Lezione n.3

Esempi di piante con contento di sostanze nutraceu.che o<enute mediante ingegneria gene.ca Antonella Leone Dipar.mento di Farmacia Università di Salerno Modificazione di alcuni componen. delle vie metaboliche e prodoA nutriteu.ci Modifica dei Lipidi nuovi oli con un più alto contenuto di PUFA Modifica dei carboidra. • amido meno digeribile -­‐Transito intes;nale -­‐diabete • barbabietola che produce fru>ano invece di saccarosio meno calorie Aumento del contenuto di vitamine alleviare i problemi di carenze Aumento del contenuto di aminoacidi essenziali Aumento del valore nutrizionale Vitamina A
Piante transgeniche
di interesse alimentare
con contebuto elevato di
vitamina e micronutrienti
La vitamina A (retinolo) è essenziale alla
crescita umana.
Il nostro corpo non produce vitamina A, e la
possiamo incamerare dalla dieta per due vie:
- 50% come pro-Vitamina A dei carotenoidi delle piante che viene convertita il
vitamina A nell’intestino.
- ingestione diretta da alimenti animali e supplementi.
Tutti i carotenoidi che contendono anelli β possono essere convertiti in retinolo,
e una delle più importanti pro-vitamine dei carotenoidi è il β-carotene
Biosintesi della vit. A dal beta-­‐carotene 400 milioni di persone sono a rischio per deficienza in vitamin A (VAD), in
particolare in Asia e Africa.
VAD rende I bambini particolarmente suscettibili
ad infezioni.
0.5 milioni di bambini diventano cieci a causa
della VAD
Il ricorso a supplementi in
vitamina A è riuscito a
ridurre I problemi del 50%
nelle aree soggette, ma
ciò risulta molto oneroso e
non utilizzabile in tutte le
aree.
E1
PP
IPP
PP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene
Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
E6
ζ-Carotene Desaturase
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
E8
α, β-Lycopene Cyclase
DMAPP
PP
GGPP
Phytoene
Neurosporene
Lycopene
β-Carotene
α-Carotene
Sono espressi questi geni nell‘endosperma del riso ??
Biosintesi di terpeni in pinata CYTOPLASM MVA pathway MITOCHONDRIA Ubiquinones FPP Ace.l-­‐Coa AACT x2 Acetoacetyl-­‐CoA HMGS HMG-­‐CoA PMK PMD Cytokinins Thiamine DXR MEP CMS CDP-­‐ME CMK MCS ME-­‐cPP HDS HMBPP MVPP IDS DMAPP IDI IPP IPP IDI DMAPP x3 GGPP x1 x3 x2 FPS Sesquiterpenes DXS DXP CDP-­‐MEP MVP GGPS PLASTID G3P+Pyruvate DMAPP MVA MVK Pyridoxol FPS IPP MHGR MEP pathway FPP Phytosterols Brassinosteroids GPS GPP Monoterpenes Chlorophylls Carotenoids Tocopherols ABA Phylloquinones Plastoquinones Gibberelins Polyprenoids Isoprene GGPS GGPP Diterpenes E1
PP
IPP
Wild-type rice endosperm
PP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
E6
ζ-Carotene Desaturase
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
E8
α, β-Lycopene Cyclase
DMAPP
PP
GGPP
Phytoene
Neurosporene
Lycopene
β-Carotene
α-Carotene
GGPP, il precursore genrale dei terpeni, è sintetizzato nell‘endosperma di
cariossidi di riso...ma nel genoma di riso gli altri geni non sono presenti!
E1
PP
IPP
Wild-type rice endosperm
PP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene
Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
E6
ζ-Carotene Desaturase
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
E8
α, β-Lycopene Cyclase
DMAPP
PP
GGPP
Phytoene
Neurosporene
Lycopene
β-Carotene
α-Carotene
Difficile inserire medinate trasformazioe sei geni!!!
transformed
E. coli
Erwinia carotovora carotenoid gene cluster
crtE
ORF2
ORF3
ORF4
crtX
crtY
crtI
crtB
ORF6
CrtI substitutes for 4 plant genes
crtZ
ORF12
Cyanobacteria e Piante
15-cis-Phytoene
E4
E5
Batteri
15-cis-Phytoen
PDS
Ζ-ISO ??
9, 15, 9‘-tri-cis-z-Carotene
gene CRTI
E6
ZDS
9, 9‘-di-cis-z-Carotene
E7
CRTISO
7, 9, 9‘, 7‘-tetra-cis-Lycopene
all-trans-Lycopene
all-trans-Lycopin
B
Plant Desaturation pathway
CrtI
shortcut
A
E1
PP
IPP
Wild-type rice endosperm
PP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
E6
ζ-Carotene Desaturase
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
E8
α, β-Lycopene Cyclase
DMAPP
PP
GGPP
E3
Phytoene
CrtI
Neurosporene
Lycopene
E7
β-Carotene
α-Carotene
´Tre geni invece di sei!!!!
Gt1p
35Sp
(1)
pZPsC
E3 (PSY)
aph IV
E,4,5,6,7 (tp-CrtI)
35Sp
Gt1p
(2)
pZLcyH
Gt1p
tp
aphIV
E8(ß-LCY)
promotore glutelina, proteina di riserva dell’endosperma di riso
peptide di transito ssRubisco
igromicina fosfotransferasi
1.6 µg/g beta-carotene
Possibilità di aumentare ulteriormente il contenuto in beta-carotene?
…Goldrn rice 1 4,8 – 7,1 µg/g beta carotene
aph IV
Gt1p
35Sp
pB19hpc
E3 (PSY) E4,5,6,7 (tp-CrtI)
0.018
0.016
Single transformant
hpc 2b
0.008
0.006
α-Carotene
Lutein
0.010
Zeaxanthin
0.012
0.004
…why is Golden Rice golden
(yellow) instead of red???
0.002
0.000
-0.002
0
20
40
…Lesson learned:
no need for lycopene
ß-cyclase
ß-Carotene
0.014
60
80
100
Ye et al., 2000; Science 287:303
E1
PP
PP
IPP
E2
GGPP-Synthase
E3
Phytoene-Synthase
Phytoene
Synthase
Phytoene Desaturase
Phytofluene
E4
E5
(Cis/trans Isomerase?)
ζ-Carotene
Neurosporene
E6
ζ-Carotene Desaturase
Lycopene
E7
Lycopene cis/trans Isomerase
DMAPP
Wild-type rice endosperm
PP
E3
GGPP
Phytoene
CrtI
E8
β-Carotene
Xanthophylls
α, β-Lycopene Cyclase
α-Carotene
Schaub et al. (2005), Plant Physiol. 138: 441
Fitoene
Carotene
Licopene
α Carotene
Luteina
Luteina- 5-6 eposside
β carotene
Zeaxantina
Anteraxantina
Violaxantina
Neoxantina
‘Engineering provitamin A (ß -carotene) biosynthetic pathway into
(carotenoid-free) rice endosperm’.
Ye et al., Science 287,303-305 (2000).
Due T-DNAs codificanti per 3 geni della pro-vitamin A (più il gene marcatore
selettivo) sono stati introdotti insieme via Agrobacterium attraverso co-transformation
LB
RB
pro
Narciso 1
ter
pro
LB
pro
pro
DaffNarciso 2odil
ter2
Daffodil 1 = phytoene synthase
Daffodil 2 = lycopene ß-cyclase
tp
Erwinia
Hyg resis
ter
ter
RB
With own native transit peptides and endospermspecific promoter from rice glutelin (GT1 promoter)
Erwinia = Erwinia double desaturase - with added transit peptide, expressed
from
35SCaMV promoter
La granella del riso transgenico mostrava un colore giallo oro brillante. La
migliore linea aveva l’85% di carotenoidi come ß-carotene
RISO DORATO
Geranyl-geranyl
diphosphate
Phytoene
Phytoene
synthase
(gene vegetale)
Phytoene desaturase
(gene batterico)
ζ-carotene
lycopene
Carotene
desaturase
(gene batterico)
lo
stesso
gene
lycopene
cyclase
(gene vegetale)
β-carotene
Nell’uomo
Vitamin A
Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y.,
Hinchliffe, E., Adams, J.L., Silverstone, A.L. & Drake, R. (2005).Improving the nutritional value of
Golden Rice through increased pro-vitamin A content Nature Biotechnology 23:482-487.
In molte pathways biosintetiche multi steps esistono degli steps limitanti.
Il collo di bottiglia in questo caso era rappresentato dalla attività enzimatica di
PSY (gene codificante per la phytoene synthase) .
Dopo aver provato diversi gei PSY
provenienti da diverse fonti è stato
provato che la combinazione gne del
mais e del riso davano la migliore
combinazione
Golden Rice2 che è stato ottenuto
accumulava 37 µg/g di carotenoidi di
cui 31 µg/g ß-carotene circa 23 volte
quello del Golden Rice precedente.
GT1pI
pSYN12424
tp-CrtI
GT1pI
ZmPSY
ubi1p
PMI
pZPsC
pZLcyH
pSYN12424
Golden rice 1
37 mg per kg di
cariosside
Golden rice 1
1,6 mg/kg
cariosside
Figura 10.11. Contenuto in provitamina A nel golden rice. a) riso indica non modificato geneticamente e
normalmente privo di carotenoidi nella cariosside; b) golden rice 1 con un contenuto in carotenoidi medio di per kg di
cariosside; c) golden rice 2 con un contenuto in carotenoidi fino a 37 mg per kg di cariosside.
Golden Rice2 che è stato ottenuto
accumula 37 µg/g di carotenoidi di
cui 31 µg/g ß-carotene circa 23 volte
quello del Golden Rice precedente.
uno degli articoli che presenterete!
Ingegneria metabolica dei carotenoidi in piante diverse Ricostruzione della via biosinte.ca dei carotenoidi in E. coli ©2011 by American Society of Plant Biologists
Via biosintetica degli
antociani nelle piante
Molto complessa,
molti geni biosintetici
coinvolti
identificati fattori
di trascrizione che
controllano in
maniera coordinata
l’epressione di molti
geni di questa via
metabolica
Antirrhinum
majus
delila fattore
di trascrizione
bHLH( basichelix-loophelix)
Rosea1
fattore di
trascrizione
R2R3-MYB
Antirrhinum majus
E8 promotore frutto-specifico di un gene della biosintesi dell’etilene (ormone
della maturazione dei frutti climaterici)
Antioxidant capacity of purple compared to red tomatoes
Red tomato –
supplemented
pellets
Purple tomato –
supplemented
pellets
p53-/p53- knockout mice
Life span, pathology
Diet
Number
of mice
Average
Lifespan
(days)
Std
Error
Maximum
Lifespan
(days)
Standard diet
24
142.0
8.7
211
Diet supplemented with 10%
red tomato powder
15
145.9
12.6
213
Diet supplemented with 10%
purple tomato powder
20
182.2
8.6
260
Lucilla Titta, Marco Giorgio
Via biosinte>ca semplificata della lisina, me>onina, treonina e isolecuicna aspartato DHDP di-­‐idrodipicolinato glicina treonina OPH O-­‐fosfo-­‐omoserina ASD aspartato semialdeide AK apartato chinasi DHDP sintasi lisina TS treonina sinatsi me>onina SAMS adenosin-­‐me>onina isoleucina CGS cista>onina γ
sintasi MGL me>onina γ liasi LKR/SDH enzima bifunzionale
Lys-ketoglutarate reductase/
saccharopine dehydrogenase
SAMS S adenosin-­‐me>onina sintasi Carenza di amminoacidi essenziali  Lisina e metionina sono gli amminoacidi essenziali limitanti delle
proteine di riserva dei semi cereali e dei legumi
 Il basso contenuto in Lys e Met diminuisce il valore nutrizionale di
queste due colture del 50–75%, rispetto a diete con un contenuto
bilanciato di amminoacidi essenziali
 La carenza di questi aa causa deficienze non specifiche nell’uomo,
 quali un più alto rischio a contrarre malattie, ritardo mentale e nello
sviluppo fisico di bambini/e
Sindrome conosciuta come PEM Protein-Energy Malnutrition (PEM)
 La WHO stima che circa il 30% delle popoalzione dei Paesi in via di
sviluppo soffre per queste carenze
Carenza di amminoacidi essenziali il gene batterico feedbackinsensitive DHDPS gene (isolato
da Corynebacterium glutamicum) sovra-espresso sotto il controllo
di un promotore endosperma o
embrione-specifico (b32 del
gene dell’albumina
dell’endosperma)!
Una sequenza “invertita e ripetuta”
corrispondente alla sequenza
parziale del cDNA del gene !
LKR/SDH inserita in un introne di una
cassetta di espressione che contiene
il cDNA del gene CordapA!
L’espressione di questo transgene
genera un RNA double-strand e del
mRNA del CordapA Frizzi, A. et al (2008) Modifying lysine
biosynthesis and catabolism in corn with a
single bifunctional expression/silencing
transgene cassette. Plant Biotechnol. J. 6, 13–
21. Carenza di amminoacidi essenziali Frizzi, A. et al (2008) Modifying lysine biosynthesis and catabolism in corn with a single bifunctional
expression/silencing transgene cassette. Plant Biotechnol. J. 6, 13–21. La patata, la quarta coltura nel mondo, è utilizzata per
produrre alimenti, mangimi, amido e alcool.
Limitata in lisina, tirosina, metionina e cisteina
Patate trasformate con gene di Amaranthus hypochondriacus che codifica per la
produzione di albumina nei semi presentano un buon bilanciamento
aminoacidico
2 costrutti
alternativi.
Promotore
constitutivo o
tuberospecifico
p35S CaMV
AmA1
pGBSS
AmA1
Nos 3’
Nos 3’
pSB8
pSB8G
l’espressionei nei tuberi è da 5 a 10 volte maggiore quando si
utilizza il promotore GBSS promoter piuttosto chi il 35S
Cambiamenti qualitativi proteici nelle patate transgeniche
contenuto in aminoacidi essenziali da 3 a 5 volte più elevato
Contenuto proteico totale incrementato del 35-45%
8-
Fold
increase
4-
1D E S G H R T A P Y V M C I L F K
Amino acid
Le piante producono il doppio rispetto al wild-type
L’albunia di Amaranthus non è allergenica :
- già utilizzata come farina in Messico e Sud America
- test iperallergenici condotti su animali come mangime non evidenziano reazioni allergiche
©2011 by American Society of Plant Biologists
Via biosintetica degli
antociani nelle piante
Molto complessa,
molti geni biosintetici
coinvolti
identificati fattori
di trascrizione che
controllano in
maniera coordinata
l’epressione di molti
geni di questa via
metabolica
Sovraespressione di due geni regolatori di A. majus (MYB Rosea1 e
bHLH Della) nel frutto determina accumulo di antocianine nella polpa e
nella buccia
Promotore frutto-specifico E8
Topi malati di cancro
p53-/p53-
Dieta
Numero
di topi
Vita
media
gg
Errore
standard
Vita
Massima
gg
standard
24
142.0
8.7
211
+ pomodoro
rosso
15
145.9
12.6
213
+ pomodoro
viola
20
182.2
8.6
260
Butelli et al, 2008 - Nature Biotech 26: 1301-1307
Effect of Chronic Consumption of Anthocyanins on the Sensitivity to ex Vivo IschemiaReperfusion Injury as Assessed by Infarct Size in Rats.Open symbols represent individual
values, and closed symbols are means ± 6 se, n = 10/group. *Different from anthocya...
Martin C et al. Plantcell 2011;23:1685-1699
©2011 by American Society of Plant Biologists
I FITOESTROGENI
Sono sostanze naturali, prodotte dalle piante, che hanno un’azione
simile agli estrogeni, gli ormoni femminili.
La loro attività biologica, è in media 1000 volte più lieve rispetto agli
estrogeni endogeni prodotti dal corpo umano.
Principali classi
• ISOFLAVONI
(legumi, soia, lenticchie, piselli,
fagioli)
• LIGNANI
(cereali, frutta, vegetali)
• CUMESTANI
(germogli di trifoglio, foraggio)
I RECETTORI ESTROGENICI
FITOESTROGENI
PREVENZIONE DI MALATTIE
CARDIOVASCOLARI
CANCRO AL SENO
OSTEOPOROSI
2
E’ possibile aumentare ulteriormente
il contenuto di isoflavoni nelle piante?
Ingegneria genetica e metabolica
INGEGNERIA METABOLICA DEGLI
ISOFLAVANOIDI
35S-CaMV
IFS
Biosintesi dei flavonoidi
Plasmide di A. tumefaciens
Piante non trasformate
genisteina
n
IFS1
Piante che sovraesprimono il
gene IFS1
Via biosinte.ca degli isoflavoni Sovra-­‐espressione del gene IFS in combinazione con altri geni della via biosinte.ca degli isoflavoni antisenso
Sintesi di genisteina in piante transgeniche di petunia, tabacco e la<uga Contenuto in genisteina in fruA di pomodoro che sovraesprimono il gene IFS • Ci vediamo Lunedi’ 25 Novembre Sovra-­‐espressione del gene OsNAS in piante di riso ed aumento del contenuto in ferro e zinco nell’endosperma Nico>anamine (NA), un agente chelante è presente ubiquitariamente nelle piante superiori. Nelle gramininacee è un precursoree dei fitosiderofori, sostanze che sono rilasciate nel suolo dall’apparato radicale e che facilitano l’assorbimento del ferro dal suolo acquisi>on. Il gene (OsNAS1), che codifica una nicotianamine
sintasi è stato fuso al promotore di una proteina
seme –specifica (la glutelina) ed usato per
trasformare piante di riso
Concentrazione di ferro e zinco in cariossidi di riso di piante che sovraesprimono il gene OsNAS L’ Apo-lipoproteina A-I è la maggiore componente proteica delle
liporpoteine ad alta densità (HDL= nel plasma
questa lipoproteina promuove l’efflusso del colesterolo dai tessuti
verso il fegato per la secrezione.
Piante transgeniche di promodoro che esprimono il peptide mimetico 6F
dell’apo-lipoproteina apoA-I.
Topi knock-out incapaci di rimuovere
lipoproteine di tipo LDL sviluppano
infiammazioni e aterosclerosi con dieta
ad alto contenuto in grassi
ApoA-I mimetics: tomatoes to the rescue
J. Lipid Res. 2013 54:(4) 878-880. First
Published on March 7, 2013,
Questi topi alimentati con pomodori che
esprimono il peptide mimetico 6F hanno
• più bassi livelli di infiammazione
• livelli più alti di HDL
• bassi livelli di acido liso-fosfatidico, che
promuove e accelera la formazione di
placche nelle arterie
Omega-­‐3 Canola and Soybean oil Scientific Progress
 Multi-gene
Non-­‐transgenic ω-­‐3 90
80
Fatty Acid (wt%)
expression
 Soybean transformation
 Omega-3 oil production
100
70
60
50
40
30
Canola
Soybean
Steari-­‐
New
biodonic available
acid Omega-3
18:4 Other polyunsaturates
Monounsaturates
20
10
0
Saturates
Control Biotech
Control
Biotechin CVD
Omega-3
Deficiency
Implicated
Echium oil, derived from the seeds of Echium Plantagineum, is enriched in stearidonic acid (SDA; 18:4 ω-­‐3), which is the immediate product of Δ-­‐6 desatura.on of 18:3 ω-­‐3 to 18:4 Contenuto in LCP-­‐UFA in salmone e in differen. piante transgeniche Ingegneria genetica e riduzione di allergeni /fattori antinutrizionali Benefici
Prodotto genico
Specie
Target
riso
allergeni
della farina
loglio
allergene
del polline
riduzione di asma
e febbre da fieno
lol p 5
antisenso
patata
glicoalcaloidi
riduzione
tossicità tubero
solanidina-glucosil
trasferasi
antisenso
proteina allergenica
riduzione di
di 16 kDa
asma ed eczema
Tecnologia
antisenso
Piante transgeniche di pomodoro con rallentata maturazione del fru<o Sintesi dell’e.lene LB
isadisso CCA
promotore S35-­‐ CaMV
nos
nptII
an.senso
piante di pomodoro Giorni Ormone della maturazione del fru<o, induce geni che codificano per enzimi degrada.vi 5’ 3’ mRNA 5’ Formazione di un duplex 3’ mRNA an.senso Traduzione bloccata Giorni 50 57 53 66 55 68 57 70 60 73 63 76 65 79 73 97 GENE GENE E.lene -­‐ + RB
Soia
Quantità di lisina
Quantità di acidi grassi poli-insaturi
Colza
Contenuto in acido erucico
Caffè
Contenuto in caffeina
Pomodoro
aumento di antiossidanti
(licopene etc)
Sono in corso ricerche per aumentare
il contenuto di sostanze nutriceutiche
di molte piante alimentari
Per la presentazione ppt
Usare font arial
dimensione 24-28 per i titoli
dimensione 18-20 per il testo
Scegliere la combinazione colore sfondo /testo
evitare diapositive affollate
Trasformazione genetica delle piante
T-DNA selvatico
T-DNA recombinante
Organizzazione di un gene
Gene
Promotore
DNA
Sequenza codificante l’RNA
5’
3’
Terminatore
3’
5’
Sito di inizio della
trascrizione
Sito di terminazione
della trascrizione