APPLICAZIONE DEL PRINCIPIO DELLE 3R NELLA

ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE
DELLA LOMBARDIA E DELL'EMILIA ROMAGNA
“BRUNO UBERTINI”
(ENTE SANITARIO DI DIRITTO PUBBLICO)
------------------------------------Sede Legale: Via Bianchi, 9 – 25124 Brescia
Tel 03022901 – Fax 0302425251 – Email [email protected]
C.F. - P.IVA 00284840170
N. REA CCIAA di Brescia 88834 APPLICAZIONE DEL PRINCIPIO DELLE 3R NELLA PRODUZIONE E NEL
CONTROLLO DEI VACCINI UTILIZZATI IN MEDICINA UMANA E VETERINARIA
Premessa
Il ricorso a presidi immunizzanti innocui ed efficaci è il principio secondo il quale è possibile
realizzare strategie di prevenzione e controllo di malattie infettive sostenute da agenti eziologici
diversificati.
Le norme legislative richiedono che tutte le fasi che caratterizzano la preparazione di un presidio
immunizzante dalla sua registrazione, alla produzione (sistema GMP), immissione in commercio
(controllo di ogni singolo lotto), e commercializzazione (farmacovigilanza) siano contraddistinte da
una serie di controlli qualitativi specifici. Gali stessi sono finalizzati ad accertare l’innocuità, la
purezza e l’efficacia del prodotto allestito.
I requisiti cui i vaccini debbono rispondere sono indicasti in specifici Decreti legislativi e numerose
sono le Autorità Regolatorie nazionali ed europee coinvolte con competenze ben definite e, nel loro
insieme, volte ad assicurare l’idoneità dei prodotti vaccinali e la loro corretta applicazione.
Al fine di minimizzare i rischi connessi con l’immissione in commercio di prodotti con
caratteristiche qualitative non propriamente adeguate le industrie farmaceutiche adottano sistemi di
produzione standardizzati che consentono di ridurre la variabilità fra i differenti lotti con l’obiettivo
di mantenere le caratteristiche di efficacia e sicurezza del prodotto allestito. Attualmente, alcune
tipologie di indagini, soprattutto quelle relative alla determinazione della potenza/efficacia, vengono
eseguite facendo ricorso ad indagini su animali.
Tuttavia, la Direttiva Europea 86/609/EEC come pure quella più recente 63/2010/UE sanciscono la
protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali e scientifici ed invitano a limitarne l’impiego.
A tal fine i test in vivo sono stati sottoposti ad accurata valutazione con l’obiettivo di poter
1 applicare, il principio delle 3R riducendo i test sugli animali mediante l’attuazione di procedure
alternative.
In ambito europeo la Farmacopea Europea rappresenta il riferimento tecnico/scientifico per il
controllo qualitativo di prodotti di differente natura fra i quali si riconoscono i prodotti biologici
comprendenti i vaccini. Sono inoltre presenti monografie specifiche relative ai singoli vaccini ed ai
requisiti cui debbono rispondere per la loro ufficializzazione. Per la determinazione dell’efficacia di
un vaccino esse prevedono indagini in ospiti recettivi ed è stato stimato che almeno il 15% degli
animali impiegati nel settore biomedico è utilizzato per il controllo dei vaccini la maggior parte dei
quali è utilizzata per il controllo dei singoli lotti.
Nonostante sia evidente dalle tabelle del Ministero che il numero degli animali utilizzati per le
suddette finalità è in graduale diminuzione tuttavia, ne consegue che i metodi in vitro debbono
essere necessariamente implementati e debbono essere principalmente indirizzati al rilascio dei
singoli lotti di vaccino. A questo riguardo i test di rilascio richiesti sono volti ad accertare
rispettivamente :
1) la potenza/ efficacia
2) l’ innocuità /sicurezza
Al fine di poter limitare la sperimentazione in vivo è necessario che le ricerche siano finalizzate
all’adeguamento al principio delle 3R nei differenti aspetti che le contraddistinguono: riduzione
(reduction), miglioramento delle condizioni sperimentali (refinement) e sostituzione (replacement)
dei test in vivo.
Test relativi all’accertamento della potenza / efficacia dei vaccini destinati alla specie umana
Tradizionalmente i test di potenza / efficacia si basano su immunizzazione e challenge di animali da
laboratorio per i quali si ritiene importante l’applicazione dei criteri “dell’earlier human endpoints”
volti a ridurre la sofferenza e condizioni stressanti degli animali sottoposti a tali infezioni.
I vaccini umani attualmente commercializzati sono raggruppati nelle seguenti categorie:
• vaccini con virus attivo;
• vaccini vivi attenuati (virus e batteri);
• vaccini inattivati (virus e batteri);
• tossoidi (tossine chimicamente inattivate);
• polisaccaridi.
I test di potenza si basano sulla titolazione /quantificazione dell’agente eziologico eseguite sia in
vivo (immunizzazione di animali da laboratorio e challenge, con valutazione della risposta
2 anticorpale, soprattutto utilizzata per i virus attenuati) che in vitro (reazione ELISA o altri
metodi).La scelta del tipo di test è direttamente correlata all’agente eziologico coinvolto.
Al fine di poter gradualmente implementare i metodi alternativi è necessario accertarne la validità.
Inoltre, debbono essere delineate delle priorità con il fine di ridurre il dispendio di energie e risorse.
In particolare l’interesse prioritario dovrebbe essere volto ai:
• metodi in vitro già messi a punto e che necessitano di essere sottoposti a processi di
validazione;
• sviluppo di metodi alternativi da utilizzarsi per quelle tipologie di indagini che necessitano
di un numero elevato di animali e del challenge con agenti virulenti responsabili di
sofferenza e dolore degli animali trattati;
• vaccini per i quali i test in vivo danno esiti molto variabili e a quelle tipologie di vaccini per i
quali i test di quantificazione dell’antigene e potenza sono ben definiti
• vaccini combinati e per quelli che hanno un meccanismo di azione ed un bersaglio ben
definito (di maggiore complessità);
• vaccini con un processo produttivo perfettamente definito e altamente standardizzato.
Sulla base dei criteri di priorità indicati l’attenzione è stata volta principalmente ai seguenti prodotti
vaccinali:
• vaccino per il controllo della difterite e del tetano;
• vaccino per il controllo della pertosse (costituito sia da cellule integre che privo di cellule);
• vaccino nei confronti della rabbia;
• diverse tipologie di vaccini nei confronti dell’antrace;
• vaccini associati;
• vaccino inattivato nei confronti della poliomielite
La scelta è stata motivata dall’elevato numero di animali richiesto per l’esecuzione dei controlli
qualitativi, dal rischio per gli operatori coinvolti nell’impiego di agenti attivi e virulenti e dalla
elevata variabilità dei test condotti in vivo come nel caso del controllo del vaccino della rabbia.
A questo riguardo la Farmacopea Europea ha emanato una proposta relativa alla determinazione
della risposta anticorpale per il rilascio dei lotti di vaccino utilizzato in ambito veterinario, quale
metodo alternativo al test in vivo.
I test in vitro inerenti la determinazione della potenza di un vaccino e principalmente basati su
reazioni sierologiche ,presentano il limite di non fornire alcuna informazione sull’attività biologica
del prodotto vaccinale. E’ inoltre da sottolineare come nel caso in cui il vaccino sia associato ad un
3 adiuvante, sia necessaria la sua eliminazione per l’esecuzione del test. Rimane comunque un
ulteriore aspetto da definire e consistente nella dimostrazione che la separazione dell’antigene
vaccinale dall’adiuvante non è responsabile di alcuna alterazione della integrità strutturale
dell’antigene e non vengono pertanto alterati i risultati delle indagini eseguite con metodi in vitro.
Ricerca scientifica volta ad implementare i metodi alternativi
Il raggiungimento degli obiettivi indicati non può prescindere dal perseguimento di attività di
ricerca volte ad approfondire le conoscenze sui meccanismi patogenetici degli agenti eziologici
coinvolti e a colmare le lacune ancora presenti in alcuni settori. Inoltre, oltre alla patogenesi, anche
la determinazione delle caratteristiche strutturali e la stabilità di un antigene permettono di
identificare “marker” antigenici responsabili e della risposta immunologica nella specie ospite.
La disponibilità di modelli animali con infezioni naturali sovrapponibili a quelle della specie
umana, come ad esempio l’infezione da virus del papilloma in specie di interesse zootecnico quali il
bovino, facilita la determinazione dell’efficacia di un vaccino in condizioni naturali e consente di
poter estrapolare tali informazioni per l’impiego della vaccinazione nella prevenzione di tale
infezione in campo umano.
Un ulteriore aspetto di basilare importanza è la divulgazione dei risultati relativi alle indagini svolte
che permette di evitare di ripetere sperimentazioni già attuate. Aspetto difficile da perseguire in
quanto vede coinvolti Ditte private con interessi commerciali e che svolgono la loro attività in
condizioni di massima segretezza. Tale ostacolo potrebbe essere superato perseguendo le strategie
di seguito indicate:
• rendendo disponibili standard di riferimento (biobanche);
• scambiando e divulgando le risorse disponibili e le procedure allestite approvate e
standardizzate;
• applicando con maggiore attenzione i principi delle 3R.
Un aspetto cruciale riguarda le Autorità Regolatarie dei diversi Paesi che dovrebbero
armonizzare i criteri di accettazione dei metodi alternativi volti ad accertare la potenza e
l’innocuità dei presidi immunizzanti.
Metodi finalizzati alla sostituzione degli animali: scambio delle informazioni ed esperienze per
la determinazione dei test di potenza dei vaccini veterinari e di quelli umani
In ambito veterinario le composizioni antigeniche sono meno caratterizzate rispetto a quelle umane
e, a titolo di esempio, può essere considerato il vaccino anti-influenzale. Viceversa le maggiori
4 esperienze acquisite nel settore veterinario relativamente all’impiego degli adiuvanti hanno
consentito di approfondire le conoscenze relative alle interazioni antigene-adiuvante
In opposizione, le metodologie relative alla quantificazione dell’antigene vaccinale sono
maggiormente definite per i vaccini ad uso umano.
Quanto indicato suggerisce che una maggiore interazione delle industrie farmaceutiche operanti nei
due settori : veterinario ed umano, consentirebbe una notevole riduzione del numero delle
sperimentazioni, e dei costi con notevoli vantaggi non solo reciproci, ma anche per la comunità
scientifica.
Un ulteriore aspetto cardine sarebbe rappresentato dalla emanazione, da parte delle Autorità
Regolatorie di linee guida/indicazioni inerenti le tipologia dei controlli qualitativi da perseguirsi sui
nuovi prodotti secondo metodi alternativi.
Aspetti relativi alla implementazione dei metodi in vitro
Nel settore della vaccinologia i metodi in vitro possono essere utilizzati in indagini pre-cliniche
grazie alla possibile interazione dell’antigene con cellule del sistema immunitario come ad esempio
i linfociti T. Tuttavia, è da sottolineare che la risposta immunologica è molto complessa e, ad oggi,
non è possibile realizzarla nel suo insieme facendo ricorso ai soli sistemi di laboratorio, ma
necessita ancora di un organismo vivente.
Viceversa, migliori risultati sono stati realizzati nella determinazione delle caratteristiche qualitative
di un vaccino ed esiti soddisfacenti sono stati ottenuti nella “reduction” e “refinement” della
sperimentazione in vivo.
La determinazione della potenza/efficacia dei vaccini ad uso umano eseguita secondo metodi
alternativi è basata sull’applicazione delle “human endpoints” finalizzate alla riduzione della
sofferenza, del numero degli animali per ciascuna dose ed alla sostituzione delle procedure di
challenge mediante approcci sierologici.
Il principale ostacolo che impedisce e ritarda il ricorso ai metodi alternativi è il processo di
validazione, laborioso, costoso e prolungato nel tempo. E’ stato calcolato che occorrono circa 17
anni per l’accettazione dalla Farmacopea Europea di un metodo sierologico alternativo ad una prova
sperimentale.
Inoltre, come precedentemente indicato, l’assenza di armonizzazione fra le Autorità Regolatorie dei
diversi Paesi rende ancora più difficoltoso il percorso.
Ulteriori ostacoli si identificano da un lato, nella necessità di effettuare una nuova registrazione di
una variazione metodologica attuata dalla Ditta produttrice con un aggravio di costi e dispendio di
5 tempo e, dall’altro nell’addestramento del personale all’adozione delle nuove tecnologie. Attività
quest’ultima non facilmente perseguibile in quanto basata su professionalità completamente diverse
e quindi non prontamenteattuabile dal personale precedentemente coinvolto nell’applicazione di
metodologie tradizionali e quindi professionalmente non adeguato.
Una soluzione alla problematica relativa al controllo dei singoli lotti di vaccino richiesto dalle
Autorità Regolatorie potrebbe essere rappresentata dalla determinazione delle caratteristiche
qualitative del prodotto allestito da cui si ottengono i differenti lotti. Tale strategia, comunemente
indicata con i termini “consistency in production” si baserebbe sulla determinazione delle
caratteristiche fisico-chimiche e immuno-chimiche dell’antigene. La graduale implementazione del
“consistency approach” permetterà una graduale riduzione degli animali nella valutazione delle
caratteristiche qualitative dei vaccini richieste dalle Autorità Regolatorie.
Attività perseguita del Centro di Referenza dei Metodi Alternativi, Cura e Benessere degli
Animali da Laboratorio
L’attività del Centro di Referenza nel settore della vaccinologia riguarda gli ambiti di seguito
riportati.
• Adattamento del ceppo lapinizzato della peste suina ad una linea cellulare di rene di suino
minipig (Ferrari M., 1991). Con tale linea cellulare è possibile la sostituzione del coniglio
per la produzione del vaccino.
• Identificazione di una linea cellulare di primate non umano per la produzione del vaccino
della poliomielite in alternativa alle colture cellulari primarie ottenute da rene di scimmia
(Progetto finanziato dal Ministero della Salute anno 2012).
• Un ulteriore progetto ricerca corrente assegnato al Reparto e condotto da un collega è volto a
sviluppare metodi in vitro per la determinazione delle caratteristiche qualitative dei lotti di
vaccini di interesse veterinario circovirus e blue tongue) (PRC 2011 001 coordinato dal Dr.
Amadori dell’IZSLER, attualmente in corso).
Osservazioni conclusive
Quanto sintetizzato evidenzia come intensa e diversificata sia l’attività relativa alle indagini volte ad
accertare la potenza e l’innocuità di vaccini utilizzati in ambito veterinario ed umano rispettando il
principio delle 3R.
6 Numerosi e complessi sono gli ostacoli che impediscono il raggiungimento, in tempi brevi, degli
obiettivi proposti. Essi sono da attribuirsi a numerosi fattori fra i quali un ruolo primario è svolto
dalla tipologia dell’antigene (complessità, patogenicità, interazione con l’ospite naturale).
Tuttavia, è pure stato evidenziato come le due Medicine(umana e veterinaria) presentino aspetti
maggiormente sviluppati rispetto ad altri suggerendo una interazione al fine di procedere in modo
più standardizzato e rapido grazie allo scambio delle specifiche esperienze acquisite.
Inoltre l’eventuale interazione delle Ditte farmaceutiche con Istituti di Ricerca potrebbe creare
ulteriori sinergie e consentire una maggiore riduzione delle sperimentazioni utilizzando dati
derivanti da esperienze altrui, competenze consolidate e linee operative comuni.
Nelle tabelle allegate sono riportate i vaccini umani e veterinari per i quali sono stati applicati
metodi in vitro finalizzati al principio delle 3R approvati ed in corso .
Referenze bibliografiche
• Casey W., Schmitt M., McFarland R., et al. Improving animal welfare and reducing animal
use for human potency testing: state of the science and future directions. Procedia in
Vaccinology. 5, 33-46, 2011.
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Symposium, Dubrovnik, Croatia, 23-24 April 2008 pg 11-16.
• Ferrari M. A tissue culture vaccine with lapinized chinese (LC) strain of hog cholera virus
(HCV).Comp Immunol Microbiol Infect Dis . 15, 221-228, 1992
• Hendriksen C. Refinement, reduction, and replacement of animal use for regulatory testing:
current best scientific practices for the evaluation of safety and potency of biologicals
(review). ILAR J. S43-48, 2002.
• Hendriksen C. Three Rs achievements in vaccinology. AATEX, Special Issue. 14, 575-579,
2008.
• Stickings P, Rigsby P, Buchheit KH, Sesardic D. Calibration of European pharmacopoeia
biological reference preparation for diphtheria vaccine (adsorbed) batch 4.Pharmeur Bio
Sci Notes. 1-9, 2009
• Three Rs microsite Canadian council on Animal Care (CCAC) (http://3rs.ccac.ca).
7 Table 1 Past and current production technology of some viral vaccines
Viral vaccines
Past production technology
Current production technology
Poliomyelitis
Primary monkey kidney cells
Continuous cell lines (in Italy still
performed in primary monkey cells)
Rabies
Baby rabbits, mice
Continuous cell lines
Influenza
Embryonated chicken eggs
Continuous cell lines
Small pox
Calf skin
Continuous cell lines
Foot and mouth disease
Bovine tongue infection
Continuous cell lines
Hog cholera virus
Rabbit infection
Continuous cell lines (in Italy, still
performed on rabbits)
Avian vaccines
Embryonated chicken eggs
Continuous cell lines (still performed on
chicken embryos)
Encefalite giapponese
Primary hamster kidney cells
Primary hamster kidney cells
Table 2. Examples of human vaccine potency tests that reduce or refine the use of animals
Vaccine Product
References For
Alternative Methods
3Rs Alternative
Traditional Test
Procedure for which
the Alternative
Method is Applicable
References for
Traditional Methods
Bacterins and Toxoids Tetanus toxoid vaccine
and tetanus component
in combined vaccines
(Clostridium tetani) Single-dilution
immunization and
serologyb, c –in vitro
toxin-binding inhibition
(ToBIb, c), indirect
ELISAb, c, Humane
Endpoint - toxininjected hind leg
paresis b, c
Ph. Eur. 2.7.8. Assay of
tetanus vaccine
(adsorbed)
Guinea pig or mouse
lethal challenge test U.S. Minimum
Requirements, 1952
WHO TRS 927, Annex
5, 2003
Diphtheria toxoid
vaccine and diphtheria
component in
combined vaccines
(Corynebacterium Single-dilution
immunization and
Serologyb, c – ELISA
or Vero Cell Assay b, c ;
Humane endpoint erythema score
following intradermal
challenge in guinea
pigs b, c Ph. Eur. 2.7.6 Assay of
diphtheria vaccine
(adsorbed)]; WHO TRS
927, Annex 5, 2003 Guinea pig lethal
challenge test U.S. Minimum
Requirements, 1947 Acellular pertussis
vaccine: whooping
cough (Bordetella
pertussis)
Immunization (mice)
and serologya, b, c
ELISA ] Ph. Eur. Monograph
1356 and 1595;
Japanese Minimum
Requirements for
Biological Products,
Mouse serology test c,d 8 2006; WHO TRS 878,
Annex 2, 1998 Viral Vaccines Rabies vaccine;
(Lyssavirus rabies) Immunization (mice)
and Serology b, c,
Humane Endpoints convulsions, paralysis,
paresisa, b, c Ph. Eur. Monograph
216; WHO TRS 941,
Annex 2, 2007 Mouse multipledilution lethal challenge
test Seligmann 1973 a Accepted by U.S. regulatory authorities.
b Published in the European Pharmacopoeia.
c WHO Technical Report Series number and year of publication
d Current test in Asia.
.
Table 3. Examples of human vaccine potency tests that replace the use of animals
Vaccine Product
Available In Vitro
Alternative Method
References for
Alternative Methods
Traditional Test
Procedure for which
the Alternative
Method is Applicable
Antigen quantification
a,
Ph. Eur. Monograph
1935
and
general;
method 2.7.1; WHO
TRS 858, 1995
Mouse serology c
Antigen quantification
a
,
Ph. Eur. Monograph
1056 and ch 2.7.15;
WHO TRS 889, 1999
Mouse serology c
Antigen quantificationa,
Ph. Eur. Monograph
214 and general
method 2.7.1; WHO
TRS 910, 2002
Rat serology c
Antigen quantification a
WHO (in press)
Mouse serology c
Viral vaccines
Hepatitis A vaccine
(hepatitis A virus)
Hepatitis B vaccine
(hepatitis B virus)
Inactivated polio
vaccine (poliovirus)
Human papillomavirus
vaccine
Polysaccharide and
polysaccharide
conjugate vaccines
NA e
Antigen quantification
a, b, f
a
Published in the European Pharmacopoeia.
b
c
WHO Technical Report Series. No mouse test in European Pharmacopoeia.
d
Not for routine lot release (Ph. Eur.).
e
Traditional method is antigen quantification
f
Accepted by U.S. regulatory authorities
Table 4. Examples of veterinary vaccine potency assays that incorporate in vitro non-animal methods
9 Vaccine Product
(Disease)
3Rs Alternative
References for
Alternative Methods
Procedure for Which
the Alternative
Method
Is Applicable
References for
Traditional Methods
Modified Live Bacterial Vaccines
Brucella abortus a
(cattle brucellosis)
In vitro titration method
determining colonyforming units (tryptose
agar)
Erysipelothrix
Rhusiopathiae a
(swine erysipelas)
In vitro titration method
determining colonyforming units (5%
bovine blood agar)
USDA SAM 612
(2007)
Mannheimia
haemolytica a
(Pasteurella
haemolytica)
(cattle respiratory
disease)
Chlamydophila felisa
(feline respiratory
disease)
In vitro titration method
determining colonyforming units
(trypticase soy agar)
USDA SAM 905
(2009); 9 CFR 113.68
Cell culture– in vitro
titration method
utilizing indirect
fluorescent antibody
staining (mouse
fibroblasts; MEM)
USDA SAM 319
(2007); (2007); 9 CFR
113.71
Cell culture– in vitro
titration method
utilizing plaqueforming units (Crandall
feline kidney cells;
MEM)
Cell culture-–in vitro
titration method
utilizing plaqueforming ) units
(Crandall feline kidney
cells; MEM)
Cell culture– in vitro
titration method
(primary chick embryo
fibroblasts; M199)
Cell culture– in vitro
titration method
utilizing cytopathic
effect (swine testicular
cells; MEM)
USDA SAM 306
(2008); 9 CFR 113.314
Cell culture-–in vitro
method utilizing
cytopathic effect or
indirect fluorescent
antibody technique
(Rhesus monkey)
kidney cells; MEM)
Cell culture– in vitro
method utilizing
cytopathic effect
(primary dog kidney
cells; MEM)
USDA SAM 121
(2005)
Modified Live Viral
Vaccines
Feline calicivirusa
(feline respiratory
disease)
Feline Rhinotracheitis
virusa
(feline respiratory
disease
Mareks disease virusa
(poultry neoplastic
disease)
Porcine transmissible
gastroenteritis caused
by cytopathic
coronavirus TGEVa
(swine infectious
diarrhea
Porcine rotavirusa
(swine infectious
diarrhea)
Infectious canine
hepatitis caused by
canine adenovirus Type
1a (canine hepatitis)
USDA SAM 600
(2009)d
9 CFR 113.65
Vaccination
challenge test in swine
Vaccination challenge
test in cattle
USDA SAM 307
(2008);
9 CFR 113.315
USDA SAM 406
(2005); 9 CFR 113.330
USDA SAM 114
(2005)
USDA SAM 304
(2007); 9 CFR 113.305
10 9 CFR 113.67
Vaccination challenge
test in chickens
Ph. Eur. Monograph
589
Canine distemper virusa
(canine viral disease)
Infectious bursal
disease virus (IBDV) a
(poultry immunosuppressive disease)
Feline panleukopenia
caused by feline
parvovirusa (feline viral
disease)
Canine parvovirusa
(canine viral disease)
Mink distemper virusa
(mink viral disease
Cell culture– in vitro
method utilizing
cytopathic effect (Vero
cells; MEM)
Cell culture– in vitro
titration method of
tissue culture adapted
IBDV (primary chick
embryo FB; M199/F10)
Cell culture– in vitro
titration method
utilizing indirecxt
fluorescent antibody
staining (Crandall
feline kidney cells;
MEM)
Embryonated chicken
eggs – titration of viral
plaques on
chorioallantopic
membrane (CAM)
Inactivated Bacterial Vaccines or Bacterins
Erysipelotrix
Antigen quantification
rhusiopathiaea
– in vitro ELISA
(inactivated) (swine
Eysipelas)
Escherichia coli
bacterinsa
(multispecies gastrointestinal)
USDA SAM 323
(2007); 9 CFR 113.306
USDA SAM 408
(2007); 9 CFR 113.331
Immunization
challenge test in
chickens
Ph. Eur. Monograph
587 Thornton 1976
USDA SAM 305
(2007); 9CFR 113.304
USDA SAM 316
(2007); 9CFR 113.307
USDA SAM 303
(2007);
9CFR 113.302
USDA SAM 613
(2009); 9 CFR 113,119
Immunization
challenge test in mink
Immunization
challenge test in mice
USDA SAM 611
(2008);
9 CFR 113,119
Immunization ,
challenge test in
hamsterse
USDA SAM
608 (2008)
USDA SAM 620 (K99
Pilus), 621 (K88 Pilus),
622 (987P Pilus), and
623 (F41 Pilus) (2010)
Leptospira interrogans
Serovar pomona
bacterina
(swine, cattle, sheep,
goats, canine, equine
leptospirosis)
USDA SAM 624
(2009);
9 CFR 113.101
Leptospira interrogans
Serovar canicola
bacterin
(inactivated, Non
adjuvanted) a, b
(swine, canine, cattle,
equine leptospirosis)
USDA SAM 625
(2009);
9 CFR 113.103 [90];
Ph. Eur. Monograph
447
USDA SAM 609
(2008)
Leptospira interrogans
Serovar grippotyphosa
Bacterina
(equine, swine,
canine,
sheep, goats, cattle
leptospirosis)
Leptospira interrogans
Serovar
icterohaemorrhagiae
bacterin a
(swine, canine,
cattle,
equine leptospirosis)
Leptospira interrogans
Serovar hardjo
bacterinb
USDA SAM 626
(2009);
9 CFR 113.104
USDA SAM 617
(2008)
USDA SAM 627
(2009);
9 CFR 113.102
USDA SAM 610
(2008)
9 CFR 113.105; Ph.
Eur. Monograph 1939;
Hendriksen 2008
11 (cattle, sheep, goats,
equine leptospirosis)
Clostridium chauvoei;
bovine (black leg)
In vitro ELISA b
(inactivated)
USDA Memo 800.104,
2003
In vitro Serology tests
instead of challenge in
rabbit/mouse
Inactivated Viral Vaccines
Bovine respiratory
viruses
Antigen quantification
(BRV, BVD, PI3,
– in vitro ELISA
BRSV) a
cattle respiratory
disease)
Feline leukemia virus
(GP70) a (feline
leukemia)
Canine coronavirus a
(canine gastrointestinal
disease)
Antigen quantificationc
Newcastle disease
– in vitro ELISA or
virusb
(chicken respiratory
serology
disease
Claassen et al. 2004
Immunization
followed by live
spore challenge in
guinea pigs
Clostridial novyi (type
B/ perfringens/septicum
USDA SAM 220; Ph.
Eur. Monograph
361
Eur. Pharmacopia
(accepted)
USDA SAM 120
(1991);
9 CFR 113.216 (BRV);
9 CFR 113.115 (BVD)
USDA SAM 321
(2007);
9 CFR 113.8
USDA SAM 322
(2007)
Ph. Eur. Monograph
870
Hendriksen 2007:
Claassen et al. 2004
Immunization
challenge
Shibley et al 1991
Immunization
challenge test in
puppies
Immunization
challenge chickens;
serology
a
Accepted by U.S. regulatory authorities.
b
Published in the European Pharmacopoeia.
c
d
Applicable after in-house (product-specific) validation. Date is year of last SAM revision.
e
The European Pharmacopoeia states endpoint is “signs” of disease and not lethality.
f
Not for routine batch release in Europe.
Table 5. Vaccine Safety - Human Use (Canadian Council on Animal Care – CCAC, 3Rs Microsite)
Alternative Test Method
Conventional
test method
Name & Description
Validation Status
Regulatory Status
Effect or
Potential
Effect on
Animal Use
Last
Reviewed
Abnormal
Toxicity Test
for Human Use
Vaccines
Deletion of test
Description and
references
No information
EU: Included in PhEur
monograph: Vaccines
for veterinary use.
(2005)
Replacement
May
2012
Oral Polio
Neurovirulence
Test
(Monkey
intracerebral)
Mutant Analysis by PCR
and Restriction Enzyme
Cleavage
(MAPREC test)
Description and
references
WHO: Validated for
type 3 oral polio virus
vaccines
No information
Reduction
May
2012
12 Alternative Test Method
Conventional
test method
Name & Description
Residual
Toxicity in
Diptheria
Vaccine
(Guinea pig)
Validation Status
Regulatory Status
Effect or
Potential
Effect on
Animal Use
Last
Reviewed
TgPVR21 Mouse
Neurovirulence Test
Description and
references
WHO: Validated for
types 1, 2 and 3 oral
polio virus vaccines
(2003)
No information
Replacement
May
2012
Vero Cell Test of
Diphtheria Toxoid
Vaccines
Description and
references
No information
EU: Accepted into
PhEur
Replacement
May
2012
Brescia, 15 Maggio 2013
Il Responsabile del Centro di Referenza per
I Metodi Alternativi, Cura e Benessere degli Animali da Laboratorio
Dr.ssa M. Ferrari
rescia, 15 Maggio CB. All Rights Reserved.1510 - 130 Albert Street, O
5G4 | Tel:13-238-4031 | Fax: 613-238-2837 | Email
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