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02/04/2014 Il contributo della sperimentazione animale allo sviluppo dei farmaci Domenico Barone I 50 anni di SSFA e la Ricerca in Italia XIII Congresso Nazionale Roma, 31 marzo – 1 aprile 2014 1 Dall’antichità... …all’età moderna… ...a quella contemporanea Ippocrate di Cos (460-377 a. C.): Corpus Hippocraticum Galeno di Pergamo (129-216 d. C.) William Harvey (1578-1657) Rudolf Magnus (1873-1927) Henry Dale (1875-1968) – Nobel 1936 Harold Burne (1892-1981) Jack Gaddum (1900-1965) John Vane (1927-2004) – Nobel 1982 2 1 02/04/2014 William Harvey (1578-1657): fu il primo a scoprire e descrivere la circolazione sistemica e le proprietà del sangue, studiando il sistema CV di un serpente: cuoreà cervello e corpo à cuore 3 Rudolph Magnus: 1873-1927 • lavori su muscoli isolati da intestino e vasi, in bagni termostatati+O2 +nutrienti+sali+glucosio • Studi sui riflessi coinvolti nella postura • Studi sulla tensione muscolare • Effetto sostanze su cuore, vasi, polmoni e tratto intestinale 2 02/04/2014 Henry Dale (1875- 1968): lavori con i bagni di organi isolati e perfusi inventati da Magnus: • Studi sulla trasmissione degli impulsi nervosi attraverso i neurotrasmettitori • Ergot e derivati rilasciano messaggeri chimici: ACH, H, ADR • Istamina (H) àanafilassi, allergia, secrezione HCl 5 Harold Burn (1892-1981): Allievo di Henry Dale, maestro di John Vane • Ideatore dei bioassay • Perfusione attraverso i vasi del tessuto • Scrisse trattati su organi isolati e perfusi: - Methods of Biological assays (1928) - Biological Standardization (1937) - Functions of autonomic transmitters (1956) - The autonomic nervous system (1963) 6 3 02/04/2014 Jack Gaddum (1900-1965): - Allievo di Henry Dale Tecnica organo isolato e «super-perfuso»: - metodo più sensibile - prolungata sopravvivenza dell’organo isolato - applicò la valutazione statistica ai dati (bioassay insulina) 7 John Vane (1927-2004): - Allievo di Harold Burn - bioassay estremamente sensibile con strip di fondo di stomaco di ratto (1957): - 5-HT 1000x più potente di triptamina nel contrarre strip stomaco di ratto 4 02/04/2014 John Vane: cascata di 8 organi super-perfusi diversi tessuti da diversi organi di diversi animali scoperta di TxA2, PGE2, PGH2 9 John Vane 10 5 02/04/2014 Anni ’40: antiistaminici per curare la febbre da fieno (H1), ma non H2-antagonisti Anni ’60: G. Hitchings e G. Helion: - allopurinolo (antiuricemico) e azatioprina (Imuran, trapianti) - scoperta recettori H2 e vari recettori 5-HT Anni ’60/’70: David Jack: 5-HTà vasocostrizione vasi cerebrali la cui vasodilatazione dà emicrania; su strip di safena di cane trovò sumatriptan agonista 5-HT 11 Anni ’70: Schild, Black e Duncan: H2-antagonisti: cimetidina (tagamet) antiulcera Anni ’80: ranitidina (ranidil), H2 antagonista antiulcera Hitchings, Helion, Black (Nobel 1988) - beta-bloccanti - H2-antagonisti - antibatterici, antimalarici - immunosoppressori, antiuricemici (milioni di pazienti salvati) 12 6 02/04/2014 Ancora…peptidi… • Anni ’50: sistema renina-angiotensina: renina (rene) ACE (polmone) angiotensinogeno à Ag I à Ag II (14 aa) (10 aa) (8aa) (ag. press.) • 1975 -’76: Ondetti, Rubin e Cushman mutano un peptide inibitore di ACE in un non-peptide inibitore di ACE: captopril (antiipertensivo) à sartanici (antagonosti recettoriali di Ag II) 13 • 1933: Ulf von Euler (Nobel 1970) scopre lipidi acidi ciclopentanoici: le prostaglandine (PG) • Anni ’60: nasce e si sviluppa la farmacologia PG: - shock anafilattico à istamina + altri mediatori (?) - l’aspirina blocca lo shock - NSAID bloccano la biosintesi PG (E2,F2a) agendo su cascata acido arachidonico (anti stroke/infarto) - scoperta tromboxano A2, aggregante piastrinico e vasocostrittore - estratti aortici sull’ arteria celiaca di coniglio isolata e perfusa à una PG antiaggreg./ipotensiva: la prostaciclina che però è instabile à iloprost (1976) 14 7 02/04/2014 • Per oltre 100 anni amil nitrito e nitroglicerina sono stati usati nell’angina pectoris • ’70s: amil nitrito e nitroglicerina à NO àrilassamento muscolatura vasale liscia à vasodilatazione • 1980: Robert Furchgott (Nobel 1998): 1) NADR contrae strip di aorta di coniglio 2) ACH sulle cellule endoteliali à fattore ipotensivo à rilassamento muscolatura liscia vasale 3) rimozione cellule endoteliali à miorilassamento • 1987: questo fattore è il NO, molecola di segnale CV • ’80s: metabolismo di L-arginina à NO à costante effetto ipotensivo 15 ’70-’80: Studi di binding recettoriale in vitro/in vivo - recettori + 3H-ligando +/- molecola in esame - screening/QSAR studies - recettogramma: profilo farmaco-tossicologico - screening di migliaia di prodotti/anno/recettore - risparmio di migliaia di roditori/anno - studi di binding recettoriale in vivo - fine ’80: HTS in Discovery su recettori clonati, uso robot, informatica à decine di migliaia di molecole testate su centinaia di recettori/anno 16 8 02/04/2014 • Protocolli NIH/NCI: screening di nuovi antitumorali: - in vitro su cellule tumorali umane e murine - in vivo su roditori portatori di: - trapianti di cellule tumorali murine: P388, L1210, MMB16, LLC (tumori singenici) - xenotrapianti di cellule tumorali umane in topi nudi e SCHID (immunodeficienti) 17 15 /4 /2013: Paul Tesar & Robert Miller • un fattore di trascrizione che riprogramma le cellule espandibili progenitrici degli oligodendrociti mielogenici à remielinizzazione della guaina mielinica persa in MS e leucodistrofie • finora oligodendrociti e loro progenitori erano ottenuti solo da tessuti fetali (bioetica!...) o da cellule staminali pluripotenti • questi primi studi sono stati condotti in vitro, su cellule di topo ed in vivo in topi ipomielinati • il prossimo passaggio: trasferire in vivo questo processo di riprogrammazione nell’animale (Tox, Safety, efficacia) per poter passare all’uomo 18 9 02/04/2014 • • • • • • • • Questa rapida carrellata, che copre la storia della moderna farmacologia, dimostra che solo grazie alla sperimentazione animale, sono stati trovati, valutati e sono entrati in terapia centinaia di farmaci salvavita: antibiotici antivirali (HIV, …) antineoplastici farmaci SNC (ansiolitici, antidepressivi, antipsicotici) ipocolesterolemizzanti, ipoglicemizzanti antiinfiammatori, analgesici, antipiretici, anestetici immunosoppressori / immunomodulatori proteine ormonali e farmacologiche ricombinanti: insulina, GH, FSH, LH, HCG, IFN, fattori di crescita, 19 citochine, McAb,… • vaccini (rabbia, vaiolo, HAV, HBV, HPV, polio, varicella, difterite, tetano, pertosse, morbillo, parotite, rosolia, influenza)… HCV, HIV, • nano(bio)tecnologie: - drug delivery system - nuove formulazioni - diagnostica in vitro e in vivo • medical device (pacemaker, protesi, stent, cateteri, ecc.) • Molto resta ancora da fare…mancanza di modelli animali… • …terapia genica e genica somatica • …farmaci per patologie neurodegenerative (MS, SLA, Alzheimer, Parkinson,…) • malattie rare e malattie orfane (5-6000!) 20 10 02/04/2014 Sperimentazione animale non solo nella ricerca… • La sperimentazione animale è stata determinante nella Ricerca e messa a punto di nuovi farmaci • è stata altrettanto importante nel determinare i successi della Chirurgia • Non meno rilevante è il ruolo della sperimentazione animale nelle attività di R&S non clinico: tossicologia, PK/PD, ADME, safety pharmacology, tollerabilità, sviluppo formulativo e… • Nel QC della produzione (bioassay) dei prodotti biotecnologici (EU/US Pharmacopeia) 21 Bilancio di un secolo di sperimentazione animale… • E’ innegabile che… • ….solo grazie alla sperimentazione animale, in questi 120 anni di storia della medicina, miliardi di persone siano state curate e guarite e/o le loro sofferenze siano state alleviate • ….le terapie abbiano dato anni alla vita e vita agli anni • ….molto resta ancora da fare, ma le prospettive sono assolutamente positive 22 11 02/04/2014 La sperimentazione animale in prospettiva • Molto ci si aspetta ancora da: - biologia molecolare e nanobiotecnologie - farmacogenetica, farmacogenomica - tracrittoma, proteoma, kinoma - modelli in vitro scientificamente validati (!) (HTS, meccanismi di azione) e modelli animali di patologie umane • La sinergia tra test in vitro e modelli in vivo porterà nuove terapie più efficaci, sicure e selettive • Le valutazioni di efficacia, safety, tossicità e PK/PD non possono e non potranno esimersi dal ricorso alla sperimentazione animale prima della R&S clinici 23 La sperimentazione animale ha posto le fondamenta delle terapie del cancro, dei trapianti, dell’immunodeficienza acquisita, delle patologie infettive, infiammmatorie, cardiovascolari, nervose, autoimmuni, e dell’ictus…. 24 12 02/04/2014 Impossibile v isualizzare l'immagine. Camelus dromedarius Camelus bactrianus Camelidi: Lama glama, Vicugna pacos • Nanobody omodimerici (IgG): 2.5 x 4 nm, 12-15 kD, poco immunogenici à nanoimmunobiotecnologia • Stabili, non tossici, resistenti al calore, affinità nM, selettivi • Legano epitopi inaccessibili a Ab classici, enzimi, attraversano BBB, legano Ag citoplasmatici degli astrociti, rapida clearance renale • In terapia: Alzheimer (in Fase I); in oncologia (HER2, HGF): 89Zr-1E2-Alb8 e 6E10: PET imaging, efficacia nel topo con glioblast. • Imaging quantitativa (PET, SPECT), diagnostica aterosclerosi in uomo e topo (VICAM1), analisi radioimmunoguidata, imaging cerebrale, radioimmunodiagnostica • 2Rs15d non interferisce con trastuzumab e pertuzumab anti-HER2 25 Microtus ochrogaster (arvicola della prateria): modello di studio delle basi neurologiche, genetiche, evolutive e molecolari dei legami/dei comportamenti sociali, del legame di coppia , di scelta/predilezione del partner, monogamia e della cura biparentale. Ox e Vp, interagendo con i rispettivi recettori, coordinano comportamenti premianti: accoppiamento, scelta selettiva del partner, elaborazione dei comportamenti sociali necessari al riconoscimento individuale. Accoppiamento à modifica stabile profilo espressione genica di Ox e VPà forte legame monogamico Tricostatina A (inibitore deacetilasi) : è un fenomeno epigenetico 26 13 02/04/2014 Saguinus oedipus (Cotton top tamarin) (anche per studi di efficacia, safe safety e Tox con biotecnologici) X Studiato a fondo per varietà e l’elevato livello qualitativo dei comportamenti sociali collaborativi e altruistici 21% affetto da colite à modello naturale per lo studio dell’insorgenza e l’evoluzione dell’ adenocarcinoma del colon à ricerca e valutazione di antitumorali Modello animale validato per lo studio dell’infezione da EBV (HHV-4)à neoplasie Dose tumorigenica di EBV inoculata nel S. oedipus à linfomi multifocali a grandi cellule, modello per studio di antitumorali e vaccini contro EBV Nel S. oedipus la vaccinazione contro l’antigene virale gp340/220 non induce immunità, ma rende l’animale capace di controllare l’infezione 27 da EBV che resta latente Chrysemis picta bellii Ha un antenato ancestrale in comune con l’uomo Ibernazione: 3-4 mesi in assoluta anossia a -10 ÷ -15 °C (nel ghiaccio) Risposte adattative: - depressione coordinata metabolismo cellulare e pompe ioniche - sangue senza nuclei di condensazione, adattamento cuore e SNC - carapace e scheletro: uptake di a. lattico e tampone pH sangue Deposizione delle uova e sesso dei neonati in funzione della °T amb. Modello animale ideale senza alternative per: - lo studio dei meccanismi naturali che proteggono cuore e SNC dai danni dell’ipossia - studi evoluzionistici, di genetica dell’evoluzione, di genomica, di biologia evolutiva dello sviluppo, di ecologia dello sviluppo 28 14 02/04/2014 Grazie per l’attenzione! [email protected] 29 15