Thymune [IT] - Thermo Fisher Scientific

Thymune*-T
IT
1. FINALITÀ D’USO
Il kit Thymune*-T è utilizzato per la determinazione
semiquantitativa degli auto-anticorpi diretti verso la tireoglobulina
umana (auto-anticorpi tiroidei).
2. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Il test sfrutta la tecnica di emoagglutinazione passiva di Boyden,
usata per la prima volta da Witebsky e Rose8 per la rilevazione
di anticorpi anti-tireoglobulina. Emazie sensibilizzate con
tireoglobulina agglutinano in presenza dell’auto-anticorpo
specifico, formando un tappeto cellulare uniforme sul fondo
del pozzetto di una micropiastra; in assenza di agglutinazione,
le emazie si dispongono ad anello o bottone. In seguito alla
scoperta di anticorpi precipitanti anti-tireoglobulina nel siero di
pazienti affetti da sindrome di Hashimoto6,9, è stato dimostrato
che auto-anticorpi verso differenti costituenti tiroidei1,4 sono
associati a lesioni infiammatorie di tipo distruttivo della ghiandola
tiroidea. Di particolare importanza ai fini diagnostici sono gli
anticorpi verso due di tali costituenti: la tireoglobulina e l’antigene
microsomiale3, 5, 7.
3. PRINCIPIO DEL METODO
Proteine come la tireoglobulina si possono facilmente legare alla
superficie di eritrociti preventivamente trattati con acido tannico.
La tireoglobulina - estratta da tiroide umana con le tecniche
classiche di precipitazione salina e coniugata con eritrociti di
tacchino tannati - costituisce un sistema in emoagglutinazione
per la determinazione di bassi livelli di auto-anticorpi antitireoglobulina. Una piccola percentuale di sieri umani reagisce
con le emazie di tacchino dando luogo ad agglutinazione
aspecifica delle emazie sensibilizzate. Tali reazioni aspecifiche
possono essere evidenziate utilizzando Emazie di controllo non
sensibilizzate. Sia le Emazie test che le Emazie di controllo sono
trattate con formalina e liofilizzate per assicurare una stabilità di
lungo termine durante la conservazione.
4. REAGENTI
il materiale solido eventualmente adeso al tappo di gomma.
Togliere delicatamente il cappuccio e il tappo di gomma.
Addizionare 3 ml di acqua distillata. Richiudere il flacone con
il tappo di gomma e agitare per favorire la dispersione del
reagente. Lasciare riposare il flacone in posizione verticale fino a
quando il contenuto apparirà completamente dissolto; agitarlo
quindi ulteriormente per inversione, per garantire una completa
miscelazione. Per un rendimento ottimale del test, le emazie
dovrebbero essere ricostituite almeno 30 minuti prima dell’uso.
Dopo la ricostituzione, le sospensioni di emazie rimangono
stabili per 5 giorni, se conservate a 2-8°C. Se è necessaria una
conservazione più prolungata (fino a un mese), la sospensione di
Emazie test può essere congelata a -15/-25°C e scongelata una sola
volta. Le Emazie di controllo possono essere distribuite in aliquote
di piccolo volume e conservate congelate a -15/-25°C fino a 18
mesi. Il Diluente e i Sieri di controllo devono essere conservati
sempre a 2-8°C. Evitare la contaminazione batterica del Diluente
e dei Sieri di controllo durante l’uso.
Emazie test
Emazie di controllo
Diluente
Siero di controllo positivo
Siero di controllo negativo
Istruzioni per l’uso
Ciascun flacone di Emazie test contiene
un Iiofilizzato equivalente a 3 ml di una
sospensione all’1% di eritrociti di tacchino
tannati, trattati con aldeide, rivestiti con
tireoglobulina umana e sospesi in una
soluzione fosfato tamponata a pH 7,2
contenente il 5% di saccarosio, l’1,5% di
siero normale di coniglio e Io 0,01% di
Bronopol.
COMPONENTI DEL KIT
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Emazie test
Ciascun flacone di Emazie di controllo
contiene un liofilizzato equivalente a 3 ml
di una sospensione all’1% di eritrociti
di tacchino tannati, trattati con aldeide
e sospesi in una soluzione fosfato
tamponata a pH 7,2 contenente il 5%
di saccarosio, l’1,5% di siero normale di
coniglio e Io 0,01% di Bronopol.
5 flaconi (tappo bianco)
1 flacone (tappo bianco)
2 flaconi (tappo bianco)
1 flacone (tappo rosso)
1 flacone (tappo blu)
1
Diluente
Ciascun flacone contiene 25 ml di
soluzione salina isotonica contenente
siero umano normale negativo per HBsAg
e per gli anticorpi diretti verso i virus HIV1, HIV-2 e HCV, siero normale di tacchino
e lo 0,1% di sodio azide. Le quantità di
sieri addizionate sono variabili e studiate
in modo tale da garantire risultati
ottimali con ciascun lotto di emazie
sensibilizzate: si raccomanda pertanto di
non usare componenti di un kit con quelli
provenienti da altri kit.
5. DESCRIZIONE DEI REAGENTI, PREPARAZIONE PER
L’USO E RACCOMANDAZIONI PER LA CONSERVAZIONE
Fare riferimento anche alla sezione Avvertenze e precauzioni
di impiego.
Prima della ricostituzione, se conservati a 2-8°C, i reagenti
mantengono la loro attività almeno fino alla data indicata sulla
confezione.
Le Emazie test e le Emazie di controllo devono essere ricostituite con
3 ml di acqua distillata seguendo le istruzioni riportate di seguito.
Picchettare delicatamente il flacone sul banco di lavoro per rimuovere
Emazie di controllo
Siero di controllo positivo
Un flacone contiene 1,0 ml di siero antitireoglobulina di pecora con un titolo di
emoagglutinazione con le Emazie test
pari a 1/640 circa. Le Emazie di controllo
mostreranno assenza di agglutinazione
a qualsiasi diluizione. Il siero contiene lo
0,1% di sodio azide.
Siero di controllo negativo
Un flacone contiene 1,0 ml di siero
umano normale, negativo per HBsAg e
per gli anticorpi diretti verso i virus HIV1, HIV-2 e HCV, che non deve causare
agglutinazione delle Emazie test e delle
Emazie di controllo ad alcuna diluizione.
Il siero contiene lo 0,1% di sodio azide.
6. AVVERTENZE E PRECAUZIONI DI IMPIEGO
Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
Esclusivamente per uso professionale.
Per informazioni su componenti potenzialmente pericolosi, fare
riferimento alle schede di sicurezza fornite dal produttore e alle
informazioni riportate sulle etichette dei prodotti.
PRECAUZIONI DI SICUREZZA
ATTENZIONE: questo kit contiene componenti di origine umana.
Nessuno dei metodi analitici conosciuti può garantire in modo
assoluto che un prodotto derivato da materiale umano non possa
trasmettere infezioni. Pertanto, tutti i materiali oli origine umana
devono essere considerati potenzialmente infettivi. Si raccomanda
di trattare questi reagenti e i campioni di origine umana secondo
le norme di buona pratica di laboratorio (GLP). Il siero umano
normale utilizzato per la produzione del Diluente e del Controllo
negativo, sottoposto a screening per HBsAg e per gli anticorpi
diretti verso i virus HIV-1, HIV-2 e HCV, ha fornito risultati negativi.
1. Il Diluente e i Sieri di controllo positivo e negativo
contengono sodio azide allo 0,1%, che è classificata dalle
Direttive della Comunità Economica Europea (CEE) in
applicazione come nociva (Xn). Di seguito sono riportate le
appropriate frasi di Rischio (R) e di Sicurezza (S).
Xn
R22
Nocivo per ingestione
R32
A contatto con acidi libera gas molto
tossico
S35
Non disfarsi del prodotto e del
recipiente se non con le dovute
precauzioni
S36
Usare indumenti protettivi adatti
S46
In caso d’ingestione consultare
immediatamente il medico e mostrargli
il contenitore o l’etichetta.
L e azidi possono reagire con rame e piombo presenti nelle
condutture di scarico e dare luogo alla formazione di sali
esplosivi. Sebbene le quantità di azidi utilizzate in questo kit
siano minime, si raccomanda di far defluire nelle condutture di
scarico i materiali contenenti azidi con molta acqua corrente.
PRECAUZIONI ANALITICHE
1. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
2. Prima dell’uso pulire le micropiastre con un panno per ridurne
l’interferenza statica.
3. Prima dell’uso tutti i reagenti e i campioni devono essere
riportati a temperatura ambiente (18-30°C). Immediatamente
dopo l’uso riportare i reagenti alla temperatura raccomandata
per la conservazione.
4. Tutti i test devono essere eseguiti a temperatura ambiente
(18-30°C).
5. Sebbene i test possano essere eseguiti sia in micropiastre
confondo a “U” che in quelle con fondo a “V”, nei test eseguiti
su tutti i lotti per confermare le caratteristiche di rendimento
Remel utilizza micropiastre con fondo a “U”. Qualora si scelga
di utilizzare i pozzetti con fondo a “V”, si raccomanda di
acquisire familiarità con gli schemi di reazione manifestati
da tali micropiastre.
6. Non utilizzare micropiastre con fondo a “UV”.
7. Per la titolazione dei campioni si suggerisce, quando possibile,
l’impiego delle micropipette poiché forniscono risultati più
accurati e attendibili rispetto ai microdiluitori. Se si utilizzano
microdiluitori, verificare con attenzione l’accuratezza
volumetrica.
7. RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
Prima dell’esecuzione del test, il sangue prelevato mediante
venopuntura deve essere lasciato coagulare naturalmente e il
siero così ottenuto chiarificato mediante centrifugazione. Se
prima dell’esecuzione del test è necessario conservare i campioni,
questi devono essere mantenuti congelati a -15/-25°C. Evitare
congelamenti e scongelamenti ripetuti. Prima del test, i campioni
di siero devono essere inattivati mediante riscaldamento a 56°C
per 30 minuti.
I campioni di plasma non sono idonei per questo test.
8. PROCEDURA
MATERIALI FORNITI
Nel kit sono forniti materiali sufficienti per 50 test (fare riferimento
alla sezione Componenti del kit).
MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
Oltre alle attrezzature normalmente presenti in laboratorio,
sono necessari:
1. Mlcropiastre riutilizzabili o monouso con pozzetti con fondo
a “U” o a “V”.
2. Contagocce da 0,025 ml.
3. Micropipetta (multicanale) o microdiluitori da 0,025 ml.
9. PROCEDURA DEL TEST
Thymune*-T - Procedimento
Per ogni campione o controllo in esame, è necessaria una fila
completa (pozzetti da 1 a 12) della micropiastra. I Sieri di controllo
positivo e negativo devono essere inclusi in ogni seduta analitica
e trattati come i campioni di siero. Questi ultimi devono essere
inattivati mediante riscaldamento a 56°C per 30 minuti.
Fase 1
Con un contagocce standard da 0,025 ml, dispensare 4 gocce di
diluente nel pozzetto 1 e una goccia nei pozzetti 2-12.
Fase 2
10. RISULTATI
LETTURA DEI RISULTATI
In caso di risultato positivo, le emazie sensibilizzate sono
agglutinate dall’anticorpo e sedimentano sul fondo del pozzetto
formando un tappeto uniforme. In caso di risultato negativo, le
emazie si dispongono sul fondo del pozzetto formando un piccolo
anello o un bottone compatto. Reazioni debolmente positive
possono mostrare schemi intermedi. Per punto finale si intende la
più alta diluizione del campione che determina un’agglutinazione
di circa il 50% delle Emazie test. A volte può essere osservato un
effetto prozona (uno o più pozzetti mostranti un’inattesa, debole
agglutinazione) alle basse diluizioni di sieri fortemente positivi; per
evitare errori, tali risultati devono essere interpretati con cautela.
Se alla diluizione finale di 1/5120 è presente un’agglutinazione
completa, preparare una diluizione 1/100 del siero in diluente (in
dotazione) e titolare come un siero normale. Se non si ottiene un
punto finale, ripetere la titolazione con una diluizione più alta,
per es.: 1/1000.
Tipici risultati ottenuti con Thymune*-T
Pipettare 0,025 ml di siero nel pozzetto 1. Usando una
micropipetta o un microdiluitore, mescolare delicatamente il
contenuto e trasferirne 0,025 ml nel pozzetto 2 (pozzetto del
siero di controllo). Eliminare 0,025 ml dal pozzetto 2.
Fase 3
Diluizione
Con una micropipetta con puntale pulito o con un
microdiluitore trasferire 0,025 ml dal pozzetto 1 aI pozzetto
3, mescolare e trasferire 0,025 ml al pozzetto 4. Continuare le
diluizioni su base due fino al pozzetto 12. Eliminare 0,025 ml
dal pozzetto 12.
Fase 4
Aggiungere immediatamente 0,025 ml di emazie di controllo
nel pozzetto 2 e 0,025 ml di emazie test nei pozzetti 3-12.
Fase 5
Mescolare il contenuto dei pozzetti, ponendo la piastra
su un agitatore per micropiastre per almeno 30 secondi o
picchiettandola leggermente su tutti e quattro i lati.
ATTENZIONE: una miscelazione inadeguata o l’uso di un
agitatore a velocità troppo bassa causano la formazione di
schemi irregolari e una minore sensibilità.
Coprire la piastra con un coperchio per evitare l’evaporazione
e la contaminazione. Lasciare riposare la piastra a temperatura
ambiente (18-30°C), al riparo dalla luce solare diretta,
su un piano non sottoposto a vibrazioni.
Leggere dopo 30 – 60 minuti.
L’illustrazione mostra otto titolazioni in micropiastra con
pozzetti con fondo a “U”. La titolazione è stata eseguita
utilizzando micropipette. Il secondo pozzetto di ogni fila
contiene Emazie di controllo con siero diluito 1/10. I pozzetti
da 3 a 12 contengono diluizioni su base due del siero (da 1/10
a 1/5120) ed Emazie test.
Fila A – Positivo 1/320
Fila E – Positivo 1/1280
Fila B – Negativo
Fila F – Negativo
Fila C – Positivo 1/160
Fila G – Positivo 1/640
Fila D – Positivo 1/20 – 1/40
Fila H – Positivo 1/40
11. CONTROLLO DI QUALITÀ
Il Pozzetto di controllo (colonna 2) deve risultare sempre negativo.
Reazioni eterofile anti-tacchino sono rare a diluizioni 1/10 o
superiori, ma se si osserva agglutinazione nel pozzetto di controllo,
il campione di siero deve essere adsorbito mescolando 0,1 ml di
siero con 0,5 ml della sospensione di Emazie di controllo. Agitare
il preparato, lasciare a riposo per 10 minuti e quindi separare per
centrifugazione il siero adsorbito.
Ripetere il test sul siero adsorbito.
I Sieri di controllo positivo e negativo sono forniti per assicurare
il corretto funzionamento delle sospensioni di Emazie test e di
controllo. Il Controllo negativo non deve causare agglutinazione
ad alcuna diluizione, mentre il Controllo positivo deve causare
agglutinazione a una diluizione di almeno 1/640 (in pozzetti con
fondo a “U”) +/- una diluizione in base due. I titoli osservati nelle
piastre con pozzetti con fondo a “V” sono di solito lievemente più
alti. Se non si ottiene un titolo accettabile con il Siero di controllo
positivo, il test non ha mostrato la sensibilità attesa e deve, di
conseguenza, essere ripetuto.
Reazioni diverse da quelle descritte indicano un’alterazione
delle Emazie test o delle Emazie di controllo, oppure una
contaminazione del Diluente.
12. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
I test basati sull’emoagglutinazione passiva (HA) per la
determinazione degli auto-anticorpi antitireoglobulina sono
circa 1.000 volte più sensibili del test con le precipitine. I pazienti
affetti da sindrome di Hashimoto con siero positivo per le
precipitine mostrano titoli HA che variano da 640 a diversi milioni.
L’associazione dei test di emoagglutinazione tireoglobulinica e
microsomiale è in grado di mettere in evidenza praticamente tutti
i casi di gozzo di Hashimoto e circa il 90% dei casi di mixedema
primario. I due test devono essere eseguiti in associazione in tutti
i casi di gozzo proposti per un intervento chirurgico poiché non è
sempre possibile distinguere clinicamente la tiroidite autoimmune
da altri tipi di gozzo. Un’altra importante applicazione dei due test
per la ricerca degli auto-anticorpi tiroidei è costituita dalla diagnosi
differenziale tra tireotossicosi primaria e tachicardie di diversa
origine, stati ansiosi, dimagrimento inatteso o diarrea. Nei casi di
esoftalmo monolaterale i test saranno di ausilio nella distinzione
tra un’eziologia endocrina e lesioni locali a carico dell’orbita,
eliminando la necessità di esami maggiormente invasivi e costosi.
In circa il 70-90% dei casi con varianti della malattia di Graves, si
ottengono titoli positivi ai test di emoagglutinazione microsomiale
e/o tireogIobulinica, in confronto al 10-15% dei controlli su
soggetti di uguale età e sesso.
Sebbene la maggior parte dei pazienti con tireotossicosi mostri
livelli relativamente bassi di anticorpi, circa il 20% presenta
titoli moderati o alti (tireoglobulina > 1/640, microsomiale >
1/6400): ciò è indice o di una forma più grave della malattia con
tendenza a ricadute, o di una concomitante tiroidite distruttiva
predisponente al mixedema post-operatorio o, infine, di perdita
spontanea della funzione tiroidea dopo pochi anni dalla comparsa
dell’episodio tireotossico. In modo analogo, l’emoagglutinazione
tireoglobulinica associata con quella microsomiale permette di
differenziare tra tiroidite atrofica con grave o lieve ipotiroidismo
e casi di depressione o obesità di altra origine. Risultati positivi
con questi due test non sono sufficienti a escludere il cancro della
tiroide, né bassi titoli (tireoglobulina < 1/160, microsomiale <
1/1600) sono sempre indicativi di gravi lesioni alla tiroide poiché
molti casi di “tiroidite focale” non sono clinicamente evidenti e
non hanno carattere progressivo. In caso di risultato positivo,
sono necessari ulteriori esami come la scintigrafia tiroidea per
il sospetto di tumore, il test del TRH per la funzionalità tiroidea
e la valutazione del livello di TSH nel siero in caso di sospetto
ipotiroidismo: la scelta del test dipende dal quadro clinico.
I test di emoagglutinazione tireoglobulinica e microsomiale
forniscono un’utile evidenza predittiva di possibile disfunzione
tiroidea in pazienti affetti da altri disordini endocrini autoimmuni
come il morbo di Addison, il diabete mellito insulino-dipendente
o autoimmunopatie poliendocrine, e in componenti di famiglie
con tendenza a malattie autoimmuni organo-specifiche.
13. LIMITI DEL METODO
Campioni di plasma o di siero infetti non sono idonei per il test.
14. RISULTATI ATTESI
Fare riferimento alla sezione Interpretazione dei risultati.
15. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
Un confronto tra la sensibilità di Thymune*-T e la tecnica di
emoagglutinazione con emazie di pecora è stato condotto
esaminando i sieri di 158 pazienti affetti da gozzo di Hashimoto,
mixedema primario o tireotossicosi. Si è riscontrata una buona
correlazione tra i due sistemi con titoli compresi tra < 1/10 e >
1/51202.
L’esame di un pannello di sieri provenienti da donatori di sangue
sani ha evidenziato un’incidenza di risultati positivi pari al 4%,
con titoli nella maggior parte dei casi pari a 1/202.
I reagenti sono accuratamente controllati per assicurare la
riproducibilità dei risultati tra lotti diversi. Ogni lotto di Emazie
test è preparato in modo da fornire titoli sovrapponibili se
confrontato con un pannello di sieri contenenti livelli noti di
auto-anticorpi, con una tolleranza non superiore a una diluizione
in base due. La riproducibilità da lotto a lotto è stata dimostrata
sottoponendo al test 12 campioni in 3 occasioni e utilizzando tre
lotti di reagenti diversi. Ciascun campione ha mostrato risultati
sovrapponibili nell’ambito di un range di +/- una diluizione in
base due in tutte le determinazioni2,10.
BIBLIOGRAFIA
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9
Witebsky, E., Rose, N.R., et al (1957). Chronic thyroiditis and
autoimmunization. J. Amer. med. Ass., 164, 1439.
10
I dati sono disponibili.
1
2
CONFEZIONE
AD12/R30850601..................................50 test
Legenda dei simboli
Numero di codice
Dispositivo medico per la diagnostica in vitro
Consultare le Istruzioni per l’uso (IFU)
Limiti di temperatura (Temp. conservazione)
Numero di lotto
Data di scadenza
Attenzione: consultare la documentazione
allegata
fabbricante
*marchio registrato
X7812 rivista Agosto 2012
Remel Europe Ltd
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT
UK
Per l’assistenza tecnica, rivolgersi al distributore di zona.