Y Chromosome AZF Analysis System Technical Manual, TM252

Transcript

TECHNICAL MANUAL
Y Chromosome
AZF Analysis System
2800 Woods Hollow Rd.
Madison, WI USA
Dispositivo medico
diagnostico in vitro
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hanover, Germania
ISTRUZIONI PER L’USO
DEL PRODOTTO
Printed in USA
Revised 3/14
MD1631
Part# TM252
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Y Chromosome
AZF Analysis System
Manuale tecnico TM252
ISTRUZIONI PER L’USO DEL PRODOTTO MD1631.
Tutta la letteratura tecnica è disponibile su Internet all’indirizzo www.promega.com
Visitare il sito web per verificare che si stia utilizzando la versione più aggiornata del presente manuale tecnico.
Uso previsto del prodotto ........................................................................................................1
2.
Descrizione .................................................................................................................................2
3.
Componenti del prodotto.........................................................................................................3
4.
Considerazioni generali ...........................................................................................................3
A. Campione modello di DNA ...........................................................................................3
B. Condizioni della PCR ......................................................................................................4
C. Termociclatori ...................................................................................................................4
D. Controllo della contaminazione.....................................................................................5
E. Reazioni di controllo........................................................................................................5
5.
Reazioni di amplificazione......................................................................................................5
A. Preparazione delle reazioni ............................................................................................6
B. Protocollo ottimale per cicli termici PCR per l'uso con termociclatore
Perkin-Elmer Model 480 .................................................................................................8
C. Elettroforesi su gel d’agarosio........................................................................................8
D. Analisi dei dati – Controlli .............................................................................................9
E. Analisi dei dati – Campioni sperimentali ..................................................................10
6.
Bibliografia ...............................................................................................................................11
7.
Appendice .................................................................................................................................11
A. Composizione dei tamponi e delle soluzioni ............................................................11
B. Fogli di lavoro.................................................................................................................12
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hanover,
Germania
ITALIANO
1.
1.
Uso previsto del prodotto
Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System(a) soddisfa i requisiti della Direttiva UE
98/79/CE sui dispositivi medicali per diagnosi in vitro. Il sistema Y Chromosome AZF
Analysis System rappresenta un metodo basato su tecnica PRC mutiplex per analizzare
l'integrità della regione AZF del cromosoma umano Y. Il sistema Y Chromosome AZF
Analysis System deve essere usato nell'ambito di un iter diagnostico finalizzato a
caratterizzare l'infertilità maschile. I risultati diagnostici ottenuti mediante questo sistema
devono essere interpretati insieme ad altri dati clinici o di laboratorio. Queste
informazioni sono potenzialmente utili per i pazienti che intendono sottoporsi alla
fertilizzazione in vitro, poiché le delezioni enlla regione AZF del cromosoma Y si
trasmettono ai figli maschi generati mediante fertilizzazione in vitro, determinando
l'infertilità della prole di sesso maschile.
Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com
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Descrizione
Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System rappresenta un metodo per la rilevazione
della regione AZF del cromosoma umano Y. Il sistema consiste in 20 coppie di primer
omologhi a siti precedentemente identificati e mappati (STS; 1-7). Quando vengono usati in
reazioni a catena della polimerasi (PCR; 6, 8), questi primer amplificano i bracci corti di DNA
non polimorfo del cromosoma Y. I primer sono stati combinati in cinque gruppi Multiplex
Master Mix da utilizzare nella PCR multiplex. Ciò consente di determinare la presenza
o l’assenza di tutti i 20 STS eseguendo cinque amplificazioni con PCR concomitanti (Figura 1).
Le delezioni del cromosoma Y nelle regioni amplificate mediante questi gruppi di primer
sono state associate all’infertilità maschile (1,2,6,9-17). Le adiacenti regioni del cromosoma Y
generalmente non si presentano come prodotti di amplificazione in sequenza all’interno di
una singola reazione di amplificazione multiplex. Le eccezioni sono SY242 e SY208 del locus
DAZ, che sono rappresentati come prodotti di amplificazione in sequenza usando reazioni
Multiplex B Master Mix, e SY84 e SY86 dei loci DYS273 e DYS148, che sono rappresentati
come prodotti di amplificazione in sequenza nelle reazioni Multiplex E Master Mix.
Multiplex Master Mixes A-D contiene una coppia di primer di controllo che amplifica
i frammenti del locus SMCX (X-linked). Il quinto Multiplex Master Mix, Multiplex E,
contiene una coppia di primer di controllo che amplifica una regione esclusiva nel DNA sia
maschile che femminile (ZFX/ZFY). Queste coppie di primer di controllo sono controlli
interni per le reazioni di amplificazione multiplex e verificano l’integrità del campione di
DNA genomico. Infine, Multiplex E Master Mix include anche una coppia di primer che
amplifica una regione del gene SRY, agendo da amplificazione di controllo per il fattore
determinante la formazione del testicolo (TDF, testis-determining factor) sul braccio corto del
cromosoma umano Y.
A
B
M 1 2 M 3 4
C
M 5 6
D
M 7 8
E
M 9 10 M
500 –
400 –
300 –
– 500
– 400
– 300
200 –
– 200
100 –
– 100
50 –
– 50
4322TA09_3A
bp
Figura 1. Esempio di amplificazione del DNA genomico maschile. Amplificazione del DNA
genomico maschile (MD115A) (corsie 1, 3, 5, 7, 9), nonché controllo negativo di DNA (corsie 2,
4, 6, 8, 10), per ciascuno dei cinque Multiplex Master Mix.
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Componenti del prodotto
Prodotto
Y Chromosome AZF Analysis System
Dim.
25 reazioni
N. di cat.
MD1631
Non destinato alla vendita negli Stati Uniti. Solo per l’esportazione. Il sistema Y Chromosome AZF
Analysis System include:
–10°C
Simboli
–30°C
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
MD154A
MD155A
MD156A
MD157A
MD158A
M300C
P119F
G452C
MD115A
G190B
Multiplex A Master Mix
Multiplex B Master Mix
Multiplex C Master Mix
Multiplex D Master Mix
Multiplex E Master Mix
GoTaq® DNA Polymerase(c)
Nuclease-Free Water
50bp DNA Step Ladder (340 ng/µl)
Male Genomic DNA (50 ng/µl)
Blue/Orange 6X Loading Dye
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
200 u
1,25 ml
90 µg
2,5 µg
1 ml
Condizioni di conservazione: conservare tutti i componenti a –10 a –30°C. Evitare di
congelarli e scongelarli più volte.
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hanover, Germania
–10°C
–30°C
Conservare a -10 a
–30°C
<n>
Contenuto sufficiente
per “n” test
Considerazioni generali
A.
Campione modello di DNA
La concentrazione, la purezza e la quantità del DNA sono considerazioni importanti
per garantire il successo dell’analisi con il sistema Y Chromosome AZF Analysis
System. Un DNA di qualità scadente può determinare un aumento del fondo
o compromettere la riuscita dell’amplificazione. La mancata riuscita
dell’amplificazione può manifestarsi con la completa assenza di amplificazione di
tutte le bande con tutti i Mutiplex Master Mix o la sparizione delle sottopopolazioni
degli alleli nei singoli master mix. Per evitare ciò, utilizzare solo DNA di alta qualità
con una percentuale di assorbanza A260/A280 ≥1,8. Il DNA non deve essere tagliato
e deve essere privo di contaminazione da proteine, etanolo o sali (soprattutto EDTA;
la concentrazione di EDTA deve essere <0,4 mM).
Rappresentante
autorizzato
ITALIANO
4.
Dispositivo medico
diagnostico in vitro
Misurare con precisione il DNA prima di usarlo con il sistema Y Chromosome AZF
Analysis System, poiché l’utilizzo di una quantità eccessiva o insufficiente di DNA
può determinare la mancata riuscita delle reazioni. Le letture spettrofotometriche
(assorbanza) a 260 nm (A260) possono essere usate per la stima della concentrazione
del DNA dove 1 Au = 50 µg di DNA a doppio filamento/ml. In ciascuna reazione di
amplificazione con PCR si devono utilizzare cinquanta nanogrammi di DNA. La
concentrazione di DNA può essere sovrastimata dalla spettrofotometria se il
rapporto A260/A280 è basso o se il valore dell’assorbanza è basso (inferiore a 0,1).
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Condizioni della PCR
Nei Multiplex Master Mix conservati a –20°C si possono formare gradienti di
concentrazione. Dopo lo scongelamento, agitare ciascuna provetta su vortex per 1015 secondi prima dell'uso. Preriscaldare lo strumento fino a 94 °C prima di collocare
le provette al suo interno. Non usare più di 1 u di GoTaq® DNA Polymerase per
ciascuna reazione di amplificazione con PRC multiplex. I normali volumi PCR finali
usando il sistema Y Chromosome AZF Analysis System sono di 25µl. Volumi PCR
di 12,5 µl possono determinare l'assenza di bande multiple e non vanno usati.
C.
Termociclatori
Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System è stato ottimizzato per l'uso con il
Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480. L'uso di altri termociclatori richiede
l'ottimizzazione e la validazione del protocollo da parte dell'utente.
Si raccomanda di usare esclusivamente provette con pareti sottili. Per il
termociclatore Perkin-Elmer Model 480 usare provette di reazione GeneAmp®
da 0,5 ml a pareti sottili.
1.
Termociclatori con coperchio riscaldato e non riscaldato
I termociclatori sono disponibili con coperchio riscaldato o non riscaldato. Per
i termociclatori con coperchio non riscaldato (il Perkin-Elmer DNA Thermal
Cycler 480), è necessario coprire la reazione con olio minerale per impedire
l’evaporazione durante i cicli termici. Per i termociclatori con coperchio
riscaldato, la copertura con olio minerale non è necessaria. Il coperchio
riscaldato di questi termociclatori impedisce l’evaporazione della reazione
durante i cicli termici. Verificare però che il coperchio riscaldato funzioni
correttamente. Un’indicazione che il coperchio riscaldato di un termociclatore
non funziona è data dalla presenza di condensa nel coperchio e intorno alla
parte superiore delle provette di reazione amplificate; i risultati inoltre
possono indicare una esecuzione non corretta delle amplificazioni. Se non
si è sicuri riguardo alla calibrazione del coperchio riscaldato o si nota la
presenza di condensa nella provetta di reazione, coprire con olio minerale.
2.
Velocità di riscaldamento/raffreddamento del termociclatore
Il tempo che un termociclatore impiega per il passaggio dalle temperature di
denaturazione, ibridazione ed estensione dei profili nei cicli termici della PCR
(spesso chiamato "tempo di rampa") può influire sull'efficienza
dell'amplificazione con PCR. La velocità con cui un termociclatore passa alle
diverse temperature di un profilo di cicli termici della PCR dipende dalla sua
fabbricazione. Il protocollo dei cicli termici della PRC è stato otimizzato per il
termociclatore Perkin-Elmer Model 480. L'uso di altri termociclatori richiede la
validazione dei tempi di rampa da parte dell'utente.
3.
Calibrazione dell’apparecchiatura
Il successo dell’amplificazione con PCR, soprattutto nella PCR multiplex,
dipende dall’accuratezza dei cicli termici. Verificare che il termociclatore
utilizzato con il sistema Y Chromosome AZF Analysis System sia calibrato.
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Controllo della contaminazione
È fondamentale evitare la contaminazione da DNA dei componenti della reazione.
Per evitare la contaminazione, occorre isolare le aree di pre-amplificazione e postamplificazione, destinando preferibilmente stanze separate. Utilizzare sempre
puntali per pipette resistenti alla formazione di aerosol, pipette dedicate per la
preparazione delle reazioni, guanti monouso puliti ed evitare la contaminazione da
trasporto delle soluzioni madre. Le workstation e le pipette devono essere pulite con
una soluzione candeggiante neutra prima e dopo l’uso.
E.
Reazioni di controllo
Con ciascun esperimento occorre includere reazioni di controllo idonee.
5.
1.
Le reazioni di amplificazione usando come modello il controllo positivo con
Male Genomic DNA fornito devono sempre essere eseguite in parallelo con
i campioni. L’amplificazione con PCR del controllo positivo con Male Genomic
DNA fornito deve sempre generare i risultati di amplificazione attesi
(consultare la sezione 7.B, Tabella 1, per le quantità attese).
2.
In parallelo con i campioni occorre anche eseguire una reazione di
amplificazione con PCR del controllo negativo senza DNA per verificare che
i reagenti non siano contaminati da DNA. L’amplificazione con PCR di un
controllo senza DNA non deve produrre risultati di amplificazione.
Reazioni di amplificazione
Materiali che devono essere forniti dall’operatore
(Le composizioni delle soluzioni sono fornite nell’Appendice, Sezione 7.A.)
•
•
•
•
•
Olio minerale leggero senza nucleasi
Termociclatore
Provette di amplificazione a pareti sottili
• Per il Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480, usare provette di reazione
GeneAmp® da 0,5 ml a pareti sottili (Applied Biosystems Part# N801-0737,
N801-0611, o N801-0537)
Gel d'agarosio preformato: 4% NuSieve® 3:1 e minigel Reliant® d'agarosio
preformati in tampone TBE (Cambrex Cat.# 54927, 54928 o 54929)
Tampone TBE 1X
Bromuro di etidio
Puntali per pipette resistenti alla formazione di aerosol
Transilluminatore UV
ITALIANO
•
•
•
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Preparazione delle reazioni
La Figura 2 illustra un diagramma riepilogativo del protocollo di preparazione delle
reazioni. In questa procedura, aliquote di DNA campione vengono collocate in una
provetta di reazione. Separatamente, la Taq DNA polimerasi viene aggiunta
a ciascuno dei Multiplex Master Mix. Quindi, il Multiplex Master Mix contenente la
Taq DNA polimerasi viene aggiunto alle provette di reazione contenenti il DNA
campione. Ciascun campione di DNA viene analizzato usando ciascuno dei
Multiplex Master Mix.
Diluire il DNA campione
(in Nuclease-Free Water)
e preparare i controlli
Preparare le miscele di Multiplex Master Mix
e Taq DNA polimerasi, una per ciascun
Multiplex Master Mix.
DNA
campione
Controllo positivo Controllo
negativo
con Male
Genomic DNA senza DNA
Preparare le reazioni:
Multiplex
1. Collocare il DNA campione
o il controllo nelle provette. Master Mix per
ciascun campione
2. Aggiungere la miscela di
Multiplex Master Mix
e Taq DNA polimerasi.
A
B
Taq DNA polimerasi
per ciascun
campione
C
D
E
DNA
Controllo Controllo
campione positivo negativo
A
B
C
Cicli termici
D
E
3856MA10_2A
Elettroforesi su gel d'agarosio
Figura 2. Rappresentazione schematica dell’analisi con il sistema Y Chromosome AZF
Analysis System.
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1.
Scongelare i Multiplex Master Mix, la Nuclease-Free Water e il Male Genomic
DNA in ghiaccio. Una volta scongelati, conservare i prodotti in ghiaccio.
Agitare i Multiplex Master Mix su vortex per 5–10 secondi prima di usarli.
2.
Compilare la tabella sottostante per determinare il numero di reazioni per
ciascun Multiplex Master Mix. Per ciascun campione di DNA vi sono cinque
provette di reazione, una per ciascun Multiplex Master Mix. Includere un
controllo positivo con Male Genomic DNA e un controllo negativo senza DNA
per ciascun Multiplex Master Mix.
Multiplex
Master Mix
A
B
C
D
E
N. di
campioni
DNA
Controllo
positivo con Male
Genomic DNA
1
1
1
1
1
Controllo
negativo
senza DNA
1
1
1
1
1
Totale
provette di
reazione
3.
Preparare ed etichettare il numero necessario di provette di reazione come
stabilito sopra. Utilizzare provette di amplificazione con pareti sottili.
Collocare le provette di reazione nel ghiaccio.
4.
In una provetta separata, diluire ciascun campione di DNA in 10 ng/µl usando
la Nuclease-Free Water fornita. Miscelare bene su vortex per 5–10 secondi.
Aggiungere 5 µl di DNA diluito alle provette di reazione con l’etichetta
corretta poste nel ghiaccio.
Controllo positivo con campione di DNA: per il controllo positivo con
campione di Male Genomic DNA, diluire il Male Genomic DNA in 10 ng/µl
aggiungendo 6 µl di Male Genomic DNA in 24 µl di Nuclease-Free Water.
Miscelare bene su vortex per 5–10 secondi. Aggiungere 5 µl nelle provette di
reazione con l’etichetta corretta poste nel ghiaccio.
Controllo negativo senza DNA: per il controllo negativo (senza DNA),
aggiungere 5 µl di Nuclease-Free Water nelle provette di reazione con
l’etichetta corretta poste nel ghiaccio.
Preparare cinque miscele Multiplex Master Mix/GoTaq® DNA polimerasi in
ghiaccio, una per ciascun Multiplex Master Mix. Agitare i Multiplex Master
Mix su vortex prima di usarli.
Componente
Multiplex Master Mix
GoTaq® DNA polimerasi (5 u/µl)
Volume finale
Volume per
reazione
20 µl
0,2 µl
20,2 µl
ITALIANO
5.
Volume per
10 reazioni
200 µl
2 µl
202 µl
6.
Agitare su vortex per miscelare.
7.
Aggiungere 20 µl della miscela Multiplex Master Mix/GoTaq® DNA
polimerasi alle provette di reazione appropriate, contenenti il DNA campione
o i controlli, poste nel ghiaccio.
8.
Agitare delicatamente su vortex per miscelare.
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9.
Centrifugare brevemente le provette per portare il contenuto sul fondo delle
provette. Collocare le provette di reazione nel ghiaccio finché si è pronti per i
cicli termici.
10.
Per i termociclatori con coperchio non riscaldato (ad esempio il Perkin-Elmer
Model 480) è necessario coprire le reazioni nella provetta di reazione con olio
minerale. Inclinare le provette e aggiungere una goccia di olio sul lato della
provetta, permettendo all’olio di scorrere in basso lungo il lato della provetta.
Protocollo ottimale per cicli termici PCR per l'uso con termociclatore
Perkin-Elmer Model 480
Il seguente protocollo è stato otimizzato per il termociclatore Perkin-Elmer Model
480. Se usa un termociclatore diverso, l'utente è tenuto ad eseguire l'ottimizzazione e
la validazione del protocollo.
È fondamentale preriscaldare lo strumento fino a 94 °C prima di collocare le
provette al suo interno.
C.
Termociclatore
Provette di reazione
DNA polimerasi
Condizioni della PCR
Model 480
0.5ml GeneAmp® a
pareti sottili
GoTaq® DNA
Polymerase
94 °C per 2 minuti, quindi
94 °C per 1 minuto
57 °C per 30 secondi
72 °C per 1 minuto
Ripetere per 35 cicli, quindi:
72 °C per 5 minuti
immergere a 4 °C
Elettroforesi su gel d’agarosio
4% NuSieve® 3:1 e minigel Reliant® preformati in tampone TBE (Cambrex, n. di cat.
54927, 54928 o 54929) sono necessari per l’elettroforesi e la successiva
visualizzazione ottimale dei prodotti di amplificazione.
1.
Diluire il marker di peso molecolare come segue:
Componente
50bp DNA Step Ladder
Blue/Orange 6X Loading Dye
Nuclease-Free Water
Volume
12 µl
4 µl
8 µl
2.
Aggiungere 2,5 µl di Blue/Orange 6X Loading Dye a ciascuna provetta di
amplificazione e miscelare.
3.
Caricare 10 µl del marker di peso molecolare diluito sul primo pozzetto
del gel.
4.
Caricare 10 µl/pozzetto di ciascun campione.
5.
Caricare 10 µl del marker di peso molecolare diluito sull’ultimo pozzetto del gel.
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6.
Analizzare il gel in TBE 1X contenente 0,5 µg/ml di bromuro di etidio
a 5 V/cm (misurato come la distanza tra gli elettrodi) finché il blu di
bromofenolo non migra sul fondo del gel.
7.
Fotografare il gel usando un transilluminatore UV (320 nm).
Analisi dei dati—Controlli
1.
Controllo negativo senza DNA – Non vi dovrebbero essere prodotti di
amplificazione specifici nelle corsie contenenti le reazioni con il controllo
negativo senza DNA. Vi potrebbero essere bande o strisce di basso peso
molecolare dovute alle interazioni dei primer. I risultati non devono essere
considerati validi se nelle reazioni con controllo negativo senza DNA si
osservano prodotti di amplificazione. Ciò indica la presenza di
contaminazione da DNA e l’esperimento va ripetuto prestando attenzione
a evitare la contaminazione.
2.
Controllo positivo con Male Genomic DNA – Nella Tabella 1 (sezione 7.B)
sono indicati il numero e la quantità dei prodotti di amplificazione per ciascun
Multiplex Master Mix. La reazione con controllo positivo contenente Male
Genomic DNA per ciascun Multiplex Master Mix deve presentare tutte le
bande indicate per il Multiplex Master Mix specifico (sezione 7.B, Tabella 1).
Le quantità dei prodotti di amplificazione possono essere stimate mediante un
confronto con il marker 50bp DNA Step Ladder analizzato sul gel. Se non tutte
le bande attese sono presenti nelle reazioni con il controllo positivo contenente
Male Genomic DNA, o se vi sono bande supplementari prominenti, significa
che vi sono problemi con i reagenti di amplificazione o con il termociclatore.
I risultati non devono essere considerati validi se nelle reazioni con il controllo
positivo contenente Male Genomic DNA si osserva l’assenza di uno qualsiasi
dei prodotti di amplificazione attesi.
3.
Primer di controllo nei Multiplex Master Mix – Nelle reazioni con Multiplex
A, B, C e D Master Mix, si deve osservare la generazione del più piccolo
prodotto di amplificazione (83bp) da un locus SMCX (X-linked). Nel Multiplex
E Master Mix, si deve osservare la generazione del più grande prodotto di
amplificazione (496bp) dai geni ZFY/ZFX. L’assenza di questi prodotti indica
un problema relativo a quella particolare amplificazione con PCR multiplex.
Se queste bande di controllo sono presenti con il controllo positivo contenente
Male Genomic DNA ma non con il DNA campione, significa che potrebbe
esservi un problema con il DNA genomico usato come modello. Possibili
problemi con il DNA campione: presenza di impurità, misurazioni non
accurate del DNA o DNA deteriorato. Verificare il DNA modello su un gel
d’agarosio prima di ripetere l’amplificazione. Ripetere le amplificazioni dalle
reazioni con DNA campione nelle quali il prodotto di controllo è assente.
Potrebbe essere necessario isolare nuovamente il DNA genomico modello.
ITALIANO
Prima di analizzare i campioni, determinare che le reazioni di controllo abbiano
prodotto i risultati attesi. I fogli di lavoro forniti (consultare la sezione 7.B, Tabella 1)
possono essere usati sia per l’analisi dei controlli che dei campioni sperimentali.
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Analisi dei dati—Campioni sperimentali
I fogli di lavoro forniti nell'Appendice (sezione 7.B) possono essere usati per l'analisi
di campioni sperimentali. Determinare la presenza o l'assenza dei prodotti di PCR
attesi (sezione 7.B, Tabella 1). I prodotti eventualmente mancanti dalle reazioni
possono essere mappati usando il foglio di lavoro della mappa del cromosoma Y
(sezione 7.B, Tabella 2). Tutte le delezioni devono essere contigue. Se per un
campione mancano più bande di amplificazione, e tali bande non sono mappate in
regioni adiacenti del cromosoma Y (sezione 7.B, Tabella 2), esse rappresentano
bande mancanti, non delezioni. In questo caso il test deve essere ripetuto. Una sola
banda di amplificazione mancante in un campione può rappresentare una banda
assente e il test deve essere ripetuto per confermare che il locus non si amplifica. Si
noti che un locus presente in un campione può non amplificarsi, se esiste una
mutazione di uno dei siti di legame primer per il locus. I risultati diagnostici
ottenuti mediante questo sistema possono essere interpretati solo insieme ad altri
dati clinici o di laboratorio. La figura 3 mostra un esempio di analisi su gel del DNA
campione che evidenzia una delezione del cromosoma Y dalle posizioni da 15 a 20
nella mappa.
A
B
3 M
C
4
5 M
D
6
7 M
E
8
9 M 10
4534TA
1 M 2
Figura 3. Esempio di analisi su gel che evidenzia delezioni del cromosoma Y. Sono illustrati
i prodotti di amplificazione ottenuti dalle reazioni con i Multiplex A-E Master Mix. Ciascun
Multiplex Master Mix viene utilizzato per l’amplificazione di campioni con Male Genomic
DNA (MD115A) (corsie 1, 3, 5, 7, 9) e di un campione rappresentativo contenente delezioni del
cromosoma Y (corsie 2, 4, 6, 8, 10). Le bande ottenute dall’amplificazione del controllo positivo
con Male Genomic DNA vengono confrontate alle bande ottenute dal DNA genomico del test
con delezioni del cromosoma Y (notare le bande delete in tutte queste corsie tranne che nel
Multiplex E). Il marker (corsie M) è il 50bp DNA Step Ladder fornito con il sistema.
Sono state osservate bande non specifiche sopra o sotto i prodotti di amplificazione
attesi sul gel d’agarosio – in particolare una banda debole è stata osservata in
Multiplex D a circa 150bp e in Multiplex E sopra il controllo. Verificare che i
controlli negativi in uso (amplificazioni senza campione di DNA) mostrino prodotti
di amplificazione senza PCR rilevabili. Se i controlli negativi non mostrano prodotti
di amplificazione con PCR, le bande non specifiche non hanno alcun effetto
sull’analisi. Nota: E’ possibile osservare un’amplificazione del locus SY133 in alcuni
individui con una delezione della regione AZFb, suggerendo che questo locus possa
essere ripetuto anche in altre parti del cromosoma.
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Bibliografia
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ITALIANO
6.
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Appendice
A.
Composizione dei tamponi e delle soluzioni
Tampone TBE 1X
89 mM Tris base
110 mM acido borico
2 mM EDTA
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B.
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Fogli di lavoro
Tabella 1. Profilo dei prodotti di amplificazione con PCR per campioni del test
Annotare la presenza (+) o l’assenza (–) dei prodotti di amplificazione con PCR attesi per
ciascun campione sperimentale.
Multiplex A Master Mix
STS
SY254
SY157
SY81
SY130
SY182
Locus
DAZ
DYS240
DYS271
DYS221
KAL-Y
SMCX
Campioni (+/–)
Quantità di Posizione
prodotto (bp) sulla mappa
380
18
290
20
209
2
173
11
125
5
83
Controllo
Multiplex B Master Mix
STS
SYPR3
SY127
SY242
SY208
Locus
SMCY
DYS218
DAZ
DAZ
SMCX
Campioni (+/–)
362
7
274
9
233
16
140
17
83
Controllo
Multiplex C Master Mix
STS
SY128
SY121
SY145
SY255
Campioni (+/–)
Locus
DYS219
228
10
DYS212
190
6
DYF51S1
143
14
DAZ
124
19
SMCX
83
Controllo
Multiplex D Master Mix
STS
SY133
SY152
SY124
Locus
DYS223
DYS236
DYS215
SMCX
Campioni (+/–)
177
12
125
15
109
8
83
Controllo
Multiplex E Master Mix
STS
SY14
SY134
SY86
SY84
Campioni (+/–)
Locus
ZFX/ZFY
496
Controllo
SRY
400
1
DYS224
303
13
DYS148
232
3
DYS273
177
4
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RBMY1, RBAY2 (Cluster)
DAZ (Cluster)
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SMCY
DYZ19 (ripetuto)
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TSPY
AMELY
Centromero
KAL-Y
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SRY
RPS4Y
ZFY
CSF2RA
IL3RA
ANT3
ASMT
XE7
MIC2p
MIC2
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Yp
Yq
Eucromatina
Eterocromatina
pseudoautosomico
pseudoautosomico
SRY
SRY
DYS271
DYS148
DYS273
KALY
DYS212
SMCY
DYS215
DYS218
DYS219
DYS221
DYS223
DYS224
DYF51S1
DYS236
DAZ
DAZ
DAZ
DAZ
DYS240
AZFc/AZFd prossimale
AZFb
AZFc
ZFX
SMCX
SMCX
SMCX
SMCX
ZFY
Control
Multiplex
A
Control
Multiplex
B
Control
Control
Multiplex Multiplex
D
C
Control
Multiplex
E
4320MA09_3A
ITALIANO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
SY14
SY81
SY86
SY84
SY182
SY121
SYPR3
SY124
SY127
SY128
SY130
SY133
SY134
SY145
SY152
SY242
SY208
SY254
SY255
SY157
AZFa
Tabella 2. Foglio di lavoro della mappa del cromosoma Y. Per ulteriori dettagli vedere la Figura 2 supplementare del
riferimento bibliografico 8. I palindromi 8, 7, 6, 5 e 4 si collocano nella mappa nella direzione prossimale di SY121 e nella
direzione distale di SY182 (1). SY121 si situa presso il confine distale di P4 (8). AZFb si estende da P5 a P1 prossimale (8).
AZFc include P1 e P2 (8). Almeno una copia di SY157 si situa nella mappa al di fuori del confine AZFc. Nota: E’ possibile
osservare un’amplificazione del locus SY133 in alcuni individui con una delezione della regione AZFb, suggerendo che
questo locus possa essere ripetuto anche in altre parti del cromosoma.
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(a)U.S. Pat. No. 6,242,235, Australian Pat. No. 761757, Canadian Pat. No. 2,335,153, Chinese Pat. No. ZL99808861.7, Hong
Kong Pat. No. HK 1040262, Japanese Pat. No. 3673175, European Pat. No. 1088060 and other patents pending.
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