Rosalind Franklin Watson e Crick

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4
Watson e Crick
Rosalind Franklin
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Le cellule eucariotiche svolgono durante la loro vita una serie
ordinata di eventi che costituiscono il
Ciclo Cellulare.
citochinesi:
o citodieresi. Divisione del citoplasma e formazione di
membrane plasmatiche indipendenti, nelle due cellule
figlie dopo la mitosi.
diploide:
Che possiede un doppio assetto cromosomico.
fase G1:
E' la fase del ciclo cellulare in cui la cellula non ha
ancora replicato il DNA per dividersi.
fase G2:
E' la fase che precede la mitosi. Le cellule in questa
fase hanno tutti i cromosomi duplicati.
fase M:
Comprende la mitosi e la citochinesi.
fase S:
E' la fase del ciclo cellulare, compresa fra la G1 e la
G2, in cui il DNA viene replicato.
interfase:
Periodo del ciclo cellulare durante il quale non vi è
mitosi o citochinesi.
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Nelle cellule in proliferazione le 4 fasi impiegano dalle 10 – 20 ore
in dipendenza del tipo cellulare
Interfase comprende le fasi G1, S, and
G2
Le macromolecole come proteine e
lipidi sono sintetizzate durante la fase
G1
Il DNA è sintetizzato durante la fase S.
Durante la G2 le cellule si preparano
alla divisione (M) il DNA duplicato
viene suddiviso alle due cellule figlie.
Le cellule che non si dividono escono
dal normale ciclo ed entrano nella G0.
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Formazione della Bolla di replicazione:
replicazione: 2 forcelle di replicazione (bidirezionali)
bidirezionali)
Enzimi coninvolti nella formazione della Bolla di replicazione:
replicazione:
•Elicasi
•SSB (single strand binding protein)
•Topoisomerasi
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Problema causati dalla formazione
della bolla di replicazione:
replicazione:
La torsione necessaria per separare I
due filamenti creerebbe a valle delle
forcelle dei grovigli di filamenti di
DNA che non permetterebbero
l’avanzamento dell’
dell’apparato di
duplicazione.
duplicazione.
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In una molecola di DNA sono presenti 10 basi ogni giro
d’elica. Lo stress torsionale necessario per aprire la
doppia elica produce un superavvolgimento del DNA che
porterà ad una variazione del numero di basi per giro
d’elica. Si creano così degli isomeri topologici del DNA
(TOPOISOMERI).
Le topoisomerasi trasformano un topoisomero in un
altro.
Topoisomerasi di tipo I: tagliano uno dei due
filamenti ruotandolo attorno quello non tagliato. Il taglio
viene riparato ed il DNA torna in forma rilassata
Topoisomerasi di tipo II:
II tagliano e ricongiungono
entrambi I filamenti.
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Topoisomerasi di tipo I
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Topoisomerasi di tipo II
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Le DNA polimerasi per
cominciare la sintesi
necessitano di un
innesco (primer).
Il primer è un piccolo
RNA (~ 10 nt).
Sintetizzato da una RNA
polimerasi DNA
dipendente: DNA
primasi
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SI
Problema connesso all’avanzamento della forcella e sintesi di entrambi I
filamenti:
Il filamento che viene sintetizzato nella stessa direzione della forcella di replicazione
viene sintetizzato in modo continuo (filamento leading, filamento guida, filamento
anticipato).
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SI
fila
me
nto
lea
din
g
g
n
i
g
ag
l
to
n
e
m
a
fil
Problema connesso all’avanzamento della forcella e sintesi di entrambi I
filamenti:Il filamento neosintetizzato che espone il 5’ P verso la direzione di
avanzamento della forcella non può essere sintetizzato di continuo ma per frammenti
(sintetizzati nella direzione opposta) che prendono il nome di frammenti di Okazaki.
Questo filamento viene chiamato filamento lagging, filamento in ritardo, filamento
lento.
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La sintesi in un filamento (3’-5’) è continua
nell’altro (5’ – 3’) è discontinua.
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Gli inneschi di RNA
verranno rimossi
dall’attività esonucleasica
5’P 3’OH di DNApolI nel
proc. e dall’ RNasi H negli
euc.
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Attività esonucleasica 3’OH 5’P della DNA pol III dei batteri e
Attività
Attività di correzione di bozze
δ negli eucarioti.
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Sito di origine: oriC (ricco in A-T)
Proteina di inizio: dnaA
Elicasi e Primasi formano il
primosoma
SSB: stabilizzano i singoli filamenti.
La primasi sintetizza il primer di RNA
La DNA pol III comincia a
sintetizzare il filamento leading
Topoisomerasi II (girasi
girasi)
Elicasi: per lo svolgimento di ogni giro d’elica impiega una mol di ATP
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Il filamento lagging forma un’ansa consentendo alla DNA pol III di muoversi
nella stessa direzione della forcella e sintetizzare I nuovi filamenti su entrambi
gli stampi in direzione 5’P – 3’OH
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Le due forcelle di replicazione si
incontreranno in una regione del cromosoma
batterico che prende il nome di TER
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Genoma molto più esteso rispetto ai procarioti
Velocità di polimerizzazione più bassa di 10 volte rispetto ai procarioti
Esistono origini di replicazione multiple (repliconi
repliconi) distanti tra loro 30 – 50 kb
Durata della sintesi del DNA ~ 6 – 8 ore.
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Complesso Primasi/DNApolα
Primasi/DNApolα
polimerizza il primer ed un piccolo
tratto di DNA.
Il fattore di replicazione C (RF-C)
e l’Antigene Nucleare di
Proliferazione Cellulare (PCNA)
in un processo ATP dipendente
scalzano il complesso
Primasi/DNApolα e consentono il
legame della DNApolδ
La DNApolα
DNApolα ha un ruolo anche nei
processi di riparazione
I primers sono rimossi dall’’RNasiH
in cooperazione con FENFEN-1 (Flap
Endonuclease)
DNA polymerase ε also plays a major role in DNA replication; its precise role is unclear, but it may sometimes substitute for DNA
polymerase δ in lagging strand synthesis
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RNA primers are placed every 50 or so nucleotides. About 10nucleotide lengths of RNA primer are extended through addition
of 10 to 20 deoxynucleotides by DNA polymerase α before DNA
polymerase δ (or ε) enters
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Il PCNA oltre ad avere un ruolo
fondamentale nella duplicazione,
è coinvolto nella regolazione
del ciclo cellulare.
cellulare.
È in grado di legare la ciclina D
(che ha un ruolo importante per
l’ingresso delle cellule in fase
G1). La ciclina D blocca PCNA ed
evita che si abbia la sintesi del
DNA. Quando la cellula entra in
fase S I livelli di ciclina D
diminuiscono e PCNA può
iniziare la trascrizione.
PCNA è coinvolto anche nella
riparazione del DNA.
DNA Quando
il DNA è danneggiato viene
attivata la proteina p21 che lega
PCNA e blocca la sintesi del DNA
sino a quando il danno non sarà
riparato
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È un problema che riguarda
l’estremità
estremità 3’OH dei telomeri.
telomeri.
Dopo che il primer di RNA è stato
rimosso come verrà
verrà riempito il
gap?
Questo fenomeno causerebbe
l’accorciamento dei cromosomi ad
ogni ciclo di replicazione.
replicazione.
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Le telomerasi allungano l’estremità 3’OH dei telomeri consentendo così di avere uno
stampo più lungo per l’azione della primasi
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Le telomerasi sono costituite da
1. una parte enzimatica: TERT (trascrittasi inversa)
2. Un piccolo RNA (TERC
TERC) che riconosce le
sequenze ripetute che caratterizzano le estremità
telomeriche
Le telomerasi sono inattive nelle cellule somatiche,
ma attive nelle cellule germinali, staminali e
tumorali
Proteine come TRF1 e TEBP (telomere end binding
protein) regolano l’azione delle telomerasi. TEBP
si lega sul tratto a singola elica sintetizzato dalla
telomerasi (spiazzandola) proteggendola ed
evitando che inneschi un segnale di danno al
DNA che potrebbe arrestare la progressione del
ciclo cellulare
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after telomerase has extended the 3′ end
by a sufficient amount a new Okazaki
fragment is primed and synthesized,
converting the 3′ extension into a
completely double-stranded end.
The telomerase RNA then translocates to a
new base-pairing position slightly further
along the DNA polynucleotide and the
molecule is extended by a few more
nucleotides. The process can be repeated
until the chromosome end has been
extended by a sufficient amount.
L'energia
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II Ed.luminosa
– Capitolo ultravioletta
4
viene
assorbita dal doppio legame che si
rompe e può reagire con la base
azotata vicina. Se questa è un'altra
timina o citosina si può formare un
legame covalente tra le due basi.
Questi dimeri sono pericolosi e
formano una rigida piega nel DNA che
causa dei problemi quando la cellula
deve duplicare il DNA. La DNA
Polimerasi legge con difficoltà il
dimero perchè questo non si adatta in
modo flessibile alla forma del suo sito
attivo.
l'enzima fotoliasi che rompe i legami
che tengono unite le due basi azotate
del dimero (utilizza la luce visibile per
innescare il processo)
(NER)
De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo
4
Vi sono glicosidasi diverse
per diversi tipi di lesione.
La base danneggiata viene
riconosciuta dalla
glicosidasi in quanto
protrude fuori dalla doppia
elica.
La distorsione
nella catena, prodotta dalla
lesione, induce la rimozione di
un corto segmento a singolo
filamento che include la lesione.
Tale attività in E.coli dipende
dall’attività di 4 proteine (UvrA-BCD). Un sistema analogo, ma
molto più complesso è attivo
negli eucarioti (proteine XPA,
XPC, ecc.).
Lo stesso sistema è
capace di recuperare le
molecole di RNA polimerasi
bloccate in seguito a lesione.
Tale fenomeno noto come
riparazione accoppiata alla
trascrizione garantisce la
riparazione del DNA in regioni
attivamente trascritte.
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Il complesso di proteine UVR è
il
responsabile
riconoscimento
del
del
sito
danneggiato e del suo taglio.
La DNA pol I sintetizza il DNA
mancante e la ligasi ripristina il
legame fosfodiesterico.
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Difetti a carico dei geni coinvolti nei
meccanismi di NER:
Xeroderma pigmentoso (ipersensibilità agli
UV)
Sindrome di Cockayne (ipersensibilità agli
UV ed agli agenti chimici)
Tricotiodistrofia: sensibilità della pelle e
fragilità di unghia e capelli
MISMATCH
De Leo - Fasano -REPAIR
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Rimozione di una base mal appaiata: viene
riconosciuto e tagliato solo il filamento di nuova
sintesi grazie al riconoscimento di un taglio
(nick) che normalmente caratterizza i filamenti di
nuova sintesi (negli eucarioti); mentre nei procarioti
viene riconosciuto il filamento demetilato
(caratteristica dei filamenti neosintetizzati)