Lezione 12 -IL MODELLO OPERONE

IL MODELLO
DELL’OPERON
La regolazione genica
nei procarioti
—  I microrganismi presentano sorprendenti capacità
di adattamento a diverse condizioni ambientali
—  Questa capacità di adattarsi, e quindi di crescere,
risiede nella capacità di esprimere velocemente i
geni necessari a far fronte a specifici stimoli
ambientali
—  VANTAGGIO: risparmio energetico, quindi una
crescita più veloce e migliore utilizzo delle risorse
disponibili
sono sempre espressi nella cellula,
geni essenziali per la cellula
(ad esempio rRNA, tRNA, proteine
ribosomali, RNA polimerasi, ecc)
COSTITUTIVI
la loro attività è controllata in risposta
alla necessità
REGOLATI
GENI
Per regolare l’espressione genica
1.  Devono riconoscere le condizioni ambientali nelle
quali attivare o reprimere l’espressione di specifici
geni
2.  Devono essere in grado di attivare o reprimere
l’espressione cordinata di specifici geni o gruppi
di geni
A che livello può agire la
regolazione nei procarioti?
DNA
proteina
mRNA
trascrizione
controllo della
trascrizione
traduzione
controllo della
traduzione
controllo della
stabilità dei
trascritti
controllo della
stabilità della
proteina
controllo
dell’attività
proteica
Controllo delle proteine per
l’utilizzo di zuccheri
—  I batteri possono utilizzare diversi zuccheri come
fonte di carbonio e di energia
—  (glucosio, lattosio, arabinosio, xylosio, ecc.)
—  Le proteine necessarie per il metabolismo dello
zucchero comprendono
—  quelle che favoriscono l’ingresso dello zucchero
nella cellula
—  quelle che catalizzano i passaggi di degradazione
dello zucchero
Regolazione del catabolismo
del lattosio in E. coli
—  Il metabolismo del lattosio è stato studiato in
dettaglio negli anni 1950 da François Jacob e
Jacques Monod
—  La loro descrizione del sistema di controllo della
trascrizione è stata una scoperta di enorme valore
scientifico che è valso loro il premio Nobel nel 1965
—  E. coli può crescere in un terreno minimo
contenente glucosio
—  I geni del metabolismo del glucosio sono costitutivi,
la glicolisi è un processo fondamentale
—  Se al terreno minimo viene aggiunto lattosio, al
posto del glucosio, E. coli sintetizza gli enzimi utili
per metabolizzare questo zucchero
Enzimi indotti dal lattosio
—  β-galattosidasi (gene lacZ)
—  che scinde il lattosio in galattosio e glucosio
—  catalizza l’isomerizzazione del lattosio in allolattosio
—  Lattosio permeasi (gene lacY)
—  per promuovere il passaggio del lattosio all’interno
della cellula
—  la β-galattoside transacetilasi (gene lacA)
—  trasferisce un gruppo acetilico ai β-galattosidi, ma la
sua funzione è ancora poco chiara
QUESTI GENI SONO DETTI GENI STRUTTURALI
Jocob e Monod studiarono le mutazioni che
alterano il metabolismo del lattosio
—  Mutazioni nei 3 geni strutturali (lacZ, lacY e lacA)
—  le mutazioni nei geni lacZ−, lacY−, lacA− furono
mappate con tecniche classiche
—  I tre geni sono strettamente concatenati e l’ordine
lacZ−lacY−lacA
—  I tre geni sono trascritti in un unico mRNA detto
policistronico o poligenico
—  Mutazioni che influenzavano la regolazione di tutti
e 3 i geni strutturali
—  Mutanti costitutivi
—  i geni strutturali sono sempre espressi, sia in presenza
che in assenza di lattosio
—  Mutanti che bloccano l’espressione dei geni
strutturali anche quando è presente il lattosio
Mappatura dei mutanti costitutivi
Sono state identificate due classi:
1a classe: mappava in una regione piccola a
monte del gene lacZ che
chiamarono operatore (lacO)
2a classe: mappava a monte dell’operatore in
un gene che chiamarono lacI, che
codifica per il repressore
Struttura della regione genomica
Essi coniarono il termine di OPERONE per
indicare un cluster di geni che svolgono
funzioni correlate e che sono regolati in
modo coordinato
Come potrebbe essere regolata la
trascrizione di geni inducibili?
REGOLAZIONE
Vie CATBOLICHE o di degradazione (lac)
INDUCIBILI
Vie ANABOLICHE o di biosintesi (trp)
REPRIMIBILI
GENE REGOLATORE
ATTIVATORI
REPRESSORI
legano una regione regolativa in base alla presenza di
MOLECOLE EFFETTRICI
INDUTTORI
CO-REPRESSORI
Influenzano la struttura tridimensionale dei regolatori
SISTEMI INDUCIBILI:
REGOLAZIONE POSITIVA
SISTEMI INDUCIBILI:
REGOLAZIONE POSITIVA
INDUTTORE ASSENTE
INDUTTORE PRESENTE
INDUTTORE
SISTEMI INDUCIBILI:
REGOLAZIONE NEGATIVA
SISTEMI INDUCIBILI:
REGOLAZIONE NEGATIVA
INDUTTORE
operatore
Per meglio definire il ruolo di
ciascun componente dell’operone
Jacob e Monod si servirono di ceppi
parzialmente diploidi
Utilizzarono ceppi F’ che portavano alcuni
geni dell’operone sul fattore di fertilità F
—  Poterono definire quali mutazioni sono
dominanti e quali recessive
—  Formulare ipotesi circa il ruolo svolto da
ciascuna regione dell’operone
Diploide parziale per mutazioni lacOc
GENOTIPO:
lacI+ P O+ Z- Y+
F’ lacI+ P Oc Z+ Y−
lacI+ P O+ Z− Y+
CROMOSOMA BATTERICO
CELLULA BATTERICA
PLASMIDE F’
lacI+ P O+ Z− Y+
F’ lacI+ P Oc Z+ Y−
SENZA INDUTTORE CON INDUTTORE
β-galattosidasi
permeasi
+
−
(sintesi della forma
mutata)
+
+
—  Il gene Lac Z è espresso in modo costitutivo
—  Il gene Lac Y è soggetto a controllo inducibile
SI PUO’ DEDURRE CHE UNA MUTAZIONE lacOc ALTERA
SOLO I GENI A VALLE SULLA STESSA MOLECOLA DI DNA
QUESTO TIPO DI MUTAZIONI SONO DETTE
CIS-DOMINANTI
L’operatore NON CODIFICA PER UN PRODOTTO DIFFUSIBILE
altrimenti uno dei due alleli controllerebbe tutti i geni per
l’utilizzo del lattosio
Diploide parziale per mutazioni lacI−
GENOTIPO:
lacI+ P O+ Z− Y+
F’
lacI− P O+ Z+ Y−
lacI+ P O+ Z− Y+
CROMOSOMA BATTERICO
CELLULA BATTERICA
PLASMIDE F’
lacI+ P O+ Z− Y+
F’
lacI− P O+ Z+ Y−
SENZA INDUTTORE
β-galattosidasi
−
permeasi
−
—  L’espressione di entrambi i geni è inducibile
—  lacI+ nella cellula è dominante su lacI−
DATO CHE I GENI lacI SI TROVANO SU MOLECOLE DIVERSE
DI DNA (configurazione in trans)
LA MUTAZIONE lacI+ E’ DETTA
TRANS-DOMINANTE SU lacI−
Jacob e Monod ipotizzarono quindi che il gene lacI codificasse
per un REPRESSORE DIFFUSIBILE nella cellula
IL MODELLO DI REGOLAZIONE NEGATIVO
PROPOSTO DA JACOB E MONOD
IN ASSENZA DI LATTOSIO
IN PRESENZA DI LATTOSIO
Il modello spiega i mutanti trovati?
I MUTANTI lacOc IN ASSENZA DI LATTOSIO
I MUTANTI COSTITUTIVI lacI-
Il modello proposto per i diploidi parziali
lacI+ P O+ Z- Y+ A+
GENOTIPO
F’ lacI+ P Oc Z+ Y- A+
SENZA
INDUTTORE
β-galattosidasi
permeasi
+
−
(sintesi della
forma mutata)
IN ASSENZA DI LATTOSIO
lacI+ P O+ Z- Y+ A+
GENOTIPO
F’ lacI+ P Oc Z+ Y- A+
CON
INDUTTORE
β-galattosidasi
+
permeasi
+
IN PRESENZA DI LATTOSIO
Il secondo diploide parziale analizzato
lacI+ P O+ Z− Y+ A+
GENOTIPO
F’ lacI− P O+ Z+ Y− A+
SENZA
INDUTTORE
β-galattosidasi
−
permeasi
−
IN ASSENZA DI LATTOSIO
lacI+ P O+ Z− Y+ A+
GENOTIPO
F’ lacI− P O+ Z+ Y− A+
CON
INDUTTORE
β-galattosidasi
+
permeasi
+
IN PRESENZA DI LATTOSIO
I mutanti di regolazione identificati
GENE MUTAZIONE FENOTIPO
lacI
lacI-
sintesi costitutiva dei 3 enzimi
lacO
lacOc
sintesi costitutiva dei 3 enzimi
lacI
lacIs
nessuna sintesi anche in presenza di lattosio
lacP
lacP-
nessuna sintesi anche in presenza di lattosio
La mutazione lacIs (superrepressore)
Nei diploidi parziali (lacI+/lacIs) lacIs è TRANS-DOMINANTE
bloccando la sintesi dei geni strutturali su entrambe le copie dell’operone
L’operone lattosio ha anche un
sistema di regolazione positiva
—  Questo sistema di regolazione assicura che i geni
dell’operone lattosio siano espressi ad alti livelli
solo se i lattosio è l’unica fonte di carbonio e se
non è presente anche il glucosio
—  Il glucosio è preferito perché può essere
direttamente utilizzabile nella glicolisi per produrre
energia
—  Gli altri zuccheri devono essere convertiti in
glucosio prima di poter essere utilizzati
—  queste conversioni richiedono energia
Il modello di regolazione positiva
dell’operone lattosio di E.coli
CAP
cAMP (AMPciclico)
(Catabolite Activator Protein)
RNA polimerasi
La proteina regolatrice CAP “sente” la
presenza di glucosio nella cellula legandosi
al cAMP la cui concentrazione è
inversamente correlata alla quantità di
glucosio nella cellula
Il legame del cAMP alla
proteina CAP aumenta
l’affinità di questo
complesso con un sito
adiacente a lacP
Il legame del complesso
CAP-cAMP al DNA
favorisce il legame della
RNA polimerasi al
promotore
CAP e cAMP mantengono gli
operoni dell’arabinosio e del
galattosio
Gli operoni sono molto comuni nei
procarioti
Permettono di:
—  regolare contemporaneamente più geni coinvolti
nello stesso metabolismo
—  mantenere i rapporti dei trascritti bilanciati
—  rispondere velocemente alle variazioni ambientali
Altri esempi di operoni:
—  triptofano
—  arabinosio
L’operone triptofano
Operone reprimibile negativo
trpR
P
O
trpE
trpD
trpC
trpB
trpB
repressore
attivo
repressore
inattivo
triptofano
Acido Corismico->Triptofano
L’operone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal
gene trpR
Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e
bloccando la trascrizione
L’operone triptofano
L’attenuazione della trascrizione
trpR
P
O
trpE
trpD
trpC
trpB
trpB
leader
162 nt
codoni trp
1
2
peptide leader (14AA)
3
4
mRNA
attenuatore
Se deleta la sequenza leader determina incremento di espressione dell’operone trp
Senza effetti sulla reprimibilita’ dell’operone.
L’operone triptofano
L’attenuazione della trascrizione
trpR
P
O
leader
trpE
trpD
trpC
trpB
trpB
162 nt
codoni trp
1
2
peptide leader (14AA)
3
4
mRNA
Attenuatore
Seq. palindroma ricca in G:C seguita da coppie A:T
Secondo livello di regolazione -> attenuazione
In presenza di tRNA trp carico di triptofano causa la terminazione prematura
della trascrizione dell’operone-> trascritto tronco (140nt)
Trascrizione di questa sequenza e dei segnali di terminazione della seq attenuatore
1
1
2
2
3
4
3
4
Attenuatore
(terminatore della
trascrizione)
UUUUUUU
mRNA
RNA nascente che
puo’ formare una
struttura a forcina
seguita da alcuni
uracili
Avviene un cambiamento conformazionale
nell’RNApolimerasi associata causando la
terminazione della trascrizione
MA…..Se al segmento 1 viene impedito
di appaiarsi con il segmento 2,
quest’ultimo si appaia con il segmento
3. Il 4 rimane singolo e non si forma il
terminatore
TRASCRIZIONE ATTIVA
2
1
E la presenza del trp come influenza l’attenuazione?
3
4
Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide
leader regola l’attività della RNA polimerasi
NB:Nei procarioti trascrizione e traduzione avvengono
contemporaneamente
peptide leader
1
AUG
UGA
2
3
4
mRNA
Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader
arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2
impedendogli l’appaiamento con il segmento 3
3
AUG
1
UGA
4
2
PRESENZA TRIPTOFANO -> Forcina di Terminazione ->OPERONE TRP NON TRASCRITTO
Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide
leader regola l’attività della RNA polimerasi
peptide leader
AUG
1
UGA
2
3
4
mRNA
Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà
in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti
impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2.
Il segmento 2 si associa con il segmento 3
2
AUG
1
UGA
3
4
PRESENZA TRIPTOFANO -> ATTENUAZIONE ->OPERONE trp ATTENUATO
La polimerasi termina
la trascrizione
2
3
4
FORCINA DI TERMINAZIONE
ASSENZA TRIPTOFANO -> LOOP ->OPERONE trp NON ATTENUATO
La polimerasi continua
2
3
Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la
velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la
disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi
proteica.
Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA
polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà
la sequenza dell’attenuatore.
La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e l’attenuazione la
riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi
operano insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte.
Sembra che l’attenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione
della biosintesi di molti amminoacidi