität von 99,2% (initiale Testung) bzw. 99,6% (Retestung) ermittelt. Bedingt
durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u. a. sind abweichende Werte möglich.
Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der Anti-HBc-Testung nicht
mit Sicherheit eine HBV-Infektion abgeleitet werden, wie auch ein negatives Testergebnis keineswegs eine HBV-Infektion sicher ausschließt.
Reproduzierbarkeit
Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt.
Für die Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden Variationskoeffizienten von 3,9 bis 13,6% erhalten. Für die Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden Variationskoeffizienten von 5,6 bis 15,3%
erhalten. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u. a. sind durchaus abweichende Werte möglich.
* Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und
anderen Ländern.
BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland
und anderen Ländern.
Boviserin ist eine eingetragene Marke von Aventis Behring.
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Lagerung
Stabilität•
+2 bis +8 °C
4 Wochen
Material/Reagenz
Zustand
Enzygnost* Anti-HBc
monoclonal
(Testplatte)
nach Öffnen
Anti-HBc/POD-Konjugat
monoclonal
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
≤ -20 °C
4 Wochen
3 Monate
Konjugat-Puffer
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
4 Wochen
gebrauchsfertig verdünntes
Konjugat
1+25
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
4 Wochen
1 Woche
Anti-HBc-Kontroll-Serum,
positiv
Anti-HBc-Kontroll-Serum,
negativ
nach Öffnen
+2 bis +8°C
4 Wochen
nach Öffnen
≤ -20 °C
3 Monate
Chromogen TMB
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Puffer/Substrat TMB
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Chromogen-Gebrauchslösung
1+10
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
geschlossenes,
Gefäß, lichtgeschützt
5 Tage
8 Stunden
Waschlösung POD
(Konzentrat)
unverdünnt
nach Öffnen
1:20
1:20
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
1 Woche
1 Tag
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Stopplösung POD
im Beutel mit
Trockenkapseln
• in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum
Tab. 2 Sensitivität
Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden an zwei unabhängigen Zentren (T, Tr) folgende
Daten ermittelt:
Probenkollektiv
Probenanzahl
initial positiv
retest positiv
akute HBV-Infektion
chronische HBV-Infektion
zurückliegende HBV-Infektion
Verlaufskontrollproben
50
100
196
115
50
99
190
115
50
99
191
115
(Tr) akute HBV-Infektion
chronische HBV-Infektion
zurückliegende HBV-Infektion
Verlaufskontrollproben
80
521
73
131
79
516
73
131
79
516
73
131
(T)
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Tab. 3 Spezifität
Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an vier unabhängigen Zentren (T, J, R, W) folgende Daten ermittelt:
Probenkollektiv
Probenanzahl
initial reaktiv
retest reaktiv
(T)
normal negative Seren
480
2
1
(J)
normal negative Plasmen
1943
494
17
4
12
2
(R)
731
0
0
2468
28
9
(W) normal negative
Seren/Plasmen
Tab. 4 Reproduzierbarkeit
Bei den Untersuchungen zur Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden an zwei unabhängigen
Zentren (T, Tr,) folgende Daten ermittelt:
Probe
Wiederholung
Ratio
% CV
1
2
3
20
20
20
1.531
1.012
0.689
8.7
13.6
8.0
(Tr) 1
2
3
15
15
15
1.559
1.079
0.951
5.0
3.9
5.4
(T)
Bei den Untersuchungen zur Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden an drei unabhängigen
Zentren (T, J, Tr) folgende Daten ermittelt:
Probe
Wiederholung
Ratio
% CV
(T)
1
2
3
10
10
10
1.689
1.090
0.844
8.5
10.7
11.2
(J)
1
2
3
10
10
10
1.878
1.329
1.109
4.7
11.5
15.3
(Tr) 1
2
3
7
7
7
1.373
0.940
0.705
5.6
12.0
10.8
Ratio = Absorption/Grenzwert
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Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung
Enzygnost*Anti-HBc monoclonal
Menüprogrammierung
Testdurchführung
für den
BEP® II
Vorbereitung der Reagenzien
BEP® 2000
4 x 25 µl Kontroll-Serum, negativ
2 x 25 µl Kontroll-Serum, positiv
25 µl unverdünnte Probe
BEP® II
BEP® III
teilbestückte Platten mit
„Wasserriegeln“ auf halbe
Platten ergänzen
100 µl Konjugat
60 min ± 5 min
(37 ± 1 °C)
4 x Waschen: BEP® II
100 µl ChromogenGebrauchslösung
automatische
Testabarbeitung
30 min ± 2 min
+18 °C bis +25 °C
lichtgeschützt
MENU NO
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DOSIERUNG KONJUGAT
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
WASCHEN UND DOSIERUNG
CHROMOGEN
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DOSIERUNG STOPPLÖSUNG
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl Stopplösung
nach maximal 1 h
Auswertung 450 nm
(Referenzwellenlänge: 650 nm)
Testergebnis
OUWE G13 C0541 (879) CS/R
18
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
4
NO
4
0.700
0.4
0.100
-
Domaine d’utilisation
Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps anti-antigène de (core) de
l’hépatite B dans le sérum ou le plasma.
Le test immunoenzymatique s’effectue à l’aide des ELISA Processors BEP® II, BEP® III et BEP®
2000. Il a été mis au point pour l’analyse d’échantillons individuels et non pas d’échantillons
poolés. Les réactifs ne peuvent être utilisés qu’à des fins de diagnostic in vitro.
Intérêt diagnostique
Dans une hépatite B aiguë, ce sont les anticorps dirigés contre l‘antigène de core de l‘hépatite B
(anti-HBc) qui apparalissent comme premiers anticorps peu de temps apres les antigènes
AgHBs et AgHBe1; ils persistent souvent toute la vie5. C‘est pourquoi le dosage des anti-HBc
dans le sérum peut-il être utilisé pour la surveillance de l‘évolution d‘une hépatite B2. L‘anti-HBc
peut également servir de marqueur pour le diagnostic différentiel des hépatites A, B et non A/non
B. Lorsque l‘anti-HBc est utilisé comme paramètre de dépistage, un résultat positif en anti-HBc
dans des sérums AgHBs et anti-HBs-négatifs peut indiquer un contact ancien avec le virus de
l‘hépatite B. Environ 10% de l‘ensemble des infections ne sont sérologiquement détectables que
par le dosage des anti-HBc3.
Avant une vaccination contre l‘hépatite B, une recherche des anti-HBc permet de connaître l‘état
immunitaire du sujet4.
Pour les études épidémiologiques, l‘anti-HBc est un paramètre précieux, dans la mesure où il
est plus longtemps détectable que l‘anti-HBs5.
Principe de la méthode
L‘Enzygnost* Anti-HBc monoclonal est un test immunoenzymatique permettant le dosage in
vitro des anticorps dirigés contre l‘AgHBc dans le sérum ou le plasma selon le principe de
compétition en une étape. L‘anti-HBc de l‘échantillon est en compétition avec le conjugué antiHBc/POD pour se lier à l‘AgHBc fixé à la surface de la plaque de microtitration. Après rinçage
des cupules, on mesure l‘activité enzymatique liée de la peroxydase. La transformation
enzymatique du peroxyde d‘hydrogène et du chromogène est interropue par l‘addition d‘acide
sulfurique dilué. Du fait du principe de compétition du test, l‘intensité de la coloration est
inversément proportionnelle à la concentration d‘anti-HBc de l‘échantillon.
Réactifs
Contenu du coffret
2 x 96
Enzygnost* Anti-HBc
Conjugué anti-HBc/POD monoclonal
Tampon conjugué (anti-HBc monoclonal)
Sérum de contrôle anti-HBc négatif
Sérum de contrôle anti-HBc positif
Solution de lavage POD (concentrée)**
Tampon/substrat TMB**
Chromogène TMB**
Solution d’arrêt POD**
Flacon vide pour solution d’emploi du chromogène
Feuilles adhésives
Sachet PE
Tableau de codes à barres
Fiche technique
2 plaques-tests
2 x 1,2 ml
4 x 12,5 ml
2 x 0,7 ml
2 x 0,5 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 pièce
6 pièce
1 pièce
1 pièce
1 pièce
Autre conditionnement : 100 x 96
** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost*
TMB (code OUVP).
OUWE G13 C0541 (879) CS/R
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Edition Février 2004
Composition
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (plaque-test): plaque de microtitration recouverte de
l’antigène de core de l‘hépatite B obtenu par génie génétique.
Conjugué anti-HBc/POD monoclonal: anti-HBc monoclonal conjugué à la peroxydase (POD).
Agent de conservation: phénol (max. 1 g/l)
Tampon conjugué (anti-HBc monoclonal) Tampon Tris additionné de Boviserin® et de Tween 20.
Agent de conservation: phénol (max. 1 g/l)
Sérum de contrôle anti-HBc négatif: sérum humain, stabilisé, valeur de D. O. indicative:
≥ 0,7 D.O.
Agent de conservation: amphotéricine (env. 5 mg/l), gentamycine (env. 100 mg/l)
Sérum de contrôle anti-HBc positif: sérum humain, stabilisé, valeur de D. O. indicative:
≤ 0,1 D.O.
Agent de conservation: amphotéricine (env. 5 mg/l), gentamycine (env. 100 mg/l)
Solution de lavage POD (concentrée): solution tampon phosphate additionnéede Tween
Agent de conservation: phénol (max. 1g/l)
Tampon/substrat TMB: peroxyde d’hydrogène (0,1 g/l) en solution tampon acétate.
Agent de conservation: n-butanol (env. 1%)
Chromogène TMB: tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure
Solution d’arrêt POD: acide sulfurique 0,5 N
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro
2. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation des sérums de contrôle a été testé visà-vis de l’anticorps AgHBs, de l’anticorps anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de l’anticorps
anti-VIH 2. Seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés.
Néanmoins, toutes les préparations obtenues à partir de sang humain doivent être
manipulées avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où
l’on ne peut exclure totalement un risque d’infection6.
3. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test.
4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à
+121 °C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’un
à l’autre et contenant chacun un désinfectant spécialement conçu pour inactiver les virus
pathogènes pour l’homme. Respecter les concentrations et temps d’incubation indiqués par
le fabricant.
Préparation des réactifs
Porter tous les réactifs et échantillons à +18/+25 °C avant le début du test, sans sortir la plaquetest de son emballage.
Pour une plaque, diluer 20 ml de solution de lavage POD avec de l’eau distillée ou désionisée
en complétant à 400 ml.
Solution d’emploi du chromogène: pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec
10 ml de Tampon/substrat TMB dans le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution
d’emploi du chromogène), et la conserver dans le flacon fermé à l’abri de la lumière. Après
emploi, bien rincer le flacon avec de l’eau distillée.
Pour des raisons de capacité de flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d’un
flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB.
Solution d’emploi du conjugué: pour une plaque, ajouter 0,5 ml de Conjugué AgHBc/POD
au contenu d‘un flacon (12,5 ml) de Tampon conjugué (anti-HBc monoclonal) (dilution au 1/26),
et mélanger en agitant légèrement et en évitant la formation de mousse.
Stabilités et conditions de conservation
Tous les éléments du coffret Enzygnost* Anti-HBc monoclonal conservés à +2/+8 °C dans leur
flacon ou sachet d’origine non ouvert peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée sur
l’étiquette.
Pour les stabilités et conditions de conservation des réactifs ouverts ou dilués à la dilution
d’emploi, se reporter au Tableau 1 en annexe.
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Matériel nécessaire
BEP® II :
pour la distribution automatique des réactifs et l’automatisation des étapes de
lavage
pour l’automatisation du test après la distribution des échantillons et de
BEP® III :
l’exploitation des résultats
BEP® 2000 : pour l’entière automatisation du test et de l’exploitation des résultats
Pipettes :
pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl.
Incubateur : bain-marie couvert (+37 ± 1 °C) ou méthode d’incubation équivalente
Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé.
Echantillons à tester
Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA)
obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être
conservés 3 jours maximum à +2/+8 °C. Pour une conservation plus longue, les congeler.
Réalisation du test
Réalisation du test sur le BEP® II
1. Schéma de distribution: déterminer le nombre de cupules nécessaires (nombre
d‘échantillons à tester + 6 cupules pour les contrôles). Sortir du cadre les barrettes inutiles et
les conserver pour un test futur (cf. Tableau 1).
2. Distribution des contrôles et échantillons: distribuer 25 µl de contrôle négatif dans les 4
premières cupules, 25 µl de contrôle positif dans la cupule 5, 25 µl de chacun des
échantillons non dilués dans les cupules suivantes, puis de nouveau 25 µl de contrôle positif
à la fin de la série ou de la plaque. Enchaîner ensuite le plus rapidement possible, mais au
plus tard dans les 15 min, la distribution du conjugué (cf. point 3).
Comme alternative au schéma de pipetage indiqué ci-dessus, on peut également déposer le
contrôle positif deux fois en début de série.
Schéma de pipetage : distribuer 25 µl de contrôle négatif dans 4 cupules, 25 µl de contrôle
positif dans 2 cupules, puis 25 µl de chacun des échantillons non dilués dans les cupules
suivantes.
3. Distribution du conjugué: ajouter dans chaque cupule 100 µl du conjugué à la dilution
d‘emploi, recouvrir la plaque d‘une feuille adhésive et la placer immédiatement dans
l‘incubateur.
4. Incubation: laisser incuber 60 ± 2 min à +37 °C ± 1 °C, et enchaîner immédiatement le
processus de lavage.
5. Lavage: retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer dans
chacune d’elles env. 0,3 ml de Solution de lavage; faire 4 lavages.
6. Distribution du substrat: ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du
chromogène, et couvrir la plaque d’une nouvelle feuille adhésive.
7. Incubation du substrat: laisser incuber 30 ± 2 minutes à +18/+25 °C a l’abri de la lumière.
8. Arrêt de la réaction: retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de
Solution d’arrêt POD en respectant le même rythme qu’en 6.
9. Mesure: faire une mesure photométrique dans l’heure qui suit a 450 nm.
Il est recommandé d’utiliser un photomètre avec deux longueurs d’onde (une de mesure et une
de référence).
La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm.
La longueur d’onde de référence doit être de 650 nm (éventuellement comprise entre 615 à 690
nm).
Réalisation du test sur le BEP® III
Pour une utilisation sur le BEP® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris la
distribution des échantillons (points 1 et 2 du paragraphe « Réalisation du test sur le BEP® II »).
Immédiatement après cette étape, placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’une
feuille adhésive, dans le BEP® III. Si la plaque n’est pas totalement utilisée, la compléter au
moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau. La suite du test est ensuite
effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP® III).
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Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP® III peuvent, du fait de conditions
techniques (cadence de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP® II. Ils ont toutefois été
validés dans la combinaison BEP® III/Enzygnost*.
Réalisation du test sur le BEP® 2000
La distribution des échantillons ainsi que toutes les étapes suivantes sont effectuées entièrement automatiquement par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP® 2000).
Validation du test
Les différentes valeurs de densités optiques des sérums de contrôle sont utilisées pour le calcul
des valeurs moyennes si:
D.O.nég. ≥ 0,700
-0,010 ≤ D.O.pos. ≤ 0,100
Pour les valeurs du sérum de contrôle anti-HBc négatif, une seule valeur sortant du domaine
indiqué peut être négligée.
Les deux valeurs du contrôle positif doivent être trouvées dans le domaine indiqué. Si ces
conditions ne sont pas remplies, le test doit être recommencé.
Exploitation du test
Sur le BEP® 2000 ou le BEP® III, le calcul des résultats se fait automatiquement. Suivre le
déroulement du manuel d’utilisation. Le protocole indiqué ci-après permet l’exploitation des
résultats sans aide de logiciel.
Calculer la valeur moyenne des densités optiques du contrôle négatif.
Pour obtenir la valeur-seuil, multiplier la valeur moyenne des contrôles négatifs par le facteur 0,4.
–
D.O. nég. x 0,4 = valeur-seuil (cut off)
La zone grise est définie comme suit:
valeur-seuil ± 10%
Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit:
Résultat du test
^ négatif:
1. D.O.échantillon > cut off + 10% =
^ positif:
2. D.O.échantillon < cut off – 10% =
^ douteux
3. cut off - 10% ≤ D.O.échantillon ≤ cut off + 10% =
En cas de résultat douteux, retester l‘échantillon, cette fois en double. Si dans le deuxième test
les deux densités optiques obtenues sont trouvées soit supérieures soit inférieures à la valeurseuil, la premier resultat peut être négligé, et l‘échantillon considéré comme négatif ou positif. Si
l‘échantillon redonne une valeur douteuse dans l‘un ou les deux dosages il recommandé de
refaire un test sur un échantillon prélevé 2 à 4 semaines plus tard.
Limites du test
1. Ne pas utiliser d’échantillon de patient contenant de l’azide de sodium!
2. Les anticoagulants comme l‘héparine, l‘EDTA ou le citrate, n‘influencent pas les résultats du test.
3. On n’a pas observé de perturbations suite à l’utilisation d’échantillons traités à la chaleur (60
min à +56 °C).
4. Un sérum insuffisamment coagulé ou contenant des éléments sanguins cellulaires peut
donner des résultats non fiables.
5. Les échantillons hémolytiques ou contenant des facteurs rhumatoïdes ne perturbent pas le test.
6. Les échantillons contenant des anticorps anti-CMV ansi que les échantillons anti-HBs
positifs n’influencent pas le résultat du test.
7. Aucune influence sur le résultat du test n’a été observée avec des échantillons provenant de
patients avec des immuncomplexes circulants ainsi que des échantillons contenant des
anticorps anti-IgG de souris.
8. Les échantillons contenant des anticorps anti-virus de l’hépatite A, anti-EBV, anti-VHC ainsi
que les échantillons lipémiques ou ictériques peuvent présenter une réactivité augmentée.
9. Les échantillons de patients hémodyalisés, transplantés, ayant eu plusieurs transfusions
sanguines ou ayant des valeurs de transaminases augmentées peuvent présenter une
réactivité augmentée.
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10. Si on utilise des échantillons décongelés, bien veiller à leur homogénéisation.
11. Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la
solution d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour le
Chromogène TMB et le Tampon/substat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la
combinaison des numéros de lots à 6 chiffres indiqués sur le coffret et dans le tableau des
codes à barres joint.
12. Le Tampon/substrat TMB, la solution d’emploi du chromogène et la Solution d’arrêt POD ne
doivent pas entrer en contact avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes
(ne pas utiliser de pipettes à parties métalliques). La réaction du substrat ne doit pas être
effectuée à proximité de désinfectants contenant de l’eau de Javel. Une coloration bleue
spontanée de la solution d’emploi du chromogène avant son transfert dans la plaque indique
une contamination ; préparer une nouvelle solution dans un récipient propre. Éviter tout
contact de la peau avec les solutions sus-mentionnées.
13. La plaque doit rester immobile pendant toute l’incubation (la placer par ex. sur un support
fixe ou dans un bain-marie sans circulation d’eau) ; le fond des cupules doit être en contact
avec l’eau thermostatée. Si l’eau contient des stabilisateurs pour éviter une contamination,
bien veiller à ce que ni la surface supérieure de la plaque ni l’intérieur des cupules n’entrent
en contact avec cette eau, au risque d’obtenir des réactions non-spécifiques.
14. En cas d’échantillon fortement réactif, il peut y avoir précipitation lors de l’addition de la Solution
d’arrêt et du virage de la coloration, sans que cela ait d’influence sur l’exploitation photométrique.
15. Les sérums de contrôle sont obtenus à partir de sérums humains natifs. Ils peuvent donc
devenir trouble, sans que cela ait d’influence sur le résultat du test.
16. Dade Behring a validé l’utilisation de ces réactifs sur plusieurs analyseurs afin d’optimiser les
performances du produit et répondre à ses spécifications. Les modifications apportées par
l’utilisateur ne sont pas sous la responsabilité de Dade Behring dans la mesure où elles
peuvent affecter les performances du système et les résultats des dosages. Il est de la
responsabilité de l’utilisateur de valider toutes modifications apportées à ces instructions ou
à l’utilisation des réactifs sur les analyseurs autres que ceux mentionnés dans les protocoles
d’application Dade Behring ou dans la présente notice d’utilisation.
17. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents
médicaux du patient, les signes cliniques et autres constatations.
Caractéristiques du test
Sensibilité et spécificité
Les résultats des études de sensibilité et de specificité sont résumés dans les tableaux 2 et 3 (en
annexe).
Pour l‘étude de sensibilité, 1266 échantillons anti-HBc-positifs on été testés, donnant une
sensibilité de 96,9 à 100% au test initial, et de 97,5% au retest. La possibilité que, dans le cadre
d‘une large utilisation du test, des échantillons ne soient pas révélés, ne peut être exclue.
Pour l‘étude de spécificité, 6116 échantillons anti-HBc-négatifs provenant de donneurs de sang
ont été testés, donnant une spécificité de 99,2% au test initial, et de 99,6% au retest. Selon le
collectif étudié, la réalisation du test et d‘autres paramètres, des valeurs divergentes peuvent
être obtenues.
Selon l‘état des connaissances actuelles, un résultat trouvé positif au test anti-HBc ne permet
pas avec certitude de déduire une infection à HBV, de même qu‘un résultat négatif ne permet en
aucun cas d‘exclure avec certitude une infection à HBV.
Reproductibilité
Les résultats d‘étude de répétabilité et de reproductibilité sont résumés dans le tableau 4 (en annexe).
Pour la répétabilité, les coefficients de variation ont été trouvés entre 3,9 et 13,6%, et pour la
reproductibilité, entre 5,6 et 15,3%. Ce sont des données qui ne peuvent être prises qu‘à titre
d‘exemple. Selon la réalisation du test ou d‘autres paramètres, des valeurs divergentes peuvent
tout-à-fait être obtenues.
* Enzygnost est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dans
d’autres pays.
BEP est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans
d’autres pays.
Boviserin est une marque déposée de Aventis Behring
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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0197
Stabilités et conditions de conservation
Echantillons/réactifs
état
conservation
stabilité•
Enzygnost* Anti-HBc
monoclonal
(plaque-test)
après
ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
Conjugué anti-HBc/POD
monoclonal
après
ouverture
+2/+8 °C
≤ -20 °C
4 semaines
3 mois
Tampon conjugué
après
ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
Conjugué à la dilution
d‘emploi
1/26
+2/+8 °C
+18/+25 °C
4 semaines
1 semaine
Sérum de contrôle
anti-HBc positif
Sérum de contrôle
anti-HBc négatif
après
ouverture
après
ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
≤ -20 °C
3 mois
Chromogène TMB
après
ouverture
+2/+8 °C
date de
péremption
Tampon/substrat TMB
après
ouverture
+2/+8 °C
date de
péremption
Solution d‘emploi du
chromogène
1/11
+2/+8 °C
dans récipient
fermé à l‘abri
de la lumière
à TA (+18/+25 °C)
5 jours
+2/+8 °C
date de
péremption
1 semaine
1 jour
Solution de lavage POD
(concentrée)
Solution d‘arrêt POD
après
ouverture
1/20
après
ouverture
dans sachet avec
capsule dessicative
+2/+8 °C
+18/+25 °C
+2/+8 °C
8 heures
date de
péremption
• jamais au-delà de la date de péremption
Tab. 2 Sensibilité
Les études de sensibilité effectuées dans deux centres indépendants (T, Tr) ont donné les
résultats suivants:
nombre d‘échantillon
positif au test
positif au retest
(T) infection aiguë à HBV
infection chronique à HBV
infection ancienne à HBV
échantillons de contrôle
d‘evolution
collectif d‘échantillons
50
100
196
50
99
190
50
99
191
115
115
115
(Tr) infection aiguë à HBV
infection chronique à HBV
infection ancienne à HBV
échantillons de contrôle
d‘evolution
80
521
73
79
516
73
79
516
73
131
131
131
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24
Tab. 3 Spécificité
Les études de spécificité effectuées dans quatre centres indépendants (T, J, R, W) ont donné les
collectif d‘échantillons
nombre d‘échantillon
positif au test
positif au retest
(T) sérums négatifs normaux
480
2
1
(J) sérums négatifs normaux
plasmas négatifs normaux
1943
494
17
4
12
2
(R) sérums négatifs normaux
731
0
0
(W) sérums/plasmas
négatifs normaux
2468
28
9
Tab. 4 Reproductibilité
Les études de sensibilité effectuées dans deux centres indépendants (T, Tr) ont donné les
échantillon
nombre de passages
ratio
CV %
(T) 1
2
3
20
20
20
1.531
1.012
0.689
8.7
13.6
8.0
(Tr) 1
2
3
15
15
15
1.559
1.079
0.951
5.0
3.9
5.4
Les études de reproducibilité effectuées dans trois centres indépendants (T, J, Tr) ont donné les
échantillon
nombre de passages
ratio
CV %
(T) 1
2
3
10
10
10
1.689
1.090
0.844
8.5
10.7
11.2
(J) 1
2
3
10
10
10
1.878
1.329
1.109
4.7
11.5
15.3
(Tr) 1
2
3
7
7
7
1.373
0.940
0.705
5.6
12.0
10.8
ratio = densité optique/valeur-seuil
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Tabl. 5 : Réalisation du test et programmation
Réalisation du test
Programmation du menu
pour le
BEP® II
préparation des réactifs
BEP® 2000
4 x 25 µl de Sérum de contrôle négatif
2 x 25 µl de Sérum de contrôle positif
25 µl de chaque échantillon non dilué
BEP® II
BEP® III
100 µl de conjugué
compléter éventuellement
la plaque à mi-plaque avec
des barrettes remplies d’eau
60 min à ± 5 min
(37 ± 1 °C)
MENU NO
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DISTRIBUTION DU CONJUGUÉ
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVAGE ET DISTRIBUTION DU
CHROMOGÈNE
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
réalisation
0
automatique du test SOAKTIME
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
®
4 lavages: BEP II
100 µl de solution
d’emploi du chromogène
30 min ± 2 min
+18 °C/+25 °C
à l’abri de la lumière
OPERATE 4
YES
DISTRIBUTION DE LA SOLUTION
D'ARRÊT
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl de Solution d’arrêt
après 1 h maximum
exploitation à 450 nm
(longueur d’onde de
référence : 650 nm)
résultat du test
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PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
4
NO
4
0.700
0.4
0.100
-
Settori d’impiego
Metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi contro l’antigene
dell’epatite B («core») nel siero e nel plasma.
L’esecuzione del test immunoenzimatico avviene su processore ELISA BEP® II, BEP® III e
BEP® 2000. Il test è stato sviluppato per l’analisi di campioni singoli e non per pool di campioni.
Il prodotto deve essere impiegato solo per scopi diagnostici in vitro.
Significato diagnostico
Gli anticorpi contro l‘antigene «core» dell‘epatite B (anti-HBc) si manifestano nella fase acuta di
una infezione da virus dell‘epatite B come primi anticorpi subito dopo la comparsa degli antigeni
HBsAg e HBeAG1 e persistono spesso per tutta la vita5. La determinazione anti-HBc nel siero
può essere utile per il controllo del decorso dell‘infezione da virus dell‘Epatite B2. L’anti-HBc può
servire inoltre come marker per la diagnosi differenziale delle epatiti A, B e non A e non B. Se la
determinazione dell‘anti-HBc viene utilizzata come parametro di screening su sieri negativi per
l‘HBsAg e per l‘anti HBs, un risultato positivo anti-HBc può essere indice di un precedente
contatto con il virus dell‘epatite B. Circa il 10% di tutti i casi di infezione possono essere rilevati
sierologicamente soltanto con la determinazione degli anticorpi anti-HBc3.
L’identificazione degli anticorpi anti-HBc è utile per la definizione dello stato immunitario dei
pazienti prima di essere vaccinati contro il virus dell‘epatite B4.
Gli anticorpi contro l’antigene HBc sono un parametro importante per la ricerca epidemiologica,
poichè possono essere rilevati per un periodo più prolungato degli anticorpi contro l‘antigene
HBs5.
Principio del metodo
L‘Enzygnost* anti-HBc monoclonale è un test immunoenzimatico per la determinazione in vitro
degli anticorpi contro l‘HBcAg nel siero o nel plasma secondo la tecnica competitiva ad una
fase. L‘anti-HBc presente nel campione in esame compete con il coniugato anti-HBc/POD per il
legame con l‘antigene HBcAg fissato sulla superficie dei pozzetti della piastra di
microtilolazione. Dopo il lavaggio dei pozzetti viene determinata l‘attività enzimatica della
perossidasi. La reazione enzimatica del perossido di idrogeno e del cromogeno viene bloccata
con l‘aggiunta di acido solforico diluito. In relazione alla tecnica competitiva del test l‘intensità
del colore sviluppato è inversamente proporzionale alla concentrazione di anti-HBc presente
nel campione in esame.
Reagenti
Contenuto della confezione
Enzygnost* anti-HBc monoclonal
2x96
Enzygnost* anti-HBc
Coniugato anti-HBc/POD, monoclonale
Tampone per il coniugato (anti-HBc monoclonale)
Siero di controllo anti-HBc, negativo
Siero di controllo anti-HBc, positivo
Soluzione di lavaggio POD (concentrata)**
Tampone/substrato TMB**
Cromogeno TMB**
Soluzione bloccante POD**
Flacone vuoto per la soluzione d’uso del cromogeno
Fogli adesivi
Sacchetti in PE
Tabella con codice a barre
Istruzioni per l’uso
2 piastre test
2 x 1,2 mL
4 x 12,5 mL
2 x 0,7 mL
2 x 0,5 mL
1 x 100 mL
1 x 30 mL
1 x 3 mL
1 x 100 mL
1 pz
6 pz
1 pz
1 pz
1 pz
Ulteriori confezioni: 100 x 96
** Questi componenti sono inclusi anche nel Kit Reagenti Supplementari per Enzygnost* TMB
(codice OUVP).
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Edizione Febbraio 2004
Composizione
Enzygnost* anti-HBc monoclonale (piastra test): piastra per microtitolazione sensibilizzata
con l‘antigene «core» d‘epatite B prodotto con tecniche di ingegneria genetica.
Coniugato anti-HBc/POD, monoclonale: anti-HBc monoclonale, coniugato con perossidasi
(POD).
Conservante: fenolo (max. 1 g/L)
Tampone per coniugato (anti-HBc monoclonale) Tampone Tris contente Boviserina® e
Tween 20.
Conservante: fenolo (max. 1 g/L)
Siero di controllo anti-HBc, negativo: siero umano, stabilizzato, valore nominale di estinzione: ≥ 0,7
Conservanti: amfotericina (ca. 5 mg/L), gentamicina (ca. 100 mg/L).
Siero di controllo anti-HBc, positivo: siero umano, stabilizzato, valore nominale di estinzione: ≤ 0,1
Conservanti: amfotericina (ca. 5 mg/L), gentamicina (ca. 100 mg/L).
Soluzione di lavaggio POD (concentrata): soluzione di tampone fosfato contenente Tween.
Mezzo di conservazione: fenolo (ca. 1g/L)
Tampone substrato TMB: perossido di idrogeno (0,1 g/L) in soluzione tampone acetato.
Mezzo di conservazione: n-butanolo (max. 1%).
Cromogeno TMB: tetrametilbenzidina-cloridrato
Soluzione bloccante POD: acido solforico 0,5 N
Avvertenze e precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in-vitro
2. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione dei sieri di controllo è stata esaminata
per la ricerca della HBsAg e degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2. Solo i campioni
risultati negativi sono stati impiegati per la produzione.
Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessairie
precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico, in quanto non è possibile
escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni6.
4. Si consiglia l’uso di guanti di protezione durante l’intera esecuzione del test.
5. Per lo smaltimento del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave per
almeno 1 ora a +121 °C. Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due contenitori collegati
in serie, i quali dovrebbero contenere un disinfettante adatto all’inattivazione dei virus patogeni
umani. Osservare le concentrazioni ed i tempi di azione indicati dal produttore.
Preparazione dei reagenti
Portare tutti i reagenti ed i campioni in esame a +18/+25 °C prima dell‘inizio del test. Non togliere
la piastra test dal sacchetto di alluminio.
Per ogni piastra test diluire 20 mL di liquido di lavaggio POD con 400 mL di acqua distillata o
deionizzata.
Soluzione d’uso di cromogeno: per ogni piastra test diluire 1 mL di cromogeno TMB con 10
mL di tampone/substrato TMB nel flacone vuoto appositamente fornito (soluzione d’uso di
cromogeno), e custodire ben chiuso al riparo dalla luce. Dopo l’uso, lavare accuratamente il
flacone con acqua distillata.
A causa della dimensione del flacone non è possibile versare il cromogeno TMB direttamente
nel tampone/substrato.
Soluzione d’uso di coniugato: per ogni piastra test aggiungere 0,5 mL di coniugato anti-HBc/
POD al contenuto di una confezione originale (12,5 mL) di tampone coniugato (anti-HBc
monoclonale), (diluizione 1:25) e mescolare agitando delicatamente, evitando la formazione di
schiuma (= soluzione di coniugato pronta per l‘uso).
Conservazione e validità
Prima dell’apertura, tutte le componenti della confezione Enzygnost* anti-HBc monoclonale
possono essere utilizzate fino alla data di scadenza indicata in etichetta, purchè conservate a
+2/+8 °C.
La conservazione e la validità dei reagenti pronti per l’uso, dopo l’apertura, sono riportate in
appendice nella Tabella 1.
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Strumentazione necessaria
Per la dispensazione automatica dei reagenti e della soluzione di
BEP® II:
lavaggio
BEP® III:
Per l’esecuzione automatica e valutazione del test, dopo la
distribuzione dei campioni
per l’esecuzione automatica del test e la valutazione dei risultati
BEP® 2000:
Pipette:
Pipette automatiche da 25, 100 e 1000 µl.
Sistema di incubazione: bagnomaria coperto (+ 37 ± 1 °C) o analoghi metodi di incubazione.
Tutta la strumentazione usata nel test deve essere validata.
Campioni
Si impiegano come campioni in esame quelli singoli (siero umano o plasma citratato/
eparinizzato/EDTA) ottenuti da tecniche standard di laboratorio. I campioni devono essere
conservati a + 2/+ 8 °C per non più di 3 giorni. Se i campioni devono essere conservati per un
lungo periodo di tempo, devono essere congelati.
Esecuzione del test
Esecuzione del test con il BEP® II
1. Schema di distribuzione: definire il numero di pozzetti necesari. (Numero di campioni in
esame + 6 pozzetti per i controlli). Per l‘esecuzione del test togliere le file di pozzetti non
utilizzate e conservarle per un successivo uso (vadi tabella 1).
2. Distribuzione dei campioni: distribuire 25 µL/pozzetto di controllo negativo in 4 pozzetti, 25
µL di controllo positivo nel pozzetto successivo, quindi distribuire 25 µL/pozzetto del
campione non diluito nei pozzetti successivi. Alla fine della serie o della piastra distribuire
ancora una volta 25 µL di controllo positivo ed effettuare nel più breve tempo possibile, al
massimo entro 15 min. dalle distribuzione dei campioni, ladistribuzione del coniugato (ved.
punto 3).
In alternativa al suriportato schema di distribuzione, è possibile distribuire il controllo positivo
due volte all’inizio della serie.
Schema di distribuzione: distribuire 25 µL di siero di controllo negativo in ognuno dei primi
4 pozzetti e 25 µL di siero di controllo positivo nei 2 pozzetti successivi; distribuire in ognuno
dei successivi pozzetti 25 µL di campione non diluito.
3. Distribuzione del coniugato: distribuire in ogni pozzetto 100 µL di coniugato diluito per
l‘uso, coprire con un foglio adesivo e inserire immediatamente nel sistema di incubazione.
4. Incubazione: incubare la piastra coperta con un foglio adesivo a +37/± 1 °C per 60 ± 5 mon.
Al termine inserirla immediatamente nel dispositivo di lavaggio.
5. Lavaggio: rimuovere il foglio adesivo, aspirare tutti i pozzetti e lavare 4 volte con ca. 0,3 mL
di soluzione di lavaggio.
6. Distribuzione del substrato: distribuire in ogni pozzetto 100 µL di soluzione d’uso di
cromogeno. Copire la piastra con un nuovo foglio adesivo.
7. Incubazione del substrato: incubare per 30 ± 2 min, a +18/+25 °C al riparo dalla luce.
8. Arresto della reazione: rimuovere il foglio adesivo e aggiungere in ogni pozzetto 100 µL di
soluzione bloccante POD, osservando la stessa cadenza del punto 6.
9. Valutazione: leggere fotometricamente i risultati a 450 nm entro 1 ora.
Si consiglia l’uso di un fotometro con due lunghezze d’onda (raggio di misura e raggio di
riferimento).
Effettuare la misurazione dei valori di estinzione dei campioni di controllo e dei pazienti a
450 nm. Si consiglia una lunghezza d’onda della misura di riferimento di 650 nm (fra 615 nm e
690 nm).
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Esecuzione del test usando il BEP® III
Prima di utilizzare il BEP® III, preparare le piastre test ed eseguire le operazioni di
dispensamento dei campioni (Paragrafo 1 e 2 in ”Esecuzione del test con il BEP® II”). Subito
dopo porre le piastre non coperte da foglio adesivo nel BEP® III. Attenzione: le piastre
parzialmente riempite devono essere completate almeno a metà piastra (6 strip) aggiungendo
”strip riempite con acqua”. Il test viene quindi eseguito in modo completamente automatico (v.
Manuale d’uso BEP® III).
Le impostazioni per i periodi di incubazione nel software del BEP® III possono differire dai periodi
del BEP® II per motivi tecnici (velocità del sistema), ma sono state validate per i metodi
Enzygnost* sul BEP® III.
Esecuzione del test usando il BEP® 2000
Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite in
maniera completamente automatica dall’analizzatore (v. manuale d’uso del BEP® 2000).
Validità del test
I singolil valori di estinzione per i sieri di controllo vengono utilizzati per calcolare il valore medio quando:
Eneg. ≥ 0,700
-0,010 ≤ Epos. ≤ 0,100
Se uno dei valori di estinzione del siero di controllo negativo anti-HBc non rientra nell valore
atteso, non viene preso in considerazione.
I valori di estinzione dei controlli positivi devono essere compresi nell‘ambito indicato. Se non
sussistono queste condizioni, il test deve essere ripetuto.
Valutazione del test
Sul BEP® 2000 o BEP® III, il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente. Consultare il rispettivo
manuale d’uso. I seguenti capitoli permettono la valutazione dei risultati senza l’ausilio del software.
Dai valori di estinzione dei controlli negativi si calcola il valore medio.
Per valutare il valore soglia si moltiplica il valore medio di estinzione del controllo negativo per il
fattore 0,4.
–
E neg. x 0,4 = valore soglia (cut off)
L‘ambito limite viene così definito:
valore soglia ± 10%
Secondo i criteri del test i campioni in esame vengono classificati come segue:
Risultato del test:
^ «negativo»
1. Ecampione > cut off + 10% = campione =
^ «temporaneamente positivo»
2. Ecampione > cut off - 10% = campione =
^ campione «dubbio»
3. cut off -10% ≤ Ecampione ≤ cut off + 10% =
Con un risultato dubbio la prova deve essere ripetuta in doppio. Se, dopo aver ripetuto il test,
entrambi i valori di estinzione risultano rispettivamente al di sopra o al di sotto dell‘ambito del valore
dubbio, il valore ottenuto inizialmente non deve essere considerato e il campione deve essere
considerato rispettivamente negativo o positivo. Se i campioni, in una o in entrambe le
determinazione del test di ripetizione, reagiscono al limite dei valori, si consiglia, per una definitiva
chiarificazione del risultato, di ripetere il test su un campione prelevato a distanza di 2–4 settimane.
Limitazioni della esecuzione del test
1. Non devono essere utilizzati campioni contenenti sodio azide!
2. Gli anticoagulanti come l’eparina, l’EDTA e il citrato non influenzano il risultato del test.
3. Non sono state riscontrate interferenze nei campioni trattati al calore (60 minuti a +56 °C).
4. I sieri provenienti da sangue non completamente coagulato, come anche componenti
cellulari del sangue, possono portare a risultati in inesatti.
5. Campioni emolizzati o contenenti fattori reumatoidi non influenzano i risultati del test.
6. I campioni contenenti anticorpi anti-CMV ed i campioni positivi per l’anti-HBs non
interferiscono con il risultato del test.
7. I campioni di pazienti con immunocomplessi circolanti ed i campioni contenenti IgG dirette
contro anticorpi murini non presentano interferenze con il risultato del test.
8. I campioni contenenti anticorpi contro il virus dell’epatite B, EBV, HIV, HCV ed i campioni
lipemici ed itterici possono presentare una elevata reattività.
9. I campioni di pazienti emodializzati, trapiantati o sottoposti a trasfusioni di sangue multiple
ed i campioni di pazienti con valori di transaminasi aumentati possono presentare una
elevata reattività.
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10. Quando si utilizzano campioni scongelati, assicurarsi di una buona omogeneizzazione del
materiale prima dell’uso.
11. E' necessario utilizzare solo reagenti appartenenti tutti ad uno stesso lotto (ad esclusione della
soluzione di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d'uso del cromogeno
preparata con i reagenti Cromogeno TMB e Tampone/Substrato TMB appartenenti tutti allo
stesso lotto). La combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre (Lot. nr.) e quella
stampata sulla confezione ed anche riportata nell'allegata tabella dei codici a barre.
12. Il tampone/substrato TMB, la soluzione d’uso del cromogeno e la soluzione bloccante POD
non devono entrare in contatto con ioni di metalli pesanti o sostanze ossidanti (non utilizzare
pipette con parti metalliche a contatto con il liquido!). Non eseguire la reazione con il substrato
in presenza di disinfettanti contenenti ipoclorito. Se la soluzione d’uso del cromogeno si colora
spontaneamente di blu prima del dispensamento nella piastra test significa che la soluzione è
stata contaminata; in tal caso preparare nuovamente la soluzione fresca in un contenitore
pulito. Evitare il contatto di queste soluzioni con la cute.
13. Durante la fase di incubazione la piastra test deve rimanere immobile (ad esempio utilizzare un
supporto fisso ed evitare bagnomaria a circolazione d’acqua); i pozzetti della piastra devono
essere a contatto con l’acqua termostatata. Se vengono utilizzati stabilizzanti per evitare la
contaminazione batterica dell’acqua, occorre fare attenzione che la superficie della piastra test
ed i pozzetti non vengano a contatto con queste soluzioni, in quanto simili contaminazioni
possono produrre reazioni aspecifiche.
14. In presenza di campioni fortemente reattivi si può verificare la formazione di un precipitato
entro la soluzione colorata. Tuttavia la valutazione fotometrica non viene compromessa.
15. Il siero di controllo è stato ottenuto da siero umano nativo. Possono manifestarsi intorbidamenti,
che però non interferiscono sui risultati del test.
16. Dade Behring ha validato l’uso di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare le
prestazioni e rispettare le specifiche dei prodotti. Le modifiche definite dall’utente non sono
supportate da Dade Behring poiché possono influire sulle prestazioni del sistema e sui
risultati del test. Pertanto è responsabilità dell’utente validare tutte le modifiche apportate a
queste istruzioni, l’uso dei reagenti su analizzatori diversi da quelli inclusi nei fogli di
istruzioni o nelle istruzioni d’uso fornite da Dade Behring.
17. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del
paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.
Caratteristiche del test
Sensibilità e specificità
I risultat per la valutazione della sensibilità e della specificità sono riportati nelle tabelle 2 e 3 (in appendice).
Per la valutazione della sensibilià sono stati esaminati complessivamente 1266 campioni antiHBc positivi ed è stata rilevata una sensibilità da 96,9 a 100% (test iniziale) e di 97,5% (dopo
ripezzione del test). Nonsi può tuttavia escludere la possibilità che, con l‘impiego del test su
vasta scala, qualche particolare campione possa risultare non identificato.
Per la valutazione della specificità sono stati esaminati 6116 campioni di sangue anti-HBc
negativi ed e stata rilevata una specificità da 99,2% (test iniziale) e da 99,6% (dopo ripetizione
del test). Possibili scostamenti da tali valori possono dipendere dal tipo di collettività esaminata,
dalle modalità di esecuzione del test o da altre variabili.
Scondo to stato attuale delle conoscenze un risultato positivo al test anti-HBc non permette di
diagnosticare con certezza un‘infezione da HBV, cosi come un risultato negativo del test non
può escudere con assoluta certezza la presenza di un‘infezione da HBV.
Riproducibilità
I risultati della riproducibilità intra-ed inter-assay sono riportati nella tabella 4 (in appendice).
Per quanto riguarda la riproducibilità intra-assay i coefficienti di variazione ottenuti variano da
3,9 a 13,6%. Per la riproducibilità inter-assay i coefficienti di variazione ottenuti variano da 5,6 a
15,3%. I dati ottenuti sono da considerare come esempio. Possibili scostamenti da tali valori
possono dipendere dalle modalità di esecuzione del test.
* Enzygnost è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Germania e altri paesi.
BEP è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti, Germania e altri paesi.
Boviserina è un marchio registrato della Aventis Behring
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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0197
Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonale
Conservazione e validità
Campioni/Reagenti
Condizioni
Conservazione
Stabilità•
Enzygnost* anti-HBc
monoclonale
(piastra test)
dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
Coniugato anti-HBc/POD
dopo apertura
+2/+8 °C
≤ -20 °C
4 settimane
3 mes
Tampone per ol coniugato
dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
Coniugato diluito per
l‘uso
1 + 25
+2/+8 °C
+18/+25 °C
4 settimane
1 settimane
Siero di controllo anti-HBc,
positivo
Siero di controllo anti-HBc,
negativo
dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
dopo apertura
≤ -20 °C
3 mes
Cromogeno TMB
dopo apertura
+2/+8 °C
data di scadenza
Tampone/Substrato TMB
dopo apertura
+2/+8 °C
data di scadenza
Soluzione Cromogeno
1+10
+2/+8 °C
+18/+25 °C
(ben chiuso, protetto
dalla luce)
5 giorni
8 ore
Soluzione di lavaggio POD
(concentrata)
non diluita
dopo apertura
1:20
1:20
+2/+8 °C
data di scadenza
+2/+8 °C
+18/+25 °C
1 settimane
1 giorno
dopo apertura
+2/+8 °C
data di scadenza
Soluzione bloccante POD
(nel sacchetto con
l‘essiccante)
• In nessun caso oltre la data di scadenza
Tabella 2: sensibilità
Per la valutazione della sensibilità sono stati forniti da due centri indipendenti (T, Tr) i seguenti
dai:
Insieme del campioni
Numero di
campioni
Inizialmente
reattivi
Reattivi dopo
ripetizione
(T) Infezione acuta da HBV
Infezione cronica da HBV
Infezione da HBV risolta
Controlli del decorso
50
100
196
115
50
99
190
115
50
99
191
115
(Tr) Infezione acuta da HBV
Infezione cronica da HBV
Infezione da HBV risolta
Controlli del decorso
80
521
73
131
79
516
73
131
79
516
73
131
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Tabella 3: specificità
Per la valutazione della specificità sono stati forniti da quatro centri indipendenti (T, J, R, W)
i seguenti dai:
Insieme del campioni
Numero di
campioni
Inizialmente
reattivi
Reattivi dopo
ripetizione
(T) Sieri normali negativi
480
2
1
(J) Sieri normali negativi
Plasmi normali negativi
1943
494
17
4
12
2
(R) Sieri normali negativi
731
0
0
(W) Sieri/Plasmi normali negativi
2468
28
9
Tabella 4: riproducibilità
Per la valutazione della riproducibilità intra-assay sono stati forniti da due centri indipendenti (T,
Tr) i seguenti dati:
Campione
Ripetizioni
Ratio
CV %
(T) 1
2
3
20
20
20
1.531
1.012
0.689
8.7
13.6
8.0
(Tr) 1
2
3
15
15
15
1.559
1.079
0.951
5.0
3.9
5.4
Per la valutazione della riproducibilità inter-assay sono stati forniti da tre centri indipendenti (T, J,
Tr) i seguenti dati:
Campione
Ripetizioni
Ratio
CV %
(T) 1
2
3
10
10
10
1.689
1.090
0.844
8.5
10.7
11.2
(J) 1
2
3
10
10
10
1.878
1.329
1.109
4.7
11.5
15.3
(Tr) 1
2
3
7
7
7
1.373
0.940
0.705
5.6
12.0
10.8
Ratio = Estinzione/cut-off
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Tabella 5: Esecuzione e programmazione del test
Enzygnost* Anti-HBc monoclonale
Esecuzione del test
Programmazione
del menù per il
BEP® II
Preparazione dei reagenti
BEP® 2000
4 x 25 µL Siero di controllo, negativo
2 x 25 µL Siero di controllo, positivo
25 µL per campioni non diluiti
BEP® II
BEP® III
100 µL
del coniugato
Nel caso di piastre
riempite parzialmente,
aggiungere file di pozzetti
con acqua fino a riempire
mezza piastra test.
60 ± 5 min
(a 37 ± 1 °C)
4 lavaggi BEP® II
100 µL Soluzione d’uso
del cromogeno
Esecuzione
automatica del test
30 ± 2 min
a +18 /25 °C
al riparo della luce
MENU NO
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DISPENSAZIONE CONIUGATO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVAGGIO E DISPENSAZIONE
CHROMOGENO
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DISPENSAZIONE SOLUZIONE
BLOCCANTE
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µL Soluzione bloccante
al massimo entro 1 ora
Lettura a 450 nm (lunghezza
d’onda di riferimento: 650 nm)
Risultati
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PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
4
NO
4
0.700
0.4
0.100
-
Campos de aplicación
Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los anticuerpos contra el
antígeno de la hepatitis B (core) en el suero o en el plasma.
La realización del ensayo inmunológico se lleva a cabo en los ELISA Procesadores BEP ® II, BEP®
III y BEP® 2000. El test se desarrolló para la investigación de muestras individuales, no de muestras en pool. El producto debe ser usado únicamente en diagnósticos in vitro.
Importancia diagnóstica
Los anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis B (core) (Anti-HBc) son los primeros
anticuerpos que se hacen presentes en el curso de una hepatitis B aguda después de la
aparición de los antígenos HBsAg y HBeAg1 y persisten a menudo durante toda la vida5. Por ese
motivo, la determinación de Anti-HBc en el suero puede utilizarse para controlar la evolución de
una hepatitis B2. Además, Anti-HBc puede servir de marcador en el diagnóstico diferencial entre
hepatitis A, hepatitis B y hepatitis non A/non B. Si se utiliza la determinación de Anti-HBc como
parámetro del screening, un diagnóstico de Anti-HBc positivo puede indicar un contacto previo
con el virus de la hepatitis B, aun en sueros negativos frente al HBsAg y al Anti-HBs. Alrededor
del 10% de todas las hepatitis son detectables serológicamente sólo mediante la determinación
del Anti-HBc3.
Antes de aplicar una vacuna contra la hepatitis B, el hallazgo de Anti-HBc permite sacar
conclusiones sobre el estado inmunitario de la persona a vacunar4.
En las investigaciones epidemiológicas, el anticuerpo contra el antígeno HBc es un parámetro
valioso ya que puede ser demostrado durante un tiempo más prolongado que el anti-cuerpo
contra el antígeno HBs5.
Principio del método
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal es una prueba immunoenzimática para la determinación in
vitro de anticuerpos contra el HBcAg en el suero o en el plasma según el principio competitivo.
El anti-HBc de la muestra compite con el conjugado Anti-HBc/POD para fijarse al HBcAg
depositado en la superficie de la placa de microtitulación. Después del lavado del pocillo se
determina la actividad enzimática de la peroxidasa fijada. La transformación enzimática del
peróxido de hidrógeno y del cromógeno se interrumpe por la adición de ácido sulfúrico diluido.
En razón del principio competitivo de la prueba, la intensidad cromática es inversamente
proporcional a la concentración de Anti-HBc presente en la muestra.
Reactivos
Contenido del envase comercial
2 x 96
Enzygnost* Anti-HBc
2 placas de prueba
Conjugado Anti-HBc/POD, monoclonal
2 x 1,2 ml
Tampón para conjugado (Anti-HBc monoclonal)
4 x 12,5 ml
Suero de control Anti-HBc, negativo
2 x 0,7 ml
Suero de control Anti-HBc, positivo
2 x 0,5 ml
Solución de lavado POD (concentrado)**
1 x 100 ml
Tampón/sustrato TMB**
1 x 30 ml
Cromógeno TMB**
1 x 3 ml
Solución de parada POD**
1 x 100 ml
Frasco vacío para preparar la solución de cromógeno
1 unidad
Láminas adhesivas
6 unidades
Bolsa de PE
1 unidad
Tabla de valores Barcode
1 unidad
Boletín informativo
1 unidad
Otros envases comerciales: 100 x 96
** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos adicionales para
Enzygnost* TMB (N° de pedido OUVP).
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Edición Febrero 2004
Composición
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (placa de prueba): Placa de microtitulación recubierta con
antígenos de la hepatitis B-core obtenidos por tecnología genética.
Conjugado Anti-HBc/POD, monoclonal: Antí HBc monoclonal, conjugado con peroxidasa
(POD). Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l).
Tampón para conjugado (anti-HBc monoclonal) Tampón Tris con Boviserin® y Tween 20.
Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)
Suero de control Anti-HBc, negativo: Suero humano, estabilizado; valor teórico de extinción ≥
0,7. Agentes de conservación: Anfotericina (aprox. 5 mg/l), Gentamicina (aprox. 100 mg/l).
Suero de control Anti-HBc, positivo: Suero humano, estabilizado; valor teórico de extinción
≥ 0,1. Agentes de conservación: Anfotericina (aprox. 5 mg/l), Gentamicina (aprox. 100 mg/l).
Solución de lavado POD (concentrado): Solución de tampón de fosfato con adición de Tween.
Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)
Tampón/sustrato TMB: Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de acetato.
Agente de conservación: n-butanol (aprox. 1%)
Cromógeno TMB: diclorhidrato de tetrametilbenzidina
Solución de parada POD: Acido sulfúrico 0,5 N
Advertencias y medidas de precaución
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro
2. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación de sueros de control ha sido
investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 y anti-HIV2. En la
elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos.
Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana
deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de
seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir
completamente la existencia de agentes patógenos6.
3. Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test.
4. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave por
lo menos 1 hora a + 121 °C. Todas las soluciones aspiradas se deben recoger en dos
recipientes conectados uno con el otro. Estos recipientes deben contener un medio de
desinfección apropiado para inactivar virus patógenos humanos. Deben observarse la
concentración y el tiempo de acción dados por el fabricante.
Preparación de reactivos
Llevar todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre +18 y +25 °C antes de iniciar
la prueba, sin sacar del recipiente la placa de prueba.
Para cada placa de prueba diluir 20 ml de solución de lavado POD con agua destilada o
desionizada hasta obtener 400 ml.
Solución de uso del cromógeno: Para cada placa de prueba diluir 1 ml de cromógeno TMB
con 10 ml de tampón/sustrato TMB en el frasco plástico adjunto (solución de uso del
cromógeno) y conservar el frasco cerrado al abrigo de la luz. Después de su uso, lavar
cuidadosamente el frasco con agua destilada.
Para evitar la repleción no está permitido verter juntos el contenido de los frasco de
cromógeno TMB y de tampón/sustrato TMB.
Solución de uso del conjugado: Para cada placa de prueba agregar 0,5 ml de conjugado
Anti-HBc/POD a un frasco original (12,5 ml) de tampón de conjugado (Anti-HBc
monoclonal) (dilución 1+25) y agitar suavemente para mezclar evitando la formación de
espuma.
Estabilidad y almacenaje
Todos los componentes del envase combinado Enzygnost* anti-HBc monoclonal aún cerrados,
conservados entre +2 y +8 °C, son utilizables hasta las fechas indicadas en las etiquetas.
La estabilidad y las condiciones de almacenaje de los envases ya abiertos o de los reactivos ya
diluidos, se pueden consultar en la Tabla 1 del apéndice.
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Equipo necesario:
BEP® II:
Para el desarrollo automático de la dosificación de reactivos y de las etapas de lavado
BEP® III:
Para la realización completamente automática del test después de la distribución
de las muestras, así como para la evaluación.
BEP® 2000: Para la realización y valoración completamente automática del test.
Pipetas:
Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µl
Incubadora: Baño de agua cubierto (+37 ± 1 °C) u otros métodos de incubación similares
Todos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados.
Material a investigar
Para la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma con
EDTA/heparina/citrato), las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar de
laboratorio. Las muestras se pueden almacenar máximo 3 días entre +2 y +8 °C. Para tiempos
más largos de almacenamiento las muestras se deben congelar.
Procedimiento
Realización del test usando el BEP® II
1. Plan de distribución: Comprobar la cantidad necesaria de pocillos (cantidad de muestras a
investigar más 6 pocillos para los controles). Quitar del soporte los elementos que no han de
ser utilizados y conservarlos para su empleo ulterior (ver Tabla 1).
2. Distribución de las muestras: Dosificar en cuatro pocillos 25 µl del control negativo por c/u,
en un pocillo 25 µl del control positivo y en cada uno de los siguientes pocillos 25 µl de la
muestra non diluir. Al final de la serie o de la placa de ensayo dosificar una vez más 25 µl del
control positivo. Acto seguido distribuir el conjugado lo antes posible, como máximo 15 min
después de la distribución de las muestras.
Coma una alternativa para el esquema de pipeteo descrito anteriormente se permite también
colocar un control positivo dos veces al comienzo de cada serie del test.
Esquema de pipeteo: Colocar en 4 pocillos 25 µl de suero de control negativo en
cada uno y en 2 pocillos 25 µl de control positivo en cada uno así como en cada uno de los
siguientes pocillos 25 µl de la muestras sin diluir.
3. Distribución del conjugado: Colocar en cada pocillo 100 µl de la solución de uso del
conjugado, cubrir con la lámina adhesiva y llevar de immediato al incubador.
4. Incubación: Incubar durante 60 min ± 5 min a +37 ± 1 °C. Lavar de inmediato.
5. Lavado: Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada
uno de ellos con aprox. 0,3 ml de solución de lavado 4 veces.
6. Distribución del sustrato: Colocar en cada pocillo 100 µl de la solución de cromógeno lista
para el uso. Cubrir la placa con una nueva lámina adhesiva.
7. Incubación del sustrato: Incubar durante 30 ± 2 min entre +18 y +25 °C al abrigo de la luz.
8. Reacción de parada: Retirar la lámina adhesiva. Agregar 100 µl de solución de parada POD
en cada pocillo, manteniendo el mismo ritmo que en el punto 6.
9. Medición: Valorar fotométricamente a 450 nm en el término de una hora.
Es recomendable utilizar un fotómetro con dos longitudes de onda (rayo de medida y rayo de
referencia).
La medida de la extinción de las muestras de control y de las muestras de pacientes debe
realizarse con una longitud de onda de 450 nm; la longitud de onda de la medida de referencia
debe ser de 650 nm (o entre 615 y 690).
Procedimiento en el BEP® III
Para el desarrollo del test en el BEP® III, las placas de prueba se deben preparar hasta la
distribución de las muestras (punto 1 hasta punto 3 del «Procedimiento en el BEP® II»).
Directamente después de esto, colocar las placas de prueba abiertas, esto es, sin lámina
adhesiva en el BEP® III. Aquí es importante observar que las placas de prueba que no estén
llenas se deben completar con «elementos con agua» hasta por lo menos la mitad de la placa
de prueba (6 elementos). Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma
completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® III).
Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP® III pueden desviarse de los del
procedimiento en el BEP® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sin
embargo validados en la combinación BEP® III/Enzygnost*.
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37
Procedimiento en el BEP® 2000
La distribución de las muestras y la realización subsiguiente del test se efectúa de forma completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® 2000).
Validez de la prueba
Los valores de extinciones de los sueros de control se pueden utilizar para calcular el valor medio
cuando:
E neg. ≥ 0,700
-0,010 ≤ E pos. ≤ 0,100
Si uno de los valores de extinción del suero de control negativo Anti-HBc se halla fuera del límite
especificado, se puede no tenerlo en cuenta para el cálculo.
Los valores de extinción de los controles positivos, en cambio, deben estar ambos dentro del
límite especificado. Si no se cumplen estos requisitos, hay que repetir la prueba.
Valoración de la prueba
La evaluación con el BEP® 2000 o con el BEP® III, se realiza automáticamente. Para esto
consultar los manuales de operaciones. Los siguientes capítulos son para tener en cuenta en el
caso de evaluaciones sin la ayuda del software.
Obtener el valor medio de las extinciones de los controles negativos.
Para calcular el valor límite, multiplicar el valor medio de extinción de los controles negativos por
el factor 0,4.
–
E neg. x 0,4 = valor límite (cut off)
Como zona límite se establece:
valor límite ± 10%
Según los criterios de la prueba, las muestras se clasifican de la siguiente manera:
Resultado del test:
^ negativo
1. Emuestra > cut-off + 10% =
^ positivo
2. Emuestra < cut-off + 10% =
^ valor límite
3. cut-off - 10% ≤ Emuestra ≤ cut-off + 10% =
En casos de resultados con valor límite la prueba se repetirá esta vez en una doble
determinación. Si en la repetición de la prueba ambas extinciones se hallan por encima o por
debajo de la zona límite, no se tomará en cuente el valor límite inicial y la muestra se prodrá
considerar como negativa o positiva respectivamente. Si, en cambio, en una o en ambas
determinaciones de la repetición las muestras dan valores límites de extinción, se recomienda,
para aclarar el resultado, una nueva determinación con una muestra extraída 2 a 4 semanas
después de la primera.
Limitaciones del Procedimiento
1. No deben usarse muestras que contengan azida sódica!
2. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato no influyen sobre el resultado de la
prueba.
3. No se ha observado ninguna alteración en muestras tratadas por calor (60 min. a +56 °C).
4. El suero de sangre insuficientemente coagulada, así como los componentes celulares
sanguíneos, pueden conducir a resultados dudosos.
5. Las muestras hemolíticas y las muestras que contienen factor reumatoideo no alteran el
desarrollo del test.
6. Las muestras con anticuerpos contra CMV, así como, las muestras anti-HBs positivas no
influyen sobre los resultados del test.
7. En muestras de pacientes con inmunocomplejos circulantes, así como, en muestras que
contienen IgG anti ratón no se observo ninguna influencia sobre los resultados del test.
8. Las muestras con anticuerpos contra el virus de la hepatitis A, EBV, HIV, HCV, así como, las
muestras lipémicas o ictéricas pueden mostrar aumento en la reactividad.
9. Las muestras de pacientes en hemodiálisis, pacientes con trasplantes, pacientes con varias
transfusiones sanguíneas, así como, pacientes con valores de transaminasas elevados
pueden presentar una reactividad aumentada.
10. En muestras descongeladas se debe tener en cuenta que el material se encuentre bien homogenizado.
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38
11. Los reactivos (con exepción de la solución de lavado POD, la solución de parada y la
solución de uso del cromógeno, la cual ha sido preparada a partir de los reactivos
dependientes del lote, cromógeno TMB y Tampón/sustrato TMB ) sólo se pueden utilizar
juntos si provienen del mismo lote, esto es, con el mismo número de 6 cifras (Nr. de Lote)
que está impreso en el envase o que se puede tomar de la Tabla de código de barras
incluida en él.
12. El tampón/sustrato TMB, la solución de uso del cromógeno y la solución de parada POD no
deben entrar en contacto con iones de metales pesados o con sustancias oxidantes (no utilizar
pipetas que tengan partes metálicas que entren en contacto con el líquido). Las reacciones del
sustrato no se deben efectuar en la cercanía de medios de desinfección que contengan
hiploclorito. Una coloración azul espontánea de la solución de uso del cromógeno antes de
agregarse a la placa de prueba está indicando una contaminación; prepare una nueva solución en
un recipiente limpio. Evite el contacto de la piel con las soluciones arriba mencionadas.
13. Durante la incubación la placa de prueba debe de permanecer en reposo (por ej. con ayuda de un
flotador fijo o con un bañomaría no circulante). Si se utilizan agentes de conservación para evitar la
contaminación del agua, hay que tener la precaución de que ni la superficie de la placa de prueba ni los
pocillos entren en contacto con estas soluciones pues podrían provocar reacciones no especificas.
14. En muestras altamente reactivas se puede presentar una precipitación del colorante al agregar la
solución de parada. La valoración fotométrica de la muestra no va a ser perturbada por esto.
15. Los sueros de control son fabricados a partir de sueros humanos nativos. Por esta razón
puede aparecer turbidez, la cual no influye sobre los resultados del test.
16. Dade Behring ha validado el uso de los reactivos en varios analizadores para optimizar el
rendimiento del producto y cumplir con las especificaciones del mismo. Las modificaciones
definidas por el usuario no están garantizadas por Dade Behring dado que pueden afectar al
rendimiento del sistema y a los resultados del ensayo. Es responsabilidad del usuario
validar las modificaciones realizadas a estas instrucciones o el uso de los reactivos en
analizadores distintos a los incluidos en las hojas de aplicaciones de Dade Behring o en
estas instrucciones de uso.
17. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia
clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.
Caracteristicas del test
Sensibilidad y especificidad
Los resultados de las pruebas de sensibilidad y especificidad están resumidos en las Tablas 2 y
3 (en el apéndice).
Para la determinación de la sensibilidad se estudiaron en total 1266 muestras anti-HBc positivas
encontrándose una sensibilidad entre el 96,9 y el 100% (ensayo inicial) o del 97,5% (repetición
del ensayo). Para una aplicación más amplia del test no se puede excluir que algunas muestras
aisladas no puedan ser reconocidas.
Para determinar la especificidad se investigaron en total 6116 muestras de sangre donada antiHBc negativas encontrándose una especificidad entre el 99,2% (ensayo inicial) o del 99,6%
(repetición del ensayo). Es posible encontrar valores diferentes dependiendo, entre otros, de la
colectividad investigada y del desarrollo del test.
De acuerdo al estado actual de los conocimientos no se puede deducir de un resultado positivo
del ensayo Anti-HBc que exista con seguirdad una infección por HBV, como tampoco un resultado
negativo de ninguna manera descarta con seguridad la presencia de una infección por HBV.
Reproducibilidad
Los resultados para la reproducibilidad en intra/inter-assay están resumidos en la Tabla 4 (en el
apéndice).
En la reproducibilidad mediente intra-assay se obtuvieron coeficientes de variación desde 3,9
hasta 13,6%. Para la reproducibilidad por inter-assay se obtuvieron coeficientes de variación
desde 5,6 hasta 15,3%. En este caso se trata de datos encontrados como ejemplo. Es posible
encontrar valores diferentes dependiendo, entre otros, del procedimiento.
* Enzygnost es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y en otros países.
BEP es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países.
Boviserin es una marca registrada de Aventis Behring
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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39
0197
Tabla 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonale
Estabilidad y almacenaje
Material/reactivo
Estado
Almacenaje
Estabilidad•
Enzygnost* Anti-HBc
monoclonal
(placa de prueba)
abierto
entre +2 y +8 °C en
4 semanas
Conjugato Anti-HBc/POD
monoclonal
abierto
entre +2 y +8 °C
a ≤ -20°C
4 semanas
3 meses
Tampon para conjugado
abierto
entre +2 y +8 °C
4 semanas
Conjugado diluido
listo para el uso
1 + 25
entre +2 y +8 °C
entre +18 y +25 °C
4 semanas
1 semana
Suero de control Anti-HBc,
positivo
Suero de control Anti-HBc,
negativo
abierto
entre +2 y +8 °C
4 semanas
abierto
≤ -20 °C
3 meses
Cromógeno TMB
abierto
entre +2 y +8 °C
Fecha de caducidad
Tampón/sustrato TMB
abierto
entre +2 y +8 °C
Fecha de caducidad
Solución de uso del
cromógeno
1+10
entre +2 y +8 °C
entre +18 y +25 °C
en recipiente cerrado,
al abrigo de la luz
5 días
8 horas
Solución de lavado POD
(concentrado)
sin diluir
abierto
1:20
1:20
entre +2 y +8 °C
Fecha de caducidad
entre +2 y +8 °C
entre +18 y +25 °C
1 semana
1 día
abierto
entre +2 y +8 °C
Fecha de caducidad
Solución de parada POD
envase con cápsulas
deshidratantes
• EN ningún caso más allá de la fecha de caducidad
Tab. 2 Sensibilidad
En la investigación de la sensibilidad se encontraron, en dos centros de investigación diferentes
(T, Tr), los siguientes datos:
Colectivo
de muestras
Número
de muestras
Reactividad
inicial
Reactividad
repetida
(T) Infección aguda por HBV
Infeccion crónica por HBV
Infección anterior por HBV
Muestras de control del
procedimiento
50
100
196
115
50
99
190
115
50
99
191
115
(Tr) Infección aguda por HBV
Infeccion crónica por HBV
Infección anterior por HBV
Muestras de control del
procedimiento
80
521
73
79
516
73
79
516
73
131
131
131
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40
Tab. 3 Especificidad
En la investigación de la especificidad se encontraron, en cuatro centros de investigación
diferentes (T, J, R, W), los siguientes datos:
Colectivo
de muestras
Número
de muestras
Reactividad
inicial
Reactividad
repetida
(T) Sueros negativos normales
480
2
1
(J) Sueros negativos normales
Plasmas negativos normales
1943
494
17
4
12
2
(R) Sueros negativos normales
731
0
0
(W) Sueros/Plasmas
negativos normales
2468
28
9
Tab. 4 Reproducibilidad
En la investigación de la reproducibilidad por intra-assay se encontraron, en dos centros de
investigación diferentes (T, Tr), los siguientes datos:
Muestra
Repeticiones
Radio
CV %
(T) 1
2
3
20
20
20
1.531
1.012
0.689
8.7
13.6
8.0
(Tr) 1
2
3
15
15
15
1.559
1.079
0.951
5.0
3.9
5.4
En la investigación de la reproducibilidad por inter-assay se encontraron, en tres centros de
investigación diferentes (T, J, Tr), los siguientes datos:
Muestra
Repeticiones
Radio
CV %
(T) 1
2
3
10
10
10
1.689
1.090
0.844
8.5
10.7
11.2
(J) 1
2
3
10
10
10
1.878
1.329
1.109
4.7
11.5
15.3
(Tr) 1
2
3
7
7
7
1.373
0.940
0.705
5.6
12.0
10.8
Radio = Absorción/Valor límite
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Tabla 5 Realización de la prueba y programación
Programación
Procedimiento
para el
BEP® II
Preparación de los reactivos
BEP® 2000
4 x 25 µl de suero control, negativo
2 x 25 µl de suero control, positivo
25 µl de cada muestra
BEP® II
BEP® III
100 µl de
conjugado
fraccionadas a medias
placas con "elementos
con agua"
60 min ± 5 min.
(37 ± 1 °C)
4 x lavar: BEP® II
100 µl de sol. de uso
del cromógeno
Procesamiento
automático
30 min ± 2 min.
entre +18 °C y +25 °C
protegido de la luz
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DOSIFICACIÓN DEL CONJUGADO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVADO E Y DOSIFICACIÓN
DEL CHROMÓGENO
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DOSIFICACIÓN SOLUCIÓN DE
PARADA
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl de sol. de
parada
máximo 1 h después
Valoración a 450 nm
(longitud de onda
de referencia: 650 nm)
Resultado de la prueba
OUWE G13 C0541 (879) CS/R
MENU NO
42
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
4
NO
4
0.700
0.4
0.100
-
Campo de aplicação
Teste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos contra o antigénio da
hepatite B (core) no soro ou no plasma.
O processamento do teste imunoenzimático faz-se com os processadores ELISA BEP® II,
BEP® III e BEP® 2000. O teste foi desenvolvido para a análise de amostras individuais, não de
amostras de pool. O produto só pode ser utilizado para efeitos de diagnóstico in vitro.
Significado diagnóstico
Os anticorpos contra o antigénio da hepatite B (core) (Anti-HBc) são os primeiros a manifestarse, logo depois dos antigénios HBsAg e HBeAg, numa hepatite B aguda1 e persistem
frequentemente durante toda a vida5. Por esse motivo, a determinação de anti-HBc no soro
pode servir para controlar a evolução de uma infecção pela hepatite B2. Além disso, o anti-HBc
pode servir de marcador no diagnóstico diferencial das hepatites A, B e não A/não B. Se se
utiliza a determinação de anti-HBc como parâmetro de screening, um resultado anti-HBc
positivo em soros HBsAg e anti-HBs negativos pode ser indício de um contacto anterior com o
vírus da hepatite B. Aproximadamente 10% de todas as hepatites só são serologicamente
detectáveis mediante a determinação do anti-HBc3.
Antes de aplicar uma vacina contra a hepatite B, a determinação de HBc permite conhecer o
estado imunitário do vacinado4.
Nas investigações epidemiológicas, o anticorpo contra o antigénio HBc é um parâmetro valioso,
uma vez que pode ser reconhecido durante um período mais prolongado do que o anticorpo
contra o antigénio Hbs5.
Princípio metodológico
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal é um ensaio imunoenzimático para determinação in vitro de
anticorpos contra HBcAg no soro ou plasma estruturado segundo o princípio da monorreacção
competitiva: O anti-HBc da amostra em teste e o conjugado Anti-HBc/POD (peroxidase)
competem entre si para se fixarem ao HBcAg fixado à superfície dos poços da microplaca.
Lavados os poços, é determinada a actividade enzimática da peroxidase ligada.
A reacção enzimática do peróxido de hidrogénio e do cromogénio é bloqueada por junção de
ácido sulfúrico diluído. Em virtude do princípio competitivo do teste, a intensidade cromática é
inversamente proporcional à concentração de Anti-HBc presente na amostra.
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial
2 x 96
Enzygnost* Anti-HBc
Conjugado Anti-HBc/POD, monoclonal:
Tampão para conjugado (Anti-HBc monoclonal)
Soro de controlo Anti-HBc, negativo
Soro de controlo Anti-HBc, positivo
Solução de lavagem POD (concentrado)
Tampão-substrato TMB
Cromógeno TMB
Solução de paragem POD
Frasco vazio para a solução de trabalho do cromógeno
Folhas adesivas
Bolsa de PE
Tabela de código de barras
Folheto da embalagem
2 placas de ensaio
2 x 1,2 ml
4 x 12,5 ml
2 x 0,7 ml
2 x 0,5 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 unidade
6 unidades
1 unidade
1 unidade
1 unidade
Outras embalagens comerciais: 100 x 96
** Estes componentes também são uma parte integrante da embalagem dos reagentes
acidionais para Enzygnost* TMB (ref. OUVP).
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Edição Fevereiro 2004
Composição
Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (Microplaca): Microplaca revestida com antigénio da
hepatite B-core obtido por tecnologia genética.
Conjugado Anti-HBc/POD, monoclonal: Anti-HBc monoclonal, conjugado com peroxidase
(POD).
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Tampão para conjugado (Anti-HBc monoclonal): tampão de Tris com boviserina® e Tween20.
Soro de controlo Anti-HBc, negativo: Soro humano, estabilizado; valor indicativo de
absorvância: ≥ 0,7
Conservantes: anfotericina (aprox. 5 mg/l), gentamicina (aprox. 100 mg/l)
Soro de controlo Anti-HBc, positivo: Soro humano, estabilizado; valor indicativo de
absorvância: ≤ 0,1
Solução de lavagem (concentrado): Solução tampão de fosfato com adição de Tween
Tampão/substrato TMB: Peróxido de hidrogénio (aprox. 0,1 g/l) em solução tampão de acetato
Conservante: n-butanol (aprox. 1%)
Cromógeno TMB: Diidrocloreto de tetrametilbenzidina
Solução de paragem: Ácido sulfúrico 0,5 N
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in vitro.
2. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de soros de controlo foi
previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, Anti-HCV, Anti-HIV1 e Anti-HIV2.
Na elaboração só são utilizados soros com resultado negativo.
No entanto, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manuseados com as
precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco
biológico, uma vez que nunca se pode excluir inteiramente o risco de contaminação por
agentes patogénicos6.
3. Recomenda-se utilizar luvas para análise durante toda a realização do teste.
4. Para descontaminação de materiais sólidos, aconselha-se uma autoclavagem durante pelo
menos 1 hora a uma temperatura de, pelo menos, + 121 ° C. Todas as soluções aspiradas
devem ser recolhidas em dois recipientes ligados em série, os quais devem conter um
desinfectante apropriado para inactivação de vírus humano-patogénicos. Observem-se as
concentrações e os tempos de incubação indicados pelo fabricante.
Preparação dos reagentes
Antes de iniciar o teste, levar todos os reagentes e amostras à temperatura de + 18 a + 25 ° C,
mas sem tirar a microplaca do seu recipiente.
Para cada microplaca, diluir 20 ml da solução de lavagem POD (concentrado) com água
destilada ou desionizada até obter 400 ml.
Solução de cromogénio: Diluir, por placa, 1 ml de cromogénio TMB com 10 ml de tampão/
substrato TMB no frasco de plástico anexo à embalagem e conservá-lo fechado e ao abrigo da
luz. Depois do uso, lavá-lo cuidadosamente com água destilada.
Dada a capacidade dos frascos, não passar todo o conteúdo do frasco de cromogénio TMB
para o de tampão/substrato TMB!
Solução de uso do conjugado: Adicionar, por placa, 0,5 ml de conjugado Anti-HBc/POD a
um frasco original (12,5 ml) de tampão para conjugado (Anti-HBc monoclonal) (1 + 25) e
agitar suavemente para misturar, mas evitar formação de espuma.
Estabilidade e condições de conservação
Não abertos, e enquanto conservados entre +2 e +8 ° C, todos os componentes da embalagem
combinada Enzygnost* Anti-HBc se mantêm utilizáveis até ao termo do prazo de validade
indicado nos rótulos.
Sobre estabilidade e condições de conservação dos reagentes abertos ou diluídos para uso, v.
tabela 1 em apêndice.
OUWE G13 C0541 (879) CS/R
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Aparelhos necessários
BEP® II:
para a execução automática da dosagem dos reagentes e das fases de lavagem
Processamento automático do ensaio e interpretação após dosagem das
BEP® III:
amostras
BEP® 2000: para o processamento e interpretação do teste, de forma inteiramente automática
Pipetas:
pipetas com êmbolo 25, 100 e 1000 µl
Incubador:
Banho-maria tapado (+37 ± 1 °C) ou outros métodos de incubação comparáveis
Todos os aparelhos utilizados no ensaio têm de estar validados.
Material a investigar
Para a análise podem ser utilizadas amostras individuais (soros humanos e plasmas EDTA/
Heparina/Citrato), colhidos de acordo com as técnicas do laboratório. As amostras poderão ser
conservadas durante de 3 dias, no máximo, entre +2 - +8 °C. Se se pretender conservá-las
durante um período de tempo superior, deverão ser congeladas.
Procedimento
Realização do teste com o BEP® II
1. Esquema de distribuição: Determinar o número necessário de poços (número das
amostras a investigar mais 6 poços para controlos). Retirar do suporte as fileiras de poços
desnecessárias e reservá-las para ulterior utilização (v. tabela 1).
2. Distribuição das amostras: distribuir em 4 poços, 25 µl em cada um, de soro de controlo,
negativo, em 1 poço 25 µl de soro de controlo, positivo, nos poços seguintes 25 µl, em cada
um, de amostra não diluída e no fim da série de teste ou da microplaca novamente 25 µl de
soro de controlo, positivo e proceder quanto antes, no máximo 15 min após o doseamento
das amostras, à distribuição do conjugado (v. 3.).
Alternativamente ao esquema de pipetagem acima indicado é permitido também distribuir o
controlo positivo dois vezes no início da série de teste.
Esquema de pipetagem: Pipetar em 4 poços, 25 µl em cada um, de soro de controlo
negativo, em 2 poços 25 µl, em cada um, de soro de controlo positivo, nos poços seguintes
25 µl, em cada um, de amostra não diluída.
3. Distribuição do conjugado: Distribuir 100 µl de solução de uso do conjugado, cobrir a
microplaca com folha adesiva e colocar imediatamente na incubadora.
4. Incubação: Deixar incubar durante 60 min ± 5 min a + 37 ± 1 ° C, imediatamente a seguir dar
início à lavagem.
5. Lavagem: Retirar a folha adesiva, aspirar o conteúdo de todas as cavidades e lavar cada
uma 4 vezes com aprox. 0,3 ml, de cada vez, de solução de lavagem.
6. Distribuição do substrato: Distribuir 100 µl de solução de cromogénio em cada poço, cobrir
a placa com nova folha adesiva.
7. Incubação do substrato: Deixar incubar durante 30 ± 2 min ao abrigo da luz entre + 18 e + 25 °
C.
8. Reacção de paragem: Retirar a folha adesiva. Acrescentar a cada poço 100 µl de solução
de paragem, mantendo o mesmo ritmo que em 6.
9. Leitura: Fazer uma medição fotométrica a 450 nm dentro de 1 hora.
É aconselhável empregar um fotómetro com dois comprimentos de onda (um de medição e
outro de referência).
Efectuar a medição das densidades ópticas das amostras de controlo e das dos pacientes a 450
nm; como comprimento de onda de referência aconselha-se 650 nm (eventualmente entre 615
e 690 nm).
Realização do teste com o BEP® III
No caso do processamento ser feito com BEP® III é necessário preparar as placas de ensaio
incluindo a dosagem das amostras (ponto 1 e 2 da “execução do teste com BEP® II).
Imediatamente a seguir, as placas de ensaio são colocadas no BEP® III abertas, ou seja, sem
película colada. Ao mesmo tempo, é necessário prestar atenção a que as placas de ensaio
parcialmente providas de ”barras de água” sejam acrescentadas até ficarem, no mínimo, pelo
meio ( 6 barras de água). O processamento subsequente do teste realiza-se automaticamente
(vide instruções de serviço do BEP® III).
OUWE G13 C0541 (879) CS/R
45
Devido às condições técnicas básicas (ciclo dos aparelhos), os tempos de incubação ajustados
no software do BEP® III podem divergir dos tempos do processamento com o BEP® II, mas
foram validados na combinação BEP® III/Enzygnost* .
Realização do teste com o BEP® 2000
A dosagem das amostras e subsequente processamento do teste são efectuados de forma
totalmente automática no aparelho (vide instruções de serviço do BEP® 2000).
Validação do teste
Os valores de absorvância dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valores
médios, se:
Eneg ≥ 0,700
-0,010 ≤ Epos ≤ 0,100
Dos valores de absorvância do soro de controlo anti-HBc, negativo, apenas um pode mostrarse fora dos limites especificados e ser ignorado.
Os valores de absorvância dos controlos positivos têm de estar ambos dentro dos limites
especificados. Não estando preenchidas estas condições, há que repetir o teste.
Valoração
As interpretações são realizadas automaticamente com o BEP® 2000 ou o BEP® III. Para o
efeito, consultar as instruções de serviço. Para uma interpretação sem a ajuda do software, é
necessário prestar atenção aos seguintes capítulos.
Calcular a média dos valores de absorvância dos controlos negativos.
Para calcular o valor-limite multiplicar o valor médio de absorvância dos controlos negativos
pelo factor 0,4.
–
Eneg. x 0,4 = valor-limite (cut off)
Como zona-limite define-se:
Valor-limite ± 10%
De acordo com os critérios do teste, as amostras serão classificadas do seguinte modo:
Resultado do teste:
^ negativo
1. Eamostra > cut off + 10% =
^ positivo
2. Eamostra < cut off - 10% =
^ zona-limite (duvidoso)
3. cut off - 10% ≤ Eamostra ≤ cut off + 10% =
Se o resultado se encontra na zona-limite, a amostra terá de ser sujeita a novo teste, desta vez
porém numa dupla determinação. Se, na repetição do teste, ambos os valores se acharem
acima ou abaixo da zona-limite, não se tomará em conta o resultado inicialmente tido por
duvidoso e a amostra será considerada negativa ou positiva.
Se, porém, numa ou em ambas as determinações do teste repetido, a amostra acusar valores
situados zona-limite, recomenda-se, para esclarecimento definitivo, uma nova determinação
com uma amostra colhida 2 a 4 semanas depois da primeira.
Limitações do procedimento
1. É interdito utilizar amostras que contenham azida sódica!
2. Anticoagulantes como heparina, EDTA e citrato não influenciam o resultado do teste.
3. Não foram observadas alterações em amostras sujeitas a tratamento térmico (60 min, +56 °C).
4. Soro de sangue insuficientemente coagulado, bem como componentes celulares
sanguíneos podem levar a resultados duvidosos.
5. Amostras hemolíticas ou que contenham factor reumatóide não prejudicam o teste.
6. As amostras com anticorpos contra o CMV e amostras positivas Anti-HBs não influenciam o
resultado do teste.
7. Não foi observada qualquer influência sobre o resultado do teste com amostras de
pacientes com imunocomplexos circulantes e amostras contendo anti IgG de rato
8. As amostras com anticorpos contra o vírus da hepatite A, EBV, HIV, HCV, bem como as
amostras lipémicas ou ictéricas podem apresentar reactividade elevada.
9. As amostras de pacientes hemodialisados, pacientes transplantados, pacientes com
transfusões de sangue múltiplas ou pacientes com valores elevados de transaminases
podem apresentar reactividade elevada.
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46
10. Amostras descongeladas devem estar bem homogeneizadas.
11. Os reagentes (com excepção da solução de lavagem POD, da solução de paragem POD e
da solução de trabalho do cromogénio, preparada esta última a partir dos reagentes
específicos de cada lote Cromogénio TMB e Tampão/substrato TMB) só podem ser utilizados
como constituintes de um mesmo lote, isto é, somente na combinação de 6 cifras (N. ° de lote)
que vem impressa na embalagem e indicada na Tabela de código de barras adjunta.
12. O tampão/substrato TMB, a solução de trabalho do cromogénio e a solução de paragem POD
não devem entrar em contacto com iões de metais pesados nem com substâncias oxidantes
(não usar pipetas com partes metálicas portadoras de líquido). Não efectuar a reacção do
substrato na proximidade de desinfectantes que contenham hipoclorito. Uma coloração azul
espontânea da solução de trabalho do cromógeno antes de esta ser colocada na placa de
ensaio é indício de contaminação; deverá então preparar-se uma solução fresca num
recipiente limpo. Evite-se o contacto cutâneo com as soluções acima mencionadas.
13. Durante a incubação deve manter-se a placa de ensaio imóvel (p. ex. sobre um suporte fixo
ou num banho-maria sem circulação de água); deste modo as cavidades mantêm-se em
contacto com a água temperada. Caso se utilizem estabilizadores para evitar uma
contaminação da água, tomar todo o cuidado para que nem a superfície da placa de ensaio
nem os receptáculos entrem em contacto com estas soluções, pois tais contaminações
podem produzir reacções inespecíficas.
14. Em amostras altamente reactivas o corante pode precipitar ao adicionar-se a solução de
paragem. O facto é irrelevante para os resultados fotométricos.
15. Os soros de controlo são preparados utilizando soros humanos congénitos. Por essa razão,
podem ocorrer turvações que, todavia, não influenciam o resultado do teste.
16. A Dade Behring validou a utilização destes reagentes em vários analisadores, com o intuito
de optimizar o desempenho do produto e satisfazer as especificações do produto. As
modificações definidas pelo utilizador não são suportadas pela Dade Behring, na medida
em que podem afectar o desempenho do sistema e os resultados do ensaio. Constitui
responsabilidade do utilizador validar as modificações efectuadas nestas instruções ou em
relação ao uso dos reagentes noutros analisadores que não os incluídos nas folhas de
instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização.
17. Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico
médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse.
Características do teste
Sensibilidade e especificidade
Os resultados das provas de sensibilidade e especificidade encontram-se resumidos nas
tabelas 2 e 3 (em apêndice).
Para averiguar a sensibilidade foi investigado um total de 1266 amostras anti-HBc positivas,
tendo sido verificada uma sensibilidade de 96.9% a 100% (ensaio inicial) e 97.5% após
repetição das amostras inicialmente borderline. Não é de excluir que, numa aplicação do teste a
mais alta escala, algumas amostras escapem a um reconhecimento.
Para determinação da especificidade foi testado um total de 6116 amostras de sangue de
dádiva anti-HBc negativas e achada uma especificidade de 99,2% (ensaio inicial) ou de 99,6%
(repetição do ensaio). Valores divergentes destes são também possíveis, dependendo isso,
entre outros factores, do colectivo testado ou da modalidade de execução do teste.
No estado actual de conhecimentos, não se pode inferir com certeza de um resultado positivo
do teste anti-HBc a presença de uma infecção pelo HBV, nem tão-pouco um resultado negativo
permite excluir com certeza a sua presença.
Reprodutibilidade
Os resultados para a reprodutibilidade em intra/inter-ensaio estão resumidos na Tabela 4 (em apêndice).
Para a reprodutibilidade intra-ensaio foram obtidos coeficientes de variação de 3,9 a 13,6%.
Para a reprodutibilidade inter-ensaio foram obtidos coeficientes de variação de 5,6 a 15,3%.
Estes dados devem ser compreendidos somente a título de exemplo. Segundo a modalidade de
execução do teste, etc., eles podem variar.
* Enzygnost e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros países.
BEP e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, na Alemanha e noutros países.
Boviserina é uma marca registada da Aventis Behring
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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47
0197
Estabilidade e condições de conservação
Material/Reagente
Estado
Conservação
Estabilidade•
Enzygnost* Anti-HBc
monoclonal
(placa de ensaio)
aberto
+2 a +8 °C em
no saco com cápsulas desidratantes
4 semanas
Conjugado Anti-HBc/POD
monoclonal
aberto
+2 a +8 °C
≤ -20 °C
4 semanas
3 meses
Tampão para conjugado
aberto
+2 a +8 °C
4 semanas
Conjugado diluído
pronto para uso
1 + 25
+2 a +8 °C
+18 a +25 °C
4 semanas
1 semana
Soro de controlo Anti-HBc,
positivo
Soro de controlo Anti-HBc,
negativo
aberto
+2 a +8 °C
4 semanas
aberto
≤ -20 °C
3 meses
Cromógeno TMB
aberto
+2 a +8 °C
até termo da validade
Tampão/Substrato TMB
aberto
+2 a +8 °C
Solução de uso do
cromógeno
1+10
+2 a +8 °C
+18 a +25 °C
recipiente fechado,
ao abrigo da luz
5 dias
8 horas
Solução de lavagem POD
(concentrado)
não diluída
aberto
1:20
1:20
+2 a +8 °C
+2 a +8 °C
+18 a +25 °C
1 semana
1 dia
aberto
+2 a +8 °C
Solução de bloqueio POD
• Nunca depois de expirado o prazo de validade!
Tab. 2 Sensibilidade
Resultados do exame da sensibilidade fornecidos por 2 centros independentes (T, Tr):
Colectivos
de amostras
Número
de amostras
Inicialmente
positivo
Positivo na
repetição
(T) Infecção aguda por HBV
Infecção crónica por HBV
Infecção anterior por HBV
Amostras de controlo da
evolução
50
100
196
115
50
99
190
115
50
99
191
115
(Tr) Infecção aguda por HBV
Infecção crónica por HBV
Infecção anterior por HBV
Amostras de controlo da
evolução
80
521
73
79
516
73
79
516
73
131
131
131
OUWE G13 C0541 (879) CS/R
48
Tab. 3 Especificidade
Resultados do exame da especificidade fornecidos por 4 centros independentes (T, J, R, W):
Colectivos
de amostras
Número
de amostras
Inicialmente
reactivo
Reactivo na
repetição
(T) Soros negativos normais
480
2
1
(J) Soros negativos normais
Plasmas negativos normais
1943
494
17
4
12
2
(R) Soros negativos normais
731
0
0
(W) Soros/Plasmas
negativos normais
2468
28
9
Tab. 4 Reprodutibilidade
Resultados do exame da reprodutibilidade intra-assay fornecidos por 2 centros independentes
(T, Tr):
Repetição
Ratio
CV %
(T) 1
2
3
Amostra
20
20
20
1.531
1.012
0.689
8.7
13.6
8.0
(Tr) 1
2
3
15
15
15
1.559
1.079
0.951
5.0
3.9
5.4
Resultados do exame da reprodutibilidade inter-assay fornecidos por 3 centros independentes
(T, J, Tr):
Amostra
Repetição
Ratio
CV %
(T) 1
2
3
10
10
10
1.689
1.090
0.844
8.5
10.7
11.2
(J) 1
2
3
10
10
10
1.878
1.329
1.109
4.7
11.5
15.3
(Tr) 1
2
3
7
7
7
1.373
0.940
0.705
5.6
12.0
10.8
Ratio = Extinção/valor-limite (cut-off
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49
Tab. 5 Realização e programação do ensaio
Realização
Programação do
Menu para o
BEP® II
Preparação dos reagentes
BEP® 2000
4 x 25 µl de soro de controlo negativo
2 x 25 µl de soro de controlo positivo
25 µl de cada amostra não diluída
BEP® II
BEP® III
100 µl de
conjugado
placas incompletas:
completar até meia placa com
fileiras de poços com água
60 min ± 5 min.
(37 ± 1 °C)
BEP® II: lavar 4 x
100 µl solução de trabalho
do cromógeno
Processamento
automático
30 min ± 2 min.
+18 °C a +25 °C
ao abrigo da luz
MENU NO
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DOSAGEM DO CONJUGADO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVAGEM E DOSAGEM DO
CROMÓGENO
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DOSAGEM DA SOLUÇÃO DE
BLOQUEIO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl de solução
de paragem
após máx. 1 h
Leitura a 450 nm
(comprimento de onda
de referência: 650 nm)
Resultado do teste
OUWE G13 C0541 (879) CS/R
50
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
4
NO
4
0.700
0.4
0.100
-
Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia:
1. Frösner GG. Die Aussagekraft serologischer Untersuchungsmethoden bei Virushepatitiden. Med Klin
1982; 77: 18-27.
2. McCollum RW, Zuckerman AJ. Viral hepatitis: Report on a WHO informal consultation. J Med Virol 1981; 8:
1-29.
3. Grady GF. Hepatitis B immunity in hospital staff targeted for vaccination. Role of screening tests in immunisation programs. JAMA 1982; 248: 2266-9.
4. Deinhardt F, Weise HJ. Aktive Immunoprophylaxe der Hepatitis B: Kolloquium über den heutigen Stand
und die zukünftige Entwicklung der Hepatitis B-Impfung in der Bundesrepublik Deutschland. Bundesgesundheitsbl 1982; 25: 272-3.
5. Niermeijer P, Gips CH, Huizenga JR, et al. IgM Anti-HBc as a marker of persistent and IgG anti-HBc as a
marker of past hepatitis B infection. A longitudinal study over 5 years. Acta Hepatogastroenterol 1978; 25:
360-4.
6. U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16.
Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles /
Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por
IVD
LOT
EXP
CCYY-MM-DD
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical
Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario
para Diagnóstico In Vitro
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de
Lote
Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de
vencimiento / termo da validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura
di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE
REF
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de
Catálogo
Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice
d'Utilisation / Istruzioni per l'uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as
Instruções de Utilização
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51

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