Epidemiologia delle infezioni virali del sistema nervoso

CONTRIBUTI SCIENTIFICI
SCIENTIFIC PAPERS
Epidemiologia delle infezioni virali del sistema nervoso centrale nella regione
Puglia
Agata Calvario, Maria Scarasciulli
UOC Microbiologia e Virologia, Azienda Ospedaliero Universitaria Policlinico di Bari
Questo lavoro è stato in parte presentato al Convegno “Il Laboratorio nelle malattie del sistema nervoso”, 6-7 Giugno 2013, Vicenza.
ABSTRACT
Epidemiology of viral infections of central nervous system (CNS) in the Puglia region. After reviewing the
available literature to identify diagnostic criteria employed to establish viral etiologic agents possibly involved in CNS
disorders, an operative algorithm was developed according to the clinical as well as environmental evidence. Results
obtained along a period of 6 years (2006-2012) by molecular biology tests on 1984 cerebrospinal fluids from patients
suffering from CNS disorders are reported.
INTRODUZIONE
Le infezioni virali del sistema nervoso centrale (SNC)
sono considerate tra le patologie più gravi in termini di
diagnosi, cura e trattamento del paziente. Sono, infatti,
tra le poche che richiedono esami in regime di urgenza
diagnostica al fine sia di stabilire con rapidità la natura
dell'agente eziologico che di instaurare la terapia idonea.
In considerazione della varietà dei quadri clinici e degli
agenti coinvolti, il panorama eziologico ambientale deve
essere tenuto presente al fine di permettere l’uso di
opportuni algoritmi diagnostici che accelerino e
ottimizzino la ricerca virologica (1). La peculiare natura
del campione di liquido cefalorachidiano (LCR), ovvero la
frequente esiguità e l’irripetibilità del prelievo, impongono
che ogni procedura sia rigorosa e personalizzata al caso
in esame. Anche la conoscenza della storia naturale del
virus ricercato, delle possibilità e dei limiti dei metodi
diagnostici disponibili è di vitale importanza, poiché
l’accuratezza e la sensibilità dei test sono condizionate
dall’appropriatezza dei campioni impiegati e dalla scelta
del metodo più opportuno, sulla base dello stato clinico e
delle caratteristiche virali. Da questo punto di vista,
l'avvento delle metodiche molecolari ha dato un impulso
straordinario alla diagnosi delle malattie del SNC, anche
se ancora ~50% dei casi resta non diagnosticato (2). Dal
momento che la corretta diagnosi porta a un beneficio di
tipo terapeutico, gestionale e di esito finale per il
paziente, ogni sforzo deve essere fatto per il suo
raggiungimento, partendo dal presupposto che il solo
esame clinico non può escludere a priori il
coinvolgimento di un agente eziologico virale. Altro
fattore importante da considerare è la componente
immunologica del processo infettivo, che può alterare e
aggravare il quadro clinico, come nel caso di encefaliti
post-infettive o post-vaccinali.
Illustriamo in questo lavoro i dati epidemiologici delle
infezioni virali del SNC, raccolti in un periodo di 6 anni in
regione Puglia, mediante un algoritmo diagnostico da noi
messo a punto e condiviso con i clinici, che consente
l’approccio alla diagnosi secondo un percorso
consolidato e in accordo con le necessità sopra riportate.
MATERIALI E METODI
Negli anni 2006-2012 sono stati analizzati 1984
campioni di LCR di pazienti in fase acuta di malattia
provenienti dai principali nosocomi della regione Puglia e
alcuni anche extraregionali. I pazienti, 1020 maschi e
964 femmine, dei quali 1796 (90,5%) immunocompetenti
e 188 (9,5%) con deficit immunitari, erano ospedalizzati
in reparti di neurologia, rianimazione, malattie infettive,
pediatria ed ematologia; presentavano all’ingresso
diagnosi di encefalite, meningite, meningoencefalite,
mielite,
poliradicoloneurite, cerebellite, “acute
disseminated encephalomyelitis” (ADEM), malattia
demielinizzante, sclerosi multipla e lesioni cerebrali.
La distribuzione per classi di età era rappresentata
Corrispondenza a: Agata Calvario, UOC Microbiologia e Virologia, Azienda Ospedaliero Universitaria Policlinico Bari, Piazza Giulio
Cesare 10, 70124 Bari. Tel. 0805593640, Fax 0805593640, E-mail [email protected]
Ricevuto: 05.06.2013
Revisionato: 19.09.2013
Accettato: 25.09.2013
biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 3
203
SCIENTIFIC PAPERS
CONTRIBUTI SCIENTIFICI
dal 16,3% di pazienti pediatrici (n=323, 0-14 anni), dal
74,7% di pazienti in età adulta (n=1483, 15-65 anni) e
dal 9,0% di pazienti anziani (n=178, >65 anni). La
percentuale di pazienti immunodepressi era,
rispettivamente, 0,8%, 8% e 0,7% nelle tre classi di età
considerate.
Riguardo ai pazienti pediatrici, 307/323 (95%) erano
immunocompetenti e 16/323 (5%) immunocompromessi,
di cui 15/16 con patologie oncoematologiche e 1/16 HIV
positivo.
La maggior parte delle indagini virologiche sono state
eseguite su campioni di LCR, raccolti prima dell’inizio
della terapia, in associazione a campioni di siero/plasma
(n=1234) e/o sangue intero (n=453) o talora ad altri
campioni da sedi differenti, suggeriti dal quadro clinico
ipotizzato, per un totale di 3847 campioni analizzati. Per
64 pazienti l’analisi di LCR è stata ripetuta dopo circa
una settimana per confermare la diagnosi o monitorare il
decorso della malattia.
I campioni erano avviati alla ricerca virologica
secondo l’algoritmo mostrato nella Figura 1: in prima
istanza erano ricercati i 7 virus erpetici [herpes simplex
virus 1 (HSV1), herpes simplex virus 2 (HSV2),
citomegalovirus (CMV), Epstein-Bar virus (EBV), human
herpes virus 6 (HHV6), varicella-zoster virus (VZV) e
human herpes virus 7 (HHV7)] e l’enterovirus; in caso di
negatività e sulla base di notizie clinico-anamnestiche
dettagliate, la ricerca veniva estesa agli altri agenti virali,
elencati nella Figura 1, con la sola eccezione di TickBorne virus, la cui ricerca veniva eseguita dall’Istituto
Superiore di Sanità, qualora le notizie epidemiologiche
ne suggerissero la determinazione.
I campioni acellulari (LCR, siero, plasma, tamponi,
gargarizzati) e cellulari (sangue intero, biopsie) erano
avviati a estrazione di DNA/RNA virale con sistema
automatico X-tractor Gene (Corbett Robotics, Diatech)
mediante kit Helix DNA/RNA plus (Nanogen Advanced
Diagnostics). Ai campioni acellulari erano aggiunti 10 µL
di CPE (controllo positivo di estrazione) - DNA/RNA
(Nanogen Advanced Diagnostics), che consentivano di
garantire l’idoneità del campione in esame. Il DNA/RNA
ottenuto era quindi risospeso in un volume finale di 150
µL con tampone di eluizione. L’amplificazione genomica
è stata eseguita con tecnica “polymerase chain reaction
(PCR) real-time” mediante sistema ABI PRISM 7300
(Applied Biosystems), con l’impiego di kit commerciali
(Nanogen Advanced Diagnostics). Le sonde specifiche
per ciascun virus, di seguito riportate, erano marcate con
fluoroforo “fluorescein amidite” (FAM) e bloccate da
“minor groove binder-nonfluorescent quencher” (MGBNFQ): CMV [esone 4 del gene “Major Immediate Early
Antigen” (MIEA)], EBV [proteina “Epstein–Barr nuclear
antigen” 1 (EBNA-1)], HSV1 [glicoproteina D, regione
“unique short” 6 (US6)], HSV2 (glicoproteina G, regione
US4), HHV6 [“open reading frame” (ORF) 13R], HHV8
(proteina del capside), VZV (“major DNA binding
protein”, ORF 29), poliomavirus BK (BKV) (“large T
antigen”), enterovirus [5' UTR (“untranslated region”)].
Il dosaggio quantitativo del DNA virale era ottenuto
mediante curva standard impiegando quantità note di
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biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 3
Parvovirus
Influenza
Tick-Borne virus
Figura 1
Algoritmo operativo per le infezioni virali del sistema nervoso
centrale.
HSV1, herpes simplex virus 1; EBV, Epstein-Bar virus; HHV7,
human herpes virus 7; HSV2, herpes simplex virus 2; HHV6,
human herpes virus 6; CMV, citomegalovirus; VZV, varicellazoster virus; ADV, adenovirus; VRS, virus respiratorio sinciziale; JCV, John Cunningham virus (poliomavirus); HHV8, human
herpes virus 8; BKV, poliomavirus BK.
plasmide (105, 104, 103 e 102 copie). Acqua bidistillata
sterile è stata utilizzata come controllo negativo. La
sensibilità analitica permetteva di identificare la
presenza di 10 molecole di DNA/RNA bersaglio in 5 µL
di estratto. I risultati erano espressi come copie di
genomi virali/mL campione (gv/mL).
La “nested” PCR era impiegata per l’amplificazione
dei rimanenti virus di seguito riportati, secondo le
indicazioni della ditta produttrice (Nanogen Advanced
Diagnostics): John Cunningham virus (poliomavirus)
(JCV) (gene codificante il “large T antigen”), influenza
(“gene matrix”), parvovirus [regione “viral protein 1”
(VP1)], HHV7 (proteina del capside regione U57),
adenovirus (proteina maggiore del capside) e virus
respiratorio sinciziale (VRS) (proteina di fusione).
RISULTATI
Dei 1984 campioni di LCR analizzati con metodiche
molecolari 293/1984 (14,8%) sono risultati positivi:
250/293
(85,3%)
provenivano
da
pazienti
immunocompetenti e 43/293 (14,7%) da soggetti
immunocompromessi. I virus più frequentemente
ritrovati appartenevano alla classe herpes, in ordine di
prevalenza HSV1, EBV, VZV, HHV7, HHV6 e CMV,
quest'ultimo con pari frequenza dell’enterovirus. A
seguire, erano identificati BKV, HSV2, HHV8, JCV e
parvovirus/ influenza virus. In 23 pazienti era riscontrata
coinfezione, con associazioni tra HSV1, EBV, HHV6,
VZV e altri virus erpetici.
Nei pazienti immunodepressi HIV positivi (n=15), le
positività hanno riguardato, nell’ordine, VZV, EBV, BKV,
CMV e 2 casi di coinfezione (HHV6-CMV, VZV-EBV). Nei
pazienti immunodepressi non HIV (n=28) sono stati
ritrovati, nell’ordine, EBV, HHV6, 5 coinfezioni (EBV-
CONTRIBUTI SCIENTIFICI
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Tabella 1
Virus identificati nel corso dell’indagine
Herpes simplex virus 1
Epstein-Bar virus
Varicella-zoster virus
Human herpes virus 7
Human herpes virus 6
Citomegalovirus
Enterovirus
Poliomavirus BK
Herpes simplex virus 2
Human herpes virus 8
John Cunningham virus
Influenza
Parvovirus
Coinfezioni
Totale
Soggetti immunodepressi
Soggetti immunocompetenti
HIV positivi
HIV negativi
Totale
36
3
6
45
47
33
37
30
13
19
7
7
3
1
1
0
16
250
HHV6, EBV-HHV7, EBV-VZV, HHV6-HHV7, HHV6VZV), CMV e VZV (Tabella 1).
Nei pazienti pediatrici, gli LCR positivi sono stati 58
(19,8%), di cui 52 (89,6%) provenienti da soggetti
immunocompetenti. Le positività nei pazienti
immunocompetenti sono state, in ordine decrescente:
HHV7 (25,8 %), enterovirus (19,2%), EBV (17,3%),
HHV6 (13,5%), HSV1 (9,6%), VZV (3,8%), CMV e
coinfezioni (3,8%). Nella coorte dei pazienti pediatrici
oncoematologici, HHV6 è stato il virus ritrovato più
frequentemente.
Nel 33,4% di tutti i casi positivi è stata osservata
contemporanea positività sia in LCR che nel campione
ematico; nell’ambito dei LCR negativi, in 202 casi
(202/1691=11,9%) è risultato positivo solo il campione
ematico.
Confrontando le diagnosi di ingresso con le positività
riscontrate, la patologia predominante nei pazienti
immunocompetenti è risultata l’encefalite associata, in
ordine decrescente, a HSV1, HHV7, EBV, VZV e HHV6;
nei pazienti immunocompromessi la patologia
predominante è risultata la meningite, anche se numerosi
sono stati i casi con altre diagnosi (Tabelle 2 e 3).
Tutte le positività per HHV6 in LCR sono state
indagate per HHV6 cromosoma integrato (CIHHV6),
analizzando campioni di siero, sangue intero e, talvolta,
di bulbo pilifero. 11 LCR sono risultati positivi per
CIHHV6 integrato, di cui 3 pediatrici (3/58 = 5,2%) e 8
provenienti da adulti (8/235 = 3,4%).
La ricerca di Tick-Borne virus, quando eseguita, è
risultata sempre negativa.
1
4
1
3
0
1
0
5
2
4
0
0
2
2
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
2
5
15
28
49
40
38
35
19
19
11
7
3
2
1
1
23
293
DISCUSSIONE
Dagli anni ‘80 nei pazienti con encefalite sottoposti a
terapia antivirale è stato documentato il sensibile
miglioramento delle sequele (3). Da allora le linee guida
internazionali hanno posto l'accento sulla necessità di
fare ogni sforzo per stabilire una diagnosi eziologica,
soprattutto nelle encefaliti virali, che rappresentano i casi
più frequenti di infezione del SNC e quelli che possono
essere trattati terapeuticamente con maggiore successo
(4). Con questi presupposti, dal 1999 abbiamo
implementato la diagnostica delle infezioni del SNC
introducendo metodiche di biologia molecolare che
hanno via via sostituito le metodiche colturali, per gli
innegabili vantaggi di tipo clinico-diagnostico,
universalmente riconosciuti (5).
Il primo effetto riscontrato è stato l'incremento
considerevole della casistica, da poche decine a >100
pazienti per anno: un dato molto incoraggiante, che
trovava ragione nel fatto che molti casi non diagnosticati
con l’impiego di tecniche tradizionali trovavano
finalmente una causa eziologica con l’approccio
molecolare. Dal 1999 al 2002, avvalendoci della
tecnologia “multiplex herpes consensus”, sono stati
studiati 378 pazienti, 91% immunocompetenti e 9%
immunocompromessi (6). Successivamente, in base
all’evoluzione tecnologica e alla rilevanza diagnosticoterapeutica, è stata introdotta la tecnologia PCR “realtime”, utilizzandola in parallelo, negli anni 2003-2004, a
quella “multiplex herpes consensus”. Sulla base di
questa esperienza, dal 2006 abbiamo introdotto un
algoritmo operativo e una scheda dati anamnestica,
condivisa con i clinici dell’Azienda Ospedaliera
biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 3
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SCIENTIFIC PAPERS
CONTRIBUTI SCIENTIFICI
Tabella 2
Positività virali correlate alle patologie di ingresso nei pazienti immunocompetenti
Meningo
Malattia
Poliradicolo Sclerosi
Encefalite encefalite Meningite demielinizzante
neurite
multipla Cerebellite Mielite
HSV1
EBV
27
11
1
12
7
1
12
VZV
HHV7
18
HHV6
11
CMV
Enterovirus
BKV
HSV2
1
1
2
2
HHV8
2
JVC
Infuenza
Parvovirus
Coinfezioni
Totale
3
7
1
-
7
2
1
-
-
4
-
3
3
1
1
2
2
-
5
3
-
1
11
2
-
1
-
-
-
36
-
-
1
-
1
-
-
-
-
9
-
-
-
8
4
2
-
1
27
2
2
-
1
-
Totale
1
-
-
-
Altro
-
-
-
-
-
19
-
-
-
-
-
2
-
-
-
1
-
-
-
1
3
-
-
2
7
-
-
-
1
4
4
1
38
-
-
4
-
96
-
5
1
-
3
3
No
diagnosi
2
-
2
-
2
1
5
5
4
-
1
2
-
-
-
1
1
-
3
47
33
37
30
13
19
7
7
3
1
1
0
16
12
10
27
250
No
diagnosi
Altro
Totale
-
-
0
HSV1, herpes simplex virus 1; EBV, Epstein-Bar virus; VZV, varicella-zoster virus; HHV7, human herpes virus 7; HHV6, human
herpes virus 6; CMV, citomegalovirus; BKV, poliomavirus BK; HSV2, herpes simplex virus 2; HHV8, human herpes virus 8; JCV, John
Cunningham virus (poliomavirus).
Tabella 3
Positività virali correlate alle patologie di ingresso nei pazienti immunocompromessi
HIV
HSV-1
HSV-2
Encefalite Meningo Meningite
Malattia
Poliradicolo
encefalite
demielinizzante
neurite
-
-
1
-
2
2
1
1
-
-
-
-
EBV
1
-
HHV6
-
CMV
VZV
HHV7
HHV8
-
BKV
Enterovirus
Infuenza
Parvovirus
JCV
Coinfezioni
Totale
-
-
1
4
-
2
-
2
-
4
-
-
-
2
-
-
1
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2
Per abbreviazioni, vedere Tabella 2.
-
1
9
-
1
5
Universitaria Policlinico di Bari, al fine di ottimizzare la
diagnosi delle malattie virali del SNC, avvalendoci di un
approccio multidisciplinare proposto e riconosciuto a
livello internazionale (7).
La scelta di esaminare sia campioni di LCR che di
siero/plasma o sangue intero deriva dalla
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-
-
-
-
-
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-
No HIV
Sclerosi
multipla
Cerebellite
Mielite
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1
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1
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1
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2
13
2
6
9
7
5
1
0
4
0
0
1
1
7
43
considerazione che in molti casi si hanno campioni
ematici positivi con LCR negativo, soprattutto nei casi di
ADEM in pazienti pediatrici oppure nei casi di encefalite
post-infettiva
o
post-vaccinale.
La
ricerca
contemporanea su diverse tipologie di campione è
suggerita da vari autori (1, 4, 7).
CONTRIBUTI SCIENTIFICI
SCIENTIFIC PAPERS
I dati di infezione virale del SNC raccolti in questo
studio permettono alcune considerazioni relative al
nostro panorama epidemiologico:
1) le infezioni del SNC sono per lo più a carico di
pazienti adulti immunocompetenti;
2) in questi, l’encefalite rappresenta la più frequente
causa di malattia associata a infezione virale, anche
se molti sono stati i casi privi di diagnosi neurologica
d’ingresso. Tale patologia è risultata associata a tutti
i virus erpetici e, in maggior percentuale, a HSV1,
EBV, VZV, HHV7 e HHV6;
3) così come riferito in letteratura, nella coorte dei
pazienti immunocompetenti, HSV1 è risultato il virus
più frequentemente identificato tra gli adulti;
diversamente, tra i pazienti pediatrici la positività per
HHV7 è stata quella prevalente, seguita da
enterovirus;
4) riguardo ai pazienti immunodepressi, EBV è risultato
il virus più frequentemente identificato, seguito da
VZV e, alla pari, da HHV6 e CMV. Tali positività
hanno riguardato in maggioranza pazienti adulti non
HIV positivi, mentre la metà dei casi positivi per
HHV6 era riferibile a pazienti pediatrici
oncoematologici; rispetto a questi ultimi casi, critici
per il “management” clinico-terapeutico, la presenza
di CIHHV6 a livello ematico e bulbo pilifero ha
consentito di distinguere un’infezione primaria da
una persistente (CIHHV6 positivo) per la quale la
terapia antivirale non è raccomandata;
5) la ricerca virologica sui campioni di siero e sangue
intero ha permesso di individuare la causa eziologica
in casi di ADEM e di encefaliti post-infettive,
soprattutto nei pazienti pediatrici;
6) la ricerca di Tick-Borne virus, quando eseguita, è
risultata sempre negativa. Ciononostante, data la
frequenza di viaggiatori provenienti da aree
endemiche per le malattie altamente infettive e
l’incremento dell’esposizione - causa dei
cambiamenti climatici - ad artropodi vettori di malattie
infettive emergenti, la ricerca di Tick-Borne virus su
campioni in fase acuta e convalescente di malattia è
altamente consigliabile.
I dati del nostro studio risultano coerenti con quelli
del sistema internazionale di validazione di sorveglianza
delle encefaliti in tutti i gruppi di età (8). Tale risultato,
soddisfacente sia da un punto di vista clinico che
diagnostico, è stato possibile grazie all’impiego di
tecnologie avanzate e all’approccio multidisciplinare alle
problematiche in studio.
CONFLITTO DI INTERESSI
Nessuno.
BIBLIOGRAFIA
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