Saggio PakAuto

ISTRUZIONI PER L'USO
Saggio PakAuto
REF
PakAuto
IVD
INDICE
USO PREVISTO ............................................................................................................................................................ 2
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE ..................................................................................................................................... 2
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA ................................................................................................................................ 2
REAGENTI ..................................................................................................................................................................... 2
PRECAUZIONI .............................................................................................................................................................. 3
AVVISI ........................................................................................................................................................................... 3
RACCOLTA DEI CAMPIONI ......................................................................................................................................... 4
PROCEDURA ................................................................................................................................................................ 4
Materiali forniti .......................................................................................................................................................... 4
Altro materiale necessario ........................................................................................................................................ 4
Procedura d'analisi ................................................................................................................................................... 5
CONTROLLO DI QUALITÀ ........................................................................................................................................... 7
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL TEST......................................................................................................... 8
LIMITI DEL TEST........................................................................................................................................................... 8
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DELLE PRESTAZIONI DEL TEST ....................................................................... 8
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................................................. 9
Saggio PakAuto
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303467.IFUIT REV E
USO PREVISTO
Il test PakAuto consiste in un test ELISA (saggio immunoassorbente legato a enzima) su fase solida saggio immunoassorbente
legato a enzima qualitativo concepito per la ricerca di autoanticorpi anti-piastrine eluiti dalle piastrine o circolanti nel siero o nel
plasma di un paziente.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE
La porpora trombocitopenica autoimmune (PTA) è una delle cause più comuni della trombocitopenia. Circa la metà dei casi di PTA si
presenta in concomitanza di altre patologie quali linfoma, lupus eritematoso sistemico (LES) e infezione da HIV; gli altri casi sono
considerati “idiopatici”. In base alla presentazione clinica, la PTA può essere classificata in PTA acuta, un disturbo dell’infanzia che
generalmente si autolimita, e PTA cronica dell’adulto, raramente a remissione spontanea.
La maggior parte degli anticorpi associati alla PTA riconosce le glicoproteine presenti sulla membrana delle piastrine, in particolare
1,2
GPIIb/IIIa, GPIb/IX e GPIa/IIa. Spesso, nel plasma o nel siero dei pazienti affetti da PTA, è possibile rilevare anticorpi circolanti che
1,2,3,4,5
reagiscono contro questi bersagli.
Tuttavia, a conferma della natura autoimmune, è preferibile caratterizzare le immunoglobuline
associate a piastrine preparate da plasma ricco di piastrine ed eluite dalla superficie delle piastrine stesse. Molti test per
l’identificazione delle immunoglobuline associate a piastrine sono aspecifici, poiché spesso forniscono risultati positivi in pazienti con
2
trombocitopenia di tipo non auto-immune.
I micropozzetti per ELISA su fase solida PakAuto sono rivestiti con le glicoproteine IIb/IIIa, Ib/IX e Ia/IIa catturate mediante anticorpi
monoclonali. Il saggio serve per rilevare gli autoanticorpi specifici per le glicoproteine delle piastrine nel siero o nel plasma (anticorpi
circolanti) del paziente o gli autoanticorpi eluiti dalla superficie delle piastrine.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Il siero o il plasma del paziente è utilizzato per la ricerca degli autoanticorpi, mentre l’eluato derivato da plasma ricco di piastrine è
utilizzato per la ricerca degli autoanticorpi presenti sulla superficie delle piastrine del paziente. Il campione viene aggiunto a
micropozzetti rivestiti da glicoproteine piastriniche, consentendo agli anticorpi, se presenti, di legarsi. Quindi gli anticorpi non legati
vengono allontanati tramite lavaggio. Ai pozzetti viene aggiunto un reagente a base di anticorpi anti-immunoglobuline umane (antiIgG/A/M) marcati con fosfatasi alcalina, quindi si lascia incubare. Gli anti-IgG/A/M non legati vengono allontanati tramite lavaggio,
quindi si aggiunge il substrato PNPP (p-nitrofenil-fosfato). Dopo 30 minuti di incubazione, la reazione viene fermata aggiungendo la
Soluzione di stop. Con uno spettrofotometro si misura poi la densità ottica del colore che si è sviluppato.
REAGENTI
Numero massimo di test per kit:

PakAuto:
5 tests per kit
Tutti i reagenti vanno conservati come indicato in etichetta.
REF
404552
Strisce di micropozzetti: strisce di micropozzetti a fondo piatto sui quali sono state immobilizzate le glicoproteine
piastriniche IIb/IIIa, Ib/IX e Ia/IIa. I micropozzetti sono contenuti all’interno di una busta laminata richiudibile.
Pronti per l’uso.
403622
Soluzione di lavaggio concentrata (10X): tampone Tris (idrossimetil)-aminometano contenente cloruro di sodio e
Tween 20. Contiene azoturo di sodio all’1%. Prima dell’uso diluire con acqua distillata o deionizzata.
Conservare la Soluzione di lavaggio diluita per un massimo di 48 ore a temperatura ambiente o per un massimo
di 7 giorni a 2-8 °C.
403831
Diluente del campione: soluzione salina tamponata con fosfato contenente albumina bovina e siero di topo.
Contiene azoturo di sodio allo 0,1%. Pronto per l’uso.
403613
Tampone substrato: soluzione contenente dietanolamina e cloruro di magnesio. Contiene azoturo di sodio allo
0,02%. Pronto per l’uso. Proteggere dalla luce.
MS
TCW
SD
SB
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ESS
403603
Soluzione di Stop. Pronta per l’uso.
404588
Coniugato anti-IgG/A/M umano: anticorpi anti-immunoglobiline (IgG/A/M) umane coniugati con fosfatasi alcalina,
prodotti in capra e purificati per affinità. Contiene azoturo di sodio allo 0,1%. Diluire nel Diluente del campione
prima dell'uso.
404590
Soluzione di risospensione delle cellule e conservante: soluzione salina tamponata con fosfato contenente
EDTA. Contiene azoturo di sodio allo 0,1%. Pronta per l’uso.
404560
Soluzione tampone: Tris contenente albumina bovina. Contiene azoturo di sodio allo 0,1%.
404565
Soluzione di eluizione: tampone glicina a pH basso.
403594
Substrato PNPP: (p-nitrofenil fosfato), polvere cristallina. Prima dell’uso ricostituire con acqua distillata o
deionizzata e diluire in Tampone substrato. Proteggere dalla luce.
404600
Siero di controllo positivo: siero umano. Contiene sodio azide allo 0,1%. Diluire nel Diluente del campione prima
dell'uso.
404576
Siero di controllo negativo: siero umano. Contiene sodio azide allo 0,1%. Diluire nel Diluente del campione
prima dell'uso.
404579
Piastrine di controllo positivo (Controllo positivo dell’eluato): piastrine umane disidratate sotto vuoto rivestite di
anticorpi. Reidratare prima dell’uso con la Soluzione di risospensione delle cellule e conservante.
404578
Piastrine normali di controllo (Controllo negativo dell’eluato): pool di piastrine umane disidratate sotto vuoto.
Reidratare prima dell’uso con la Soluzione di risospensione delle cellule e conservante.
503019
Copripiastra
AH
CRP
BS
ES
PN
PC
NC
PCP
NCP
PS
PRECAUZIONI








Non utilizzare i reagenti se torbidi o contaminati.
Si DEVE prestare attenzione per evitare la contaminazione del Diluente del campione e del Coniugato. La contaminazione fortuita
di tali reagenti con siero o plasma umano determinerà la neutralizzazione del Coniugato e, di conseguenza, il fallimento del test.
Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza indicata.
I micropozzetti e i reagenti contenuti nel kit non vanno utilizzati congiuntamente a nessun altro sistema di analisi.
La sostituzione di componenti del kit con altri componenti diversi da quelli forniti può comportare risultati incoerenti o errati.
Alla fine di ogni analisi, scartare tutti gli avanzi del Coniugato diluito, del Siero di controllo positivo e del Siero di controllo negativo
diluiti e del reagente PNPP ricostituito e diluito.
Quando si preparano le diluizioni, seguire le istruzioni del produttore delle pipette in merito alle tecniche appropriate di
dispensazione e risciacquo.
La reazione tra enzima e substrato durante l’incubazione finale è sensibile alla temperatura, pertanto va eseguita in un’area a
temperatura controllata (22-25 °C).
AVVISI



Tutti i sieri di origine umana utilizzati nei controlli negativi e positivi di questo prodotto sono stati analizzati mediante i metodi
approvati dalla FDA e sono risultati negativi per la presenza di anticorpi contro HIV, HCV e HBsAg. Tuttavia, nessun metodo di
analisi può garantire con assoluta certezza l’assenza di virus HIV, HCV, HBV o di altri agenti infettivi. Pertanto, questi materiali
devono essere considerati come potenzialmente infetti.
Alcuni dei reagenti forniti insieme al kit contengono sodio azide come conservante.
AVVERTENZA Il sodio azide reagisce con il piombo e il rame presenti nelle condutture idrauliche, formando azoturi metallici
altamente esplosivi. Quando scartato in un lavandino, è necessario far fluire grandi volumi d’acqua per evitare l’accumulo di azoto.
Il sodio azide è un veleno ed è tossico se ingerito.
Al termine delle operazioni, scartare tutti i componenti attenendosi le normative locali
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RACCOLTA DEI CAMPIONI
Siero o plasma povero di piastrine - Per la ricerca di autoanticorpi circolanti
Il sangue va raccolto in provette sterili contenenti l’anticoagulante EDTA oppure come siero e analizzato quando è ancora fresco. Il
siero o il plasma povero di piastrine che non può essere analizzato subito va conservato a 2-8 °C per non più di 48 ore, altrimenti va
congelato. I campioni congelati a una temperatura pari o inferiore a –20 °C sono utilizzabili per un massimo di 2 anni.
Il siero o il plasma va separato dagli eritrociti prima di essere spedito o conservato.
La presenza di particolati o aggregati nel campione può determinare risultati falsi positivi o valori in duplicato poco coerenti. I campioni
contenenti materiale particolato vanno sottoposti a centrifugazione prima dell’analisi.
Per evitare cicli di congelamento/scongelamento i campioni vanno aliquotati in volumi piccoli.
Campioni con contaminazioni microbiche, emolizzati, lipemici, itterici o inattivati al calore possono comportare risultati incoerenti e
quindi vanno evitati.
Piastrine o plasma ricco di piastrine - Per la ricerca di autoanticorpi eluiti dalla superficie piastrinica
8,9
Il sangue va raccolto in provette sterili contenenti EDTA. Conservare il sangue in toto o il plasma ricco di piastrine a temperatura
ambiente (20-25 °C). Non refrigerare o congelare le piastrine o il plasma ricco di piastrine.
7
7
Per la preparazione degli eluati piastrinici, è necessario un numero minimo di piastrine pari a 1 x 10 (preferibilmente 5 x 10 piastrine).
Un campione con un numero sufficiente si ottiene da pazienti con conta piastrinica di  10.000/µL raccogliendo due provette da 7 mL di
sangue in toto.
NOTA: La spedizione dei campioni di sangue può causare la deplezione del numero di piastrine. Se i campioni sono da trasportare, è
meglio raccogliere un campione di volume maggiore per garantire una quantità sufficiente di piastrine da eluire.
Gli eluati preparati devono essere subito sottoposti all’analisi oppure vanno conservati in congelatore a -80 °C.
PROCEDURA
Materiali forniti
I flaconcini possono contenere una quantità maggiore di reagente rispetto a quanto indicato in etichetta. Quando si preparano le
diluizioni, assicurarsi di utilizzare uno strumento appropriato per la misurazione del reagente.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
6 – 2 x 8 Strisce di micropozzetti
1 x 50 mL di Soluzione di lavaggio concentrata (10X)
1 x 14 mL di Diluente del campione
1 x 14 mL di Tampone substrato
1 x 14 mL di Soluzione di blocco
1 x 80 µL di Coniugato anti-IgG/A/M umane
1 x 50 mL di Soluzione di risospensione delle cellule e conservante
1 x 2,5 mL di Soluzione tampone
1 x 2,5 mL di Soluzione di eluizione
3 x 50 µL di Substrato PNPP
1 x 0,3 mL di Siero di controllo positivo
1 x 0,7 mL di Siero di controllo negativo
1 Piastrine di controllo positivo (Controllo positivo dell’eluato)
1 Piastrine normali di controllo (Controllo negativo dell’eluato)
6 Copripiastra
Altro materiale necessario
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Provette di analisi per il campione del paziente, le diluizioni dei controlli e quelle dei reagenti
Pipette per i trasferimenti
Micropipette regolabili per l’erogazione di 10 – 100 µL e 100 – 1,000 µL e puntali monouso
Timer
Lettore di micropiastre per misurare l’OD a 405 o 410 nm e a 490 nm
Acqua distillata o deionizzata
Panni di carta assorbente
Sistema/dispositivo di lavaggio per micropiastre
Centrifuga per separare il siero o il plasma dai campioni dei pazienti
Bagno o incubatore termostatato a 37°C
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11.
12.
13.
Provette per microcentrifuga
Microcentrifuga per pellettare le piastrine
7
Piastrine normali (5 x 10 ) come controllo dell’eluizione
Procedura d'analisi
1.
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-25°C).
2.
Preparare la Soluzione di lavaggio diluita diluendo la Soluzione di lavaggio concentrata. Aggiungere 1 volume di Soluzione di
lavaggio concentrata a 9 volumi di acqua distillata o deionizzata. Miscelare bene.
3.
Calcolare il numero di campioni dei pazienti (eluato o siero/plasma) da analizzare. Utilizzando il Foglio di lavoro (Recording
Sheet), assegnare a ogni campione una posizione costituita da una colonna. Registrare l’identità di ciascun campione sul
Foglio di registrazione
Preparazione delle piastrine del campione
4.
Preparare i pellet delle piastrine a partire dalle piastrine del paziente o dalle piastrine normali di un donatore seguendo la
procedura sotto descritta:
a)
b)
c)
d)
e)
Preparare il plasma ricco di piastrine (PRP) centrifugando i campioni di sangue in EDTA a 110-150 rcf per 10-15 minuti.
Trasferire il PRP in una provetta di polipropilene pulita e centrifugare a 10.600 rcf per 5-10 minuti per ottenere il pellet di
piastrine. Rimuovere il plasma senza toccare il pellet di piastrine utilizzando una pipetta.
Aggiungere 500 µL di Soluzione di risospensione e conservazione delle cellule (CRP) al pellet di piastrine e miscelare bene
con una pipetta per disgregare completamente il pellet. Trasferire la sospensione di piastrine in una provetta per
microcentrifuga e lavare 3 volte come descritto sopra con almeno 500 µL di CRP. A ogni lavaggio, verificare che il pellet sia
stato risospeso completamente per consentire la rimozione di tutto il plasma dalla superficie delle piastrine.
7
Dopo il lavaggio finale, preparare un pellet di piastrine contenente tra 1 e 5 x 10 piastrine. Questo si ottiene risospendendo le
piastrine con CRP e portando la conta piastrinica a 10.000-50.000 piastrine per µL. Trasferire 1 mL in una provetta per
microcentrifuga e centrifugare per 5 minuti a 10.600 rcf per pellettare. (In alternativa, un pellet di piastrine da 5-10 µL dovrebbe
contenere abbastanza piastrine per eseguire l’eluizione. Confrontare il pellet con una provetta identica contenente 5-10 µL di
Diluente del campione).
Dopo aver ottenuto il pellet di piastrine, rimuovere completamente tutta la CRP residua utilizzando una pipetta. Non
distruggere il pellet piastrinico.
Preparazione delle piastrine di controllo
5.
Preparare i pellet delle piastrine di controllo come indicato qui di seguito
Aggiungere 500 µL di Soluzione di risospensione e conservazione delle cellule alle Piastrine di controllo positivo (Controllo
positivo dell’eluato) e, se necessario, alle Piastrine normali di controllo (Controllo negativo dell’eluato). Lasciar riposare a
temperatura ambiente per almeno 10 minuti per consentire la reidratazione. Miscelare bene con una pipetta per disgregare
completamente il pellet da risospendere. Centrifugare a 10.600 rcf per 5-10 minuti. Far decantare o aspirare il supernatante e
asciugare con carta assorbente il tampone rimasto per ottenere un “bottone” asciutto di piastrine.
NOTA
È preferibile utilizzare piastrine normali fresche per il Controllo negativo dell’eluato, tuttavia sono state incluse piastrine
disidratate nei casi in cui non siano disponibili piastrine normali.
NOTA
Il Controllo positivo dell’eluato può essere congelato per usi futuri. Non congelare o scongelare il Controllo positivo dell’eluato
per più di due volte.
Preparazione degli eluati del campione e del controllo
6.
Preparare gli eluati del campione e del controllo seguendo la procedura sotto descritta.
a)
b)
c)
7.
Prima di procedere, verificare che tutti i pellet di piastrine siano ben sedimentati e che sia stata rimossa tutta la CRP. È
imperativo rimuovere tutta la CRP residua per essere certi che quando si prepara l’eluato questo non risulti diluito.
Aggiungere 180 µL di Soluzione di eluizione a ogni pellet di piastrine e miscelare con l’aiuto di una pipetta. Lasciar riposare la
miscela a temperatura ambiente per 2 minuti. Centrifugare a 10.600 rcf per 5-10 minuti in una provetta per microcentrifuga.
Trasferire subito i supernatanti (eluati) in una provetta per microcentrifuga pulita e a ciascuna di esse aggiungere 180 µL di
Soluzione tampone. Miscelare bene. Centrifugare a 10.600 rcf per 10 minuti in una provetta per microcentrifuga per rimuovere
tutti i detriti piastrinici.
Quando gli eluati sono pronti, procedere prontamente all’analisi per evitare che gli anticorpi si riattacchino ai detriti piastrinici,
altrimenti, se l’analisi verrà condotta in un secondo tempo, congelare. Gli eluati piastrinici possono essere conservati a -80°C per
analisi future. Se si analizzano solo gli eluati, passare alla Fase 9.
NOTA Non diluire gli eluati.
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Analisi del siero/plasma per la ricerca di anticorpi circolanti
Preparazione dei campioni e dei controlli
8.
9.
Diluire come spiegato sotto e miscelare bene.
Volume del Diluente del
campione
Volume del
campione
PC
150 µL
50 µL
NC
300 µL
100 µL
Siero o plasma del
paziente
300 µL
100 µL
Rimuovere la cornice per i micropozzetti dalla busta laminata. Estrarre le strip necessarie e riporre subito quelle rimanenti nella
busta protettiva.
NOTA
Il kit contiene una sola cornice per le strisce di micropozzetti. Non gettarlo prima di aver terminato tutte le strip.
NOTA
Orientare la cornice in modo che la posizione A1 si trovi in corrispondenza dell’angolo in alto a sinistra. Controllare che tutte le
strip siano posizionate e incastrate correttamente nella la cornice. Etichettare o numerare ogni strip per evitare errori. Per tutta
la durata dell’analisi, mantenere la piastra orientata sempre nello stesso modo.
10.
Aggiungere 300 µL di Soluzione di lavaggio diluita a tutti i pozzetti e lasciar riposare a temperatura ambiente per 5-10 minuti..
11.
Aspirare o far decantare forzatamente e capovolgere su carta assorbente per impedire l’essiccazione.
12. Aggiungere 50 µL dell’appropriato eluato, controllo diluito o siero/plasma del paziente ai pozzetti di una colonna come mostrato
nella Figura 1.
NOTA
Non aggiungere campioni o reagenti ai pozzetti del bianco (Blank).
NOTA
Quando si analizzano più campioni dei pazienti contemporaneamente, è necessaria solo una serie di controlli SIGLARE OGNI
STRISCIA PER EVITARE ERRORI.
13. Sigillare i micropozzetti con un copripiastra e incubare per 30-35 minuti in un bagnomaria a 37 °C. Se si usa un incubatore a
secco, prolungare di altri 10 minuti.
14. Diluire 1:100 il Coniugato utilizzando il Diluente del campione. Utilizzare un contenitore di polipropilene.
Strisce
AH
2-2x8
20 µl
6-2x8
60 µl
SD
2,0 ml
6,0 ml
NOTA
Il Coniugato è viscoso. Miscelare 2-3 volte col puntale nel Coniugato prima di erogare e risciacquare dopo l’aggiunta del
Diluente del campione.
Miscelare bene.
Saggio PakAuto
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15. FASE DI LAVAGGIO
a)
b)
c)
d)
e)
Aspirare o far decantare il contenuto dei pozzetti capovolgendoli su carta assorbente.
Aggiungere 300 µL di Soluzione di lavaggio diluita.
Aspirare o far decantare.
Ripetere i passaggi b + c per un totale di 3 o 4 lavaggi.
Dopo l’ultimo lavaggio, far decantare picchiettando vigorosamente per rimuovere tutta la soluzione di lavaggio residua.
Capovolgere su carta assorbente per impedire l’essiccazione.
Dopo l’ultimo lavaggio, è importante rimuovere completamente la soluzione di lavaggio
NOTA
16. Aggiungere 50 µL di Coniugato diluito (preparato in precedenza come indicato sopra) a tutti i pozzetti ECCETTO quelli indicati
destinati al bianco (BLANK).
17. Sigillare i micropozzetti con un copripiastra e incubare per 30-35 minuti in un bagnomaria a 37 °C. Se si usa un incubatore a
secco, prolungare di altri 10 minuti.
18. Solubilizzare il Substrato PNPP aggiungendo alla provetta 0,5 mL di acqua distillata o deionizzata. Sostituire il tappo e miscelare
bene. Proteggere dalla luce fino al momento dell’uso.
19. Diluire 1:100 il Substrato PNPP utilizzando il Tampone substrato.
Strisce
2-2x8
6-2x8
PN
40 µl
120 µl
SB
4,0 ml
12,0 ml
Miscelare bene. Proteggere dalla luce fino al momento dell’uso.
20. FASE DI LAVAGGIO
a)
b)
c)
d)
e)
Aspirare o far decantare il contenuto dei pozzetti tamponando su carta assorbente.
Aggiungere 300 µL di Soluzione di lavaggio diluita.
Aspirare o far decantare.
Ripetere i passaggi b + c per un totale di 3 o 4 lavaggi.
Dopo l’ultimo lavaggio, far decantare picchiettando vigorosamente per rimuovere tutta la soluzione di lavaggio residua.
Capovolgere su carta assorbente per impedire l’essiccazione.
Procedere subito alle successive tre fasi.
21. Aggiungere 100 µL della Soluzione PNPP diluita a tutti i pozzetti ECCETTO quelli destinati al bianco (BLANK, riga H).
22. Lasciar incubare i micropozzetti al buio per 30 minuti a TEMPERATURA AMBIENTE (22-25 °C).
NOTA Il tempo e la temperatura di incubazione dopo l’aggiunta di PNPP sono critici. NON VARIARE il tempo o la temperatura di
incubazione stabiliti. Per motivi di riproducibilità, far partire il timer subito dopo l’aggiunta del reagente al primo pozzetto.
23. Interrompere la reazione aggiungendo 100 µL di Soluzione di stop a ogni pozzetto nella stessa sequenza seguita per l’aggiunta del
substrato. Aggiungere 200 µL di Soluzione di stop ai pozzetti destinati al bianco (Blank).
24. Leggere l’assorbanza (OD) di ogni pozzetto a 405 o 410 nm utilizzando un filtro di riferimento di 490 nm. Se non si può procedere
subito alla lettura dei risultati, riporre i pozzetti al buio per un massimo di 30 minuti.
25. Dalle letture di tutti i pozzetti dei campioni e dei controlli sottrarre i valori letti nei pozzetti del bianco. Molti lettori per analisi ELISA
sono programmati per eseguire automaticamente questo calcolo.
26. Registrare i risultati sul Foglio di lavaro.
CONTROLLO DI QUALITÀ
Il controllo di qualità del test PakAuto è intrinseco al sistema di analisi stesso grazie all’aggiunta dei Controlli positivo e negativo.
Quando si analizza solo il siero/plasma del paziente, utilizzare il Siero di controllo positivo e il Siero di controllo negativo. Quando si
analizzano i campioni di eluato del paziente, includere le Piastrine di controllo positivo e le Piastrine normali di controllo. Questi
controlli, che vanno sempre inseriti in ogni analisi, aiutano a stabilire se si sono verificati errori tecnici o se uno dei reagenti non ha
funzionato.
Saggio PakAuto
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303467.IFUIT REV E
Criteri di validità di un test:
Controllo negativo
Controllo positivo
Eluato
 0,100 (Riga IIb/IIIa)
 1,000
Siero
 0,160 (Riga IIb/IIIa)
 1,000
Le letture della OD ottenute dai risultati del test in duplicato non devono deviare per più del 20% dalla media dei due valori. I campioni
con risultati che deviano da questo limite devono essere rianalizzati.
NOTA
Duplicati non coerenti possono derivare dall’omissione del reagente o del campione, aggiunta non corretta dei reagenti,
temperatura non costante durante le incubazioni, luce diffusa durante l’incubazione o contaminazione tra pozzetti. La mancata
esecuzione dell’analisi in duplicato può comportare l’accettazione di risultati errati.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL TEST
Risultati del test indicanti valori di OD uguali o superiori di 2 volte il valore ottenuto per la media dei controlli negativi della
corrispondente glicoproteina (2 valori di controllo negativo per ciascuna glicoproteina) sono considerati positivi.
LIMITI DEL TEST








Si possono ottenere risultati errati in caso di contaminazione batterica dei materiali del test, incubazioni di durata inadeguata, errori
di lavaggio o di decantazione dei pozzetti del test, esposizione del substrato alla luce diffusa, omissione di uno dei reagenti del
test, esposizione a temperature superiori o inferiori rispetto a quanto indicato, piastrine insufficienti o in eccesso oppure omissione
di uno dei passaggi.
In questa analisi, la presenza di complessi di tipo immunitario o di altri aggregati di immunoglobuline nel campione del paziente
può indurre un aumento dei legami aspecifici e determinare risultati falsi positivi.
Alcuni anticorpi a basso titolo e bassa avidità potrebbero non essere riconosciuti da questo test.
Le decisioni cliniche non vanno basate esclusivamente sui risultati di questo saggio.
Questo prodotto è stato specificamente ideato per la ricerca degli autoanticorpi eluiti dalle piastrine di un paziente. Pertanto, una
reazione positiva ottenuta soltanto con il siero o il plasma del paziente non indica necessariamente la presenza di un
autoanticorpo. Utilizzando questo saggio possono risultare reattivi anche alloanticorpi specifici per le piastrine.
Il test PakAuto ha lo scopo di rilevare gli autoanticorpi contro le glicoproteine piastriniche IIb/IIIa, Ib/IX e Ia/IIa. Non risulta che gli
autoanticorpi contro altre proteine piastriniche reagiscano nel presente saggio.
È possibile che un autoanticorpo fornisca un risultato falso negativo in questa analisi a causa dell’ingombro sterico rappresentato
dagli autoanticorpi umani con gli anticorpi monoclonali murini usati per catturare le glicoproteine piastriniche.
Il saggio PakAuto va utilizzato come test di screening. Il riconoscimento dell’identità di un anticorpo anti-piastrinico non va basato
esclusivamente sui pattern di reazione ottenuti da un campione analizzato con questo prodotto. Pertanto, i risultati positivi o
negativi ottenuti mediante il presente test devono essere interpretati alla luce dei reperti clinici o di altri test sul siero.
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DELLE PRESTAZIONI DEL TEST
Se appropriatamente conservato e utilizzato secondo le procedure sopra descritte, questo prodotto può rilevare la presenza di
autoanticorpi contro le glicoproteine piastriniche in base a quanto definito nel Foglio di lavoro.
A garanzia di una reattività e di una specificità appropriate, ogni lotto del saggio PakAuto viene analizzato prima del rilascio utilizzando
campioni di cui è noto il contenuto in anticorpi reattivi contro le glicoproteine identificate nel Foglio di lavoro allegato e con campioni nei
quali è nota l’assenza di tali anticorpi.
Valutazione delle prestazioni
Metodo di confronto
Positivo
Negativo
Saggio
PakAuto
24
1
25
Negativo
23
49
72
Totale
47
50
97
Concordanza:
Co-Positività:
Co-Negatività:
Metodo di confronto:
Saggio PakAuto
Totale
Positivo
75.3%
51.1%
98%
IgG associate a piastrine* (citometria a flusso)
6,7
*Le PAIgG hanno un basso valore predittivo per ITP.
8
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BIBLIOGRAFIA
1.
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2015-05-15
Warning
Danger
H302
H318
H412
EUH032
P264
P270
P273
P280
P301 + P312
P305 + P351 + P338
P310
P330
Saggio PakAuto
Attenzione
Pericolo
Nocivo se ingerito
Provoca gravi lesioni oculari
Nocivo per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata
A contatto con acidi libera gas molto tossici
Lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso
Non mangiare, né bere, né fumare durante l'uso
Non disperdere nell'ambiente
Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso
IN CASO DI INGESTIONE: contattare un CENTRO ANTIVELENI/un medico in caso di malessere
IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le
eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare
Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico
Sciacquare la bocca
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