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G It Diabetol Metab 2008;28:55-64
Lavoro originale
L’R+-acido lipoico accelera
la guarigione delle ulcere diabetiche
sottoposte a terapia iperbarica:
modulazione dei fattori
coinvolti nell’angiogenesi
e nel rimodellamento tessutale
RIASSUNTO
1
2
3
R. Alleva , M. Tomasetti , D. Sartini ,
M. Emanuelli3, F. Di Donato4, B. Borghi1,
E. Nasole4
1
Dipartimento di Anestesia, IRCCS Istituti Ortopedici
Rizzoli, Bologna; 2Dipartimento di Patologia Molecolare e
Terapie Innovative, Università Politecnica delle Marche,
Ancona; 3Istituto di Biochimica e Biotecnologie, Università
Politecnica delle Marche, Ancona; 4Centro di Medicina
Iperbarica, Bologna
Corrispondenza: dott.ssa Renata Alleva,
Dipartimento di Anestesia, IRCCS Istituti Ortopedici
Rizzoli, via GC Pupilli 1, 40136 Bologna
e-mail: [email protected]
G It Diabetol Metab 2008:28:55-64
Pervenuto in Redazione il 17-10-2007
Accettato per la pubblicazione il 04-03-2008
Parole chiave: R+-acido lipoico, matrice extracellulare,
angiogenesi, ossigeno iperbarico, ulcere diabetiche
Key words: R+-lipoic acid, extracellular matrix,
angiogenesis, hyperbaric oxygen, diabetic wounds
L’ulcera diabetica cronica è caratterizzata da una persistente
infiammazione che determina un’alta concentrazione di proteasi. Le proteasi degradano diversi fattori di crescita e proteine
della matrice extracellulare che sono essenziali per il normale
processo di guarigione. La terapia iperbarica rappresenta tutt’oggi un approccio terapeutico alternativo. In questo studio, è
stato valutato l’effetto dell’R+-acido lipoico in pazienti affetti da
ulcere diabetiche croniche sottoposti a terapia iperbarica.
Mediante tecnica ELISA, è stata valutata la concentrazione tessutale e plasmatica dei fattori coinvolti nell’angiogenesi e nel
rimodellamento della matrice extracellulare. Pazienti sottoposti a
terapia iperbarica sono stati inclusi in due gruppi, gruppo R+acido lipoico e gruppo placebo. La concentrazione proteica è
stata valutata in biopsie effettuate alla prima sessione di trattamento iperbarico (T0), alla quinta sessione (T1) e dopo 10 giorni
di trattamento iperbarico (T2). La supplementazione con R+acido lipoico in combinazione con il trattamento iperbarico inibisce lo stato infiammatorio cronico modificando i livelli
proteasi/antiproteasi nel microambiente della ferita. La diminuzione dei livelli di metalloproteasi-9 (MMP9) e l’aumento della
concentrazione della metalloproteasi-2 (MMP2) e del fattore di
crescita piastrinico (PDGF-BB) contribuiscono ad accelerare il
processo di riparazione e guarigione della ferita. Dall’analisi clinica si evidenzia che la somministrazione di R+-acido lipoico
determina una significativa riduzione della ferita rispetto al solo
trattamento iperbarico (rispettivamente, 40,8 ± 37,2% vs 5,7 ±
43,3%, p = 0,02 osservato dopo 42 giorni di trattamento). In
conclusione, l’acido R+-lipoico contribuisce alla distruzione del
“loop autocrino positivo” che mantiene lo stato cronico della ferita, determinando la progressione del processo di guarigione.
56
R. Alleva et al.
SUMMARY
R+-lipoic acid accelerates healing process of diabetic ulcers
treated with hyperbaric oxygen therapy: modulation of factors
involved in the angiogenesis and tissue remodeling
Chronic diabetic ulcer is characterised by a persistent inflammation followed by a high proteases concentration. Proteases
lead to the degradation of growth factors and proteins of extracellular matrix which are important in the normal healing
process. Up to date, the hyperbaric oxygen (HBO) therapy represents an alternative therapeutic approach. In this study, has
been evaluated the effect of R+-lipoic acid in patients affected
by chronic diabetic ulcers underwent to HBO therapy. By
ELISA technique, the tissue and plasmatic concentration of
factors involved in the angiogenesis and extracellular matrix
remodelling have been evaluated. Patients underwent HBO
therapy were included in two groups, the R+-lipoic acid group
and the placebo group. Protein expression profiles for extracellular matrix and angiogenesis mediators were evaluated in
biopsies and plasma samples collected at the first HBO session (T0 ), at the 5th HBO session (T1 ) and after 10 days of HBO
treatment (T2 ). R+-LA supplementation in combination with
HBO therapy inhibits the chronic inflammatory state, changing
the protease/anti-protease levels within the wound microenvironment. Decrease in the metalloproteinase-9 (MMP9) expression and the increase of metalloproteinase-2 (MMP2) together
with increased levels of the piastrinic growth factor (PDGF-BB),
significantly contribute to acceleration of the dermal wound
repair process. Clinical analysis of the wounds show that R+lipoic acid supplementation significantly reduce the wound area
respect to the HBO treatment only (40.8 ± 37.2% vs 5.7 ±
43.3%, p = 0.02, respectively at day 42 of the treatment). In
conclusion, R+-lipoic acid contributes to the disruption of the
“positive autocrine feedback loops” that maintain the chronic
wound state promoting the progression of the healing process.
Introduzione
Le ulcere del piede diabetico rappresentano un importante
problema poiché sono associate a una significativa morbosità e mortalità1-5, pertanto, il trattamento e la cura di tali ulcere rappresentano a tutt’oggi un importante problema clinico6. Le interazioni molecolari coinvolte nella mal cicatrizza-
Ulcera del piede diabetico
• Eventi traumatici ripetuti
• Detriti/frammenti cellulari
• Tossine batteriche
Trattamento OTI
• Aumento della risposta infiammatoria
• Invasione dei macrofagi e neutrofili
Attivazione dei macrofagi attraverso
citochine e fattori di crescita
R+-ACIDO LIPOICO
Cellule infiammatorie e fibroblasti
Serina-proteasi
MMPs
TIMPs
Degradazione della matrice, dei fattori di crescita e dei loro recettori
FERITA CRONICA
Figura 1 Modello molecolare della fisiopatologia dell’ulcera cronica. Nelle ferite croniche
insorte in seguito a danni ricorrenti o cronici
(i.e. ischemia intermittente), una volta stabilite, si genera un circolo positivo e autocrino
che mantiene lo stato cronico della ferita,
prevenendo la progressione del processo di
guarigione. Il trattamento OTI contribuisce a
inibire l’infezione batterica stimolando la rigenerazione tessutale. L’R+-acido lipoico inibisce lo stato infiammatorio cronico, modificando il rapporto proteasi/antiproteasi a livello di microambiente della ferita. L’interruzione
del circolo positivo e autocrino accelera il
processo di cicatrizzazione.
57
L’R+-acido lipoico accelera la guarigione delle ulcere diabetiche sottoposte a terapia iperbarica
Tabella 1 Caratteristiche cliniche dei soggetti.
Soggetti Sesso Età
Trattamento
Area ulcera
(n)
(M/F) (anni) (lipoico/placebo)
(cm2)
HbA1c
(%)
Patologia
Sede
Terapia
1
F
86
Lipoico
47,9
11,6
Venosa
Gamba
Insulina
2
F
82
Placebo
40,3
8,2
Arteriosa
Gamba
Ipoglic. orale
3
M
80
Placebo
9,0
7,9
Arteriosa
Piede
Insulina
4
F
64
Lipoico
2,3
9,1
Arteriosa
Piede
Insulina
5
F
89
Lipoico
0,09
8,3
Arteriosa
Piede
Insulina
6
F
87
Placebo
2,7
8,6
Arteriosa
Gamba
Ipoglic. orale
7
F
81
Lipoico
2,7
9,3
Arteriosa
Gamba
Ipoglic. orale
8
F
63
Placebo
4,9
8,9
Venosa
Malleolo
Ipoglic. orale
9
M
66
Lipoico
33,9
8,7
Arteriosa
Piede
Insulina
10
F
70
Placebo
7,5
8,4
Arteriosa
Piede
Ipoglic. orale
11
M
71
Placebo
22,9
8,4
Arteriosa
Malleolo
Ipoglic. orale
12
F
79
Placebo
0,06
7,9
Venosa
Piede
Insulina
13
M
74
Lipoico
6,4
8,2
Arteriosa
Piede
Insulina
14
M
77
Lipoico
21,1
11,1
Arteriosa
Piede
Insulina
15
M
71
Lipoico
18,0
9,2
Arteriosa
Piede
Insulina
16
F
70
Placebo
40,9
8,4
Venosa
Gamba
Ipoglic. orale
17
M
69
Placebo
3,2
8,9
Arteriosa
Gamba
Ipoglic. orale
18
F
87
Placebo
8,2
9,1
Venosa
Gamba
Insulina
19
M
68
Lipoico
25,4
8,7
Arteriosa
Gamba
Ipoglic. orale
20
M
72
Lipoico
11,7
7,8
Arteriosa
Piede
Insulina
zione e il passaggio dello stato acuto a quello di ferita cronica hanno maggiormente interessato la ricerca scientifica7-9.
Le ulcere del piede diabetico spesso non cicatrizzano a
causa di persistenti e alti livelli di citochine proinfiammatorie
in sede della ferita, i quali inducono alti livelli di metalloproteinasi (matrix metalloproteinases, MMPs) della matrice extracellulare (extra cellular matrix, ECM). Queste endopeptidasi
zinco-dipendenti10 a loro volta distruggono i fattori di crescita, recettori e proteine della matrice che sono essenziali per
la cicatrizzazione dell’ulcera9-12 (Fig. 1). Le MMPs sono
anche responsabili della frammentazione controllata della
membrana basale, dell’angiogenesi e della epitelizzazione.
Il circolo autocrino positivo feedback loop mantiene lo stato cronico delle ferite, che insorgono in seguito a danni ricorrenti o cronici (i.e. ischemia intermittente), impedendone la guarigione.
Pertanto, per promuovere il processo di guarigione è fondamentale l’interruzione di questo circolo. Recentemente, è stata rivolta
una grande attenzione alla scoperta di nuove molecole o trattamenti in grado di stimolare il processo di cicatrizzazione. In uno
studio svolto precedentemente13, è stato osservato che l’acido
α-lipoico (AL) in associazione all’ossigeno terapia iperbarica (OTI)
contribuiva efficientemente ad accelerare la regressione delle
ulcere croniche, agendo sia da antiossidante sia da modulatore
dell’infiammazione. L’acido α-lipoico viene usato nel trattamento
di varie patologie associate a polineuropatia, tra le quali il diabete
mellito14. Diversi studi hanno dimostrato che l’enantiomero dell’acido α-lipoico, R+-acido lipoico (R+-AL), preferenzialmente viene
accettato dal complesso della piruvato deidrogenasi rappresentando quindi la forma attiva e fisiologica dell’acido α-lipoico15,16.
In questo studio, abbiamo studiato l’effetto dell’R+-AL nella
modulazione di fattori coinvolti nel rimodellamento della ECM e
nell’angiogenesi in pazienti affetti da ulcere diabetiche croniche
trattate con OTI. È stato osservato che la supplementazione
con R+-AL in combinazione con OTI inibisce efficacemente l’espressione delle citochine proinfiammatorie e dei fattori di crescita che, di conseguenza, regolano l’espressione e l’attività
delle MMPs, promuovendo il processo di cicatrizzazione.
Materiale e metodi
Reclutamento dei pazienti e supplementazione
con R+-acido lipoico
Previo consenso informato, 20 pazienti (9 maschi e 11 femmine, età media 77 ± 9 anni) sono stati arruolati al Centro
di Medicina Iperbarica di Bologna. Le patologie prese in esame
58
R. Alleva et al.
A
Gruppo R+-AL
250
Non-attiva
Attiva
200
150
100
*
*
T1
T2
50
0
T0
MMP2 biopsia (ng/mgP)
MMP2 biopsia (ng/mgP)
Gruppo PL
300
*
*
T1
T2
200
100
0
T0
2000
1500
1000
*
500
0
T0
T1
T2
MMP2 plasma (ng/ml)
MMP2 plasma (ng/ml)
B
2500
2000
*
*
1500
1000
500
0
T0
*T1 e T2 vs T0, p < 0,05
e trattate con OTI erano ulcere ischemiche del piede diabetico,
area dell’ulcera 15 ± 15 cm2. I soggetti presentavano valori di
emoglobina glicata (HbA1c) di 8,25 ± 0,04% ed erano sottoposti a terapia insulinica (0,5 U/kg) o a terapia ipoglicemizzante
orale (glibenclamide, 15 mg/die, Tab. 1). I fattori di inclusione
erano: non fumatori con ulcere di almeno 30 giorni, piede diabetico < stadio Wagner 4, pressione arteriosa alla caviglia ≥ 50
mmHg, ossimetria transcutanea basale (pTcO2) ≥ 20 mmHg.
Pazienti con altre malattie (infiammazioni, malattie reumatiche
ed endocrine) e soggetti sottoposti a trattamenti farmacologici
o a supplementazione antiossidante sono stati esclusi dallo
studio. I pazienti sono stati randomizzati e divisi in due gruppi,
gruppo R+-acido lipoico (gruppo R+-AL) e gruppo placebo
(gruppo PL) e lo studio condotto in doppio cieco. Alla prima
sessione OTI, i soggetti ricevevano 300 mg di R+-acido lipoico
(1 capsula) o placebo (1 capsula) un’ora prima dell’esposizione all’ossigeno e una capsula immediatamente dopo la terapia. Successivamente, i pazienti hanno continuato ad assumere l’antiossidante o il placebo (2 capsule al giorno) per 6 settimane (tempo medio di durata di un ciclo OTI).
T1
T2
Figura 2 Concentrazione tessutale e
plasmatica della MMP2 totale e attiva
in pazienti supplementati e non supplementati con R+-acido lipoico sottoposti a OTI. I livelli di MMP2 sono stati
determinati nel tessuto bioptico (A) e
nel plasma (B) di soggetti supplementati (gruppo R+-AL) e non supplementati (gruppo PL) al primo trattamento
OTI (T0 ), alla quinta sessione di trattamento iperbarico (T1 ) e dopo 10 giorni
di terapia OTI (T2 ). °T1 e T2 vs T0 ; *gruppo R+-AL vs gruppo PL, p < 0,05.
sa e i pazienti respiravano ossigeno al 100% alla pressione di
2,5 atmosfere attraverso una maschera oro-nasale. Il trattamento consisteva nella respirazione di ossigeno per tre periodi successivi di 25 minuti intervallato da 3 minuti di respirazione di aria
dall’ambiente, per una durata totale della terapia di 90 minuti.
Analisi clinica delle ulcere
La valutazione clinica delle ferite è stata eseguita mediante
software mouse-eye (RG Taylor, USA, 2001, disponibile su:
www.hop.man.ac.uk/staff/rtaylor); l’ossimetria transcutanea è stata attuata con un ossimetro Kontron Instrument a
2 canali. L’area della ferita è stata valutata in pazienti supplementati e non supplementati con l’enantiomero R+acido lipoico, prima (T0) e dopo 14 (T14) e 42 (T42) giorni dall’inizio del trattamento OTI. I risultati sono stati espressi
come variazione in percentuale dell’area a T14 e T42 rispetto al valore basale (T0).
Protocollo iperbarico
Raccolta e processamento del plasma
e delle biopsie tessutali
I pazienti sono stati sottoposti a 30 trattamenti OTI consecutivi
(1 sessione al giorno, 5 giorni/settimana) come da protocollo
adottato per le ulcere cutanee croniche. La camera iperbarica
(Galeazzi, La Spezia, Italia) era pressurizzata con aria compres-
Il sangue e il tessuto bioptico sono stati prelevati alla prima
sessione OTI (prima del trattamento, T0), alla quinta sessione (dopo 1 settimana di supplementazione, T1) e alla decima sessione (dopo 14 giorni di supplemetazione (T2). Il
59
L’R+-acido lipoico accelera la guarigione delle ulcere diabetiche sottoposte a terapia iperbarica
Tabella 2 MMPs attiva/totale e complesso MMPs/TIMPs in soggetti supplementati e non supplementati con
R+-acido lipoico sottoposti a OTI.
A
Gruppo PL
Gruppo R+-AL
Biopsia
T0
T1
T2
T0
T1
T2
MMP2att/MMP2tot
0,69 ± 0,27
0,60 ± 0,56
0,46 ± 0,66
0,47 ± 0,55
0,92 ± 0,87*
0,74 ± 0,22*
MMP9att/MMP9tot
0,22 ± 0,03
0,16 ± 0,03
0,21 ± 0,04
0,27 ± 0,28
0,34 ± 0,25
0,13 ± 0,14*
MMP2/TIMP1
1,00 ± 0,84
0,89 ± 0,50
0,53 ± 0,08*
1,74 ± 0,45
3,96 ± 3,71*
4,79 ± 2,95*
MMP2/TIMP2
2,26 ± 2,24
6,43 ± 6,44
2,02 ± 1,61
2,20 ± 2,53
2,01 ± 2,53
6,06 ± 1,90*
MMP9/TIMP1
1,60 ± 0,03
2,32 ± 1,25
1,70 ± 0,57
2,46 ± 0,56
2,35 ± 1,46
1,36 ± 0,79*
MMP9/TIMP2
3,38 ± 3,06
17,11 ± 7,33*
5,86 ± 3,81*
3,19 ± 3,61
3,44 ± 3,80
2,10 ± 3,84*
T0
Gruppo PL
T1
T2
T0
Gruppo R+-AL
T1
T2
MMP2att/MMP2tot
1,12 ± 1,40
0,84 ± 0,91
0,70 ± 1,07*
1,18 ± 0,83
1,94 ± 1,35*
1,50 ± 1,02*
MMP9att/MMP9tot
1,26 ± 1,56
1,57 ± 0,49
0,82 ± 0,70*
1,02 ± 0,80
0,73 ± 1,00
0,57 ± 0,49*
MMP2/TIMP1
3,07 ± 2,17
1,57 ± 0,55*
1,24 ± 2,02*
2,53 ± 0,29
1,94 ± 0,67
15,90 ± 12,46*
MMP2/TIMP2
3,80 ± 0,94
3,15 ± 0,92
2,26 ± 1,88*
4,36 ± 1,50
3,79 ± 1,17
29,55 ± 18,81*
MMP9/TIMP1
0,91 ± 0,69
0,75 ± 1,00
0,67 ± 0,76*
0,87 ± 0,36
0,80 ± 0,92
0,30 ± 0,68*
MMP9/TIMP2
2,32 ± 1,39
2,37 ± 0,92
2,34 ± 1,47
2,83 ± 3,04
2,30 ± 2,44
3,17 ± 2,85
B
Plasma
*p < 0,05, T1 e T2 vs T0.
sangue periferico (10 ml) raccolto in provette con eparina,
è stato immediatamente centrifugato a 1000× g per 15
minuti e il plasma ottenuto è stato conservato a –80 °C fino
all’analisi in ELISA. Campioni di 5 mm di tessuto bioptico
sono stati presi al centro della ferita. Il prelievo bioptico è
stato immediatamente congelato a –20 °C per l’analisi in
ELISA. Questi ultimi sono stati omogeneizzati in un tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 7,4) e successivamente centrifugati a 12.000× g per 5 minuti per
rimuovere il particolato. Il sovranatante è stato analizzato
per il contenuto proteico (Bradford, Sigma, St Louis CA), e
conservato a –80 °C.
Determinazione dell’attività enzimatica
delle MMP2 e MMP9
L’attività enzimatica delle MMP2 e MMP9 è stata analizzata nelle biopsie e nel plasma mediante kit ELISA
(Amersham Biosciences, NJ). Anticorpi specifici per le
MMP2 e MMP9 sono attaccati sul fondo di una piastra a 96
pozzetti. La forma attiva delle MMPs presenti nel tessuto
bioptico e nel plasma viene catturata dagli anticorpi specifici dopo incubazione per l’intera notte. Dopo quattro
lavaggi, vengono aggiunti 50 µl di reagente di rivelazione.
Dopo incubazione a 37 °C per 3-4 ore, l’assorbanza dei
campioni viene letta alla lunghezza d’onda di 405 nm in un
lettore ELISA (Sunrise, Tecan, Milano, Italia). La concentrazione delle forma attiva delle MMPs è stata estrapolata da
una retta standard e l’attività calcolata come cambi di
assorbanza a 405 nm per ora, moltiplicata per un fattore
1000 ed espressa come unità per ml (U/ml).
Determinazione della concentrazione
dei fattori angiogenetici e delle metalloproteinasi
La concentrazione dei fattori implicati nell’angiogenesi (vascular endothelial growth factor, VEGFβ, fibroblastic growth factor,
bFGF, platelet derived growth factor, PDGF-BB, interleuchine
IL-1β e IL-6, tumor necrosis factor, TNFα) e delle metalloproteinasi della matrice (MMP2, MMP9) e dei loro inibitori (tissue
inhibitor metalloproteinase, TIMP1, TIMP2) è stata determinata nei lisati bioptici e nel plasma mediante metodica multiplex
sandwich ELISA (SearchLight, Pierce Biothecnology, Rockford,
IL). Ogni pozzetto della micropiastra è stato ricoperto con
anticorpi specifici ai quali si legano le proteine corrispondenti
presenti nel campione. Dopo opportuni lavaggi, la rivelazione
è stata eseguita mediante reazione biotina-streptoavidina e il
segnale chemiluminescente rilevato con SearchLight CCD
Imaging System.
Ogni campione è stato determinato in duplicato e la concentrazione espressa in ng/mg proteina per le biopsie e in
ng/ml per il plasma.
60
R. Alleva et al.
A
250
200
150
100
50
0
T0
T1
T2
MMP9 biopsia (ng/mgP)
Gruppo R+-AL
400
MMP9 plasma (ng/ml)
MMP9 biopsia (ng/mgP)
Gruppo PL
600
300
200
*
100
0
T0
T1
T2
MMP9 plasma (ng/ml)
B
600
400
200
0
T0
T1
T2
400
200
*
0
T0
*T1 e T2 vs T0, p < 0,05
Analisi statistica
I test non parametrici di Kruskal-Wallis e Mann-Whitney
sono stati usati per determinare le differenze significative
della concentrazione e dell’attività delle MMPs e i livelli dei
fattori di crescita tra i tre punti di prelievo (T0, T1, T2) e tra i
gruppi. I valori di p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. L’analisi statistica è stata condotta
mediante l’uso del programma statistico SPSS versione
11.0 (SPSS, Chicago, IL).
Risultati
Concentrazione tessutale e plasmatica delle
MMP2, MMP9 e dei loro inibitori TIMP1, TIMP2
Il livello proteico di MMP2 e MMP9 sia nel tessuto bioptico
sia nel plasma è stato valutato sia come proteina totale sia
come attività proteica. Come mostrato in figura 2, la MMP2
non attiva e la sua forma attiva diminuivano leggermente in
seguito al trattamento OTI (gruppo PL). Nel gruppo R+-AL,
la MMP2 totale e la sua attività aumentavano significativamente al tempo T2, come osservato sia nella biopsia sia nel
plasma. Il rapporto MMP2 attiva/MMP2 totale era significativamente ridotto a T2 nel gruppo PL, contrariamente a
quanto osservato nel gruppo R+-AL nel quale tale rapporto
T1
T2
Figura 3 Concentrazione tessutale e
plasmatica della MMP9 totale e attiva
in pazienti supplementati e non supplementati con R+-acido lipoico sottoposti
a OTI. I livelli di MMP9 sono stati determinati nel tessuto bioptico (A) e nel plasma (B) di soggetti supplementati
(gruppo R+-AL) e non supplementati
(gruppo PL) al primo trattamento OTI
(T0 ), alla quinta sessione di trattamento
iperbarico (T1 ) e dopo 10 giorni di terapia OTI (T2 ). °T1 e T2 vs T0 ; *gruppo R+AL vs gruppo PL, p < 0,05.
aumentava a livello sia tessutale sia plasmatico (Tab. 2 A,
B). Un andamento opposto è stato osservato per la MMP9
la cui espressione e attività erano indotte dal trattamento
OTI. La supplementazione con R+-acido lipoico riduceva le
concentrazioni della MMP9 sia a livello dell’ulcera sia a livello plasmatico (Fig. 3), mostrando di conseguenza un ridotto rapporto MMP9 attiva/MMP9 totale (Tab. 2 A, B). I livelli
di TIMP1 e TIMP2 non subivano cambiamenti durante la
terapia OTI e non erano significativamente diversi tra i gruppi (dati non mostrati). I TIMPs rivestono un ruolo chiave
nella regolazione dell’attività enzimatica delle MMPs; l’attività delle MMPs è inibita dal legame dei TIMPs in un rapporto molare di 1:1. Di conseguenza un controllo bilanciato dei complessi MMPs/TIMPs è necessario per un regolare processo di riparazione. Comunque, iI complesso
MMP2/TIMP1 e MMP2/TIMP2 era significativamente
aumentato al tempo T2 nel gruppo R+-AL (Tab. 2 A, B).
L’acido R+-lipoico determinava anche una riduzione del
complesso MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2 osservato al
punto T2 (Tab. 2 A, B).
Concentrazione plasmatica
delle citochine IL-1β, IL-6, TNFα
L’incremento dei livelli delle proteasi, includendo le MMPs, è
stato associato alla presenza, a livello dell’ulcera, di cellule
infiammatorie (leucociti e monociti) e alla presenza di elevate
L’R+-acido lipoico accelera la guarigione delle ulcere diabetiche sottoposte a terapia iperbarica
14
12
IL-1β (ng-ml)
citochine proinfiammatorie7,13. Quindi, le citochine IL-1β, IL-6
e TNFα sono state valutate nel plasma di pazienti supplementati e non supplementati con R+-acido lipoico che erano
sottoposti a terapia OTI. Come mostrato in figura 4, non
sono stati osservati cambiamenti significativi nei due gruppi
(gruppo PL e gruppo R+-AL) per quanto riguarda TNFα.
Contrariamente, i livelli plasmatici di IL-1β e IL-6 aumentavano in seguito a trattamento OTI nei pazienti che ricevevano
placebo, probabilmente per i processi infiammatori, mentre
l’R+-acido lipoico inibiva marcatamente l’espressione di tali
citochine.
10
Gruppo PL
Gruppo R+-AL
8
6
4
*
2
0
T0
Livelli tessutali e plasmatici
dei fattori di crescita PDGF-BB, bFGF, VEGFβ
L’R+-acido lipoico accelera il processo
di guarigione delle ulcere croniche
trattate con OTI
Dall’analisi clinica si è evidenziato che il solo trattamento
iperbarico determinava una leggera riduzione dell’area
della ferita del 2,1 ± 6,2% e del 5,7 ± 43,3% rispettivamente dopo 14 e 42 giorni di trattamento iperbarico. La
somministrazione giornaliera di R+-acido lipoico accelerava efficacemente il processo di guarigione determinando una significativa riduzione della ferita, osservata
dopo 42 giorni di trattamento, del 40,8 ± 37,2%,
p = 0,02 (Fig. 6).
T1
T2
20
IL-6 (ng-ml)
16
12
8
*
4
0
T0
T1
T2
T0
T1
T2
60
TNFα/ng/ml)
È noto che l’infiammazione a livello dell’ulcera determina
distruzione tessutale, coinvolgendo la degradazione del
proteoglicano e del collagene, dei fattori di crescita, della
fibronectina e dei fattori che inibiscono le proteasi. Sono
stati, quindi, esaminati in entrambi i gruppi i livelli tessutali
e plasmatici dei fattori di crescita quali VEGFβ, bFGF e
PDGF-BB. Un significativo incremento della concentrazione del VEGFβ e del bFGF è stato osservato nel gruppo placebo in seguito al trattamento con ossigeno. La supplementazione con l’antiossidante inibiva l’espressione del
VEGFβ e del bFGF, ma induceva, rispetto al gruppo PL, un
significativo aumento della concentrazione tessutale e plasmatica del PDGF-BB (Fig. 5).
61
40
20
0
°T1 e T2 vs T0, *gruppo AL vs gruppo PL, p < 0,05
Discussione
Figura 4 Concentrazione plasmatica delle citochine IL-1β, IL6, e TNFα in pazienti supplementati e non supplementati con
acido R-lipoico sottoposti a OTI. I livelli di citochine
IL-1β, IL-6, e TNFα sono stati determinati nel plasma di soggetti supplementati (gruppo R+-AL) e non supplementati
(gruppo PL) al primo trattamento OTI (T0 ), alla quinta sessione
di trattamento iperbarico (T1 ) e dopo 10 giorni di terapia OTI
(T2 ). °T1 e T2 vs T0 ; *gruppo R+-AL vs gruppo PL, p < 0,05.
L’ulcera cronica è una seria complicazione del diabete
mellito. La ferita spesso non cicatrizza a causa di una persistente e alta concentrazione di citochine proinfiammatorie presenti nel sito dell’ulcera, portando a sua volta a un
aumento della concentrazione delle proteasi. Queste ultime di conseguenza provvedono a degradare diversi fattori di crescita e proteine della matrice, fattori essenziali per
il normale processo di cicatrizzazione7,8,17. Una riduzione
dell’attività delle MMPs nell’essudato raccolto dalle ferite
croniche è stato descritto da altri autori. Tale riduzione
veniva associata all’inizio di guarigione dell’ulcera18. Una
significativa riduzione della MMP9 e del complesso
MMP9/TIMP1, associata a un aumento dell’attività della
MMP2 e dei livelli del complesso MMP2/TIMP1 e
MMP2/TIMP2 è stata osservata sia nelle biopsie sia nel
plasma del gruppo R+-AL. Le MMP2 e MMP9 sono fortemente implicate nel processo di cicatrizzazione, in quanto degradano il collagene tipo IV e V della membrana
basale e il collagene tipo I nell’interstizio18 permettendo la
62
R. Alleva et al.
Plasma
0,4
Gruppo PL
*
Gruppo R+-AL
0,3
0,2
0,1
0
T0
T1
PDGF-BB /ng/mgP)
PDGF-BB /ng/mgP)
Biopsia
0,5
*
20
10
T0
T1
T2
3
*
40
30
20
*
10
bFGF (ng/ml)
bFGF (ng/mgP)
*
30
0
T2
50
0
2
1
*
0
T0
T1
T2
T0
12
T1
T2
2,5
10
*
8
6
4
2
*
*
T1
T2
0
VEGFβ (ng/ml)
VEGFβ (ng/mgP)
40
2,0
1,5
*
1,0
0,5
0
T0
T0
°T1 e T2 vs T0, *gruppo AL vs gruppo PL, p < 0,05
migrazione cellulare19,20. L’incremento dell’attività della
MMP2 indotta dall’R+-acido lipoico è un evento positivo
per la cicatrizzazione. Infatti la MMP2 non solo regola il
rimodellamento della matrice extracellulare, ma svolge
anche un effetto antinfiammatorio, modulando la proteina-3 chemiotattica dei monociti (monocyte chemotactic
protein-3, MCP-3), una chemochina che promuove la
chemiotassi leucocitaria21. La MMP2 è una delle metalloproteinasi più efficienti nel tagliare e inattivare la MCP-3,
determinando non solo il blocco dell’inizio di una risposta
infiammatoria, ma inibendo un’infiammazione preesistente21. Al contrario, la MMP9 non disattiva la MCP-3, ma
taglia e attiva le citochine proinfiammatorie IL1β e IL8,
potenziando la loro attività22, inducendo un innalzamento
del flusso leucocitario e di conseguenza un aumento del
processo infiammatorio. È ben noto che la MMP9 preferenzialmente degrada la matrice extracellulare nelle prime
fasi del processo di cicatrizzazione. I livelli di MMP9 si
innalzano nelle due prime settimane dal danno, decrescendo poi ai valori basali tra le due e le quattro settimane. Questo coincide con il tempo al quale inizia il processo angiogenico in cui viene formato nuovo tessuto23,24. La
T1
T2
Figura 5 Concentrazione tessutale e
plasmatica dei fattori di crescita
PDGF-BB, bFGF, e VEGFβ in pazienti
supplementati e non supplementati
con acido α-lipoico sottoposti a OTI. I
livelli dei fattori di crescita PDGF-BB,
bFGF, e VEGFβ sono stati determinati
nel tessuto bioptico e nel plasma di
soggetti supplementati (gruppo R+-AL)
e non supplementati (gruppo PL) al
primo trattamento OTI (T0 ), alla quinta
sessione di trattamento iperbarico (T1 )
e dopo 10 giorni di terapia OTI (T2 ). °T1
e T2 vs T0 ; *gruppo R+-AL vs gruppo
PL, p < 0,05.
MMP2 interviene nel processo di guarigione più tardivamente, ed è coinvolta nei cambiamenti strutturali del tessuto24. L’induzione selettiva della MMP2 e l’inibizione della
MMP9 indotta dall’R+-acido lipoico può promuovere la
cicatrizzazione della ferita non solo stimolando la migrazione cellulare, ma anche prevenendo l’infiammazione. La
transiente comparsa delle MMPs a livello della membrana
basale dell’epitelio in proliferazione implica che l’espressione delle MMPs, durante la riparazione della ferita, è
regolato efficientemente dal punto di vista sia spaziale sia
temporale. Questo efficiente sistema di controllo viene
mediato dall’azione dei fattori di crescita e delle citochine
che sono transitoriamente presenti nella fase infiammatoria25,26. I cheratinociti e le cellule endoteliali sono sorgenti
di MCP-1 e IL-8; tali citochine sono over-regolate durante il normale processo di riparazione dell’ulcera26 e sono
responsabili dell’innesco dell’infiammazione.
Un’infiammazione autoregolata è un normale e necessario
prerequisito per l’attivazione dei fibroblasti e per la sintesi di
nuova matrice. Diversamente, un’infiammazione sostenuta e
con una prolungata persistenza di neutrofili e monociti nella
sede della ferita inibisce la normale cicatrizzazione27.
63
L’R+-acido lipoico accelera la guarigione delle ulcere diabetiche sottoposte a terapia iperbarica
100
1
*
*
0
5
*
-100
Figura 6 Valutazione clinica delle ferite in soggetti supplementati (gruppo R+-AL) e non supplementati (gruppo PL)
sottoposti a OTI. L’area della lesione è stata calcolata
mediante programma mouse-eyes. Le ulcere sono state
analizzate dopo 14 giorni (T14 ) e 42 giorni (T40 ) di OTI. I risultati sono stati espressi come variazione in percentuale dell’area a T14 e T42 rispetto al valore basale (T0 ).
In questo studio abbiamo osservato che i prelievi bioptici di
ulcere diabetiche croniche mostravano elevati livelli di citochine e fattori di crescita. La terapia OTI induceva un aumento dei fattori di crescita bFGF e VEGFβ e delle citochine
proinfiammatorie IL-1β, IL-6 a livello sia tessutale sia plasmatico. La supplementazione con R+-acido lipoico riduceva
marcatamente i livelli di tali molecole.
IL-1β e IL-6 agiscono come citochine proinfiammatorie e la
loro inibizione contribuisce a sopprimere il processo infiammatorio. Analogamente, il PDGF-BB rappresenta un fattore
chemiotattico per i monociti e i fibroblasti regolando il processo di angiogenesi28,29. Il PDGF-BB accelera la granulazione tessutale e la deposizione di matrice extracellulare29. In
questo studio, abbiamo osservato che l’R+-acido lipoico
induce significativamente l’espressione proteica per PDGFBB determinando un incremento della sua concentrazione a
livello tessutale e plasmatico. Diversamente, una riduzione
dei livelli del PDGF-BB è stata osservata nel gruppo placebo. Alcuni autori hanno dimostrato che in ferite con difetti di
riparazione, il processo di cicatrizzazione veniva stimolato
applicando alcuni fattori polipeptidici di crescita, quali il FGF
e il PDGF-BB30. Questo ha contribuito all’uso del PDGF-BB
ricombinante nel trattamento delle ulcere diabetiche. Infatti il
PDGF-BB promuove la fase infiammatoria/proliferativa di
riparazione con la deposizione di nuova matrice senza
distruggere la normale sequenza di eventi di guarigione,
diversamente da quanto osservato per altri fattori di crescita, quali il FGF e il TGFβ che alterano il normale processo di
cicatrizzazione30. In questo studio, sebbene preliminare per il
numero dei casi esaminati, abbiamo osservato che nelle
ulcere diabetiche croniche i fattori proinfiammatori erano
altamente espressi. L’infiammazione cronica e la contaminazione batterica stabiliscono insieme un circolo autocrino
T14
T42
*p = 0,02
-200
N=
10
10
Gruppo PL
10
10
Gruppo R+-AL
positivo che contribuisce a mantenere l’ulcera in uno stato
cronico. Una scarsa e compromessa ossigenazione rappresenta un fattore che limita il processo di cicatrizzazione, pertanto un adeguato trattamento OTI è necessario per stimolare la rigenerazione tessutale.L’R+-acido lipoico inibisce lo
stato infiammatorio cronico, modificando il rapporto proteasi/antiproteasi a livello del microambiente della ferita. Il
decremento di espressione della MMP9 e l’aumento della
MMP2, unito a un aumentato livello del PDGF-BB, contribuiscono ad accelerare il processo di riparazione dell’ulcera
come osservato dopo 42 giorni di trattamento, suggerendo
un ruolo benefico della supplementazione con R+-acido lipoico nel trattamento delle ferite croniche (Fig. 1).
Ringraziamenti
Si ringrazia la ditta MDM, Milano, per aver generosamente
fornito la molecola R+-acido lipoico (Patiox capsule).
Conflitto di interessi
Nessuno.
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