Presentazione di PowerPoint

IL LABORATORIO NELLE
URGENZE ED EMERGENZE
β2-microglobulina e KIM-1: punto di vista del
Laboratorio
Dr. Rossella Zenobi
Aula Golgi, 2-3 Ottobre 2009, Tor Vergata
Prima che un marcatore possa essere ritenuto
clinicamente utile deve :
Essere affidabile
Dare ulteriori informazioni prognostiche rispetto ai
vecchi marker
Dare informazione sul segmento del nefrone
interessato
Essere utile per il monitoraggio della malattia
Essere validato clinicamente
Più utili marker urinari che sierici, solo i primi
possono essere di origine esclusivamente renale
La β2−Microglobulina ha un peso
molecolare di 11800 dalton e si
trova come costituente naturale in
tutte le cellule nucleate come
componente del sistema HLA.
La sua struttura è formata da 7
foglietti beta intrecciati tipici della
superfamiglia delle
immunoglobuline, in vitro forma
facilmente fibrille amiloidi
denaturandosi a pH acido
A pH naturale è in grado di
allungare le fibrille ma non di
iniziare il deposito.
Si trova costantemente nel sangue a basse
concentrazioni e viene liberamente filtrata dal rene
dove viene riassorbita e degradata dai tubuli renali.
È stata associata da tempo all’amiloidosi secondaria
alla dialisi (DRA) in pazienti nefropatici, inizialmente
si pensava limitata ai tessuti osteoarticolari ma è
stato recentemente scoperto anche negli organi
viscerali.
La β2−microglobulina è il principale costituente del
deposito amiloidoso, supportando così l’idea che non
ci sia attivazione proteolitica per la formazione delle
fibrille amoiloidi.
Studi in vitro mostrano effetti antianabolici sui condrociti
cartilaginei e questo potrebbe essere il meccanismo d’azione
della degradazione della cartilagine nei pazienti dializzati.
È stato evidenziato una correlazione positiva tra la severità
dell’amiloidosi gastrointestinale ed il tempo di dialisi dei pazienti.
La cinetica di formazione delle fibrille sembra seguire un iniziale
processo di polimerizzazione con un lungo tempo di latenza per
la formazione del nucleo ed un rapido accrescimento delle fibrille.
AJ Borysik et al.: Glycosaminoglycans in dialysis-related amyloidosis 2007
Studi in vitro hanno dimostrato che alcuni
glicosaminoglicani (GAGs) come l’eparina, il 4condroitinsolfato ed il 6 condroitinsolfato, normalmente
presenti nelle giunzioni osteo-articolari possono iniziare
il deposito del nucleo fibrillare a pH fisiologico.
d-eparina
e- 4-condroitinsolfato
f- 6-condroitinsolfato
AJ Borysik et al.: Glycosaminoglycans in dialysis-related amyloidosis 2007
Nella foto e deposito
di amiloide nella
parete dei vasi
(birifrangenza verde
sotto luce
polarizzata).
Nella foto f
dimostrazione che i
depositi di amiloide
sono costituiti da
beta 2
microglobulina
(colorazione
immunoistochimica
specifica).
Un aumento di β2- microglobulina nei valori urinari è associato
con la presenza di danno tubulare; quindi la determinazione di
questa nelle urine è un mezzo adatto per la diagnosi e la
valutazione successiva del danno renale tubulointerstiziale.
La metodica di scelta, per il dosaggio della β2−microglobulina a
livello diagnostico, è una metodica nefelometrica, questa
permette il dosaggio sia su campioni di siero o plasma che sulle
urine.
Particelle di polistirene rivestite con anticorpi specifici anti-β2−
microglobulina umana vengono aggregati dalla β2-microglobulina
umana presente nel campione. Questi aggregati diffondono un fascio
di luce che attraversa il campione. L’intensità della luce diffusa è
proporzionale alla concentrazione della relativa proteina presente nel
campione. Il risultato può essere determinato confrontandolo con
uno standard a concentrazione nota.
Nefelometria [dal greco
nephélē “nebbia”, “nuvola”] : metodo
di analisi ottica in cui viene misurata la
dispersione della luce emessa
lateralmente.
La nefelometria viene adottata
soprattutto
nella quantificazione dei componenti
determinati immunologicamente di
siero, plasma, urine e
liquido CSF (mediante reazione
antigene-anticorpo).
Sorgente luminosa: LED a
infrarossi
Lunghezza d'onda: 840 nm
Rilevatore: fotodiodo al
silicio
La variabile di misurazione è la luce
dispersa su aggregati di antigenianticorpi in una soluzione rilevata
fotometricamente. Questo metodo
consente di ottenere misurazioni
particolarmente sensibili.
Dr. G. Bruschetti © 2008 Siemens Healthcare Diagnostics Inc.
L’effetto di dispersione della luce deriva dal fatto che gli immunocomplessi
si comportano da elementi di emissione di luce secondaria in seguito
all'impatto del raggio incidente.
Il grado di dispersione della luce dipende dalla concentrazione delle
particelle in sospensione, dal loro diametro e da altri parametri che
normalmente vengono tenuti fissi per un determinato sistema di reazione.
Misurano, ad un angolo variabile rispetto alla luce incidente, l’incremento
della luce dispersa conseguente alla formazione dei complessi antigeneanticorpo.
I sistemi Behring Nephelometer (BN) effettuano misure nell'infrarosso ad
una lunghezza d'onda di 840 nm e con un angolo di sfasatura rispetto al
raggio incidente compreso tra 13° e 24°
A questa lunghezza d'onda le più comuni sostanze interferenti che possono
essere contenute nel siero assorbono in misura molto limitata.
Dr. G. Bruschetti © 2008 Siemens Healthcare Diagnostics Inc.
Kidney injury molecule 1 (KIM-1) o T cells
immunoglobulin mucin 1 (Tim-1)
È un recettore fosfotidilserinico.
Poco presente nel rene sano ma sovraespresso nelle cellule
epiteliali del tubulo prossimale del rene ischemico.
Il suo dominio extracellulare è tagliato, vicino alla membrana
da una metalloproteasi, ed è rilasciato in forma solubile.
Questo rilascio spiega la sua presenza nelle urine di pazienti
affetti da necrosi tubulare acuta.
Bailly ha ipotizzato che questa forma solubile si leghi alle
integrine, sopprimendo la loro funzione, permettendo così
alle cellule epiteliali di muoversi durante la rigenerazione.
La parte extracellulare è tagliata da una metalloproteasi. La
parte intracellulare ha un sito di fosforilazione della tirosina che
potrebbe essere critico per la regolazione delle funzioni della
KIM-1.
La famiglia genica è conosciuta come TIM perché
queste proteine sono espresse dalle cellule T e
contengono un dominio simile alle Ig ed uno
simile alla mucina.
Il primo prodotto genico TIM ad essere
identificato è stato il KIM-1 nel rene ed il
recettore cellulare per l’epatite A (HAVRC) nel
fegato.
La famiglia consiste di 3 geni nel cromosoma 5q.
La struttura del dominio delle Ig è altamente
conservata, mentre il dominio della mucina è
variabile tra i membri ma sono tutti ricchi in
treonina, serina e prolina.
KIM-1 è elevato nella nefrotossicità da farmaci,
appare nelle urine, dopo insulto ischemico, entro
12 ore e prima che appaiano i cilindri.
È presente nel 100% delle biopsie da pazienti che
mostrano danni tubulari.
La sua espressione potrebbe indicare una
potenziale reversibilità del danno.
I suoi livelli potrebbero essere predittivi di rigetto
del trapianto.
Nel danno tubulare la sovraespressione di KIM-1 è visibile lungo la
superficie luminale del tubulo. (PT-tubulo prossimale, G-glomerulo).
Ichimura ipotizza che KIM-1 è un recettore
funzionale che induce la fagocitosi delle cellule
apoptotiche e che inoltre lega le LDL ossidate
come le scavenger cells.
Le due azioni insieme eliminerebbero le cellule
morte ed i detriti, facilitando la riparazione.
Anticorpi contro KIM-1 possono essere sia
stimolatori che inibitori.
Kim-1–expressing tubule epithelial cells bind and internalize apoptotic
bodies and necrotic debris in rat kidneys following ischemic injury. (A) By
light microscopy, necrotic cellular debris (seen by differential interference
contrast [DIC]) binds to apically located Kim-1 (dark brown) of surviving
tubule epithelial cells (large arrows). An apoptotic body is seen in 1 Kim1–positive epithelial cell (small arrow). (B) By fluorescence microscopy
many DAPI-positive (blue) apoptotic bodies (large arrows) can be seen
binding to the surface of Kim-1–positive (red) epithelial cells, and Kim-1–
expressing cells have processes (red, small arrow) internalizing an
apoptotic body (blue). In addition, apoptotic bodies have been internalized
by Kim-1–positive epithelial cells (blue, arrowhead).
La KIM-1 legherebbe gli aminofosfolipidi espressi dalle
cellule apoptotiche, con un meccanismo simile a
quello usato dai macrofagi, ed innescherebbe
l’internalizzazione dei detriti.
Inoltre sarebbe il primo recettore non legato alla linea
mieloide che è in grado di legare non soltanto le LDL
ossidate ma anche quelle native.
Il dosaggio della KIM-1 urinaria è effettuato con una metodica
ELISA a sandwich basata su:
1. Ancoraggio di anticorpi di capra anti KIM-1 umana sul fondo
di piastre a 96 pozzetti, seguito da un lavaggio
2. Legame della KIM-1 umana presente nel campione da parte
dell’anticorpo ancorato
3. Legame di un anticorpo di capra anti KIM-1 biotilinato
4. Lavaggio del materiale non legato, seguito dall’aggiunta di
perossidasi coniugata con la streptadivina che si lega
all’anticorpo biotinilato
5. Lavaggio dell’enzima libero
6. Rilevazione della quantità di KIM-1 attraverso l’azione della
perossidasi sul substrato (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina)
La rilevazione è fotometrica a 450 nm corretti per
l’assorbimento a 540 nm
L’aumento dell’assorbimento è direttamente proporzionale
alla quantità di KIM-1
La curva standard varia tra i 31.25 ai 2000 pg/mL
I campioni di urina vengono tenuti a 30’ a temperatura
ambiente per una sedimentazione spontanea fino ad un
massimo di 4h.
Il sovranatante viene aliquotato e conservato a -70°C fino al
momento del dosaggio
Studi sul recupero mostrano che urine molto concentrate per
la presenza di KIM-1 possono essere diluite fino ad 8x
Prove di stabilità hanno mostrato che la KIM-1 si mantiene
abbastanza stabile fino a 14 giorni in ambiente refrigerato.
Valori di riferimento normali:
60-837 pg/mL
Linearità
Chaturvedi S, Farmer T, Kapke GF.
Assay validation for K I M -1: hum an
urinary renal dysfunction biom arker.
Int J Biol Sci. 2009;5(2):128-34
Precisione
Vaidya VS, Waikar SS, Ferguson MA, Collings FB, Sunderland K, Gioules C, Bradwin G, Matsouaka R, Betensky
RA, Curhan GC, Bonventre JV. Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Kidney Injury in
Humans. Clin Transl Sci. 2008 Dec;1(3):200-208.
TEST RAPIDO PER KIM-1
Nanoparticelle d’oro colloidale vengono
rivestite con Ab policlonali contro KIM-1
Si aggiunge il campione, se è presente la
KIM-1, il complesso rapidamente migra,
attraverso una membrana di
nitrocellulosa, fino ad una linea dove
incontra un Ab contro un altro epitopo
della KIM-1
La presenza di KIM-1 viene rivelata in
pochi minuti, dopo che le sfere si
depositano sulla linea e vengono
evidenziate da una linea rosso scura
Range linearità= 1-20 ng/ml Limite inferiore di sensibilità= 0.8 ng/ml
Vaidya VS, Ford GM, Waikar SS, Wang Y, Clement MB, Ramirez V, Glaab WE, Troth SP, Sistare FD, Prozialeck
WC, Edwards JR, Bobadilla NA, Mefferd SC, Bonventre JV. A rapid urine test for early detection of kidney
injury. Kidney Int. 2009 Jul;76(1):108-14
I livelli che eccedono gli 800 pg/ml
sembrano essere un ottimo cutoff
(75% sensibilità, 89% specificità)
tra pazienti con o senza AKI.
La correlazione tra ELISA e
RenaStick è di r2 = 0.88
Vaidya VS, Ford GM, Waikar SS, Wang Y, Clement MB,
Ramirez V, Glaab WE, Troth SP, Sistare FD, Prozialeck WC,
Edwards JR, Bobadilla NA, Mefferd SC, Bonventre JV. A rapid
urine test for early detection of kidney injury.
Kidney Int. 2009 Jul;76(1):108-14
Vaidya VS, Ford GM, Waikar SS, Wang Y, Clement MB,
Ramirez V, Glaab WE, Troth SP, Sistare FD, Prozialeck WC,
Edwards JR, Bobadilla NA, Mefferd SC, Bonventre JV. A
rapid urine test for early detection of kidney injury.
Kidney Int. 2009 Jul;76(1):108-14
GRAZIE PER
L’ATTENZIONE