Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte

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Università degli studi di Catania
Dipartimento di Scienze del Farmaco
Corso di laurea in
TOSSICOLOGIA DELL’AMBIENTE E DEGLI ALIMENTI
Loria Tino
Le Aflatossine nel pistacchio
commercializzato a Bronte
Tesi di Laurea
Relatrice:
Chiar.ma Prof.ssa A. Panico
Correlatore:
Dott. D. Pulvirenti
Anno Accademico 2014-2015
Tesi di Laurea
Loria Tino
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Tesi di Laurea
Loria Tino
INDICE
1
PREMESSA ............................................................................................................................................ 5
2
IL PISTACCHIO ....................................................................................................................................... 8
3
IL PISTACCHIO VERDE DI BRONTE - DOP ............................................................................................ 11
3.1
Disposizioni del Regolamento ........................................................................................................ 12
3.2
Prodotti al Pistacchio ...................................................................................................................... 14
3.3
Il commercio del Pistacchio a Bronte ............................................................................................. 16
4
LE MICOTOSSINE ................................................................................................................................ 20
4.1
5
Diffusione e Tossicità...................................................................................................................... 21
LE AFLATOSSINE ................................................................................................................................. 25
5.1
Cenni storici .................................................................................................................................... 25
5.2
Struttura Chimica e proprietà chimico-fisiche ............................................................................... 26
5.3
Produzione da Aspergillus .............................................................................................................. 28
5.4
Fattori che ne influenzano la produzione ...................................................................................... 31
5.5
Contaminazione dei pistacchi......................................................................................................... 32
5.6
Le importazioni in Europa ed il sistema RASFF............................................................................... 37
5.7
Normativa ....................................................................................................................................... 44
6
TOSSICITA’ DELLE AFLATOSSINE ......................................................................................................... 49
6.1
Tossicocinetica ............................................................................................................................... 51
6.1.1
Assorbimento ............................................................................................................................. 51
6.1.2
Distribuzione .............................................................................................................................. 51
6.1.3
Metabolismo .............................................................................................................................. 52
6.1.4
Escrezione................................................................................................................................... 54
6.2
Tossicodinamica ............................................................................................................................. 55
6.3
Tossicità Acuta ................................................................................................................................ 56
6.4
Tossicità Cronica ............................................................................................................................. 58
7
DETERMINAZIONE ANALITICA DELLE AFLATOSSINE........................................................................... 60
7.1
Campionamento ............................................................................................................................. 60
7.2
Scelta del metodo di analisi............................................................................................................ 60
7.3
Confronto delle tecniche analitiche applicabili .............................................................................. 62
7.4
Metodo analitico Applicato ............................................................................................................ 64
7.4.1
Principio del metodo .................................................................................................................. 64
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7.4.2
Fasi operative ............................................................................................................................. 64
7.4.3
Reagenti e Soluzioni ................................................................................................................... 65
7.4.4
Strumentazione .......................................................................................................................... 66
7.4.5
Condizioni operative................................................................................................................... 68
7.4.6
Procedura di calibrazione ........................................................................................................... 68
7.4.7
Preparazione del campione ........................................................................................................ 72
7.4.8
Estrazione ................................................................................................................................... 72
7.4.9
Clean-up ..................................................................................................................................... 73
7.4.10
Analisi del campione .................................................................................................................. 75
7.4.11
Calcolo ed espressione del risultato ........................................................................................... 77
7.4.12
Validazione e Prestazioni del metodo ........................................................................................ 78
8
SCOPO DELLA TESI .............................................................................................................................. 81
8.1
Scelta dei campioni......................................................................................................................... 81
8.2
Dati sperimentali ottenuti .............................................................................................................. 83
8.3
Analisi dei Risultati ......................................................................................................................... 85
9
CONCLUSIONI ..................................................................................................................................... 87
10
ALLEGATI ........................................................................................................................................ 89
11
RINGRAZIAMENTI ...................................................................... Errore. Il segnalibro non è definito.
12
RIFERIMENTI ................................................................................................................................... 94
12.1
Sitografia ........................................................................................................................................ 94
12.2
Bibliografia...................................................................................................................................... 94
12.3
Normative ....................................................................................................................................... 95
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1 PREMESSA
Il pistacchio di Bronte rappresenta per me un prodotto al quale sono particolarmente legato
per le mie origini. Fin da piccolo ho partecipato alla raccolta e su questa ho dei bellissimi ricordi
legati a mio nonno, a tal proposito riporto un racconto che scrissi nel settembre 2013:
Stasera la statale mi ha fatto sognare
“Percorrendo quei quindici chilometri in direzione di Catania, ti rendi conto di quanto le
campagne brontesi siano particolarmente vive in questo periodo dell’anno.
E ti stupisci pensando a come le nostre famiglie da secoli ripetano la medesima cosa.
Tante piccole luci segnano il territorio circostante e dalla strada le vedi brillare come stelle, e
proprio come le stelle, mentre viaggiavo, mi hanno fatto sognare ad occhi aperti.
Mi sono affiorati alla mente ricordi che quasi credevo di aver cancellato, ricordi della mia
infanzia. Ricordi di quando, le ultime settimane d’estate, mi trasferivo in campagna dai miei
nonni in compagnia dei miei cugini, ma senza i miei genitori.
Sono passati quasi 20 anni da allora e mi piace pensare che le stesse cose le stiano facendo i
bambini di adesso, anche se è difficile che si stacchino dall’invadente tecnologia che ci
circonda.
Il ricordo più bello era di stare coi miei cugini a scherzare, lavorare, giocare e dormire tutti
insieme.
La raccolta per noi era una cosa bella:
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Ricordo che mio nonno ci pagava per ogni secchio di pistacchio, e visto che in un giorno non
riuscivamo a riempirlo, ricordo che custodivamo il nostro raccolto come oro negli armadi del
garage, al riparo da furti e sabotaggi che noi stessi mettevamo in atto.
Ricordo l’odore del mattino, ci alzavamo presto ed amavo lavarmi all’aperto con l’acqua
fredda.
Ricordo la colazione fatta di latte e brioches, a scelta potevamo anche metterci del caffè.
Ricordo il sapore dell’acqua del pozzo che usavamo per dissetarci, aveva un sapore metallico,
forse perche la tiravamo su con una vecchia pentola di alluminio e la bevevamo direttamente
da li.
Ricordo l’odore sgradevole di quell’insetto verde soprannominato da noi “a fitusa” e ricordo
che ci macchiava le mani.
Ricordo il pranzo, spesso fatto di pasta al pomodoro, molto semplice ma eravamo tutti li
attorno alla tavola ad aspettarlo.
Ricordo i pomeriggi passati a stendere i pistacchi al sole sul tetto e quelli passati a mangiarli
col rischio che ci venisse la febbre.
Ricordo i giochi che facevamo: scavare buche nel terreno creando sottopassaggi e sperando
che non crollassero, scendere da quella strada in cemento con la “cariola” fatta di tavole di
legno e cuscinetti come ruote, andare su quella bici rosa senza freni di mio cugino, e poi non
mancava in nascondino della sera o il gioco della settimana coi numeri impressi sul cemento.
Ricordo la sera quando ci pulivamo con l’olio rancido le braccia fatte di colla e ricordo le
ciocche di capelli tagliate per via della troppa colla.
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Ricordo la cena, fatta di cotoletta ed insalata, e quella tv in bianco e nero sul camino che
raramente prendeva qualche canale.
Ricordo il dopocena, dopo la doccia uscivamo nel cortile in pigiama a goderci quell’aria
fresca, e ricordo l’odore dei millepiedi che risalivano le mura della casa.
Ricordo la notte, dormivamo tutti insieme in dei letti sistemati giornalmente nella cucina per
noi bambini. Non dormivamo mai prima dell’una e davamo la caccia alle zanzare. Ogni tanto
qualche topolino di campagna ci faceva visita, ed al mattino lo trovavamo nelle trappole di
colla.
E ricordo che al mattino eravamo nuovamente tutti li, felici di cominciare la nostra nuova
giornata lavorativa.“
Tino Loria
L’elaborato si articola in una prima parte volta a dare nozioni sulla produzione e la lavorazione
che il Pistacchio subisce a Bronte, correlata da alcuni dati sulle importazioni.
Una seconda parte interessa la contaminazione da aflatossine: come avviene, quali sono le
condizioni favorevoli, quali le fasi critiche per lo sviluppo; seguita da informazioni sulla loro
tossicità ed il loro effetto sulla salute umana.
Nella terza parte verrà descritto il metodo analitico per la determinazione delle aflatossine ed i
risultati delle prove eseguite su campioni di prodotto al Pistacchio commercializzati a Bronte.
Buona Lettura.
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2 IL PISTACCHIO
Il pistacchio (Pistacia vera - L.) è un albero della famiglia delle Anacardiaceae. Può raggiungere
un'altezza di circa 12 metri e un'età di 300 anni.
È originario del Medio Oriente, dove veniva coltivato già in età preistorica, particolarmente in
Persia. La coltura del pistacchio, dalla Siria sarebbe passata in Grecia a seguito delle conquiste
di Alessandro Magno (III secolo a.C.).
In Italia la pianta fu introdotta dai Romani; mentre in Sicilia, la coltivazione in forma diffusa, si
fa risalire al Periodo della dominazione araba (VIII e IX secolo d.C.). Sono di origine araba,
infatti, i termini “frastuca” e “frastucara” usati in Sicilia per indicare il frutto e la pianta (termine
arabo “fustuq”).
Il frutto è una drupa con un endocarpo ovale a guscio sottile e duro, contenente il seme,
chiamato comunemente "pistacchio" che ha colore verde vivo sotto una buccia viola.
L'alimento è formato per l'83% da lipidi, per il 12% da proteine e per il 5% da carboidrati.
Zone di coltivazione a rilevanza internazionale si trovano in Medio Oriente (Iran, Turchia e
Siria), negli Stati Uniti (California) e, negli ultimi anni, anche in Cina. (S2)
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Iran
tonnellate prodotte
(2012)
472 097
Rendimento
(tonnellate/ettaro)
1,78
Stati Uniti
231 000
Turchia
150 000
4,27
3,03
Cina
74 000
1,53
Siria
57 195
2,48
Grecia
10 000
2,6
Italia (Sicilia)
3 100
1,76
Afghanistan
2 000
1,43
Australia
1 792
0,06
Tunisia
1 400
1,33
Mondo
1 005 610
2,03
Paese
Tabella 1 - Produzione di pistacchio nel mondo anno 2012 (S3)
Nel territorio di Bronte (Catania), in oltre 2600 Ettari di terreno, c’è l’80 % della produzione
Siciliana (2500 tonnellate prodotte nel 2012) e rappresenta lo 0,25 % della quantità prodotta
nel mondo.
(B1) (S5)
. Riguardo la quantità di prodotto importato in Italia, si veda invece il
paragrafo 5.6 (Le importazioni in Europa ed il sistema RASFF)
A differenza del resto del mondo, a Bronte le piante di pistacchio crescono prevalentemente in
terreni sconnessi di origine vulcanica che rendono complicata l’automazione della racconta, che
avviene dunque manualmente, ma conferiscono al prodotto particolari qualità organolettiche.
Si presenta, ad esempio, di colore verde intenso rispetto ai prodotti esteri, questo dovuto alla
maggiore quantità di MgO nei terreni di produzione vulcanica. Il Mg++, come noto, costituisce la
molecola centrale della clorofilla conferendogli il colore verde-giallastro. (B13)
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TIPOLOGIE DI PIANTAGIONI E METODO DI RACCOLTA GENERALI:
TIPOLOGIE DI PIANTAGIONI E METODO DI RACCOLTA A BRONTE:
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3 IL PISTACCHIO VERDE DI BRONTE - DOP
Il pistacchio di Bronte è una varietà di pistacchio a Denominazione di origine protetta DOP, il
riconoscimento è stato pubblicato nel Reg. UE n. 21 del 12 gennaio 2010. (N1)
La denominazione di origine protetta “Pistacchio Verde di Bronte” è riservata al prodotto, in
guscio, sgusciato o pelato, delle piante della specie botanica “Pistacia vera”, cultivar
“Napoletana”, chiamata anche “Bianca” o “Nostrale”, innestata su “Pistacia terebinthus” (S4).
La coltivazione e la produzione di pistacchio rappresenta per Bronte, un importante fonte di
reddito, tanto da essere soprannominato l' Oro Verde, per il suo alto valore commerciale.
La città di Bronte ha saputo sfruttare questo vantaggio, infatti nel suo territorio si contano oltre
1000 produttori, la maggior parte con appezzamenti di circa 1 ettaro cadauno, nonché qualche
grosso produttore con un multiplo di ettari.
Tradizionalmente la raccolta è biennale, l’ultima è stato proprio a settembre 2015. Questo
antico sistema è volto a garantire un prodotto di maggiore qualità. Evitando il sovraccarico
annuale si ottiene anche una quantità maggiore di frutto nell’anno di carica. Recentemente
qualche produttore ha iniziato ad applicare il sistema di raccolta annuale con dei risultati
soddisfacenti nel breve termine, ma si sconoscono ancora le ricadute a lungo termine sulla vita
delle piante.
Il frutto raccolto viene in genere smallato ed asciugato al sole ad opera del produttore stesso,
che poi vende il suo pistacchio in guscio alle aziende di trasformazione locali. (S2)
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Figura 1 - Pistacchio di Bronte in fase di Maturazione
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Figura 2 - Metodo di essiccazione del pistacchio a Bronte
3.1 Disposizioni del Regolamento
Il “Pistacchio Verde di Bronte” DOP all’atto dell’immissione al consumo deve rispondere,
oltre alle comuni norme di qualità, alle seguenti caratteristiche fisiche ed organolettiche:

colore cotiledoni: verde intenso, rapporto di clorofilla a/b compreso tra 1,3 e 1,5;

sapore: aromatico forte, senza inflessione di muffa o sapori estranei;

contenuto di umidità compreso tra 4% e 6%;

rapporto lunghezza/larghezza del gheriglio compreso tra 1,5 e 1,9;

alto contenuto di grassi monoinsaturi nei frutti (presenza predominante dell’acido
oleico con il 72%, seguito dal 15% del linoleico e dal 10% del palmitico). (N1)
La zona di produzione del “Pistacchio Verde di Bronte”, ricade nel territorio dei comuni di
Bronte, Adrano, Biancavilla (Provincia di Catania). In particolare i confini sono cosi
individuati:

BRONTE - ad Ovest lungo il fiume Simeto, ad Est fino a quota 900 m s.l.m., a Sud con il
Comune di Adrano ed a Nord lungo la strada Bronte - Cesarò;
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
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ADRANO - a Nord con il confine del Comune di Bronte, a Sud con il centro abitato e la
S.S. 121 ed a Est con la lava “Grande” del 1595 e con il Comune di Biancavilla, ad Ovest
lungo il fiume Simeto fino alla summensionata S.S. 121;

BIANCAVILLA - a Nord con il territorio di Adrano, a Sud con il centro abitato e la S.S.
121, a Est con il confine comunale di S. M. Licodia, ad Ovest con il confine del Comune
di Adrano.
La zona di produzione deve essere compresa tra i 400 e i 900 m s.l.m. La zona delimitata è
caratterizzata da suoli che evolvono su substrati di origine vulcanica. Le peculiarità
pedoclimatiche e la tecnica della degemmazione, praticata nella zona di produzione del
“Pistacchio Verde di Bronte” consentono di accentuare la naturale alternanza della specie
e di trarre vantaggi nella difesa fitosanitaria. (N1)
Le operazioni di raccolta del prodotto al corretto grado di maturazione, in relazione alle
zone di produzione e all’andamento climatico, si svolgono dalla seconda decade di agosto
alla prima decade di ottobre.
La raccolta avviene manualmente mediante bacchiatura sulle reti o per brucatura,
utilizzando panieri avendo cura di impedire che i frutti cadano per terra.
I frutti devono essere smallati meccanicamente, per ottenere il prodotto in guscio, entro
le 24 ore successive alla raccolta, onde evitarne l’imbrunimento e l’eventuale
contaminazione. Successivamente alla fase di smallatura, il prodotto in guscio deve essere
immediatamente essiccato alla luce diretta o con altri sistemi d’essiccamento,
mantenendo la temperatura del prodotto compresa tra i 40 ei 50°C, fino ad un’umidità
residua del seme di pistacchio compresa tra il 4 ed il 6%, In questa fase, soprattutto nel
sistema tradizionale alla luce diretta, è alto il rischio di contaminazione del prodotto.
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Il prodotto essiccato deve essere messo in contenitori nuovi di juta, carta o polietilene ed
evitare il contatto con pavimenti o muri, in idonei locali ventilati ed asciutti.
Lo stoccaggio può durare fino a 24 mesi dopo la raccolta. E’ possibile sgusciare e/o pelare
meccanicamente il pistacchio.
E’ assolutamente vietato utilizzare prodotti chimici per la conservazione del “Pistacchio
Verde di Bronte” DOP.
Nel periodo marzo-ottobre, in funzione dell’andamento climatico, il prodotto nelle
diverse tipologie, in guscio, sgusciato o pelato, deve essere conservato a temperatura
compresa tra 13 e 17°C, oppure in confezioni sigillate sottovuoto o in atmosfera
modificata. (N1)
3.2 Prodotti al Pistacchio
A Bronte si producono un'infinita varietà di prodotti derivati dalla lavorazione del
pistacchio, come il famoso pesto di pistacchio per il condimento della pasta, il gelato al
pistacchio, gli arancini al pistacchio, le paste di pistacchio, le torte al pistacchio, la crema
di pistacchio, la crema dolce spalmabile di pistacchio, il cioccolato al pistacchio, il liquore
al pistacchio, il panettone natalizio al pistacchio, le “fillette” al pistacchio (dolce tipico
brontese presente anche al gusto di vaniglia) e molto altro.
Il pistacchio al naturale ed il pistacchio semilavorato per pasticcerie, viene
commercializzato prevalentemente in cinque diverse forme che poi serviranno alla
produzione dei vari prodotti finiti.
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Nome
Trattamento
Uso
Pistacchio in
guscio
trattamento di smallatura
meccanica ed essiccazione
a 50 °C circa in forni
ventilati o luce solare
Produzione delle
altre forme di
vendita.
Pistacchio
sgusciato
sgusciatura meccanica,
non subisce trattamenti
termici.
Per lo più a scopo
decorativo e
produzione di
pistacchio tritato
Pistacchio
pelato
pelatura del pistacchio
sgusciato sottoposto a
trattamento con vapore
d’acqua a 100 °C per pochi
minuti.
Per lo più a scopo
decorativo e
produzione di
pistacchio tritato
Pistacchio
tritato
prodotto da pistacchio
tostatura a 120 °C per 60
minuti e triturazione.
Dimensione:
- farina < 1 mm
- granella: 2-4 mm
Usato per la
preparazione di
paste, torte, pesto,
liquore ed uso
decorativo
Pasta pura di
pistacchio al
100%,
prodotto da pistacchio
tostatura a 120 °C per 60
minuti e lavorazione con
macchine raffinatrici in
modo da ottenere un
prodotto cremoso.
Usato per la
preparazione del
gelato, crema
spalmabile,
cioccolato
Foto
Tabella 2 - Diverse forme di vendita del pistacchio al naturale (foto S1)
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E facile notare come nelle ultime forme di vendita, pistacchio tritato e pasta pura di
pistacchio al 100%, il pistacchio perda la sua originale dimensione e forma utile per
l’individuazione della varietà e dunque presunta provenienza del prodotto.
Sono queste due forme infatti quelle maggiormente a rischio di contraffazione per
miscelazione con pistacchio di importazione o addirittura con olio di semi vari per la pasta
di pistacchio dichiarata pura al 100%.
3.3 Il commercio del Pistacchio a Bronte
Alcune imprese dichiarano di acquistare solo prodotto locale mentre altre (70% del
totale) anche prodotto d’importazione. (B1)
L’approvvigionamento del prodotto locale avviene solitamente durante l’annata di carica
e si concentra nel periodo che va dal mese di agosto al mese di ottobre.
L’approvvigionamento del prodotto d’importazione avviene durante tutto il corso
dell’anno. (B1)
Il prodotto che riscontra il maggior gradimento dagli importatori brontesi (miglior
rapporto qualità/prezzo) è il pistacchio turco. Infatti il 100% di coloro che importano,
acquistano quasi esclusivamente dalla Turchia; solo due imprese associano una buon
quantitativo di prodotto siriano (50% e 10% del totale di prodotto importato) ed una
acquista dall’Iran il 10% dei propri fabbisogni. (B1)
Dai dati del commercio di pistacchio in UE riportati in Tabella 6, risulta invece che i
principali fornitori sono Stati Uniti ed Iran, dal quale la Sicilia importa il 75% del totale.
Tale dato risulta essere in contrasto con quanto dichiarato dagli operatori brontesi. (B1)
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Quattro sono gli importatori brontesi, questi acquistano sia prodotti locali ed eseguono la
sgusciatura e/o pelatura meccanica, sia prodotti di importazione che arriva già sgusciato.
Eseguono quindi lo stoccaggio e rivendono il prodotto al naturale o la pasta pura al 100%
alle aziende di lavorazione locali, nazionali ed estere.
Sul territorio sono inoltre presenti circa 20 esercizi pubblici (bar), che tramandano l’antica
maestria dei pasticceri Brontesi nella lavorazione del pistacchio per ottenere prodotti di
alta qualità che vengono venduti prevalentemente sul luogo di produzione.
A questi si aggiungono circa 20 aziende di lavorazione del pistacchio che
commercializzano prodotti semilavorati e lavorati all’ingrosso e dettaglio.
Per pubblicizzare i propri prodotti molte imprese ricorrono a diverse iniziative
pubblicitarie, l’80% delle imprese possiede un proprio marchio d’origine e la stessa
percentuale ha effettuato azioni di pubblicità; diversi sono i mezzi utilizzati: il 70% ricorre
ai quotidiani e/o settimanali e partecipa a fiere o mostre mercato. Il 60% delle imprese, è
organizzata nell’effettuare pubblicità direttamente sul punto vendita mediante una rete
commerciale, ed il 40% delle imprese viene pubblicizzata su riviste specializzate. In ogni
caso, il mezzo pubblicitario più importante è internet, utilizzato a tal fine dal 90% delle
imprese, e la stessa percentuale, è dotata di un sito proprio; inoltre il 70% di esse utilizza
il sito per l’E-commerce.
Io personalmente, che possiedo delle discrete capacità informatiche, ho realizzato nel
2015 un sito e-commerce per un mio caro amico brontese che ha deciso di avviare
un’attività commerciale su internet di prodotti al pistacchio, creando un proprio marchio
ma delegando la produzione ad aziende già presenti sul mercato (S8).
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Diagramma 1 – Flusso delle vendite di pistacchio a Bronte
Complessivamente l' Oro Verde produce annualmente una ricchezza di circa 20 milioni di
euro. I mercati di destinazione dei prodotti realizzati sono per l’80% nazionale ed il 20%
estero. (B1)
Riguardo la ripartizione percentuale dei mercati di destinazione nazionali, il mercato
siciliano assorbe il 35% del prodotto ed il nord Italia assorbe quasi il 40% dell’intera
produzione; tra le regioni settentrionali un ruolo primario è rivestito dalla Lombardia.
Per quanto riguarda il mercato estero, essi vengono raggiunti prevalentemente (60% delle
imprese) tramite gli importatori grossisti; per il 30% delle imprese esistono canali diretti
con negozi esteri specializzati. (B1)
La Germania rappresenta un interessante mercato per l’80% delle imprese e, per alcune
di esse, rappresenta l’unico interlocutore estero. Seguono la Francia, dove esporta il 60%
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delle imprese, la Svizzera e gli Stati Uniti con il 40%, il Giappone con il 20%, la Svezia,
l’Olanda e l’Australia con il 10%. (B1)
Allo scopo di tutelare i produttori locali, ottenere una maggiore equità nella distribuzione
dei redditi tra gli operatori “a monte” e quelli “a valle” e valorizzare un prodotto che
possiede delle caratteristiche peculiari fortemente legate all’area geografica di
provenienza e che appare minacciato da importazioni di pistacchio di qualità inferiore, il
3 novembre 2004 è stato costituito da 30 produttori ed imprenditori agricoli il "Consorzio
di tutela". È stato rilevato, infatti, che i visti i quantitativi di prodotto lavorato
annualmente nelle imprese rilevate e, considerata la produzione media annua ottenuta
dagli impianti autoctoni, inevitabilmente le aziende di trasformazione ricorrono
all’acquisto di prodotto estero (anche solo per la mescita). E come già descritto, nel 2010
il pistacchio di Bronte ha ottenuto il riconoscimento di prodotto a Denominazione di
origine protetta DOP. (N1)
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4 LE MICOTOSSINE
Il problema dei residui tossici nei prodotti alimentari ha assunto notevole rilievo in tema di
sicurezza alimentare. In particolare, il monitoraggio di contaminanti di derivazione “naturale”,
quali le micotossine (B2) è diventato un controllo di routine per l’industria agro-alimentare.
Le micotossine sono metaboliti secondari di funghi che infestano le derrate alimentari o il
foraggio destinato all’alimentazione degli animali da allevamento. (B3).
Generalmente hanno basso peso molecolare e natura lipofilica, ma non costituiscono una
classe chimica in quanto le loro strutture sono molto differenti essendo prodotte da specie o da
ceppi diversi della stessa specie fungina. Questo spiega anche i diversi effetti indotti. Le
micotossine sono infatti responsabili di danni a livello epatico, renale, del sistema nervoso e
gastrointestinale; alcune sono state classificate come cancerogene (B3) (Vedi Tabella 3)
Attualmente sono note più di 300 micotossine, ma solo di un numero limitato si conoscono gli
effetti tossici.
I generi fungini maggiormente interessati alla produzione di tali tossine sono l’Aspergillus, il
Fusarium e il Penicillium. Tali funghi hanno un aspetto pulverulento di colore bianco, verdastro
o nero dovuto ad una fitta rete di filamenti e di sporangi, i contenitori delle spore, che invade
l’ospite infiltrandosi in modo capillare (vedi Figura 3)
Lo sviluppo di funghi e la formazione di micotossine sono possibili già quando una pianta
coltivata si trova ancora in campo, e poi in tutte le successive fasi di conservazione e
trasformazione. Le micotossine tuttavia non sono correlate direttamente alla crescita del fungo,
ma risultano essere piuttosto una sua risposta a determinati stimoli ambientali.
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Figura 3 - Mais contaminato da Aspergillus (S1)
Le micotossine preoccupano per diversi motivi:

possono essere presenti anche in alimenti non visibilmente ammuffiti;

hanno effetti tossici particolarmente gravi (vedi Tabella 3).

sono attive anche a basse concentrazione;

sono particolarmente stabili ai trattamenti fisici e chimico-fisici: molte risultano
termostabili fino a 150°C ed all’essiccazione; trattamenti come molitura, radiazione,
estrazione, raffinazione e fermentazione ne diminuiscono il contenuto ma non sono
in grado di distruggerle completamente
(B4)
. Un trattamento chimico in grado di
eliminarle è invece il trattamento con Ammoniaca e sali alcalini.
4.1 Diffusione e Tossicità
Secondo stime effettuate dalla FAO nel 1985, un quarto della produzione mondiale di
derrate destinate al consumo alimentare ed umano, sarebbe contaminato da
micotossine. Questo è spiegato dal fatto che le spore dei funghi tossigeni sopra descritti
sono prodotte in grandi quantità e sono ubiquitarie: dunque possono vivere in molti tipi
di ambienti e vengono facilmente disseminate dalle correnti d’aria.
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Tra i fattori che influiscono sulla crescita fungina e dunque sulla probabile produzione di
micotossine, ci sono:

elevata temperatura ambientale (30-40 °C)

attività dell’acqua aw (acqua libera nell’alimento)

pH (6-8 unità)

ossigeno (> 2%)

quantità di amido e lipidi
E’ facile dedurre che i cibi a rischio sono quelli provenienti da regioni con clima tropicale e
sub-tropicale (Figura 4) e composti da grandi quantità di amido e lipidi (B2).
Si tratta di tutti i cereali (mais, frumento, orzo, avena,segale, ecc.) salvo il riso, i semi
oleaginosi (arachidi, girasole, semi di cotone, ecc.), la frutta secca ed essiccata (mandorle,
noci, nocciole, fichi secchi, ecc.), i semi di cacao e caffè, le spezie come il peperoncino, il
pepe, lo zenzero, la frutta e verdura (uva, mele, pere,carote, pomodori, ecc).
Sono di conseguenza suscettibili di contaminazione alcuni prodotti derivati da queste
materie prime: per esempio farine ad uso umano e animale, derivati dei semi oleaginosi,
esclusi gli oli raffinati (perché le tracce di micotossine che possono passare nell'olio
greggio vengono rimosse dal trattamento con alcali usato nel processo di raffinazione),
prodotti contenenti cacao, caffè, vino, birra, succhi di frutta e ortaggi, latte, prodotti
contenenti spezie.
pagina 22
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Figura 4 - Aree del pianeta maggiormente interessate dalla presenza di micotossine
L’esposizione dell’uomo e dell’animale può avvenire tramite ingestione di alimenti
contaminati oppure tramite via aerea, in ambienti di lavoro dove siano presenti polveri di
granaglie contaminate aero-disperse, o in ambienti domestici in cattive condizioni
igieniche. Inoltre gli animali esposti a loro volta diventano fonte di esposizione se
destinati a diventare alimenti o produttori di alimenti destinati all’uomo. Il rapporto tra la
quantità di micotossina escreta e quella ingerita dall’animale è definito “carry over”, il
trasferimento nelle carni è generalmente nullo ad accezione dei tessuti di fegato e rene
(deputati alla detossificazione) e del latte che può contenere dei metaboliti tossici. (es.
Aflatossina M1).
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Micotossina
Principali funghi
produttori
Aflatossine B1,
B2, G1, G2
Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticum
Aflatossina M1
Metabolita di B1
Fumonisine
Fusarium moniliforme
Ocratossina A
Aspergillus Ochraceus,
Penicillium viridicatum
Patulina
Aspergillus clavatus,
Penicillium patulum
Tricoteceni
Fusarium,
Myrothecium
Zearalenone
Fusarium
Effetto tossico
Alimenti più coinvolti
Immunotossiche,
epatotossiche,
mutagene,
cancerogene
epatotossica
epatotossiche,
neurotossiche,
cancerogene,
Cereali (Mais), semi
oleaginosi (arachidi) ed altra
frutta secca, spezie
Immunotossica,
nefrotossica,
cancerogena,
teratogena
Genotossica e
cancerogena in misura
minore.
Neurotossiche,
Emorragia meningea e
cutanea, necrosi
cutanea
Effetti estrogenici
Cereali, arachidi, caffè
verde, cacao, spezie,
liquirizia, carni suine e
avicole, vino, birra.
Mele, pere, carote e derivati
(succhi di frutta)
Latte e derivati
Mais
Cereali, specialmente mais
Mais, granaglie
Tabella 3- Principali micotossine, funghi produttori ed effetti tossici (B3)
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5 LE AFLATOSSINE
Le aflatossine, ritenute a ragione le micotossine per eccellenza, sono state oggetto delle
ricerche più approfondite e ancora oggi destano le maggiori preoccupazioni in quanto
contaminanti dell’alimentazione di larga parte della popolazione mondiale che vive nelle fasce
tropicali dove le caratteristiche del clima e la pressochè totale assenza di refrigerazione,
facilitano la crescita delle muffe produttrici.
5.1 Cenni storici
L’inizio della moderna tossicologia è databile al 1960, anno in cui venne dato grosso
impulso alla ricerca delle micotossine, in seguito ad una grave intossicazione che colpì il
settore avicolo in Inghilterra, divenuta successivamente nota con il nome di “malattia X
del tacchino”. Più di 100.000 tacchini morirono dopo aver consumato farina di noci
brasiliane ed arachidi contaminate. Il principale contaminante fungino isolato da quelle
arachidi era Aspergillus flavus. Le indagini effettuate consentirono l’isolamento
dell’agente eziologico ovvero una miscela di composti tossici fluorescenti, denominati
aflatossine
(B5)
.
Nel 1963, successivi studi
(B6)
, hanno portato all’identificazione, all’isolamento e alla
caratterizzazione chimica delle aflatossine, si scoprì inoltre che tali sostanze potevano
essere separate cromatograficamente in quattro diverse componenti, che furono distinte
in B1, B2, G1 e G2, a seconda del colore della fluorescenza emessa (blue o green) in
relazione all’irradiazione con luce ultravioletta a 360 nm ed alla loro mobilità
cromatografia (B7).
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Successivamente alla scoperta delle aflatossine Allcroft e Carnaghan (1963), ipotizzarono
che alcuni residui di aflatossina ingeriti dagli animali con la razione, potessero ritrovarsi
nel latte o in altri derivati. In vacche da latte alimentate con prodotti contaminati da
aflatossina B1, venne ritrovata una sostanza tossica, che in esperimenti condotti sulle
anatre risultò nociva quanto l’aflatossina B1, e che risultò legata anche alle frazioni
caseiniche della cagliata. Tale sostanza rivelò una fluorescenza blu-viola simile a quella
precedentemente osservata per l’aflatossina B1, ma in questo caso, dato il primitivo
isolamento dal latte, gli venne attribuito il nome di aflatossina M o “milk toxin”.
L'aflatossina M1 è stata quindi il primo metabolita idrossilato della B1 ad essere isolato e
identificato (B9).
Campbell ed altri (1970) nel cercare di chiarire l’eziologia del cancro al fegato nell’uomo
prodotto dall’aflatossina B1, scoprirono per la prima volta, la presenza dell’aflatossina M1
nelle urine. Successivamente furono isolate a partire dalle urine e dal latte le aflatossine
M1 e M2, identificandole come metaboliti della B1 e B2 dei mammiferi.
5.2 Struttura Chimica e proprietà chimico-fisiche
Chimicamente sono composti eterociclici altamente ossigenati
(B3)
derivati dalla cumarina, a basso peso molecolare ( < 500 u.m.a.), alto
punto di fusione (269 °C per Aflatossina B1) ed elevata
Figura 5 - Cumarina
termostabilità (fino a 250°C).

Le Aflatossine del gruppo B sono bifuranocumarine fuse con un anello
ciclopentenoico (di colore verde nella Figura 6).
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
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Le Aflatossine del gruppo G sono bifuranocumarine fuse con un anello lattonico (di
colore verde nella Figura 6).

Le M1, M2 sono il prodotto di idrossilazione rispettivamente di B1 e B2 (gruppo –OH
sull’anello bifurano) che si riscontrano nelle secrezioni degli organismo che li hanno
metabolizzati (urine, latte, bile).

Tra le molecole della serie 1 e le molecole della serie 2, la differenza risiede in un
doppio legame sull’anello bifurano (di colore blu nella Figura 6).
Figura 6 - Formule di struttura Aflatossine
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Afla
Numero
CAS
Formula
Massa
mol.
(uma)
B1
1162-65-8
C17H12O6
312.28
B2
7220-81-7
C17H14O6
314.29
G1
1165-39-5
C17H12O7
328.28
G2
7241-98-7
C17H14O7
330.29
M1
6795-23-9
C17H12O7
328.28
M2
6885-57-0
C17H14O7
330.29
Nome IUPAC
2,3,6a,9a-tetrahydro-4methoxycyclopenta(c)furo(3',2':4,5)furo(2,3h)(1)benzo-pyran-1,11-dione
2,3,6aa,8,9,9aa-Hexahydro-4methoxycyclopenta(c)furo(2',3':4,5)furo(2,3h)chromene-1,11-dione
7AR,cis)3,4,7a,10a-tetrahydro-5-methoxy-1H,12Hfuro(3',2':4,5)furo(2,3-h)pyrano(3,4-c)chromene1,12-dione
1H,12H-furo(3',2':4,5)furo(2,3-h)pyrano(3,4c)(1)benzopyran-1,12-dione
(6AR-cis)-2,3,6a,9a-tetrahydro-9a-hydroxy-4methoxycyclopenta(c)furo(3',2':4,5)furo(2,3h)(1)benzopyran-1,11-dione
2,3,6a,8,9,9a-Hexahydro-9a-hydroxy-4methoxycyclopenta(c)furo(3',2':4,5)furo(2,3-h)(1)
benzopyran-1,11-dione
Tabella 4- Tabella riepilogativa Aflatossine (S2)
Solubilità: Le aflatossine risultano assai poco solubili in acqua (10-30 µg/mL), ma molto
solubili nei solventi organici mediamente polari (es. metanolo, cloroformio, toluene).
Stabilità: hanno alto punto di fusione (269 °C per AFB1), ma sono instabili sotto luce UV in
presenza di O2 ed a pH estremi (pH<3 e pH>10) in presenza di ossidanti.
Reattività: l’anello del lattone è sensibile a idrolisi alcalina, le aflatossine sono sensibili ad
ammoniaca e ipoclorito di sodio.
5.3 Produzione da Aspergillus
Le Aflatossine sono prodotte principalmente da alcuni ceppi di Aspergillus flavus e da
quasi tutti i ceppi di Aspergillus parasiticus.
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L’Aspergillus flavus, rappresenta la forma conidiofora (imperfetta) di un ascomicete la cui
forma perfetta è caratterizzata dalla produzione di un asco, mentre nella forma
imperfetta produce spore agame dette conidi.
Figura 7 - Foto di Aspergillus flavus in SEM (microscopio elettronico a scansione)
Le muffe appartenenti all’Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus sono estremamente
diffuse nell’ambiente ed hanno la capacità di insediarsi, grazie alle micro-fessure operate
da insetti e parassiti nei tessuti vegetali, e nel proseguo del loro accrescimento, di
produrre micotossine e numerose spore fungine che per diffusione anemofila
raggiungono altre piante.
Come già detto nel capitolo delle micotossine, l’aspetto pulverulento delle muffe è
dovuto ad una fitta rete di ife (filamenti) e di sporangi (contenitori di spore), che invadono
l’ospite infiltrandosi in modo capillare (vedi Figura 3).
Alcune specie di Aspergilli sono dannose per uomo ed animali, mentre altre possono
essere impiegate per fini utilitaristici, come: l’Aspergillus orizae, capace di fermentare lo
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zucchero nel processo di produzione del sakè ed utilizzabile anche per la produzione di
salsa di soia; l’Aspergillus wenti, anch’esso utilizzato per la preparazione della salsa di
soia; dalle colture di Aspergillus flavus e A. fumigatus (uno dei principali costituenti del
compost, identificato per la prima volta nel 1848) si possono ricavare antibiotici come: la
flavicidina, la flavicina e la fumagatina.
Recentemente anche la specie Aspergillus Ochraceoroseus è stata inserita tra quelle
produttrici di aflatossine. In Giappone, poi, sono stati isolati l’Aspergillus tamarii e
l’Aspergillus pseudo tamarii
(B11)
, mentre in Australia sono presenti due distinti
sottogruppi di Aspergillus flavus, uno definito Aspergillus Australis.
Su 3460 ceppi di A. flavus isolati da alimenti contaminati, solo il 74% è in grado di
produrre aflatossine (B9) :

Aspergillus flavus (maggiormente ubiquitario), produce le aflatossine B1 e B2 e
talvolta la micotossina (acido ciclopiazonico)

Aspergillus parasiticus (più frequente nei climi subtropicali e tropicali ha elevata
affinità di crescita in frutta e semi oleosi), produce le aflatossine B1, B2, G1 e G2.

Aspergillus nomius e A. bombycis, strettamente legati all’A. flavus, producono
aflatossine B1, B2, G1 e G2.

Aspergillus tamarii produce le aflatossine B1 e B2 e l’acido ciclopiazonico.

Aspergillus australis, infine, produce aflatossine (B1, B2, G1 e G2) e acido
ciclopiazonico. La sua presenza sembra essere confinata nell’emisfero sud, è stata
infatti ad oggi verificata, in Argentina, in Australia, in Indonesia e in Sud Africa (B12).
L’enorme mole di dati internazionali indicano l’Aspergillus flavus e l’Aspergillus
parasiticus, come i maggiori responsabili, della percentuale d’aflatossine presente negli
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alimenti di tutto il mondo. Alla stregua di questi anche l’Aspergillus australis può
considerarsi un grande serbatoio di aflatossine per il sud del mondo.
5.4 Fattori che ne influenzano la produzione
I fattori estrinsechi che influiscono sulla produzione di aflatossine possono suddividersi in
fisici, chimici, nutrizionali e biologici.
1. I fattori fisici includono temperatura, umidità relativa, luce, grado di aerazione e pH.
La temperatura ottimale per A. flavus è 25°C, mentre per A. parasiticus varia tra 25 e
35°C. La produzione si blocca sotto i 13°C e sopra i 42°C. In generale la temperatura
ottimale è compresa nell’intervallo 25-28°C. Un clima caratterizzato da temperatura
elevata seguita da brusco calo (giornate calde e notti fredde, temporali) favorisce la
produzione di aflatossine, così come in generale qualsiasi fattore di stress. La
produzione di aflatossine risulta particolarmente abbondante in stagioni con
temperature superiori alla media e piovosità inferiore alla media;
Anche l’umidità relativa del substrato e l’umidità relativa ambientale sono fattori
critici per la produzione di aflatossine, che aumenta quando la disponibilità di acqua
varia in più o in meno (stress idrico) e si porta a livelli non più ottimali per lo sviluppo
delle muffe. L’umidità relativa ambientale minima per la produzione di aflatossine
varia tra l’83% e l’88%.
L’impatto della disponibilità d’acqua (aw), sulla crescita e la produzione delle
micotossine è notevole, per le aflatossine si hanno valori ottimali di aw pari a 0.85.
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Le quantità maggiori di aflatossine sono prodotte a pH acidi. Valori di pH < 6
favoriscono B1 e B2, valori di pH > 6 favoriscono G1 e G2.
Valori massimi di
aflatossine si ottengono in un intervallo di pH tamponato tra 5 e 6.
2. I fattori chimici ad esempio riguardano l’uso di fungicidi;
3. I fattori nutrizionali includono la presenza di sostanze specifiche, come minerali
(zinco), vitamine, acidi grassi, aminoacidi e le fonti di energia come l’amido, (B10) .
4. Tra i fattori biologici, gli insetti sono da considerare tra i maggiori responsabili della
contaminazione sia per la veicolazione delle spore fungine, sia per il danneggiamento
dei frutti, con un’aumentata esposizione degli stessi all’attacco fungino.
Ma è da considerare anche lo stress della pianta (dovuto a fattori fisici visti prima) che
può portare la rottura meccanica delle muffe, e la presenza di altre specie fungine
(azione competitiva).
5.5 Contaminazione dei pistacchi
La produzione di aflatossine può avvenire sia in campo, sia durante le fasi di essiccazione,
stoccaggio, trasformazione, manipolazione e trasporto.
La drupa del pistacchio è costituita da 3 parti:

Esocarpo, detto anche mallo, involucro esterno di natura polposa

Endocarpo, detto guscio, involucro di natura legnosa

Seme, pistacchio, che rappresenta il frutto commestibile.
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Poco prima della maturazione, il guscio del pistacchio può aprirsi parzialmente, ma
l’involucro esterno (mallo) resta sostanzialmente intatto e dunque ha un azione
protettiva.
Talvolta il mallo può dividersi, questo avviene sia per il processo di crescita naturale sia
per effetto di agenti esterni come gli insetti. Se il mallo si divide, i pistacchi sono
maggiormente suscettibili alla contaminazione con spore di A. flavus e A. parasiticus
veicolate dal vento o dagli insetti stessi.
Figura 8 - Pistacchio cv Napoletana con mallo intero
Figura 9 - Pistacchio IRAN con avvenuta rottura del mallo
In Iran, Afghanistan e Iraq si coltivano specie caratterizzate da grosse noci con gusci che
sono relativamente soggette ad un’apertura prematura, inoltre, i fattori climatici
caratteristici di queste zone sono un altro elemento favorente.
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Figura 10 - Pistacchio IRAN con guscio aperto
In Italia invece di coltivano specie (cultivar Napoletana) con noci di forma affusolata che
meno frequentemente si aprono spontaneamente. Inoltre, il clima più temperato
rappresenta un altro fattore sfavorevole alla contaminazione.
In uno studio condotto negli Stati Uniti su una piantagione che possedeva dall’ 1% al 5%
dei frutti con il mallo diviso, è emerso che il 20% dei campioni era contaminati da
aflatossine, mentre non vi era alcuna contaminazione nei frutti col mallo intero (S7) .
Un altro studio effettuato in Grecia nel 2012, Aflatoxin contamination in pistachio nuts: A
farm to storage study (B14), con lo scopo di determinare le fasi di produzione, le condizioni
e / o le pratiche di gestione che influenzano la produzione di aflatossine nei pistacchi, ha
evidenziato quanto segue.
Sono stati presi in esame 80 alberi in 4 pistacchieti (20 alberi per frutteto) della varietà
Pistachia vera greco cv Egina. Cinque campioni sono stati prelevati da ogni frutteto per
l'analisi delle aflatossine (totale 20 campioni):

Il primo campione è stato prelevato prima della maturazione (31 luglio)
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
Il secondo quando il frutto era maturo (13 agosto)

il terzo al momento della raccolta (20-30 agosto)

il quarto alla fine del processo di essiccazione

l'ultimo nel campione in stoccaggio (45 giorni dopo l'asciugatura)
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I risultati hanno mostrato che la fase più critica per contaminazione da aflatossine è
quella di maturazione ed è stata rilevata una quantità di aflatossine totali sopra i limiti
consentiti: da 11 μg/kg a 1361 μg/kg tra frutteti.
Alla raccolta, la concentrazione di aflatossine era ancora più elevata raggiungendo 1420
μg/kg nel frutteto A. Livelli più elevati di aflatossine (> 1000 μg/kg) sono stati rilevati nei
frutteti con pesanti infestazioni di insetti che indicano dunque una correlazione positiva
tra contaminazione e infestazioni.
Nelle fasi post-raccolta, la contaminazione da aflatossine rilevata è stata da 40 a 1200
μg/kg alla fine del processo di essiccazione e 650 - 1100 μg/kg nei prodotti stoccati,
proporzionale agli stessi livelli di aflatossine nella fase di pre-raccolta ed alle condizioni di
stoccaggio, questo ha evidenziato la proliferazione delle muffe nei prodotti conservati
non adeguatamente.
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Figura 11 - Pistacchio IRAN contaminato da A.Flavus (S6)
Durante la spedizione e lo stoccaggio la formazione di muffe è influenzata da molti fattori,
tra cui il livello di umidità, temperatura, aerazione, infestazione da insetti nei silos; il
tempo di stoccaggio, trattamenti chimici con fungicidi, densità delle spore e condizioni di
conservazione (in particolare percolazione di acqua o condensa) (S7).
Quando la raccolta avviene in tempo asciutto, la contaminazione da micotossine di solito
non raggiungono proporzioni allarmanti. Diventa un problema invece quando la raccolta
avviene in un clima molto umido. In molti paesi in via di sviluppo, la combinazione di
apparecchiature di essiccazione insufficienti accoppiate con condizioni atmosferiche
umide generano risultati in livelli di aflatossine inaccettabili.
I pistacchi sono utilizzati in un gran numero di prodotti nell’industria alimentare come già
descritto in precedenza, subiscono processi di tostatura, salatura e raffinazione ma come
riportato, le aflatossine sono composti termostabili (fino a 250°C) e dunque tali processi
non ne riducono la contaminazione.
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La normativa inoltre, come descritto più avanti, vieta l’uso di prodotti chimici allo scopo di
decontaminazione, cosi come la mescita con lotti di prodotto non contaminato.
Il principio guida per contenere i livelli di contaminazione è quello di adottare un
approccio cosiddetto “olistico”, vale a dire una associazione di azioni concertate lungo
tutta la filiera agro-alimentare “dal campo alla tavola”.
In definitiva, la prevenzione sul campo con l’uso di fungicidi nelle zone maggiormente a
rischio, le corrette tecniche di coltivazione che riducono lo stress delle piante, la corretta
essiccazione ed il controllo rigoroso dell’umidità nella fase di stoccaggio, unita
all’adeguato trasporto sono i mezzi da perseguire per ottenere prodotti salubri.
5.6 Le importazioni in Europa ed il sistema RASFF
Sul sito della comunità europea, sezione import/export di merci
(S12)
, è possibile
consultare il flusso delle merci da e verso l’europa.
Nello specifico caso dei pistacchi in guscio e sgusciati (codice prodotto: 080251) per
l’anno 2014 è possibile estrapolare i dati di seguito riportati:
Paese
Valore importato in
Europa (EURO)
Quantità importata in
Europa (Kg)
Quantità Esportata
dall'Europa (Kg)
United States
Iran, Islamic Republic of
Turkey
Argentina
United Arab Emirates
China, People's Republic of
Syrian Arab Republic
Madagascar
Canada
Lebanon
361.830.226
111.989.411
1.313.912
347.933
404.924
169.967
272.079
8.589
171.197
6.135
49.239.000
14.763.000
155.000
72.000
48.000
39.000
37.000
22.000
20.000
5.000
20.000
46.000
20.000
0
25.000
0
0
0
5.000
0
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Afghanistan
Côte d'Ivoire
Japan
Switzerland
Israel
Ceuta
Belarus
Tunisia
Serbia
1.436
2.257
132
0
612
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
16.000
22.000
23.000
30.000
31.000
46.000
67.000
74.000
Totale
476.526.816
64.402.000
613.000
Tabella 5 - Import/Export di Pistacchio per l'anno 2014 in EU
Da questa tabella appare chiaro che gli Stati Uniti sono il più grosso importatore di
Pistacchi in Europa con quasi 50mila tonnellate di prodotto esportato, seguito da Iran e
Turchia. I maggiori acquirenti di pistacchio dall’Europa risultano invece essere Tunisia e
Serbia.
Paese
Valore importato in
Italia (EURO)
Quantità importata in
Italia (Kg)
United States
Iran, Islamic Republic of
Argentina
Japan
Totale
17.328.240
2.767.398
347.933
2.129.000
367.000
72.000
20.443.571
2.568.000
Quantità Esportata
dall'Italia (Kg)
3.000
3.000
Tabella 6 - Import/Export di Pistacchio per l'anno 2014 in Italia
Da questa seconda tabella relativa al flusso di pistacchio in Italia, si conferma come
maggiore importatore gli Stati Uniti anche in Italia, seguito dall’Iran. Riguardo il Totale di
prodotto importato, si noti come l’Italia abbia importato 2.500 tonnellate di pistacchio nel
2014.
N.B. nelle precedenti tabelle non sono inclusi i prodotti lavorati e semilavorati al
pistacchio, e il mix di frutta secca.
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Per quanto riguarda il controllo delle merci, nell’ambito della Comunità Europea è attivo il
sistema RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) che consente di notificare in tempo
reale la presenza di eventuali rischi per la salute pubblica connessi al consumo di alimenti
o mangimi ed utilizzo di oggetti destinati a venire in contatto con alimenti. È un
meccanismo di comunicazione del rischio rapido basato sull’utilizzo della posta
elettronica e di schede di notifica standard. Questo sistema è entrato in vigore con la
direttiva 92/59/CE del Consiglio Europeo relativa alla sicurezza degli alimenti (N4) . Quando
uno Stato Membro viene a conoscenza, in seguito ai controlli effettuati, dell’esistenza di
un rischio sanitario, lo notifica immediatamente alla Commissione Europea che a sua
volta, sentito il parere dell’Autorità, lo trasmette a tutti gli altri Stati della Comunità
tramite i “Punti di contatto” (enti di riferimento per ogni Stato Membro). Sulla base delle
notifiche, la Commissione Europea può inoltre adottare decisioni relative a specifiche
merci che possono rappresentare un rischio per la salute umana, subordinandone
l’importazione in territorio comunitario a particolari condizioni.
Le merci di provenienza extra CE possono entrare nel territorio comunitario solo
attraverso i “Punti identificati di importazione”, cioè porti, aeroporti o punti di
attraversamento terrestre autorizzati [N2].
In Italia, presso i punti identificati d’importazione sono presenti gli Uffici di Sanità
Marittima e di Frontiera (USMAF) o le loro Unità Territoriali (UT), i quali, assieme ai Punti
di Ispezione Frontaliera (PIF) e agli Uffici Veterinari Adempimenti CEE (UVAC), effettuano,
tra le altre attività, i controlli igienico-sanitari sulle merci in ingresso destinate al consumo
umano che possano rappresentare, anche solo potenzialmente, un rischio per la salute e
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la sicurezza delle persone. Gli USMAF sono strutture direttamente dipendenti dal
Ministero della Salute.
Figura 12 - Distribuzione territoriale degli USMAF (S9)
Dal 2006 è diventato operativo per gli USMAF un applicativo informatico denominato
“NSIS USMAF”, parte integrante del Nuovo Sistema Informativo Sanitario (NSIS); esso
consente il collegamento in rete tra i 17 uffici USMAF, le 37 unità territoriali e gli Uffici
centrali di coordinamento.
Secondo quanto definito dal Regolamento (CE) 178/2002
(N5)
, in caso di analisi con esito
positivo, quindi di prodotto non regolamentare, deve esserne data notifica immediata alla
Commissione Europea per attivare l’allerta. Ciò avviene mediante la trasmissione delle
informazioni registrate nel NSIS USMAF al Punto di Contatto alla Commissione Europea,
che entro 24 ore la inserisce nel sistema RASFF. Il flusso dei dati (NSIS – RASFF), per gli
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Loria Tino
Uffici USMAF, avviene in entrambe le direzioni, in quanto gli stessi medici ed operatori
addetti al controllo consultano, nella fase di valutazione delle richieste di importazione
merce, sia il sistema NSIS (contenente le allerte generate in ambito nazionale dagli
USMAF), sia il sistema RASFF per le notifiche in ambito comunitario.
Ricevuta la notifica, la Commissione Europea (DG SANCO) trasmette immediatamente
l’informazione a tutti gli stati membri, che devono notificare le misure d’allerta prese,
compreso il rifiuto di carichi all’importazione in un dato punto identificato ed eventuali
restrizioni o richiami di merce già distribuita sul mercato. L’allerta si conclude dopo il
decimo campionamento negativo effettuato su casi analoghi.
Come si legge nel REG. 16/2011/UE (N6) , le notifiche possono essere di diverso tipo:

«notifica di allarme», una notifica di un rischio che richiede o potrebbe richiedere
un’azione rapida in un altro paese membro;

«notifica di informazione», una notifica di un rischio che non richiede un’azione rapida
in un altro paese membro; questa può essere:
o «notifica di informazione per follow-up», una notifica di informazione relativa a
un prodotto già presente o che potrebbe essere immesso sul mercato in un
altro paese membro;
o «notifica di informazione per attenzione», una notifica di informazione relativa
a un prodotto che è presente solo nel paese membro notificante; o non è stato
immesso sul mercato; o non è più sul mercato;

«notifica di respingimento alla frontiera», una notifica di respingimento di una partita,
di un container o di un carico di alimenti o di mangimi come descritta all’articolo 50,
paragrafo 3, lettera c), del regolamento (CE) n. 178/2002 (N5) .
pagina 41
Tesi di Laurea
Loria Tino
Il destino delle merci contaminate dipende dal contenuto di contaminante riscontrato.
Per le contaminazioni da Aflatossine, nello specifico, l’art. 19 del Regolamento (CE)
882/2004 (N3) prevede:

distruzione;

trattamenti secondo l’art. 20 del Regolamento sopra citato per rendere conforme la
partita, è vietata la diluizione;

re-invio al paese d’origine o ad altro paese con normativa che ne consenta
l’importazione, secondo quanto definito all’art. 21 Regolamento sopra citato

uso a fini industriali o per estrazione dell’olio.
Le condizioni di identificazione e circolazione in sicurezza della merce destinata a
trattamenti sul territorio nazionale sono descritte nel documento SANCO/1208/2005[N2].
In particolare, per le merci potenzialmente contaminate da aflatossine, la Decisione della
Comunità Europea 06/504/CE stabilisce differenti frequenze di controlli, che variano dal
5% al 100% del carico, a seconda della matrice e della provenienza dello stesso [N2].
Sul sito del RAFSS (S10) è possibile consultare i report annuali delle notifiche, nonché la lista
costantemente aggiornata di tutte le notifiche in atto dal 1979 ad oggi con la possibilità di
eseguire ricerche inserendo la “categoria prodotto” (tipo di alimento), la “categoria di
rischio” (es. micotossine), la “parola chiave” (es. Aflatossine), la nazione che ha dato
l’allerta ecc.
Facendo una rapida ricerca nel periodo 2014-2015, inserendo i seguenti dati:

categoria prodotto = nuts, nuts product and seeds

categoria di rischio = mycotoxins
pagina 42
Tesi di Laurea

Loria Tino
keywords = pistachio, aflatoxin
Ed elaborando la tabella dei risultati, sono emerse :

86 notifiche nell’ anno 2014

67 notifiche nel periodo Gennaio-Giugno 2015
E’ possibile consultare le tabelle elaborate nei documenti in allegato:
Allegato 1 – Notifiche RASFF anno 2014 relativa alle aflatossine nel pistacchio in guscio
e sgusciato importato in UE
Allegato 2 - Notifiche RASFF periodo Gennaio-Giugno 2015 relative alle aflatossine nel
pistacchio in guscio e sgusciato importato in UE
Dai dati, si riscontra che circa il 90 % delle notifiche sono state “notifica di respingimento
alla frontiera ”, inoltre sia per il 2014 che per il 2015, nel 55% dei casi si è trattato di
pistacchi provenienti dall’Iran, seguono Stati Uniti e Turchia con circa il 20% a testa dei
casi.
Durante questi 18 mesi presi in esame, l’Italia ha trasmesso 33 notifiche (il 21 % del
totale).
In tutte le notifiche, il contenuto di aflatossine è superiore al tenore massimo ammesso
per legge, e in bel 14 casi supera i 200 µg/kg (20 volte superiore).
pagina 43
Tesi di Laurea
Loria Tino
In un caso particolare notificato dalla Spagna il 06/05/2015 riguardante pistacchio in
guscio proveniente dall’Iran (cod. rif. 2015.AUV), il contenuto di AFB1 era di 796 µg/kg,
quasi 1 mg/Kg!
5.7 Normativa
A livello comunitario, il Regolamento (CE) 1881/2006 (N7) “che definisce i tenori massimi di
alcuni contaminanti nei prodotti alimentari”, è stato modificato dal Regolamento (UE)
165/2010 (N8) per quanto riguarda le sole aflatossine.
L’EFSA ha infatti deciso di innalzare i tenori massimi di aflatossina B1, aflatossine totali
(Somma di B1, B2, G1 e G2) ed aflatossina M1 in prodotti alimentari quali cereali, frutta
secca, spezie, prodotti per l’infanzia e latte.
Per quanto riguarda i Pistacchi Sgusciati [rif. 2.1.6 in Tabella 7] (incluso pistacchio tritato,
pasta pura al 100%, e tutte le altre forme usate come ingredienti nei prodotti derivati di
pistacchio), si è passato da un tenore massimo fissato nel REG (CE) 1881/2006 di 2,0
μg/kg per AFB1 e 4,0 μg/kg per AFtot all’attuale tenore massimo del Reg. (UE) 165/2010 di
8,0 μg/kg per AFB1 e 10 μg/kg per AFtot .
Per il Pistacchio in Guscio [rif. 2.1.2 in Tabella 7] (considerato come prodotto che deve
subire trattamento fisico prima del consumo umano allo scopo di ridurre il quantitativo di
aflatossine, come ad esempio la cernita per eliminare quelli visibilmente ammuffiti)
l’attuale tenore massimo è di 12,0 μg/kg per AFB1 e 15 μg/kg per AFtot .
Dal nuovo regolamento si legge che:
pagina 44
Tesi di Laurea
Loria Tino
“Il gruppo di esperti scientifici sui contaminanti nella catena alimentare (CONTAM)
dell’Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA), in data 25 gennaio 2007, ha
concluso che l’innalzamento da 4 μg/kg a 8 o a 10 μg/kg dei tenori massimi di aflatossine
totali nelle mandorle, nelle nocciole e nei pistacchi avrebbe effetti modesti sulle stime di
esposizione alimentare, sul rischio di tumori e sui margini di esposizione calcolati. Il
gruppo di esperti ha concluso inoltre che l’esposizione alle aflatossine da tutte le fonti
dovrebbe essere al livello più basso ragionevolmente ottenibile, perché le aflatossine sono
genotossiche e cancerogene. I dati dimostrano che si potrebbe ridurre l’esposizione
alimentare totale alle aflatossine se, grazie a una più efficace applicazione delle normative
e a una diminuzione dell’esposizione da fonti alimentari diverse da mandorle, nocciole e
pistacchi, venisse ridotto il numero di prodotti alimentari altamente contaminati che
arrivano sul mercato.” Il rapporto è stato pubblicato su l’EFSA Journal n°446 del 2007 (N9) .
(Nds) In pratica dicono si ridurre il numero di prodotti contaminati importati diversi dalla
frutta secca, ma intanto hanno alzato il tenore massimo di aflatossine per permettere
l’ingresso di mandorle, nocciole e pistacchi esteri.
Prodotti alimentari
Tenori massimi (μg/kg)
2.1.
Aflatossine
2.1.1.
Arachidi e altri semi oleosi ( ) da sottoporre a cernita o ad altro
trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quali
ingredienti di prodotti alimentari
ad eccezione:
—delle arachidi e degli altri semi oleosi da sottoporre a
pressatura per la produzione di oli vegetali raffinati
Mandorle, pistacchi e semi di albicocca da sottoporre a cernita o
ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o
dell’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari
Nocciole e noci del Brasile da sottoporre a cernita o ad altro
trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quali
ingredienti di prodotti alimentari
2.1.2.
2.1.3.
B1
40
Totali
5
8,0 ( )
5
12,0 ( )
5
8,0 ( )
M1
5
—
5
—
15,0 ( )
15,0 ( )
5
15,0 ( )
pagina 45
Tesi di Laurea
2.1.4.
2.1.5.
2.1.6.
2.1.7.
2.1.8.
2.1.9.
2.1.10.
2.1.11.
2.1.12.
2.1.13.
2.1.14.
2.1.15.
2.1.16.
2.1.17.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Loria Tino
5
10,0 ( )
5
4,0 ( )
5
10,0 ( )
5
10,0 ( )
2,0 ( )
5
4,0 ( )
—
5,0
10,0
—
2,0
4,0
—
2,0
4,0
—
5,0
10,0
—
—
—
0,050
5,0
10,0
—
0,10
—
—
—
—
0,025
0,10
—
0,025
Frutta a guscio, diversa dalla frutta a guscio di cui ai punti 2.1.2 e
2.1.3, da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima
del consumo umano o dell’impiego quale ingrediente di prodotti
alimentari
40
Arachidi e altri semi oleosi ( ) e relativi prodotti di trasformazione,
destinati al consumo umano diretto o all’impiego quali ingredienti
di prodotti alimentari,
ad eccezione:
— degli oli vegetali crudi destinati alla raffinazione
— degli oli vegetali raffinati
Mandorle, pistacchi e semi di albicocca destinati al consumo
umano diretto o all’impiego quali ingredienti di prodotti
41
alimentari ( )
Nocciole e noci del Brasile destinate al consumo umano diretto o
41
all’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari ( )
Frutta a guscio, diversa dalla frutta a guscio di cui ai punti 2.1.6 e
2.1.7, e relativi prodotti di trasformazione, destinati al consumo
umano diretto o all’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari
5,0 ( )
Frutta secca da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico
prima del consumo umano o dell’impiego quale ingrediente di
prodotti alimentari
Frutta secca e relativi prodotti di trasformazione, destinati al
consumo umano diretto o all’impiego quali ingredienti di prodotti
alimentari
Tutti i cereali e loro prodotti derivati, compresi i prodotti
trasformati a base di cereali, eccetto i prodotti alimentari di cui ai
punti 2.1.12, 2.1.15 e 2.1.17
Granturco e riso da sottoporre a cernita o ad altro trattamento
fisico prima del consumo umano o dell’impiego quali ingredienti di
prodotti alimentari
6
Latte crudo ( ), latte trattato termicamente e latte destinato alla
fabbricazione di prodotti a base di latte
Le seguenti specie di spezie:
Capsicum spp. (frutti secchi dello stesso, interi o macinati,
compresi peperoncini rossi, peperoncino rosso in polvere, pepe
di Caienna e paprica)
Piper spp. (frutti dello stesso, compreso il pepe bianco e nero)
Myristica fragrans (noce moscata)
Zingiber officinale (zenzero)
Curcuma longa (curcuma)
Miscele di spezie contenenti una o più delle suddette spezie
Alimenti a base di cereali e altri alimenti destinati ai lattanti e ai
3 7
bambini ( ) ( )
Alimenti per lattanti e alimenti di proseguimento, compresi il latte
4 8
per lattanti e il latte di proseguimento ( ) ( )
9 10
Alimenti dietetici a fini medici speciali ( ) ( ) destinati
specificamente ai lattanti
2,0 ( )
8,0 ( )
5,0 ( )
5
5
5
—
—
—
5
5
GU L 37 del 13.2.1993, pag. 1.
GU L 364 del 20.12.2006, pag. 5.
Codex General Standard for Contaminants and toxins in foods (CODEX STAN 193-1995)
The EFSA Journal (2007) 446, pagg. 1-127.
Dichiarazione del gruppo di esperti scientifici sui contaminanti nella catena alimentare, su richiesta della Commissione europea, sugli
effetti per la salute pubblica di un innalzamento dei tenori di aflatossine totali da 4 μg/kg a 10 μg/kg nella frutta a guscio diversa da
mandorle, nocciole e pistacchi. The EFSA Journal (2009) 1168, pagg. 1-11.
pagina 46
Tesi di Laurea
Loria Tino
(40)
Semi oleosi di cui ai codici NC 1201, 1202, 1203, 1204, 1205, 1206, 1207 e prodotti derivati di cui al codice NC 1208; i semi di melone
rientrano nel codice ex 1207 99.
(41)
Nel caso in cui i relativi prodotti derivati/di trasformazione siano derivati/trasformati esclusivamente o quasi esclusivamente a partire
dalla frutta a guscio in questione, i tenori massimi definiti per la corrispondente frutta a guscio si applicano anche ai prodotti
derivati/di trasformazione. Negli altri casi si applica ai prodotti derivati/di trasformazione l’articolo 2, paragrafi 1 e 2.»;
Per tutte le altre note si veda il REG (CE) 1881/2006
Tabella 7 – Tabella aggiornata dal Regolamento (UE) 165/2010 (N8) relativa al tenore massimo di
Aflatossine nei prodotti alimentari
pagina 47
Tesi di Laurea
Loria Tino
REG (CE) 1881/2006
Prodotto
AFB1
Reg. (UE) 165/2010
AFtot
AFB1
AFtot
μg/kg
pistacchi destinati al consumo umano diretto o
all’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari,
incluso pistacchio tritato, pasta pura al 100%,
pistacchi da sottoporre a cernita o ad altro
trattamento fisico prima del consumo umano o
dell’impiego quali ingredienti di prodotti
alimentari
2,0
4,0
8,0
10,0
5,0
10,0
12,0
15,0
Tabella 8 - riepilogo aumento livelli aflatossine in UE nel 2010
Dunque i criteri seguiti nei Regolamenti per la fissazione dei livelli si basano
essenzialmente sulla differenza tra i prodotti alimentari destinati all’uso umano per i quali
sia necessario impiegare trattamenti fisici per la riduzione del tenore di aflatossina prima
che l’alimento sia idoneo al consumo rispetto a quei prodotti alimentari già pronti per il
consumo.
Inoltre nei due Regolamenti è vietato l’uso di agenti chimici per decontaminare le
partite di prodotti contaminati e la possibilità di miscelare partite conformi a quelle non
conformi. Si evidenzia inoltre che gli stessi limiti massimi tollerabili sono stati fissati anche
sugli ingredienti.
pagina 48
Tesi di Laurea
Loria Tino
6 TOSSICITA’ DELLE AFLATOSSINE
L’impatto delle aflatossine sulla salute dipende dalla quantità di aflatossina assunta con gli
alimenti, dalla tossicità del composto, dal peso corporeo dell’individuo, dalla presenza di altre
micotossine e da fattori dietetici. Per stabilire un rapporto di causalità tra l’ingestione di
aflatossine e una specifica malattia umana devono essere soddisfatti alcuni criteri:

presenza di aflatossine negli alimenti,

accertata esposizione alle aflatossine,

correlazione fra esposizione e incidenza di una determinata malattia,

riproducibilità dei caratteristici sintomi negli animali da esperimento,

simile modalità di azione nell’uomo e nei modelli animali.
Una misura dell’esposizione sull’uomo è oggi possibile grazie alla messa a punto della metodica
per l’individuazione di biomarcatori molecolari consistenti nella determinazione quantitativa
delle aflatossine o dei loro derivati metabolici nei fluidi biologici dei soggetti esposti. Questo
tipo di test è stato usato per indagini epidemiologiche in alcune aree dell’Africa e dell’Asia,
dove il 95% circa dei sieri testati è risultato positivo all’analisi dell’addotto aflatossina-albumina.
In alternativa, il rischio per l’uomo viene valutato in maniera indiretta, partendo dalla
tossicologia animale e dall’analisi statistica di dati epidemiologici relativi a popolazioni a rischio.
Sono stati finora accertati almeno otto eventi epidemiologici di aflatossicosi acute dell’uomo. In
uno di essi, verificatosi nell’India occidentale e associato al consumo di mais contaminato
mediamente da 2 ppm di aflatossina B1, sono stati registrati 400 casi di epatite cronica di cui
100 con esito mortale. Inoltre, gli studi epidemiologici condotti sulle popolazioni a rischio
dell’Africa centro-meridionale (Kenia, Monzambico) e della Tailandia hanno chiaramente
pagina 49
Tesi di Laurea
Loria Tino
indicato l’esistenza di una correlazione positiva tra ingestione di aflatossine con la dieta e
incidenza del cancro del fegato. Le aflatossine sono state trovate anche in preparati di biopsia
di fegato di bambini sudanesi affetti da epatiti croniche, nonché nel latte materno di donne
sudanesi (si ricorda che il cancro primario del fegato è soprattutto una malattia delle
popolazioni giovani delle regioni tropicali e subtropicali, mentre è relativamente raro in Europa
e in America del Nord). Casi indiscussi di fibrosi epatica sono stati constatati nell’uomo dopo
una contaminazione prolungata di farine contaminate da A. flavus.
Varie organizzazioni internazionali come la Food and Agriculture Organization, la World Health
Organization, la Food and Drug Administration, l’International Agency for Research on Cancer e
il Joint Expert Committee on Food Additives (FAO, WHO, FDA, IARC, JECFA), sono
costantemente impegnate nella valutazione del rischio per la salute umana ed animale
derivante dalle micotossine. L’Istituto Superiore della Sanità ha più volte ribadito, che qualora
mangimi contaminati vengano usati nell'alimentazione di animali da allevamento; anche i
prodotti da questi derivati, possono risultare contaminati.
Recenti osservazioni hanno riscontrato la presenza dell’aflatossina B1, in un’ampia varietà di
prodotti alimentari, confermando cosi la persistenza della stessa nel mais, grano, semi di
lupino, fava, latte, yogurt, formaggi e uova.
Le aflatossine sono essenzialmente delle epatotossine dotate anche di attività cancerogena,
mutagena e probabilmente teratogena. Tra esse la più potente è la B1 che per questo è stata
oggetto di molte approfondite ricerche.
La scala di tossicità è cosi stabilita: B1 > M1 > G1 > B2 > G2
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Tesi di Laurea
Loria Tino
Le manifestazioni di tossicità generate dalle aflatossine possono essere di vario ordine in
conseguenza dell’ampia gamma di specie fungine che le producono, della diversa tossicità
intrinseca, della dose, dell’organo bersaglio, del sesso, dell’età e della specie animale.
L’incidenza di certi tipi di cancro pare essere fortemente condizionata dall’elevata tossicità di
alcune aflatossine, proprio questo aspetto desta perplessità circa la sicurezza di mangimi ed
alimenti.
6.1 Tossicocinetica
L’aflatossina B1 dopo l’assunzione da parte di un vertebrato superiore può essere
metabolizzata ad altri composti, alcuni dei quali sono caratterizzati da una maggiore o
minore tossicità. Queste trasformazioni comprendono reazioni di prima fase (riduzione,
ossidazione e idrolisi) e di seconda fase che consentono la combinazione con un
composto naturale prodotto dall’organismo.
6.1.1
Assorbimento
Le aflatossine sono composti caratterizzati da una elevata lipofila, quando assunte
per via orale vengono assorbite prevalentemente a livello intestinale e passano al
torrente circolatorio dove si legano alle albumine.
L’assorbimento attraverso il sistema respiratorio è stato accertato nell’uomo in
addetti alla macinazione dei mangimi ma l’importanza di questa modalità di
intossicazione non è stata attualmente quantificata.
6.1.2
Distribuzione
pagina 51
Tesi di Laurea
Loria Tino
Le aflatossine tendono a distribuirsi nel grasso e nei tessuti molli, tuttavia le
concentrazioni più elevate di residui si riscontrano negli organi coinvolti nei
processi di detossificazione: il rene e soprattutto il fegato. Esiste una correlazione
fra la quantità di tossina ingerita e la presenza di residui in questa ultima sede.
6.1.3 Metabolismo
Reazioni di fase 1
La reazione più importante nel metabolismo di prima fase dell’aflatossina B1 è
l’ossidazione da parte di enzimi microsomiali che avviene prevalentemente a
livello epatico. Il fegato rappresenta la sede metabolica dove, ad opera delle
ossidasi a funzione mista citocromo P-450 dipendenti, presenti nella frazione
microsomiale, si giunge alla formazione di diversi metaboliti (aflatossina Q1, P1,
B2a, M1, M2, aflatossicolo, ecc.) e degli intermedi epossidi. (B16)
Mediante l’azione di enzimi a funzione mista citocromo P-450 dipendenti viene
prodotto l’AFB1 8,9 epossido, una delle sostanze a più alto potere cancerogeno
attualmente conosciute.
Mediante idrossilazione si può avere la formazione di aflatossina M1 e Q1;
attraverso una reazione di O-demetilazione si ottiene l’aflatossina P1. Questi
ultimi due composti sono caratterizzati da una tossicità molto inferiore rispetto
alla B1 (B16).
L’aflatossicolo, prodotto dalla riduzione della B1, in natura viene velocemente
riconvertito a B1 e ne costituisce quindi una riserva(B16).
pagina 52
Tesi di Laurea
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Reazioni di fase 2
Il processo di detossificazione dell’organismo nei confronti delle aflatossine
avviene principalmente attraverso due reazioni: il B1-8,9-epossido viene legato al
glutatione
(reazione catalizzata dalla GSH-transferasi) ed in minor misura
trasformato in aflatossicolo; l’attività di questo enzima varia molto nelle differenti
specie animali e questo è attualmente ritenuto il motivo delle enormi differenze di
suscettibilità a questa tossina da parte delle varie specie animali studiate.
Altri metaboliti (AFM1; AFP1; AFQ1) vengono coniugati con l’acido glucuronico. Le
reazioni di seconda fase diminuiscono la tossicità ed aumentano la idrosolubilità e
la polarità dei composti favorendone l’escrezione.
pagina 53
Tesi di Laurea
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Figura 13 - Metabolismo aflatossina B1
6.1.4 Escrezione
Per quanto riguarda l’escrezione dell’AFB1, una frazione della tossina viene
eliminata attraverso il tratto intestinale, ma le principali vie di escrezione sono
rappresentate da quella biliare (in forma di AFB1-glutatione) e urinaria (come
aflatossina M1). Anche il latte è una via di escrezione dell’AFB1 (come AFM1),
costituendo in tal modo, a causa della rilevante tossicità di questo metabolita, una
potenziale fonte di assunzione durante la fase della lattazione.
Figura 14 - Escrezione dei metaboliti di AFB1
pagina 54
Tesi di Laurea
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6.2 Tossicodinamica
Le aflatossine hanno la capacità di interferire con il metabolismo energetico, inibendo
l’attività delle catene di trasporto degli elettroni. Successivamente alla biotrasformazione,
tali sostanze interagiscono con diverse macromolecole dell’organismo (DNA, RNA,
proteine e carboidrati) e possono indurre mutazioni genetiche, inibizione dei sistemi
enzimatici e alterazioni del metabolismo dell’interferone coinvolto nelle risposte
immunitarie e nelle reazioni antinfiammatorie.
Attualmente sono noti due tipi di interazione con il DNA da parte delle aflatossine:

la prima consiste in un legame reversibile non covalente con i siti attivi della
macromolecola,

la seconda in un legame molto stabile di tipo covalente che porta alla formazione degli
addotti del DNA. In questo caso non si lega al DNA l’aflatossina, ma il suo metabolita
8,9-epossido.
L’epossido ha elevato potenziale cancerogenetico a sua volta determinato dalle reazioni
con gli acidi nucleici.
L’alterazione nell’espressione di particolari geni, detti proto-
oncogèni, presenti in forma inattiva in tutte le cellule e attivabili anche da una singola
mutazione, può
portare ad alterazioni nella regolazione dello sviluppo, della
proliferazione e dell’iperplasia
cellulare; queste alterazioni possono eventualmente
progredire verso una evoluzione maligna.
Mentre la formazione di addotti con il DNA è responsabile dell’attività cancerogena, la
reazione tra l’epossido e le proteine potrebbe essere responsabile della tossicità acuta
dell’aflatossina B1.
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Tesi di Laurea
Loria Tino
Anche la diminuzione della sintesi proteica operata dalle aflatossine avviene mediante
due meccanismi:

un azione disaggregante sui poliribosomi e sul RER epatici;

il blocco della trascrizione da parte della RNA-polimerasi DNA-dipendente, con
conseguente diminuzione della sintesi proteica cellulare.
Un effetto è l’inibizione a livello epatico della sintesi dei fattori della coagulazione ed
anche fenomeni di steatosi, infatti la diminuita sintesi di proteine utili al trasporto dei
lipidi (apoproteine per le lipoproteine) causa alterazione della mobilizzazione e del
trasporto dei lipidi con conseguente degenerazione grassa del fegato.
Infine le aflatossine determinano anche alterazione del metabolismo dei carboidrati con
diminuzione delle riserve epatiche di glicogeno.
Gli effetti tossici conseguenti dovuti all’esposizione all’aflatossine sono correlati alla dose
ed al tempo di esposizione: vengono distinte due diverse forme di intossicazione, acuta e
cronica.
6.3 Tossicità Acuta
L’aflatossina (AFB1) è stata classificata come composto molto tossico (dose letale
mediana DL50 1-50 mg/kg) per molte specie animali ed estremamente tossico (DL50 <
1mg/kg) per alcune particolarmente
sensibili come trota, gatto e anatroccolo.
Quest’ultimo, per l’elevata sensibilità (la DL50 è 0,35 per AFB1 in animali di un giorno), in
passato veniva utilizzato per la prova biologica atta a stabilire l’eventuale contaminazione
delle derrate alimentari (B16).
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Tesi di Laurea
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Per l’uomo la DL50 per AFB1 oscilla tra 0,6 e 10 mg/Kg di peso corporeo.
In Tabella 9 sono riportati i valori di DL50 per alcune specie animali.
Specie
coniglio
DL50 espressa in
mg/kg
0,3
trota
0,3
anatroccolo
gatto
0,35
0,55
tacchinotto
0,4-0,6
cane
0,5-1
suini appena svezzati
0,6
gallina ovaiola
0,2-1
pulcino
1-1,5
Uomo
0,6 - 10
ratto
5-18
Tabella 9 - DL50 in diverse specie
L’intossicazione acuta da aflatossine (aflatossicosi acuta) è caratterizzata da depressione
ed anoressia seguite da anemia, ascite, ittero e diarrea.
L’organo di elezione per la detossificazione, il fegato, presenterà necrosi emorragiche e
ingrossamento delle cellule epatiche (colore grigiastro, struttura fibrosa, lobi allargati e
bordi arrotondati); inoltre, possono essere interessati anche, reni, sistema nervoso
centrale e tessuti, questi ultimi mostreranno una maggiore predisposizione alle lesioni
cutanee, con ritardo della coagulazione ematica.
La morte si verifica di norma entro poche ore o giorni ed è dovuta alla gravità delle
lesioni epatiche.
pagina 57
Tesi di Laurea
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6.4 Tossicità Cronica
Quindi gli effetti prodotti in conseguenza dell’ingestione di alimenti contaminati variano
in relazione alla tipologia d’animale, al tessuto colpito, alla quantità ingerita, e ad altri
fattori che possono condurre alla formazione di carcinomi.
Nel 1987 il Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA), ha dichiarato che
l’aflatossina B1 è il più potente epatocancerogeno naturale conosciuto per tutte le specie
di mammiferi studiate.
È dimostrato sperimentalmente che le aflatossine sono potenti cancerogeni in grado
produrre cancro al fegato anche in virtù di un’azione combinata tra aflatossine e virus
dell’epatite B (HBV) nell’eziologia del tumore epatico primario, è bene ricordare che
produce negli individui portatori di HBV tossicità circa 30 volte superiore. Recenti studi
effettuati in una fascia sociale ad alto rischio come quella dei consumatori di stupefacenti
marjiuana ed eroina, ottenuti da piante che veicolano aflatossine, hanno rilevato
un’infezione più aggressiva da HBV ed HIV. Nel 20% dei casi di eroinomani esaminati in
Olanda ed Inghilterra vi è la positività sierica per l'aflatossina B1, l’aflatossina B2 e
l’aflatossicolo.
Anche il frequente consumo di bassi livelli di aflatossine è generalmente associabile a
malattie croniche come il cancro, aspetto questo, che desta particolare timore.
Studi epidemiologici effettuati nei primi anni settanta in alcuni Stati dell’Africa e del Sud
Est Asiatico hanno dimostrato che in casi di prolungata esposizione umana alle aflatossine
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esiste una correlazione lineare fra consumo alimentare e incidenza di cirrosi epatica e
epatocarcinoma.
I dati sulla tossicità cronica per l’uomo sono derivati in gran parte da limiti basati su dati di
origine animale, talvolta troppo alti a causa della differente sensibilità, mostrata dalle
diverse specie animali. Per questo l’Europa e gli organismi internazionali non hanno
fissato una dose giornaliera accettabile (DGA) per le aflatossine.
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7 DETERMINAZIONE ANALITICA DELLE AFLATOSSINE
7.1 Campionamento
Riuscire ad ottenere un campione rappresentativo di pistacchi per la determinazione della
contaminazione da aflatossine è particolarmente difficile, dato che è stata verificata
un’incidenza della contaminazione fungina che riguarda un numero molto basso di
pistacchi.
Come dimostrato da vari studi, infatti, in 30 kg di campione può essere contenuto un
singolo pistacchio contaminato; d’altra parte i frutti di pistacchio possono contenere un
livello di aflatossine decisamente alto, nell’ordine di 1.000 µg; per tale motivo da un
singolo frutto contaminato può derivare una contaminazione media di circa 33 μg/kg di
prodotto, considerando 30 kg di prodotto come unità base, come consigliato dalla
Comunità europea. Nell’attuazione dei cicli di campionamento ci si ispira ai principi
enunciati nel Reg. (CE) n. 401/2006 Allegato I.
7.2 Scelta del metodo di analisi
Un metodo analitico per l’analisi delle micotossine deve: (B15)
1. Essere adatto ai programmi di monitoraggio (screening per il controllo qualità dei
materiali nella produzione di alimenti / mangimi);
2. Consentire il rispetto dei tenori massimi stabiliti dalle normative internazionali
(determinazione di micotossine a livelli inferiori ai tenori massimi ammissibili, secondo
criteri di accettabilità definiti);
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3. Permettere la raccolta di informazioni sull'esposizione umana e animale alle micotossine
(studi di valutazione del rischio);
I parametri richiesti per l’accettabilità di un metodo di analisi sono:

Specificità (o selettività): abilita di un metodo di determinare un analita in presenza di
composti potenzialmente interferenti;

Limiti di rivelabilità (LOD): la più piccola quantità di analita che può essere rivelata sulla
base del rapporto segnale/ rumore dello strumento usato;

Limite di quantificazione (LOQ) : la più piccola quantità di analita che può essere
purificata e quantificata con un metodo;

Intervallo di applicabilità: intervallo di concentrazione dell’analita in cui e stato provato
il metodo e per il quale sono noti i valori di precisione ed accuratezza;

Accuratezza: definisce il grado di concordanza fra il valore medio di un certo numero di
misure ed il valore vero attribuito al parametro da misurare;

Precisione: grado di accordo di misurazioni ripetute in modo indipendente applicando
lo stesso metodo su uno stesso materiale;

Ripetibilità: esprime la deviazione di una serie di misure ripetute rispetto al loro valore
medio;

Riproducibilità: distribuzione dei risultati di prove reciprocamente indipendenti
ottenuti in condizioni di “riproducibilità”. La riproducibilità intra-laboratorio può essere
misurata all’interno dello stesso laboratorio con lo stesso metodo, sullo stesso
materiale da saggio, da differenti operatori, strumenti, ad intervalli di tempo
relativamente lunghi. La riproducibilità inter-laboratorio può essere valutata mediante
studi collaborativi (identico materiale da saggio e metodo analitico, differenti
laboratori, operatori e strumenti. Esempio prove interlaboratorio circuiti UNICHIM,
FAPAS).

Esattezza o recupero: può essere stabilita solo per mezzo di un materiale di riferimento
certificato (MRC). Se non e disponibile un MRC, l’esattezza è valutata dall’analisi di
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campioni fortificati, cioè arricchiti con una quantità nota dell’analita da rilevare e si
definisce recupero. L’esattezza o recupero rappresenta il rapporto tra il valore medio
misurato per un analita in un MRC o in un campione fortificato ed il suo valore
certificato o noto, espresso come percentuale di tale valore.

Incertezza di misura: può essere intesa come la stima dell’intervallo dei valori entro cui
cade il valore vero di una misura. Questa definizione deriva dal fatto che ogni misura e
caratterizzata da variabilità, che si può verificare durante i vari stadi della procedura
analitica.
7.3 Confronto delle tecniche analitiche applicabili
Nel corso degli anni
sono state sviluppate e normate per le Aflatossine diverse
metodologie, ormai applicate dalla stragrande maggioranza dei laboratorio nel mondo.
Ma l’utilizzo di metodi analitici validati non è garanzia sufficiente per ottenere risultati
affidabili nella determinazione delle aflatossine. Un fondamentale requisito a supporto
dell’affidabilità è l’utilizzo di tecniche di assicurazione della qualità dei risultati che
prevedano, ove possibile, l’utilizzo di materiali di riferimento certificati (ad es. JRC/IRMM)
e la partecipazione a circuiti d’interconfronto (ad esempio FAPAS®). È inoltre altrettanto
importante stimare l’incertezza di misura: attualmente sono disponibili specifiche guide
che indichino come effettuare tale stima (ad es. EURACHEM/CITAC Guide CG4
“Quantifying Uncertainty in analitycal Measurement” ).
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Tecnica
Vantaggi
Contro
TLC
- permette determinazioni
precise per livelli superiori a 2
µg/Kg
- costi limitati
- Eccellenti performance
(specificità, accuratezza,
precisione)
- bassi livelli di rivelabilità
- sicurezza per l’operatore
- pochi punti critici
- risultati rapidi
- analisi simultanea di molti
campioni
- alta sensibilità
- non richiede attrezzature
costose
- semplice da utilizzare dopo
breve training dell’operatore
- fase di automazione
- valida per screening
- Analisi simultanea di
micotossine
- altamente sensibile e
selettiva
- possibilità di ridurre ed
eliminare la fase di clean-up
- non è necessaria la
derivatizzazione
- Uso di solventi considerati
pericolosi per l’ambiente e
l’operatore
IAC-HPLC con
derivatizzazio
ne pre o post
colonna e
rivelazione
fluorimetrica
Saggi ELISA
ImmunoEnzimatici
LC-MS/MS
con IAC multianticorpo
Riferimenti
Normativi
AOAC-993.17
- costoso strumentazione
- costo IAC
- richiede addestramento
dell’operatore
- tempi di analisi
- derivatizzazione
- interferenze dovute alla matrice
- possibili falsi positivi/negativi
- Cross-reattività con altre
micotossine
(specificità)
- Ripetibilità e riproducibilità
critiche
- necessità dell’analisi di
conferma
AOAC 991.31
- costi elevati strumentazione
- costi IAC
- richiede addestramento
dell’operatore
- elevati costi di manutenzione
In fase di
sviluppo
CEN EN
12955:1999
AOAC 993.16
Tabella 10 - Confronto tecniche analitiche per le aflatossine
Generalmente i laboratori che si trovano a gestire grandi quantitativi di campioni,
preferiscono eseguire la determinazione con metodi di screening (es. ELISA), che però
richiede alta esperienza dell’operatore per evitare errori come i falsi positivi-negativi. Cosi
facendo si riducono i costi ed i tempi per le analisi, solo in caso di campioni con valori
prossimi o superiori al limite di legge viene eseguita l’analisi di conferma in HPLC.
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7.4 Metodo analitico Applicato
L’analisi delle aflatossine è stata eseguita utilizzando un metodo interno validato nel 2010
dal laboratorio Progetto Ambiente & C. s.a.s. (Catania). La validazione è stata necessaria
per ottenere la certificazione col sistema italiano di accreditamento “ACCREDIA” avvenuta
il 4 maggio 2010 per le 10 prove in esame tra qui quella della determinazione della
aflatossine sulla frutta secca, cereali, mangimi e prodotti derivati. La procedura è stato
sviluppata partendo dal metodo normato UNI EN 12955:1999
(N10)
aggiornata anni dopo
dalla UNI EN ISO 16050:2011 (N11) .
Io personalmente ho preso parte alla fase di validazione, coordinata dal responsabile del
laboratorio Dott. Chim. Danilo Pulvirenti e dal direttore tecnico Dott. Chim. Salvatore
Pulvirenti, in quanto tecnico di laboratorio per il suddetto centro analisi dal 2008 ad oggi.
7.4.1 Principio del metodo
Le aflatossine presenti nel campione sottoposto ad analisi vengono prima estratte
con appropriato solvente, poi purificate mediante l’uso di colonne monouso ad
immunoaffinità (IAC), dunque determinate mediante l’uso di un cromatografo
liquido a fase inversa con rivelatore fluorimetrico previa derivatizzazione. La
determinazione quantitativa dei vari composti viene effettuata con le aree dei
rispettivi picchi cromatografici sulla base di opportune rette di taratura di miscele
di riferimento. I risultati sono di norma espressi in μg/Kg di Aflatossina B1 e di
Aflatossine Totali (somma di B1, B2, G1 e G2).
7.4.2 Fasi operative
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Dopo aver costruito la retta di taratura, utilizzando soluzioni standard di
riferimento a titolo noto, si passa alla fase di determinazione di seguito
schematizzata:

Preparazione del campione da sottoporre ad analisi;

Estrazione delle aflatossine dalla matrice;

Clean-up per eliminare le sostanze interferenti;

Separazione cromatografica mediante HPLC;

Derivatizzazione post-colonna per rendere più visibili alcune aflatossine;

Determinazione quantitativa mediante uso di rivelatore fluorimetrico;

Calcolo del risultato e dell’incertezza di misura associata.
7.4.3 Reagenti e Soluzioni
Tutte i reattivi utilizzati devono essere di grado analitico, inoltre la vetreria usata
deve essere decontaminata mediante lavaggio con Ipoclorito di sodio al 1% per 1
notte.

Solventi per HPLC – Acqua, Metanolo, Acetonitrile.

Soluzione derivatizzante PBPB (piridinio idrobromuro per bromuro) 100 mg/L:
sciogliere 100 mg di PBPB in circa 50 ml di acqua per HPLC. Quindi portare a
volume in un matraccio tarato da 1 L. La soluzione è stabile per quattro giorni se
conservata ed utilizzata in luogo fresco (Temperatura non superiore ai 25 ºC) ed
al riparo dalla luce diretta del sole.

Tampone PBS a pH 7.2 (Phosphate Buffer saline): Miscelare 60 ml di soluzione
23,873 g/l di sodio fosfato bibasico (Na2HPO4*12 H20) e 30 ml di soluzione
9,078 g/l di potassio fosfato monobasico (KH2PO4). Misurare il pH e correggerlo
fino a pH 7.2 usando le due soluzioni. Se il pH è più alto usare la soluzione di
potassio diidrogeno fosfato.
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
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Soluzione Estraente Metanolo:Acqua 80:20 v/v : Unire 80 ml di Metanolo per
HPLC a 20 ml di acqua per HPLC.

Soluzione al 1 % v/v di Acetonitrile in Toluene. Porre in un matraccio tarato da
100 ml, 1 ml di acetonitrile e portare a volume con toluene.

Materiale di Riferimento per Aflatossina B1, B2, G1 e G2 acquistati singolarmente
ed in polvere (es. vials da 1 mg).

Soluzione Madre ~ 10 mg/L per Aflatossina B1: Sciogliere tutto il contenuto
presente nella vials del materiale di riferimento ( ~ 1 mg) in soluzione 1 % v/v di
Acetonitrile in Toluene, portare a volume di 100 mL.

Soluzione Madre ~ 10 mg/L per Aflatossina B2: Sciogliere tutto il contenuto

Soluzione Madre ~ 10 mg/L per Aflatossina G1: Sciogliere tutto il contenuto

Soluzione Madre ~ 10 mg/L per Aflatossina G2: Sciogliere tutto il contenuto
7.4.4 Strumentazione

Bilancia analitica con sensibilità di 0,0001 g;

pH-metro;
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
Omogeneizzatore;

Agitatore magnetico;

Sistema di evaporazione rotante con pompa da vuoto (rotavapor);

Colonne ad immunoaffinità monouso per aflatossine (tipo Afla-clean o
equivalenti);

HPLC con pompa reciprocante a 3 vie (ELEMENTO B in Figura 15) e sistema di
iniezione (ELEMENTO A in Figura 15)

Colonna cromatografica C18, dimensioni particelle 5um, lunghezza 250 mm,
diametro interno 4.6 mm (ELEMENTO C in Figura 15);

Sistema per derivatizzazione post-colonna, formato da:
Pompa per soluzione derivatizzante (ELEMENTO D in Figura 15);
Valvola a T (ELEMENTO E in Figura 15)
1 - flusso proveniente dalla pompa derivatizzante,
2 – flusso proveniente dalla colonna cromatografica,
3 – flusso in uscita per il rivelatore.
Il tubo in uscita 3 dalla valvola T è di lunghezza 1 m per fare in modo che avvenga
la reazione di bromurazione.

Rivelatore fluorimetrico (FLD) per HPLC (ELEMENTO F in Figura 15);
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Figura 15 - HPLC con derivatizzatore post colonna utilizzato in laboratorio
7.4.5 Condizioni operative

Rivelatore fluorimetrico: λecc = 366 nm; λem = 436 nm;

Fase Mobile: Acqua:Metanolo:Acetonitrile 54 : 29 : 17;

Flusso eluizione 1 ml/min;

Volume di iniezione (loop) = 50 µL;

Flusso pompa derivatizzante 0,4 ml/min.
7.4.6 Procedura di calibrazione
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Determinazione della concentrazione delle soluzioni madre. Le soluzioni madre,
preparata come descritto, hanno una concentrazione non nota. Per conosce
l’esatta concentrazione di tali soluzioni, cosi da poter preparare soluzioni standard
a titolo noto, bisogna misurare l’assorbanza di queste soluzioni a 350 nm allo
spettrofotometro UV-VIS utilizzando come bianco la soluzione al 1 % v/v di
acetonitrile in toluene. Dalla lettura di assorbanza e applicando la seguente
formula si ricava la concentrazione delle quattro aflatossine:
Conc.(mg / L) 
ABS  MW 1000

Dove:

ABS: assorbanza di ciascuna soluzione di aflatossina letta a 350 nm;

MW: peso molecolare di ciascuna aflatossina;

ε: estinzione specifica di ciascuna aflatossina (in toluene-acetonitrile);
Aflatossina
MW (gr/mol)
Ε
B1
312
19300
B2
314
21000
G1
328
16400
G2
330
18300
Tabella 11 - Parametri per il calcolo della concentrazione delle aflatossine
Preparazione soluzione di Lavoro 100 ng/mL: Se la concentrazione delle soluzioni
madre è esattamente 1 mg-L, prelevare 1 mL per ogni soluzione di ciascun
aflatossina ed inserirle nel medesimo matraccio da 100 mL, portare a secco in
corrente di azoto e successivamente portare a volume con la fase mobile. Se la
concentrazione risulta differente, eseguire gli opportuni calcoli per ottenere la
concentrazione finale prefissata.
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Preparazione soluzione Standard n° 1 (2 ng/ml): Prelevare 1 ml di soluzione di
lavoro 100 ng/mL e trasferirli in un matraccio tarato da 50 mL, portare a volume
con la fase mobile.
Preparazione soluzione Standard n° 2 (5 ng/ml): Prelevare 2,5 ml di soluzione di
con la fase mobile.
Preparazione soluzione Standard n° 3 (10 ng/ml): Prelevare 5 ml di soluzione di
con la fase mobile.
Costruzione delle rette di taratura. Avviare lo strumento attenendosi a quanto
indicato nelle condizioni operative, dunque lasciare condizionare la colonna per
almeno 30 minuti. Iniettare le 3 soluzioni di calibrazione preparate al momento
dell’uso ed acquisire i cromatogrammi. Processare i cromatogrammi elaborando la
migliore retta passante per i punti di calibrazione (bestfit lineare) e verificare che il
valore di regressione lineare R2 sia > 0,98. Se la retta non è soddisfacente,
reiniettare le soluzioni standard.
Ordine di
eluizione
1
2
3
4
Aflatossina
RT
G2
5,07 min
G1
5,76 min
B2
6,79 min
B1
8,05 min
Tabella 12 - Tempi di ritenzione
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Figura 16 - Cromatogramma ottenuto per la soluzione standard n°2
Figura 17 - Rette di calibrazione ottenute nelle condizioni descritte sopra
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7.4.7 Preparazione del campione
Il campione deve essere finemente triturato e ben omogeneizzato prima di essere
sottoposto ad analisi. Nel caso di pistacchio sgusciato, questo viene macinato
direttamente. Nel
caso
di pistacchio
in guscio,
questo deve
essere
precedentemente sgusciato e poi macinato, il risultato viene espresso sulla parte
commestibile come da regolamento.
7.4.8 Estrazione
In una beuta da 100 mL pesare 25,00 g ± 0,01 g di aliquota di prova macinata e
aggiungere 50 ml di una soluzione estraente. Porre la beuta su agitatore
magnetico per 30 minuti al termine dei quali, dopo breve sedimentazione, filtrare
su filtro di carta raccogliendo il filtrato.
Figura 18 - Estrazione
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Prelevare 2 ml con pipetta graduata di filtrato e portarli in un matraccio tarato da
10 ml. Portare a volume con la soluzione di PBS pH 7.2.
7.4.9 Clean-up
La
purificazione
dell’estratto
viene
eseguita
mediante
colonnine
ad
immunoaffinità (IAC) specifiche per aflatossine (tipo aflaclean come in foto) che
non hanno bisogno di essere condizionate. Sono in commercio anche colonnine
multi-anticorpo e colonnine rigenerabili.
Figura 19 - Meccanismo delle IAC
Il meccanismo di separazione è di tipo immunoaffine proprio perché la
micotossina si lega al sito specifico per l’anticorpo che si trova nel setto della
colonnina. Il materiale estraneo viene eliminato per lavaggio con acqua e
successivamente il legame aflatossina-anticorpo è rimosso mediante eluizione con
opportuno solvente.
L’ estrazione e la purificazione possono essere anche eseguite in fase solida (SPE)
risparmiando dunque sul costo delle IAC, a discapito però della selettività.
pagina 73
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Dunque:

fare eluire la soluzione preservante presente nella colonnina rimuovendo il
tappo superiore ed inferiore.

Immettere i 10 mL di estratto diluito col PBS nella colonnina mediante
pipetta pasteur.

Una volta eluito tutto l’estratto, riempire il matraccio con 10 ml di acqua
deionizzata ed immetterli nella colonnina per eliminare le impurezze.

Tappare la colonnina nell’estremità inferiore ed inserirla in un palloncino
da 50 mL con tappo a smeriglio.

Introdurre 1 ml di metanolo ed attendere 5 minuti.

Togliere il tappo inferiore e fare eluire il metanolo attraverso la colonnina
nel pallone da 50 mL.

Estrarre col altri 3 mL di metanolo poco per volta.

Portare a secco al rotavapor

Riprendere con 1 mL di fase mobile

il campione è pronto per l’analisi strumentale
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Figura 20 - Clean-up del campione
7.4.10 Analisi del campione
L’estratto purificato e ripreso con 1 mL di fase mobile è pronto per l’analisi.
Dunque, dopo aver fatto condizionare la colonna per almeno 30 minuti nelle
stesse condizioni operative descritte per la costruzione della retta di calibrazione,
vengono prelevati ~ 150 µL di campione con una siringa per HPLC ed introdotti
nell’iniettore predisposto con loop da 50 µL.
Le aflatossine in miscela verranno separate in colonna cromatografica, all’uscita
della quale reagiranno con la soluzione di PBPB per essere derivatizzate. La
derivatizzazione è necessaria per le aflatossine B1 e G1 in quanto tali molecole
non sono dotate di elevata fluorescenza. Reagendo col bromo, esse subiranno
bromurazione del doppio legame sull’anello bifurano.
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Figura 21 - reazione di derivatizzazione
Figura 22 - Effetto della derivatizzazione sui picchi cromatografici
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La derivatizzazione post-colonna può anche essere eseguita con soluzione di Iodio a 60 °C
(iodurazione del doppio legame) oppure con raggi UV a 254 nm (derivatizzazione
fotochimica). Oppure può essere eseguita pre-colonna con acido trifluoroacetico (TFA)
che idrata il doppio legame.
Dopo la derivatizzazione il rivelatore misurerà la fluorescenza, ed il software dello
strumento acquisirà il segnale registrando il cromatogramma.
Dal tempo di ritenzione RT, specifico per ogni singola aflatossina in miscela, e dall’area del
picco interpolata con la retta di taratura, il software fornirà il risultato in ng/mL che
servirà al calcolo del risultato di residuo sul campione.
Nel caso in qui la risposta cada al di fuori del limite superiore del campo di linearità,
prelevare un aliquota di campione inferiore e rieseguire l’analisi.
7.4.11 Calcolo ed espressione del risultato
Dal report cromatografico, estrarre il risultato in ng/mL per ogni singola
aflatossina individuata nel campione.
Dunque procede al calcolo del risultato in µg/Kg (ppb) di campione come segue:
Aflatossina ng/g =
V estraente mL
V finale mL
ng
∗
∗ Risultato in
V purificato mL
P aliquota g
mL
Dove:
V estraente
= Volume miscela estraente (50 mL)
V purificato
= Volume prelevato per purificazione (2 mL)
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P aliquota
= Peso del campione analizzato (25 g)
V finale = Volume finale usato per riprendere l’estratto (1 mL)
Semplificando:
Aflatossina ng/g =
25 mL
ng
∗ Risultato in
P aliquota g
mL
Il risultato in ng/g è equivalente a µg/kg (ppb).
Procedere al calcolo dell’incertezza estesa (U) da associare al risultato,
interpolando linearmente i dati relativi riportati in prestazioni del metodo.
Dunque esprimere il risultato come segue:
Aflatossina B1 = Risultato µg/kg ± U µg/kg
Aflatossine Totali = Somma (B1 + B2 + G1 + G2) µg/kg ± U µg/kg
Le cifre significative dell’incertezza da associare alla misura possono essere al
massimo due, preferibilmente una. Il risultato deve essere arrotondato allo stesso
numero di cifre decimali dell’incertezza che andremo ad associare. Le normali
regole dell’arrotondamento possono essere applicate sia per l’incertezza che per il
risultato.
7.4.12 Validazione e Prestazioni del metodo
La validazione è la “conferma, sostenuta da evidenze oggettive, che i requisiti
relativi ad una specifica utilizzazione prevista sono stati soddisfatti” (ISO
9000:2000).
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In accordo alla norma EN ISO/IEC 17025:2000, che definisce i requisiti del sistema
di garanzia della qualità nel laboratorio di prova, un metodo di analisi puo essere
validato secondo vari schemi. Tra questi sono stati scelti la validazione mediante
partecipazione a circuiti inter-laboratorio (profency test) e studi intra-laboratorio.
La Decisione 98/179/CE della Commissione Europea richiede che il laboratorio di
controllo ufficiale partecipi periodicamente ai proficiency test riconosciuti
internazionalmente. La partecipazione ai circuiti inter-laboratorio è importante
per valutare le prestazioni analitiche del laboratorio, e confrontarle con quelle di
altri laboratori. Il laboratorio ha preso parte al circuito FAPAS durante il periodo
tra 2008-2012.
Per quanto riguarda la validazione nello studio intra-laboratorio, sono state
eseguite una serie di fortificazioni (per la precisione 10 repliche) ai tre diversi livelli
di contaminazione (2 ppb, 5 ppb e 10 ppb). I risultati del recupero medio
percentuale ottenuto (come si può osservare nella tabella) e dei coefficienti di
variazione CV % sono soddisfacenti a tutti i livelli di fortificazione.
Il metodo dunque garantisce un elevato recupero dell’analita e la deviazione
standard dei dati indica anche una ripetibilità accettabile.
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Aflatossina
B1
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REC.
LOD
medio
µg/Kg
%
96
0,1
LOQ
µg/Kg
0,2
Concentrazione ai
livelli di taratura
µg/Kg
Scarto tipo
di ripetibilità
µg/Kg
CV (%)
Incertezza
estesa
µg/Kg
L1
2,0
0,4
20
0,6
L2
5,0
0,5
10
0,9
L3
10,0
0,8
8
1,0
Campo di applicazione:
LOQ –> 20,0 µg/Kg
Campo di linearità:
2 µg/Kg -> 10 µg/Kg
N.B. Per tutte le aflatossine sono presi come riferimento i valori calcolati per B1.
Tabella 13 - prestazioni del metodo
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8 SCOPO DELLA TESI
Lo scopo del lavoro di tesi è stato quello di verificare se il pistacchio commercializzato a Bronte,
che, come visto dai dati delle importazioni e da quanto dichiarato dagli operatori del settore,
proviene per il 75% da paese Extra UE (in particolare Iran, Turchia e Stati Uniti), sia conforme ai
requisiti richiesti dalle vigenti norme circa il limite massimo residuo di aflatossine. Dunque per
verificare l’efficienza dei controlli ufficiali eseguiti dai laboratori pubblici, volti a tutela della
salute.
Analizzando inoltre dei campioni di pistacchio di produzione propria, si è verificato anche il
livello di contaminazione per le aflatossine nel pistacchio DOP di Bronte.
8.1 Scelta dei campioni
Come precedentemente detto, il pistacchio al naturale ed il semilavorato viene venduto
prevalentemente in 5 forme differenti e le forme “pistacchio tritato” e “pasta pura di
pistacchio al 100%”, sono quelle a maggior rischio di contraffazione. Dunque proprio
queste ultime sono state prese in considerazione per eseguire le analisi di controllo sul
contenuto di Aflatossine in prodotti commercializzati a Bronte.
I campioni analizzati sono sei, cinque di questi sono di pistacchio tritato ed uno di pasta di
pistacchio pura al 100%. Inoltre due campioni di pistacchio tritato sono di produzione
propria (allo scopo di verificare con certezza il residuo di aflatossine nel pistacchio
prodotto a Bronte), mentre i rimanenti quattro campioni sono stati acquistate da aziende
operanti nel territorio di Bronte. Tali aziende, oltre al punto vendita di Bronte, hanno
tutte un sito internet per la commercializzazione in Italia/Europa.
pagina 81
Tesi di Laurea
Loria Tino
Figura 23 - Campioni sottoposti ad analisi
Campione
numero
Tipo di
prodotto
Azienda
1
Pistacchio
tritato
2
Pistacchio
tritato
3
Pistacchio
tritato
4
Pistacchio
tritato
Pistacchio
tritato
Produzione
//
propria (anno
2013)
Produzione
//
propria (anno
2015)
AZIENDA 1
Azienda con
proprio marchio,
che delega la
produzione a
terzi.
AZIENDA 2
Bar, gelateria,
pasticceria.
AZIENDA 3
Azienda di
produzione e
lavorazione.
AZIENDA 4
Azienda di
produzione e
lavorazione.
5
6
Pasta pura
di pistacchio
al 100%
Tipologia azienda
Indicazione
sulla
provenienza
Prodotto nel
territorio a
marchio DOP
Prodotto nel
territorio a
marchio DOP
Prodotto nello
stabilimento di
Bronte
Quantità
Prezzo
2 Kg
//
2 Kg
//
Confezione
da 100 g
4,00 €
Assente
Confezione
da 100 g
Confezione
da 100 g
6,00 €
Vasetto da
100 g
4,00 €
Prodotto nello
stabilimento di
Bronte
Assente
4,50 €
Tabella 14 - Tabella riepilogativa campioni
Come riportato in tabella, il campione 1 e il campione 2 sono costituiti da pistacchio
prodotto a Bronte in due anni di produzione differenti, 2013 e 2015. Il campione 1
dunque è stato conservato per 2 anni in un sacco di juta, esposto all’aria ma la riparo
pagina 82
Tesi di Laurea
Loria Tino
dalla luce del sole, umidità e fonti di calore. Questo per verificare l’efficienza del
tradizionale metodo di conservazione.
E’ importante notare le scarse o assenti informazioni sulla provenienza del prodotto.
Il venditore del campione n°3, che riporta in etichetta “Prodotto nello stabilimento di
Bronte…”, ha dichiarato sotto mia esplicita domanda che il prodotto è di importazione
extra UE, questa informazione è assente nella confezione.
8.2 Dati sperimentali ottenuti
Dai report cromatografici ottenuti si è proceduto al calcolo del risultato, il riepilogo dei
dati ed il giudizio di conformità sono indicati nelle tabelle seguenti:
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
AF TOTALI
(µg/Kg)
(µg/Kg)
(µg/Kg)
(µg/Kg)
(µg/Kg)
1
< LOQ
< LOQ
< LOQ
< LOQ
< LOQ
2
< LOQ
< LOQ
< LOQ
< LOQ
< LOQ
3
1,0 ± 0,3
< LOQ
< LOQ
< LOQ
1,0
4
2,4 ± 0,4
0,2 ± 0,2
1,0 ± 0,3
< LOQ
3,6
5
2,8 ± 0,4
< LOQ
< LOQ
< LOQ
2,8
6
2,4 ± 0,4
0,3 ± 0,2
0,5 ± 0,3
< LOQ
3,2
N.B. Valori corretti per il recupero
LOQ Limite di quantificazione (vale 0,2 µg/Kg per il metodo applicato dal laboratorio)
#
Tabella 15 - Dati sperimentali ottenuti
AF Totali
LMR per AF
GIUDIZIO DI
(µg/Kg)
Totali (µg/Kg)
CONFORMITA’
1
< LOQ
CONFORME
2
< LOQ
CONFORME
< LOQ
3
1,0
1,0
CONFORME
< 8,0
< 10,0
4
2,4
3,6
CONFORME
5
2,8
2,8
CONFORME
6
2,4
3,2
CONFORME
LMR = Limite massimo del residuo come da Reg. (UE) 165/2010.
LOQ = Limite di quantificazione (vale 0,2 µg/Kg per il metodo applicato dal laboratorio)
#
AFB1
(µg/Kg)
< LOQ
LMR per AFB1
(µg/Kg)
Tabella 16 - Giudizio di conformità per i campioni
pagina 83
Tesi di Laurea
Loria Tino
Di seguito si riportano i cromatogrammi ottenuti per i sei campioni analizzati.
Figura 24 - Cromatogrammi campioni
pagina 84
Tesi di Laurea
Loria Tino
8.3 Analisi dei Risultati
Tutti i campioni analizzati sono risultati conformi.
Ma come si vede dai dati ottenuti, per i due campioni di produzione propria (C1 e C2) per
i quali si ha l’assoluta certezza della proveniente, il residuo di aflatossine è minore del
LOQ (0,2 μg/Kg). Invece per tutti e quattro i campioni acquistati sono stati rilevati livelli
maggiori del LOQ.
Nel 75 % dei casi, tre campioni su quattro (2 di pistacchio tritato e 1 di pasta pura al 100 %
di pistacchio) sono stati quantificati livelli di contaminazione medi superiori a 2 μg/Kg per
AFB1 e 3 μg/Kg per AF totali.
Alla luce di quanti discusso, è plausibile la totale assenza di aflatossine nel pistacchio DOP
di Bronte per:

Clima sfavorevole allo sviluppo di Aspergillus

Tecnica di produzione e trasformazione all’avanguardia

Tecniche di stoccaggio del prodotto ottimali
Dunque, seppur conformi, viene da pensare che i prodotti che presentano un residuo
quantificabile di aflatossine siano stati mal prodotti, mal conservati o miscelati in parte o
del tutto con pistacchio di importazione, che dai dati diffusi dal sistema RASFF risultano
mediamente contaminati.
C’è da aggiungere inoltre che se vigesse ancora il REG. (CE) 1881/2006, che fissava il LMR
per AFB1 a 2 μg/Kg (modificato dal Reg. (UE) 165/2010 a 8 μg/Kg) questi 3 campioni in
pagina 85
Tesi di Laurea
Loria Tino
oggetto sarebbero risultati “non conformi” e dunque non commercializzabili. Ma come
definito dagli esperti scientifici dell’ EFSA:
“l’innalzamento da 4 μg/kg a 8 o a 10 μg/kg dei tenori massimi di aflatossine totali
nelle mandorle, nelle nocciole e nei pistacchi avrebbe effetti modesti sulle stime di
esposizione alimentare, sul rischio di tumori e sui margini di esposizione calcolati.
Ma l’esposizione alle aflatossine da tutte le fonti dovrebbe essere al livello più basso
ragionevolmente ottenibile, perché le aflatossine sono genotossiche e cancerogene.
Questo riducendo l’esposizione alimentare alle aflatossine da fonti diverse da
mandorle, nocciole e pistacchi, e riducendo il numero di prodotti alimentari
altamente contaminati che arrivano sul mercato.”
pagina 86
Tesi di Laurea
Loria Tino
9 CONCLUSIONI
Il rischio sanitario collegato alle micotossine, e alle aflatossine in particolare, è universalmente
riconosciuto. Le aflatossine, come discusso, sono epatotossiche, genotossiche e cancerogene.
Dai dati diffusi da organismi internazionali e nazionali sui controlli effettuati, si evidenzia una
diffusa contaminazione nei prodotti destinati all’alimentazione umana.
A partire dal 1965, anno in cui sono stati definiti i limiti massimi per le aflatossine nelle arachidi,
l’Europa ha preso provvedimenti legislativi relativi a livelli massimi ammissibili per le più
importanti micotossine in molte matrici alimentari, oltre a provvedimenti relativi a metodi per il
campionamento, requisiti per l’analisi, condizioni per l’importazione e a programmi coordinati
per il controllo ufficiale. Oggi infatti si sono creati dei piani di monitoraggio efficaci e praticabili
dediti non solo al controllo delle derrate prodotte nel nostro paese, ma soprattutto incentrati
su un attento e qualificato controllo di prodotti provenienti da Paesi extra UE nella fase
dell’ingresso nel nostro Paese.
La trasparenza sull’etichetta però rimane un problema attuale in Europa. Dal REG. (UE)
1169/2011, sulle informazioni da riportare in etichetta, si legge:
Art.26 “L’indicazione del paese d’origine o del luogo di provenienza è obbligatoria nel
caso in cui l’omissione di tale indicazione possa indurre in errore il consumatore in merito
al paese d’origine o al luogo di provenienza reali dell’alimento.”
Ma questa si applica agli alimenti e non agli ingredienti, recentemente la Coldiretti ha
dichiarato che circa un terzo della produzione complessiva dei prodotti agroalimentari venduti
in Italia ed esportati con il marchio made in Italy contiene in realtà materie prime straniere.
pagina 87
Tesi di Laurea
Loria Tino
Nulla peraltro vieta agli operatori di aggiungere su base volontaria informazioni ulteriori in
merito all'origine dei prodotti e/o delle materie prime.
Per quanto riguarda i prodotti al pistacchio acquistati, si evidenziano informazioni non chiare
sulla provenienza della materia prima e ciò induce il consumatore a pensare che l’origine sia
uguale al luogo di produzione.
Questo è a sfavore dei prodotti di eccellenza del nostro paese, e nel caso del pistacchio di DOP
di Bronte, prodotti che sono assolutamente privi di residui di micotossine come emerso dal
presente lavoro.
E’ dunque opportuno concludere che la sicurezza alimentare e la trasparenza sulle etichette è
un obbiettivo comune che può essere raggiunto con impegno, responsabilità e rispetto delle
normative da parte di tutti gli operatori interessati. Questo per impedire che eventuali falle
possano provocare danni con gravi ripercussioni sulle filiere coinvolte e soprattutto sulla fiducia
dei consumatori nel sistema europeo di tutela.
pagina 88
Tesi di Laurea
Loria Tino
10 ALLEGATI
Allegato 1 – Notifiche RASFF anno 2014 relativa alle aflatossine nel pistacchio in guscio e
sgusciato importato in UE
#
Data
Classificazione
Notificata da Provenienza
Conc. AFB1 Conc. AF
(µg/kg)
tot (µg/kg)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
20/10/2014
notifica di respingimento alla frontiera
Germany
Turchia
295,8
295,8
17/12/2014
Bulgaria
Iran
289,1
313,2
29/07/2014
Slovakia
Iran
280,2
310,7
01/12/2014
Bulgaria
Iran
267,0
282,0
05/08/2014
Notifica di allarme
Italy
Iran
261,0
282,0
25/03/2014
Italy
Stati Uniti
228,5
233,2
15/12/2014
Belgium
Iran
163,0
176,0
14/07/2014
Lithuania
Iran
146,0
155,0
28/08/2014
Notifica di allarme
Slovakia
Iran
141,5
155,4
23/12/2014
Belgium
Iran
119,0
253,0
28/10/2014
Italy
Turchia
96,4
104,7
12/09/2014
Greece
Iran
93,8
24/07/2014
Belgium
Iran
86,4
93,2
22/07/2014
Germany
Iran
84,5
93,9
18/07/2014
Italy
Stati Uniti
84,0
93,0
15/10/2014
Germany
Iran
76,7
87,0
02/04/2014
Germany
Iran
71,6
78,0
08/12/2014
Bulgaria
Iran
71,6
80,6
23/12/2014
Belgium
Iran
70,4
79,5
18/06/2014
Cyprus
Iran
67,3
70,7
04/07/2014
Notifica di allarme
Germany
Stati Uniti
62,1
66,9
08/12/2014
Germany
Iran
61,8
67,6
12/03/2014
Italy
Iran
60,5
68,0
15/09/2014
Germany
Iran
57,5
21/10/2014
Netherlands
Turchia
55,0
25,0
17/11/2014
Lithuania
Iran
54,0
56,0
23/01/2014
Italy
Stati Uniti
51,0
57,0
13/01/2014
Italy
Stati Uniti
50,0
53,0
27/02/2014
Italy
Siria
49,4
52,9
19/09/2014
France
Iran
46,0
50,0
18/02/2014
Germany
Iran
43,8
09/07/2014
Lithuania
Iran
43,0
48,0
pagina 89
Tesi di Laurea
Loria Tino
#
Data
Classificazione
Conc. AFB1 Conc. AF
(µg/kg)
tot (µg/kg)
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
21/03/2014
Germany
Turchia
41,9
20/06/2014
Notifica di allarme
Netherlands
Stati Uniti
40,0
03/09/2014
Italy
Turchia
39,1
45,3
28/10/2014
Notifica di allarme
Netherlands
Stati Uniti
38,0
42,0
17/10/2014
Germany
Turchia
37,8
25/03/2014
Italy
Iran
33,4
36,3
04/03/2014
Italy
Afghanistan
32,0
40,0
11/08/2014
Germany
Iran
31,7
24/07/2014
Italy
Afghanistan
31,6
33,9
23/12/2014
Belgium
Iran
31,0
34,6
20/06/2014
Notifica di allarme
Netherlands
Iran
31,0
34,0
14/10/2014
Lithuania
Iran
30,0
14/03/2014
Germany
Turchia
29,8
14/04/2014
Italy
Iran
28,4
31,7
29/05/2014
Italy
Iran
27,7
30,0
20/06/2014
Italy
Siria
27,6
30,9
10/01/2014
Germany
Turchia
27,6
41,6
02/04/2014
Germany
Iran
27,0
31,9
07/07/2014
Italy
Turchia
26,4
29,8
05/03/2014
Belgium
Turchia
25,1
27,9
18/06/2014
United Kingdom
Stati Uniti
25,0
27,8
17/01/2014
United Kingdom
Turchia
24,2
25,9
12/11/2014
Spain
Iran
24,0
05/03/2014
Belgium
Iran
23,9
26,0
04/03/2014
Germany
Iran
23,8
25,9
09/04/2014
Belgium
Iran
23,4
24,2
22/05/2014
Notifica di allarme
Germany
Turchia
23,2
25,9
29/07/2014
Italy
Iran
23,0
25,0
27/10/2014
Germany
Turchia
22,6
25,0
27/02/2014
Italy
Stati Uniti
22,0
25,0
10/11/2014
Italy
Stati Uniti
21,6
20/06/2014
notifica di informazione per attenzione
Netherlands
Stati Uniti
21,0
21,0
29/10/2014
Poland
Stati Uniti
20,9
23,2
25/07/2014
United Kingdom
Stati Uniti
20,5
24,0
28/02/2014
Germany
Iran
18,9
20,6
11/03/2014
Germany
Iran
18,4
18,4
11/08/2014
Germany
Turchia
17,5
25/03/2014
Notifica di allarme
Slovakia
Iran
17,3
21,2
13/01/2014
France
Turchia
16,8
16,8
13/05/2014
Italy
Siria
16,7
32,3
46,6
pagina 90
Tesi di Laurea
Loria Tino
#
Data
Classificazione
Conc. AFB1 Conc. AF
(µg/kg)
tot (µg/kg)
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
01/12/2014
Bulgaria
Iran
16,0
02/12/2014
Italy
Turchia
16,0
27/08/2014
Germany
Iran
14,8
26/05/2014
Italy
Iran
14,4
12/12/2014
notifica di informazione per follow-up
Belgium
Stati Uniti
14,0
19/09/2014
France
Iran
13,7
14,6
11/09/2014
Germany
Iran
13,1
14,8
10/09/2014
Germany
Iran
12,7
14,1
01/04/2014
Germany
Turchia
12,3
14,0
15/10/2014
Germany
Iran
12,1
13,5
21/05/2014
Germany
Turchia
11,4
14,5
19/11/2014
Poland
Turchia
11,3
07/04/2014
Italy
Iran
10,1
11,7
19/02/2014
Belgium
Turchia
4,3
26,0
17,0
16,0
Allegato 2 - Notifiche RASFF periodo Gennaio-Giugno 2015 relative alle aflatossine nel
pistacchio in guscio e sgusciato importato in UE
#
Data
Classificazione
Conc. AFB1 Conc. AF
(µg/kg)
tot (µg/kg)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
06/05/2015
Spain
Iran
796,0
862,0
09/01/2015
Belgium
Turchia
545,0
559,0
03/04/2015
Italy
Iran
350,0
390,0
11/02/2015
Germany
Iran
295,5
21/05/2015
Netherlands
Stati Uniti
220,0
260,0
07/05/2015
Belgium
Iran
195,0
215,0
27/02/2015
Notifica di allarme
Netherlands
Iran
190,0
210,0
26/03/2015
Greece
Iran
170,7
186,6
07/04/2015
Spain
Turchia
170,0
185,0
05/03/2015
Germany
Iran
153,5
08/05/2015
Notifica di allarme
Netherlands
Iran
140,0
160,0
21/05/2015
Luxembourg
Stati Uniti
136,0
144,0
16/03/2015
Romania
Iran
135,4
187,5
17/04/2015
Belgium
Iran
126,0
145,0
21/01/2015
Bulgaria
Iran
118,5
128,0
07/05/2015
Belgium
Iran
111,0
120,0
30/06/2015
Belgium
Iran
103,0
119,0
pagina 91
Tesi di Laurea
Loria Tino
#
Data
Classificazione
Conc. AFB1 Conc. AF
(µg/kg)
tot (µg/kg)
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
04/06/2015
Belgium
Stati Uniti
96,9
152,0
17/03/2015
Belgium
Iran
95,7
113,0
20/04/2015
France
Turchia
90,0
100,0
17/04/2015
Belgium
Iran
76,2
83,4
17/03/2015
Belgium
Iran
75,0
88,2
03/06/2015
France
Stati Uniti
71,0
80,0
12/03/2015
Spain
Iran
67,0
30/01/2015
Greece
Iran
64,2
72,7
22/04/2015
Notifica di allarme
Italy
Iran
51,3
56,3
29/06/2015
Germany
Stati Uniti
47,6
53,3
17/06/2015
Italy
Iran
47,5
47,5
28/05/2015
Germany
Iran
43,4
47,2
11/02/2015
Belgium
Iran
38,9
42,3
04/06/2015
Belgium
Stati Uniti
35,0
36,6
19/05/2015
Italy
Stati Uniti
33,8
20/03/2015
Germany
Iran
33,7
24/04/2015
Belgium
Iran
32,2
22/06/2015
Italy
Iran
32,0
36,0
13/04/2015
Italy
Iran
30,6
32,4
13/04/2015
Belgium
Giordania
29,9
39,9
11/03/2015
Italy
Turchia
29,0
33,0
30/01/2015
Germany
Iran
28,6
07/05/2015
Belgium
Iran
28,1
28,1
20/04/2015
France
Turchia
28,0
29,0
20/03/2015
Belgium
Afghanistan
27,9
31,5
29/06/2015
Germany
Turchia
27,1
23/01/2015
Germany
Iran
26,3
27,4
23/03/2015
Bulgaria
Iran
25,2
26,9
03/03/2015
Spain
Iran
24,0
13/05/2015
Germany
Stati Uniti
24,0
26,3
11/06/2015
Germany
Stati Uniti
22,7
24,3
07/05/2015
Spain
Iran
22,5
25,0
14/01/2015
Netherlands
Turchia
22,0
27,0
30/04/2015
United Kingdom
Iran
21,8
26,1
19/06/2015
Germany
Turchia
21,5
23,6
08/01/2015
Belgium
Iran
20,0
25,1
21/05/2015
Netherlands
Stati Uniti
20,0
20,0
20/03/2015
Belgium
Turchia
19,4
21,7
02/03/2015
Italy
Stati Uniti
19,2
14/04/2015
Bulgaria
Turchia
18,9
38,0
22,3
pagina 92
Tesi di Laurea
Loria Tino
#
Data
Classificazione
Conc. AFB1 Conc. AF
(µg/kg)
tot (µg/kg)
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
11/05/2015
Germany
Iran
18,7
20/02/2015
Germany
Turchia
17,1
17,1
25/02/2015
Belgium
Iran
16,7
19,1
09/04/2015
Italy
Stati Uniti
16,5
17,4
17/04/2015
Italy
Afghanistan
16,4
18,4
20/04/2015
Spain
Iran
15,9
17,6
29/06/2015
Belgium
Stati Uniti
15,5
16,8
03/06/2015
France
Stati Uniti
11,4
53,0
05/01/2015
Bulgaria
Turchia
10,3
26,0
24/06/2015
Germany
Turchia
9,9
pagina 93
Tesi di Laurea
Loria Tino
11 RIFERIMENTI
11.1 Sitografia
S 1.
S 2.
S 3.
S 4.
S 5.
S 6.
S 7.
S 8.
S 9.
S 10.
S 11.
https://www.google.it
https://it.wikipedia.org
https://en.wikipedia.org
http://www.agraria.org
http://www.istat.it
http://www.americanpistachios.org/
http://www.fao.org/
http://www.dosicily.com
http://www.salute.gov.it/
http://ec.europa.eu/food/safety/rasff/index_en.htm (RAFSS)
http://madb.europa.eu/madb/statistical_form.htm (Import/export di merci UE)
11.2 Bibliografia
B 1. LA FILIERA DEL PISTACCHIO IN SICILIA (CORERAS 2007)
B 2. COUNCIL FOR AGRICOLTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY (CAST 2003 ) - “Mycotoxins:
Risks in Plant, Animal and Human Systems.” Ames/IO USA.
B 3. TOSSICOLOGIA II EDIZIONE (PICCIN 2008) – Galli, Corsini, Marinovich
B 4. BOTANICA MEDICA, FARMACEUTICA E VETERINARIA (ZANICHELLI - 1993) - A.Ceruti, M.
Ceruti, G. Vigolo
B 5. Aspergillus flavus and Turkey X Disease. Toxic metabolites of Aspergillus flavus
(NATURE - 1962) - Nesbitt, B.F., O’Kelly, J., Sargeant, K., Sheridan, A.
B 6. Rev. Trav. Chim (1963) van Dorp, D.A., Van Der Zijden, A.S.N., Beerthuis, R.K.,
Spaareboom, S.,Ord, W.,O., De Jong, K., Kenuing, R.
B 7. The Merck Index, 13 th ed. (Merck 2001) O’Neil, M.J., Smith, A., Heckelman.
B 8. Isolation and structure of aflatoxins M1 and M2. (Tetrahedron Lett. 1966) - Holzapfel,
C.W., Steyn, P.S., Purchase, I.F.H.
B 9. Le micotossine nelle piante e nelle derrate alimentari (L’Italia Agricola - 1988) Bottalico,
A.
B 10. Mycotoxins and animal foods (Boca Raton – 1991) Wyatt, R.D., Smith, J.E., Henderson,
R.S.
B 11. Aflatoxin and cyclopiazonic acid production by a sclerotium producing Aspergillus
tamarii strani (Appl. Environ. Microbiol – 1996) - Goto, T., Wicklow, D.T., Ito, Y.
B 12. Cryptic speciation and recombination in the aflatoxin-producing fungus Aspergillus
flavus. ( Proc. Natl. Acad. USA – 1998) - Geiser, D.M., Pitt, J.I., Taylor, J.W.
B 13. La chimica degli alimenti (Zanichelli - 2005) - Tom Coultate.
B 14. Aflatoxin contamination in pistachio nuts: A farm to storage study (ELSEVIER - 2012)
Georgiadou, A. Dimou, S. Yanniotis
pagina 94
Tesi di Laurea
Loria Tino
B 15. ANGELO VISCONTI - Sviluppi diagnostici nell’analisi delle micotossine - IV Congresso
Nazionale sulle Micotossine Roma, Giugno 2012
B 16. Tossicologia Veterinareia - Aflatossine – (Ambrosiana 1994) Pompa G. Beretta C.
11.3 Normative
N 1. REG. 21/2010/CE del 12 gennaio 2010
N 2. SANCO/1208/2005 rev. 1 - Guidance document for competent authorities for the
control of compliance with EU legislation on aflatoxins
N 3. REG. 882/2004/CE - Controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in
materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali
N 4. DIR 92/59/CEE - Relativa alla sicurezza generale dei prodotti
N 5. REG. 178/2002/CE - che stabilisce i principi e i requisiti generali della legislazione
alimentare, istituisce l'Autorità europea per la sicurezza alimentare e fissa procedure nel
campo della sicurezza alimentare
N 6. REG. 16/2011/UE - recante disposizioni di applicazione relative al sistema di allarme
rapido per gli alimenti ed i mangimi
N 7. REG. 1881/2006/CE - che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti
alimentari
N 8. REG. 165/2010/UE - modifica, per quanto riguarda le aflatossine, del regolamento (CE)
n. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti
alimentari
N 9. l’EFSA Journal n°446 (1-127) del 2007 - OPINION OF THE SCIENTIFIC PANEL ON
CONTAMINANTS IN THE FOOD CHAIN ON A REQUEST FROM THE COMMISSION RELATED
TO THE POTENTIAL INCREASE OF CONSUMER HEALTH RISK BY A POSSIBLE INCREASE OF
THE EXISTING MAXIMUM LEVELS FOR AFLATOXINS IN ALMONDS, HAZELNUTS AND
PISTACHIOS AND DERIVED PRODUCTS.
N 10. UNI EN 12955:1999 - “Determinazione di aflatossina B1 e della somma di aflatossine B1,
B2, G1 e G2 nei cereali, frutti in guscio e prodotti derivati – Metodo per cromatografia
liquida ad alta risoluzione con derivatizzazione post-colonna e purificazione in colonna di
immuno affinità.
N 11. UNI EN ISO 16050:2011 – “Prodotti alimentari - Determinazione di aflatossina B1 e del
contenuto totale di aflatossine B1, B2, G1 e G2 nei cereali, nelle noci e nei prodotti
derivati - Metodo per cromatografia liquida ad alta risoluzione
pagina 95

Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte

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