Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Codice

Dako
Liquid DAB+ Substrate
Chromogen System
Codice K3467
Uso previsto
Per uso diagnostico In Vitro.
Questo sistema substrato-cromogeno è un sistema DAB ad elevata sensibilità, idoneo all'uso con i metodi di
colorazione basati sulla perossidasi nelle tecniche immunoistichimiche (IHC) e di ibridazione in situ (ISH). Per
effetto dell'ossidazione, il sistema DAB forma un prodotto finale marrone in corrispondenza del sito
dell'antigene o dell'acido nucleico bersaglio.1
Fare riferimento alla sezione “General Instructions for Immunohistochemical Staining” e/o alla sezione
“Istruzioni” relativa al sistema di rivelazione in uso per: (1) Principio della procedura, (2) Materiali necessari ma
non forniti, (3) Conservazione, (4) Preparazione dei campioni, (5) Procedura per la colorazione, (6) Controllo
della qualità, (7) Risoluzione dei problemi, (8) Interpretazione dei risultati, (9) Limiti generali.
Reagente fornito
Codice K3467
Sono forniti i materiali elencati di seguito, sufficienti per preparare 15 ml di soluzione substrato-cromogeno. Le
quantità indicate assicurano la colorazione di almeno 50 campioni.
Quantità
1x1ml
Descrizione
DAB Chromogen (cromogeno DAB)
3,3'-diamminobenzidina in soluzione cromogena.
1x15 ml
Substrate Buffer (tampone substrato)
Tampone imidazolo-HCl a pH 7,5 contenente perossido di idrogeno e un agente antibatterico.
Precauzioni
1. Per uso professionale.
2. Il cromogeno DAB e il tampone substrato sono sensibili alla contaminazione ad opera di molteplici agenti
ossidanti, quali metalli, batteri, polvere e strumenti di vetro comunemente usati in laboratorio. Per impedire
la contaminazione e la scadenza prematura dei reagenti, evitare il contatto con potenziali fonti di
contaminazione.
3. Per impedire la contaminazione, non pipettare il cromogeno DAB e il tampone substrato direttamente dai
flaconi. Erogare prima i volumi necessari in contenitori puliti, quindi pipettare dai contenitori. Non rimettere
la soluzione inutilizzata nei contenitori originali.
4. Evitare di conservare I componenti DAB o eseguire la colorazione in condizioni di luce intensa, ad esempio
sotto la luce diretta del sole.
5. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, così da evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
6. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
7. Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti.
Pericolo
Cromogeno liquido DAB+: 1-5% Biphenyl-3,3’,4,4’-tetrayltetraammonium tetrachloride
H350
Può provocare il cancro.
H341
Sospettato di provocare alterazioni genetiche.
P201
Procurarsi istruzioni specifiche prima dell’uso.
P202
Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze.
P280
Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del
viso. Indossare indumenti protettivi.
P308 + P313
IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Richiedere assistenza medica.
P405
Conservare sotto chiave.
P501
Smaltire il prodotto e il recipiente secondo ogni regolamento locale, regionale,
nazionale e internazionale.
(126061-001)
P04040IT_01/K3467/2015.04 p. 1/3
Conservazione
Conservare il sistema DAB Substrate-Chromogen a 2–8 °C nel contenitore originale.
Non sono stati osservati segnali evidenti che suggeriscano l’instabilità di questi prodotti. Pertanto è opportuno
analizzare un controllo positivo e un controllo negativo contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Qualora
si ottenga una colorazione imprevista, cioè non giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio
ma dovuta ad un probabile problema del kit per analisi, contattare l’Assistenza Tecnica Dako.
Preparazione dei
campioni
Prima che la colorazione IHC abbia luogo, i tessuti devono essere fissati e trattati. La fissazione impedisce
l’autolisi e la putrefazione dei tessuti asportati, preserva l’antigenicità, migliora l’indice di rifrazione dei
costituenti del tessuto e aumenta la resistenza degli elementi cellulari al trattamento del tessuto. Il tessuto
viene sottoposto a disidratazione, diafanizzazione degli agenti disidratanti, infiltrazione di mezzi inclusivi,
inclusione e infine sezionamento. I fissativi più comuni per i preparati di tessuto destinati alle procedure IHC
sono descritti nella sezione “General Instructions for Immunohistochemical Staining”. Queste informazioni sono
fornite esclusivamente come linee guida. Le procedure ottimali dovranno essere definite e verificate dall’utente.
Preparazione del
reagente
Aggiungere 1 goccia (o 20 µl) del cromogeno DAB per ogni ml di tampone substrato. Utilizzare la provetta
graduata fornita con il kit per misurare la quantità di tampone substrato necessaria. Mescolare con cura e
applicare la soluzione utilizzando la pipetta fornita con il kit. Dopo l'uso, lavare accuratamente la provetta per
analisi graduata e la pipetta con acqua distillata. La soluzione di lavoro substrato preparata (CHROM) deve
essere conservata a una temperatura di 2–8°C e deve essere utilizzata entro 5 giorni.
Procedura
Per eseguire le procedure di colorazione IHC e ISH, è necessario immergere i campioni in un bagno tampone
dopo l'incubazione con il reagente HRP. Al termine del bagno, rimuovere il tampone in eccesso e asciugare
con cura il vetrino attorno al campione.
1. Ricoprire il campione con la soluzione DAB. Incubare per 5–30 minuti. Se lo si desidera, è possibile
eseguire l'incubazione con il sistema DAB Substrate-Chromogen a temperature più alte della temperatura
ambiente.
2. Sciacquare delicatamente con acqua distillata.
3. Se lo si desidera, è possibile applicare la colorazione di contrasto.
4. Applicare un vetrino coprioggetti con un mezzo di montaggio acquoso o permanente.
Per quanto riguarda il metodo con vetrini "capillary gap", osservare le seguenti raccomandazioni:
1. Non è necessario aggiungere detergenti al sistema substrato-cromogeno per ridurre la tensione
superficiale.
2. Tirare su il sistema DAB Substrate-Chromogen per 20–30 secondi, quindi schizzare la soluzione. Tirare su
almeno due volte prima di incubare per 5–30 minuti.
Risultati
Nell procedure IHC e ISH, il sistema DAB Substrate-Chromogen genera un prodotto finale della reazione di
colore marrone, in corrispondenza del sito dell'antigene o dell'acido nucleico bersaglio.
Per una corretta interpretazione dei risultati, è necessario includere controlli positivi e negativi in ogni ciclo di
colorazione. I controlli positivi rivelano se i campioni sono stati trattati e analizzati in maniera corretta. I controlli
negativi sono utili nella valutazione della colorazione aspecifica. Se presente, la colorazione aspecifica
apparirà piuttoso diffusa.
Limiti
Le attività di perossidasi endogena e di pseudoperossidasi, riscontrabili nelle emoproteine quali l'emoglobina,
la mioglobina, il citocromo e la catalasi, oltre che negli eosinofili, possono produrre risultati falsi-positivi.2,3
Se il tessuto è stato fissato in formalina, è possibile inibire questa attività incubando il tessuto in perossido di
irdogeno al 3% per cinque minuti, prima di applicare l'anticorpo primario o la sonda. Gli strisci di midollo osseo
o sangue e le sezioni di tessuto congelato possono essere trattati con Peroxidase Blocking Reagent (codice
S2001). Questa procedura non elimina comunque il pigmento rossiccio-marrone delle emoproteine. È possibile
utilizzare anche una soluzione di metanolo-perossido di idrogeno, tuttavia alcuni antigeni potrebbero subire
una denaturazione con questa procedura.
Bibliografia
1. Graham RC and Karnovsky MJ. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the
proximal tubules of mouse kidney: ultra-structural cytochemistry by a new technique. J Histochem
Cytochem 1966; 14:291
2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells.
J Histochem Cytochem 1987; 35:213
3. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press.
1990; 46
(126061-001)
P04040IT_01/K3467/2015.04 p. 2/3
Edition 04/15
(126061-001)
P04040IT_01/K3467/2015.04 p. 3/3