Crescita microbica

Crescita microbica
Supponiamo di considerare una cellula microbica in fase di suddivisione (per via
asessuata). Ciascuna cellula figlia, a sua volta, si dividerà ulteriormente e così via per
cui dopo n divisioni nel nostro terreno di coltura saranno presenti
N = 2n
cellule. Supporremo per semplicità che ciascuna cellula impieghi lo stesso tempo per
dividersi e generare due cellule figlie e che queste ultime si dividano ulteriormente
con la stessa rapidità delle cellule madri. Se t è il tempo impiegato dalle nostre cellule
per effettuare n divisioni potremo scrivere:
n
⋅t
N = 2t
Indicando con il simbolo µ’ il rapporto n/t (ossia il numero di divisioni nell’unità di
tempo) e denominando tale rapporto con il nome di tasso di crescita specifico, avremo:
N = 2µ'⋅t
Volendo utilizzare come base della funzione potenza non il numero 2 bensì il numero e
= 2.718…:
N = 2µ'⋅t = e µ⋅t
ln2 µ'⋅t = µ ⋅ t
µ'⋅ln2 = µ
L’ultima delle uguaglianze su scritte fornisce la relazione tra il tasso di crescita
riferito ad una potenza di base 2 e quello relativo alla funzione esponenziale.
Il numero totale di cellule al tempo t, supponendo di essere partiti non da 1 ma da N0
cellule, sarà pertanto:
N = N0 ⋅ e µ⋅t
Dividendo entrambi i membri per il volume V del sistema otterremo:
x = x0 ⋅ e µ⋅t
(1)
Dove x è la concentrazione delle cellule, detta anche concentrazione della biomassa.
La relazione (1) diagrammata su un piano cartesiano semilogartmico ln(x) vs t dà
origine ad una retta di pendenza µ. Questa relazione viene chiamata di crescita
esponenziale o illimitata1. E’ chiaro che nella realtà le cose non funzionano così sia
perchè dopo un certo tempo, all’aumentare della concentrazione della biomassa, la
quantità di nutrilita nel terreno di coltura inizia a diminuire, sia perché i prodotti del
metabolismo cellulare (la cui concentrazione va aumentando nel tempo) hanno effetto
inibente sulla velocità di generazione di nuove cellule.
1
Dalla (1) si ottiene, derivando rispetto al tempo:
dx
1 dx d(lnx )
= x 0 ⋅ e µ⋅t ⋅ µ = µ ⋅ x ⇒ µ = ⋅
=
dt
x dt
dt
Il tasso di crescita specifico, quindi, è la pendenza della tangente alla curva che rappresenta il
logaritmo dell’andamento di x nel tempo. Questa definizione ha validità generale, ossia anche se la
relazione tra lnx e t non è lineare, il tasso di crescita µ è definito sempre in questo modo.
Crescita miscrobica
1
L’andamento reale della crescita microbica in un terreno di coltura è quello
rappresentato da una curva a sigmoide.
L’equazione di una curva di questo tipo è definita da almeno 3 parametri che
potrebbero essere scelti quali:
• Il valore λ dell’intercetta della tangente nel punto di flesso (che ha la pendenza
massima) con l’asse delle ascisse (tempo di latenza)
• La pendenza della tangente nel punto di flesso µmax
• Il valore xmax (o Nmax) asintotico cui tende la popolazione cellulare al tendere di
t→∞
Il diagramma evidenzia la presenza di 3 zone distinte.
C’è una prima zona, corrispondente alla fase cosiddetta di latenza (detta anche fase
lag), in cui le cellule non si riproducono, o si riproducono molto lentamente. In questo
periodo, che corrisponde ai minuti iniziali successivi all’inoculo, le cellule si stanno
ambientando e stanno adeguando il loro metabolismo alle nuove condizioni in cui si sono
venute a trovare.
La seconda zona è quella relativa alla fase di crescita esponenziale (o illimitata) vista
in precedenza. La quantità di nutrilita disponibile è talmente grande rispetto alla
concentrazione della biomassa che ogni cellula si riproduce liberamente. Il tasso di
crescita specifico assume valori via via crescenti fino a raggiungere un valore massimo
corrispondente alla pendenza della tangente alla curva nel punto di flesso.
Successivamente, quando la concentrazione di nutrilita inizia a non essere più in forte
eccesso rispetto alla biomassa, anche il tasso di crescita inizia a decrescere sempre di
più fino ad annullarsi (terza zona della curva, corrispondente alla fase cosiddetta
stazionaria).
Crescita miscrobica
2
E’ evidente quindi che la (1) non rappresenta l’equazione di tutta la curva ma solo del
tratto centrale di questa e che la µ lungi dall’essere una costante (caratteristica del
tipo di microrganismo e del terreno in cui questo si sta sviluppando) è a sua volta una
funzione di x (concentrazione della biomassa).
Sono stati proposti diversi modelli di crescita, ognuno caratterizzato da una funzione
µ = µ(x) diversa e più o meno complessa. Uno dei più vecchi (1950), a tutt’oggi molto
utilizzato sia per la sua eleganza e semplicità che per la capacità di adattarsi bene ai
dati sperimentali, è quello di Monod:
µ ⋅S
µ = max
KS + S
In tale espressione S è la concentrazione del substrato in un certo istante, µmax è il
tasso di crescita specifico massimo, che si ha per S→∞, KS è la cosiddetta costante di
mezza saturazione, corrispondente al valore di S per cui µ = µmax/2.
L’espressione di Monod (che è di origine sperimentale) non fornisce direttamente µ in
funzione di x. Il legame esiste ma è ottenibile indirettamente introducendo una nuova
variabile, la resa Y definita come l’incremento di biomassa per unità di massa di
substrato consumato (x ed S sono entrambe concentrazioni):
(x − x0 ) ⋅ V = x − x0
Y=
(S0 − S) ⋅ V S0 − S
Y ⋅ S0 + x0 − x xmax − x
=
Y
Y
Dove x0 ed S0 sono le concentrazioni della biomassa e del substrato all’istante iniziale
t=0 e xmax = Y·S0 + x0. L’espressione di Monod diventa pertanto:
µ ⋅ S µmax ⋅ (xmax − x )
(2)
µ = max
=
KS + S KS ⋅ Y + xmax − x
S=
Ricordando che:
1 dx
µ= ⋅
x dt
Avremo, separando le variabili ed integrando:
t
∫µ
max
0
⋅ dt =
x
KS ⋅ Y + xmax − x
⋅ dx
x ⋅ (xmax − x )
x0
∫
(3)
L’integrale a secondo membro può essere risolto col metodo dei coefficienti
indeterminati:
x
x
KS ⋅ Y + xmax − x 
A

B
dx
⋅
=


 +
 ⋅ dx
(
)
(
)
x
x
x
⋅
−
x
x
−
x
max
max




x0
x0
Portando a denominatore comune le frazioni dell’integrando del secondo membro:
x
x
x
A

(B - A) ⋅ x + A ⋅ xmax ⋅ dx (4)
A ⋅ (xmax − x ) + B ⋅ x
B
+
⋅
dx
=
⋅
dx
=


x (xmax − x )
x ⋅ (xmax − x )
x ⋅ (xmax − x )
x0 
x0
x0
Imponendo che le funzioni integrande in (3) e (4) abbiano gli stessi coefficienti delle
potenze uguali di x e gli stessi termini noti, avremo:
∫
∫
∫
∫
∫
Crescita miscrobica
3
(B − A) = −1
A ⋅ xmax = KS ⋅ Y + xmax
Da cui:
A =1+
KS ⋅ Y
xmax
B = A −1 =
KS ⋅ Y
xmax
Sostituendo nell’integale ed effettuando il calcolo otterremo:
 x − xmax   Ks ⋅ Y 
 x   K ⋅Y 
⋅

µmax ⋅ t = ln  ⋅  1 + s  − ln
 x 
x
x
−
x
x
max 
max   max 
 0 
 0
Che è l’equazione della sigmoide cercata. Effettuando delle semplici manipolazioni
algebriche ed introducendo i parametri P = KS·Y/xmax e Q = xmax/x0, avremo:
 (x − xmax )/x0 
 x
µmax ⋅ t = ln  ⋅ (1 + P ) − ln 
 ⋅P
 x0 
 (x0 − xmax )/x0 
(5)
 x

x
µmax ⋅ t = ln  ⋅ (1 + P ) − ln Q −  ⋅ P + ln (Q − 1) ⋅ P
x0 
 x0 

Si noti ancora come tale espressione dipenda da 3 parametri caratteristici del
microrganismo e che rappresentano la sua carta di identità (KS, µmax ed Y (o xmax)) più
altri due x0 ed S0 che dipendono dalla nostra scelta. [Ad esempio cellule di
Escherichia coli su glucosio presentano, a 30 °C i seguenti valori: KS = 4 mg/l, Y = 0.23,
µmax = 1.35 h-1].
L’equazione di Monod può essere direttamente utilizzata per predire l’andamento nel
tempo della crescita di un microrganismo (o della scomparsa di substrato) in un
reattore batch ma può, forse in maniera più adeguata, essere utilizzata nei processi
continui in cui vi sia un substrato limitante (processi chemostatici). In effetti
osservando la (2) possiamo notare come:
µmax
µ ⋅ (x − x )
µmax
=
=
µ = max max
(6)
KS ⋅ Y
KS ⋅ Y
KS ⋅ Y + xmax − x
+1
+1
(xmax − x )
(S0 ⋅ Y + x0 − x )
Che per t=0 ed x=x0 diviene:
µ
µt =0 = max
KS
+1
S0
Questo ci fa comprendere come il valore di µ nelle fasi iniziali di crescita non potrà
mai essere 0 (al limite, se il rapporto tra KS e S0 fosse molto elevato (bassissima
affinità tra microrganismo e substrato e bassissima concentrazione iniziale di
quest’ultimo), µ potrebbe essere molto bassa) ossia l’espressione di Monod (2) non è
adatta per descrivere un processo reale di crescita batch all’inizio, durante la fase
Crescita miscrobica
4
lag2. La (2) può invece essere utilizzata per descrivere in maniera corretta
l’andamento nel tempo della concentrazione x della biomassa o del substrato S quando
sia stata superata la zona di crescita esponenziale illimitata, ossia quando µ ≤ µmax e ci
si trovi nel ramo superiore della sigmoide3.
Curve crescita E.coli
Y=0.23 µ max=1.35 h-1 KS=4 mg/l
2,5
2
ln(x)
1,5
1
x0=1 , S0=10
0,5
x0=1 ; S0=20
x0=1 , S0=30
0
0
0,5
1
1,5
2
Tempo (h)
2
Anche se il diagramma di x in funzione di t ottenuto da (5) ha l’aspetto di una curva sigmoidale, il
diagramma di lnx in funzione di t non darà mai origine ad una sigmoide completa ma ne fornirà solo il
ramo superiore.
3
Ricavando la derivata della (6) rispetto alla x otteniamo:
− µmax ⋅ KS ⋅ Y
dµ −µmax ⋅ (KS ⋅ Y + xmax − x ) + µmax ⋅ (xmax − x )
=
=
<0
2
dx
(KS ⋅ Y + xmax − x )2
(KS ⋅ Y + xmax − x )
Ossia la µ sarà sempre decrescente al crescere di x al contrario di ciò che avviene nel ramo inferiore
della sigmoide.
Crescita miscrobica
5
Nel caso di un reattore CSTR, il bilancio di materia totale e su un generico
componente del sistema (biomassa, substrato o prodotto) potrà essere scritto come:
Intot − Outtot = Acctot
Ini − Outi + Geni = Acci
Supponendo che il reattore lavori in condizioni stazionarie (Accumulo = 0):
Intot − Outtot = 0 ⇒ Fin = Fout = F
Ini − Outi + Geni = 0 ⇒ F ⋅ ci,in − F ⋅ ci,out +
d(ci,out ⋅ V )
=0
dt
Esplicitiamo il bilancio di materia per la biomassa (dove con x0 indicheremo la
concentrazione di biomassa in ingresso):
d(x ⋅ V )
dx
= 0 ⇒ F⋅x = V ⋅
F ⋅ xin − F ⋅ x +
dt
dt
Poiché xin è di norma pari a 0 (alimentazione sterile) e poiché V= cost. (Acctot = 0),
avremo quindi:
dx
F
F⋅x = V ⋅
⇒ ⋅x = µ⋅x ⇒ D = µ
dt
V
Dove con il simbolo D si è indicato il cosiddetto rapporto di diluizione (che è l’inverso
del tempo di permanenza).
Alla stessa relazione saremmo pervenuti effettuando il bilancio sul substrato:
d(S ⋅ V )
dS
= 0 ⇒ F ⋅ Sin - F ⋅ S = -V ⋅
F ⋅ Sin − F ⋅ S +
dt
dt
Se definiamo Y la resa istantanea del processo (yield) rispetto al substrato come il
rapporto delle due velocità istantanee di generazione:
d(x ⋅ V )
velocitàgenerazione,biomassa
dS
1 dx
(*)
Y=−
= dt ⇒
=−
velocitàgenerazione,substrato d(S ⋅ V )
dt
Y dt
dt
Il bilancio di materia sul substrato diventa:
1 dx
D ⋅ Sin - D ⋅ S =
⇒ D ⋅ Y ⋅ (Sin − S) = µ ⋅ x
Y dt
La resa istantanea del processo può, con buona approssimazione4, ritenersi costante
col tempo, per cui la (*) integrata fornisce:
4
Se infatti ipotizziamo che per la cellula microbica sia possibile considerare tutte le reazioni
metaboliche come un unico processo del tipo:
Substrato → biomassa + prodotto
(**)
avremo che Yistantaneo deriverà dalla stechiometria della reazione (**) e sarà costante nel tempo ed
uguale ad Yistantaneo = Ymedio = ∆x/∆S. Questa è però una approssimazione in quanto le reazioni
metaboliche sono costituite da una catena di trasformazioni che non è detto avvengano con la stessa
velocità (per cui ci può essere accumulo di qualche prodotto intermedio e quindi Yistantaneo ≠ Ymedio =
∆x/∆S). Inoltre c’è da considerare che non tutto il substrato viene utilizzato per formare nuova
biomassa ma che una parte di questo serve per alimentare la biomassa già esistente per cui la relazione
tra x ed S dovrebbe essere del tipo:
Crescita miscrobica
6
Y ⋅ (Sin − S) = (x - xin )
Per cui il bilancio fornisce nuovamente l’uguaglianza5: D = µ
L’uguaglianza ora ricavata esprime questa situazione: in condizioni di regime, in un
reattore CSTR la velocità di crescita specifica di un microrganismo è uguale alla
velocità di diluizione, ossia maggiore è la quantità di sostanze nutritive immesse,
maggiore sarà la rapidità con cui si accresce il microrganismo.
In altre parole, supponiamo di essere partiti con un reattore batch con una certa x0
ed S0. Dopo un certo tempo t, quando le concentrazioni hanno assunto i valori x’ ed S’
e il tasso di crescita sia diventato µ’ alimentiamo il reattore con una portata costante
F tale che F/V=D=µ’. Il sistema da questo momento in avanti permane indefinitamente
nelle stesse condizioni senza modificare né le concentrazioni né il tasso di crescita.
Potrebbe essere interessante cercare di capire quello che succederebbe, a questo
punto, se modificassimo la portata di alimentazione F (cioè il fattore D).
Supponiamo quindi che in un certo istante t=0 (in cui la situazione all’interno del
reattore sia di regime e la concentrazione di biomassa sia xin) la velocità di diluizione
sia modificata e portata ad un nuovo valore D ≠ µ’. Applicando l’equazione di bilancio
avremo:
INbiomassa − OUTbiomassa + GENbiomassa = ACC
− F ⋅ x + µ'⋅V ⋅ x = V⋅
dx
dt
dx
dt
Separando le variabili ed integrando:
− D ⋅ x + µ'⋅x =
xfin
∫
xin
dx
=
x
t
∫ (µ'−D) ⋅dt
0
x 
ln fin  = (µ'−D) ⋅ t
 xin 
xfin = xin ⋅ e (µ'−D )⋅t
Nel calcolo dell’integrale abbiamo supposto per semplicità che il tasso di crescita µ’
non si modifichi e rimanga costante nel tempo. Se la velocità di diluizione D è
aumentata rispetto al valore iniziale µ’, l’esponente avrà segno meno per cui la
concentrazione di biomassa tenderà gradualmente a zero. Viceversa, se la velocità di
diluizione è diminuita, la concentrazione di biomassa crescerà in misura esponenziale.
 dS dSmantenimento
dx
= − Y ⋅ 
−
dt
dt
 dt



Dove dS è dSalimentazione rappresentano il consumo di substrato totale e quello legato solo al
mantenimento (alimentazione) della biomassa. Tuttavia quest’ultimo consumo può in genere venire
trascurato.
5
Il che era prevedibile dato che il secondo bilancio di materia (quello sul substrato) si aggiunge alle due
equazioni di bilancio già utilizzate, quella del bilancio globale: Fin = Fout = F e quella del bilancio parziale
sulla biomassa.
Crescita miscrobica
7
In realtà le cose sono più complesse perché anche il tasso di crescita si modifica a
causa del cambiamento a carico di x (e di S). Per capire come vadano veramente le
cose occorrerebbe risolvere il sistema di equazioni:
dx
− F ⋅ x + µ ⋅ V ⋅ x = V⋅
dt
dS
µ ⋅V ⋅ x
=V⋅
F ⋅ Sin − F ⋅ S −
dt
Y
µ = µ(x )
Senza volerci addentrare nelle difficoltà del calcolo differenziale, è comunque
possibile fare delle semplici considerazioni.
Supponendo di avere a che fare con un reattore chemostatico, ossia che le condizioni
iniziali in cui si fosse verificata la perturbazione (la variazione di F e di D) fossero tali
che µ’ < µmax (per intenderci il punto del funzionamento a regime, prima della
perturbazione, si trovava sul ramo superiore della curva sigmoide), avremo che il
funzionamento del reattore si modificherà nel senso che se D > µ’ la concentrazione di
biomassa tenderà a diminuire mentre, all’inverso, se D < µ’ la concentrazione x
aumenterà. Tutto questo può essere visualizzato sulla curva di funzionamento di un
reattore batch (grafico ln(x) vs t) su cui sarà possibile determinare un nuovo punto di
funzionamento, e quindi ad una nuova µ. Avremo perciò che nel primo caso la µ sarà
aumentata, e diminuita nell’altro. In ogni modo ben presto la µ sarà diventata di nuovo
uguale alla D per cui il sistema raggiunge una nuova situazione di regime. Il
microrganismo cioè si adatta, come velocità di crescita, ai cambiamenti
nell’alimentazione che noi gli imponiamo, comportandosi come un sistema
autoregolante.
Si potrebbe verificare che, all’inverso, un reattore non chemostatico, ossia in fase di
crescita esponenziale o in fase di latenza, non è un sistema stabile nel senso che può
anche non pervenire ad un'altra situazione di regime che sia diversa da quella x=0.
Occorre tuttavia puntualizzare che la µ del microrganismo non può crescere all’infinito
in quanto è legata alla concentrazione del substrato dalla relazione di Monod (ad
esempio) per cui la massima velocità di crescita sarà data da:
µ ⋅S
µcr = max in
KS + Sin
Dove Sin è la concentrazione del substrato nella corrente di ingresso (che è la massima
concentrazione di substrato ipotizzabile si raggiunga nel reattore pari a nessun
consumo di questo). Questo valore critico non può essere superato e rappresenta il
valore limite di D che noi possiamo imporre al microrganismo pena la perdita
progressiva di biomassa nel reattore (lavaggio o wash-out).
Crescita miscrobica
8
Un reattore chemostatico è, per quanto ora detto, un sistema che non può funzionare
stabilmente in alcune condizioni (in particolare nella zona di crescita esponenziale
µ=µmax e di crescita stazionaria µ=0). Per questo motivo spesso viene adoperato un
altro tipo di reattore continuo chiamato turbidostato. In questo apparecchio ciò che
viene tenuto sotto controllo è la concentrazione della biomassa che determina la
turbidità del liquido misurata tramite una fotocellula. Supponendo di aver fissato il
set-point nella zona di crescita esponenziale, quando la concentrazione cellulare
supera il valore prefissato viene aumentata la portata di alimentazione che (se D>µmax)
determinerà una diluizione dell’ambiente ed un abbassamento della turbidità dello
stesso. Viceversa, se la concentrazione cellulare diminuisse la portata di alimentazione
viene diminuita con conseguente aumento della concentrazione x.
Un turbidostato è quindi un reattore continuo che non sta mai a regime (questo dal
punto di vista delle concentrazioni x di biomassa e S di substrato poiché le portate di
ingresso ed uscita, e quindi il volume del sistema, sono sempre uguali grazie al sistema
di uscita tramite stramazzo). Esso in teoria potrebbe essere usato in qualunque zona
del diagramma a sigmoide anche se la zona di utilizzo più interessante è senza dubbio
quella di crescita esponenziale.
Crescita miscrobica
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