La nuova monografia armonizzata

La nuova monografia armonizzata
Analisi del testo e confronto con le vecchie
monografie
Elisa Baretta
Cristina Bandera
Italfarmaco SpA
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Confronto tra le monografie:
Che cosa è cambiato?
Ci sono dei dubbi
…
Approfondiremo alcuni punti.
Elisa Baretta
Cristina Bandera
Italfarmaco SpA
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Titoli 1
Europea
USP
Armonizzata
2.6.12 Microbiological
examination of non-sterile
products: total viable aerobic
count.
<61> Microbial limit tests
Eur. 2.6.12
USP <61>
(B. Harmonised method)
Microbiological examination of
non-sterile products: microbial
enumeration tests.
(A. Method of the European
Pharmacopoeia)
•Preparation of the sample
•Examination of the sample
•
Effectiveness of culture media
and validity of the counting
method
•Interpretation of the results
•Preparatory testing
•Buffer solution and media
•Sampling
•Procedure
- Total aerobic microbial
count
- Test for Staphylococcus
aureus and Pseudomonas
aeruginosa
- Test for Salmonella and
Escherichia coli
- Total combined molds and
yeasts count
- Retest
1.
2.
3.
4.
Introduction
General procedures
Enumeration methods
Growth promotion test and suitability
of the counting method and negative
controls
4-1. General considerations
4-2. Preparation of tests strains
4-3. Negative control
4-4. Growth promotion of the media
4-5. Suitability of the counting method in
the presence of product
4-6. Results and interpretation
5. Testing of products
5-1 Amount used for the test
5-2 Examination of the product
5-3 Interpretation of the results
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale - Scopo
Europea
USP
Armonizzata
Permettere il conteggio dei batteri mesofili e dei
funghi che possono crescere in condizioni aerobie.
Test per la stima del
numero di
microorganismi
aerobi vivi.
Permettere il
conteggio dei batteri
mesofili e dei funghi
che possono crescere
in condizioni aerobie.
I test servono sopratutto per determinare se una
sostanza oggetto di una monografia della
Farmacopea possiede i requisiti microbiologici
specificati nella monografia stessa.
I test possono anche essere usati per il test di
efficacia dei conservanti (5.1.3) e per monitorare
la qualità delle materie prime.
I test possono essere usati in associazione con le
linee guida sulla qualità microbiologica 5.1.4.
Se i test sono usati per scopi come il monitoraggio
delle materie prime e dei prodotti finiti o per le
convalide di processo, l’
esecuzione dei test, il
numero di campioni da prelevare e
l’
interpretazione dei risultati sono oggetto di
accordo tra il produttore e le autorità competenti.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
I test servono
sopratutto per
determinare se una
sostanza o una
preparazione
possiede i requisiti di
qualità microbiologica
stabiliti.
Conta aerobica totale - Campionamento
Europea
USP
Armonizzata
Deve esserci un piano di campionamento
ben definito. Deve dipendere da fattori
come la grandezza del lotto, il rischio per la
salute dei pazienti, le caratteristiche del
prodotto ed il livello di contaminazione che
ci si aspetta. Se non prescritto diversamente
usare campioni di 10 g o 10 ml. Scegliere il
campione casualmente dal bulk o dai
contenitori disponibili. Un esempio di piano
di campionamento applicabile ai prodotti per
cui possono esserci problemi di distribuzione
dei microorganismi è quello a tre classi. In
questo caso si devono prelevare 5 campioni
per ogni lotto ed analizzarli separatamente.
Le tre classi sono:
I) campioni accettabili (meno di m ufc/g) m:
limite della monografia (nessuno supera
10m)
II) campioni marginali (più di m ufc/g, ma
meno di 10m ufc/g) (max 2 tra m e 10m).
III) campioni difettosi (più di 10m ufc/g).
Procurarsi
campioni
da 10 ml o
10 g per
ogni test
richiesto
dalla
monografia
individuale.
Se non richiesto diversamente, usare 10 g o 10 ml del
prodotto.
Per i fluidi o i solidi in aerosol campionare 10
contenitori. Per i cerotti campionarne 10.
La quantità può essere ridotta a non meno della
quantità presente in 10 unità di dose per le sostanze in
queste condizioni:
- la quantità per unità di dose è meno di 1 mg
- la quantità per g o ml (se non in dose singola) è meno
di 1 mg.
Per i principi attivi con la quantità da campionare
limitata o con lotti molto piccoli (ad es. meno di 1000
ml o 1000 g) la quantità da analizzare è l’
1% del lotto,
a meno che non sia richiesta o giustificata ed
autorizzata una differente quantità.
Per i prodotti per cui il numero totale di pezzi del lotto è
meno di 200 il campione può essere ridotto a 2 unità e
1 unità se è meno di 100.
Scegliere il campione casualmente dal bulk o dai
contenitori disponibili. Per ottenere la quantità richiesta,
mischiare il contenuto di un adeguato numero di
contenitori.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale - preparazione del campione 1
Europea
USP
Armonizzata
(messa a punto e convalida)
Dissolvere o diluire 10 g o
ml di prodotto in soluzione
fisiologica tamponata
peptonata pH 7.0 o altro
liquido adatto. In genere si
usa la diluizione 1:10, ma
possono esserne usate
altre.
Se necessario correggere il
pH fino a circa 7. Se il
prodotto ha una nota
attività antimicrobica si può
aggiungere un agente
inattivante.
Per i prodotti insolubili in
acqua aggiungere dei
tensioattivi (es. 1g/l di
Tween 80).
Preparare il campione con
dei trattamenti che siano
appropriati per le sue
caratteristiche e che non
alterino il numero e le
specie dei microrganismi
originariamente presenti.
Ottenere sospensioni o
soluzioni in una forma
adatta alla procedura
analitica.
Per un solido che non si
scioglie completamente
ridurre la sostanza ad una
polvere moderatamente
fine e sospenderla nel
veicolo specificato.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Il metodo per la
preparazione del campione
dipende dalle caratteristiche
fisiche del prodotto. Si
possono usare le procedure
descritte o altre alternative.
Generalmente per la messa
a punto del metodo si usa 1
g diluito 1:10.
Diluenti suggeriti: soluzione
fisiologica tamponata
peptonata pH 7.0, tampone
fosfato pH 7.2, TSB. Se
necessario correggere il pH
in modo che si collochi tra 6
e 8.
Per i prodotti insolubili in
acqua aggiungere dei
tensioattivi (es. 1g/l di
Tween 80).
Conta aerobica totale - preparazione del campione 2
Europea
USP
Armonizzata
Per i prodotti grassi
omogenizzare il prodotto con non
più della metà del suo peso di
Tween 80 sterile o altro
tensioattivo. Se necessario
riscaldare a 40° (o 45°C)
massimo ed eventualmente
mantenere il campione
solubilizzato in bagnomaria o in
un incubatore. Aggiungere
diluente pre-riscaldato e
mescolare attentamente
continuando a mantenere
riscaldato il campione per il
tempo più breve necessario per
la formazione di un’
emulsione ed
in ogni caso per non più di 30
minuti.
Per un fluido che consiste di
una soluzione vera, di una
sospensione in acqua, di un
veicolo idroalcolico con meno
del 30% di alcool e per un
solido che si dissolve subito
completamente usare 90 ml di
tampone fosfato pH 7.2 od il
terreno specificato.
Per i prodotti grassi
solubilizzare preventivamente
in Isopropil miristato o Tween
80 o altro tensioattivo non
inibente. Se necessario
riscaldare a 40° (o 45°C)
massimo ed eventualmente
mantenere il campione
solubilizzato in bagnomaria.
Aggiungere diluente preriscaldato e, se necessario,
continuare a mantenere
riscaldato il campione fino
all’
inoculo.
Per i fluidi immiscibili in acqua,
le pomate, le creme e le cere
preparare una sospensione con
una minima quantità di un
adatto agente emulsionante
sterile (come uno dei
polisorbati) usando un
agitatore meccanico e
riscaldando ad una
temperatura non superiore a
45°C, se necessario.
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Conta aerobica totale - preparazione del campione 3
Europea
USP
Armonizzata
Per i cerotti transdermici
rimuovere il foglio protettivo con
una pinzetta sterile e posarli con
la parte adesiva all’
insù su una
superficie sterile. Coprire la parte
adesiva con una garza sterile (o
con un un tessuto filtrante
polimerico monofilamento) e
porre 10 cerotti in minimo 500 ml
di soluzione fisiologica
tamponata peptonata pH 7.0 con
un inattivante tipo Tween 80 e/o
lecitina. Agitare vigorosamente
per almeno 30’(prep. A)
Porre altri 10 cerotti in 500 ml di
LB ed agitare vigorosamente per
almeno 30’(prep. B).
Per un campione fluido in
aerosol raffreddare il
campione in una miscela di
alcool e ghiaccio secco per
circa 1 ora, tagliare il
contenitore per aprirlo,
lasciargli raggiungere la
temperatura ambiente,
permettere al propellente di
uscire o riscaldare per farlo
uscire. Prelevare la quantità
di campione necessaria.
Per gli aerosol trasferire il
prodotto in un contenitore sterile
o filtrare direttamente.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Per i cerotti transdermici
rimuovere il foglio protettivo e
posarli con la parte adesiva
all’
insù su una superficie sterile.
Coprire la parte adesiva con un
materiale sterile poroso e porre i
cerotti in un contenitore con
diluente. Agitare vigorosamente
per almeno 30’
.
Conta aerobica totale –esecuzione delle analisi 1
Europea
USP
Armonizzata
Filtrazione su membrana
Usare membrane con pori di
diametro nominale non maggiore
di 0.45 m e la cui efficacia nel
trattenere i batteri sia stata
dimostrata. Scegliere il tipo di
filtro in modo che la sua efficienza
non sia inficiata dal tipo di
sostanza da filtrare. Ad es. usare
i filtri in nitrato di cellulosa per le
soluzioni acquose, oleose e
debolmente alcooliche e quelli in
acetato di cellulosa per le
soluzioni molto alcooliche.
Trasferire un’
adeguata quantità di
campione preparato
(possibilmente che contenga 1 g
di prodotto) su ognuna di 2
membrane e filtrare subito.
Filtrazione su membrana
--
Filtrazione su membrana
Preparare il campione con un metodo
che sia adeguato (validato) e
trasferire un’
adeguata quantità di
campione preparato su ognuna di 2
membrane e filtrare subito. Lavare
ogni filtro seguendo la procedura
validata.
Per la TAMC trasferire una membrana
su TSA, per la TYMC trasferire l’
altra
su SDA.
Incubare il TSA a 30-35°C per 3-5 gg
ed il SDA a 20-25°C per 5-7 gg.
Calcolare il numero di ufc/g o ml.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale –esecuzione delle analisi 2
Europea
USP
Armonizzata
Lavare ogni filtro con 3 aliquote,
ognuna di circa 100 ml di un
liquido adatto, come la sol.
fisiologica tamponata peptonata
pH 7 a cui possono essere
aggiunti degli inattivanti. Se
convalidato, si può lavare meno
di 3 volte.
Trasferire una membrana (per la
conta dei batteri) su un terreno
adeguato (come il TSA) e l’
altra
(per i funghi) su un terreno
adeguato (come il SDA).
Incubare il TSA a 30-35°C ed il
SDA a 20-25°C per 5 gg, a meno
che non si ottenga una conta
affidabile in un tempo più breve.
Scegliere le piastre con la conta
più alta al di sotto delle 100
colonie e calcolare il numero di
ufc/g o ml.
--
Dalla convalida:
Usare membrane con pori di diametro
nominale non maggiore di 0.45 m e
la cui efficacia nel trattenere i batteri
sia stata dimostrata. Scegliere il tipo di
filtro in modo che la sua efficienza non
sia inficiata dal tipo di sostanza da
filtrare.
Usare un filtro per ogni
microorganismo.
Trasferire un’
adeguata quantità di
campione preparato (possibilmente
che contenga 1 g di prodotto) sul filtro
e filtrare subito. Lavare ogni filtro con
un’
adeguata quantità di diluente.
Per la TAMC trasferire la membrana su
TSA, per la TYMC su SDA.
Incubare come da tabella.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale –esecuzione delle analisi 3
Europea
USP
Armonizzata
Conta in piastra
Conta in piastra
Conta in piastra
a) per inoculo
Usare piastre da 90 mm ed
aggiungere ad ognuna 1 ml di
campione preparato e 15-20 ml
di terreno adatto per i batteri
(come il TSA) o 15-20 ml di
terreno adatto per i funghi
(come il SDA) liquefatto a non
più di 45°C.
Se si usano piastre più grandi
aumentare proporzionalmente
la quantità di agar.
Se necessario diluire il
campione preparato in modo
che 1 ml contenga tra 30 e
300 colonie. Pipettare 1 ml
della soluzione finale in 2
piastre. Aggiungere subito
15-20 ml di TSA sciolto e
mantenuto a circa 45°C.
Chiudere le piastre,
mescolare il campione con
l’
agar ruotando o muovendo
le piastre.
a) per inoculo
Usare piastre da 90 mm ed
aggiungere ad ognuna 1 ml di
campione preparato e 15-20 ml di
terreno adatto per i batteri (come il
TSA) o 15-20 ml di terreno adatto
per i funghi (come il SDA)
liquefatto a non più di 45°C.
Se si usano piastre più grandi
aumentare proporzionalmente la
quantità di agar.
Per ogni terreno preparare almeno
2 piastre per ogni livello di
diluizione.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale –esecuzione delle analisi 4
Europea
USP
Armonizzata
Per ogni terreno preparare
almeno 2 piastre per ogni
livello di diluizione.
Incubare il TSA a 30-35°C ed il
SDA a 20-25°C per 5 gg, a
meno che non si ottenga una
conta affidabile in un tempo
più breve.
Lasciar solidificare a
temperatura ambiente,
invertire ed incubare a 3035°C per 48-72h.
Al termine dell’
incubazione
contare le colonie ed
esprimere il risultato per g o
ml usando la media delle due
piastre. Se non ci sono
colonie esprimere il risultato
come <10 ufc/g o ml (per la
dil 1:10).
Incubare il TSA a 30-35°C per 3-5
gg ed il SDA a 20-25°C per 5-7 gg.
Scegliere le piastre corrispondenti
ad una diluizione e che abbiano il
numero più alto di colonie inferiore
a 250 (50 per i funghi). Fare la
media aritmetica delle conte e
calcolare il numero di cfu/g o ml.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale –esecuzione delle analisi 5
Europea
USP
Armonizzata
b) per spatolamento
Usare piastre da 90 mm ed
aggiungere 15-20 ml di terreno
adatto per i batteri (come il TSA)
o 15-20 ml di terreno adatto per i
funghi (come il SDA) liquefatto a
non più di 45°C e lasciar
solidificare. Se si usano piastre
più grandi aumentare
proporzionalmente la quantità di
agar.
Asciugare le piastre, ad esempio
sotto una cappa a flusso laminare
o in un incubatore.
Spatolare un volume misurato di
non meno di 0.1 ml del campione
preparato.
Per ogni terreno usare almeno 2
piastre per ogni livello di
diluizione.
Procedere come con il metodo a).
--
b) per spatolamento
Usare piastre da 90 mm ed
aggiungere 15-20 ml di terreno
adatto per i batteri (come il TSA) o
15-20 ml di terreno adatto per i
funghi (come il SDA) liquefatto a
non più di 45°C e lasciar
solidificare. Se si usano piastre più
grandi aumentare
proporzionalmente la quantità di
agar.
Asciugare le piastre, ad esempio
sotto una cappa a flusso laminare
o in un incubatore.
Spatolare un volume misurato di
non meno di 0.1 ml del campione
preparato.
Per ogni terreno usare almeno 2
piastre per ogni livello di
diluizione.
Procedere come con il metodo a).
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale –esecuzione delle analisi 6
Europea
USP
Armonizzata
MPN
La precisione e l’
accuratezza del
metodo MPN è inferiore a quella
degli altri due metodi. In
particolare si ottengono risultati
inaffidabili per la conta delle
muffe. Usare questo metodo
solo se giustificato.
Preparare una serie di 3
diluizioni 1:10 successive.
Inoculare da ogni diluizione 3
aliquote da 1g o ml 3 provette
con 9-10 ml di un adeguato
terreno liquido (tipo TSB). Se
necessario aggiungere un
inattivante.
MPN
Preparare 14 provette con 10
ml di TSB. Preparare quattro
file da tre provette. Pipettare
1 ml della diluizione 1:10 del
campione nelle prime 3
provette + 1 (A) (1:100 =
100 l di campione) e
agitare. Da quest’
ultima
piepttare 1 ml nelle seconde
3 provette + 1 (B) (1:1000 =
10 l di campione) e agitare.
Dalla provetta B pipettare 1
ml nelle terze 3 provette
(1:10000 = 1 l di campione)
e agitare. Le ultime tre
provette sono il controllo
negativo. Eliminare le A e B.
MPN
La precisione e l’
accuratezza del
metodo MPN è inferiore a quella
degli altri due metodi. In
particolare si ottengono risultati
inaffidabili per la conta delle
muffe. Usare questo metodo solo
se giustificato.
Preparare una serie di 3 diluizioni
1:10 successive. Inoculare da ogni
diluizione 3 aliquote da 1g o ml 3
provette con 9-10 ml di un
adeguato terreno liquido (tipo
TSB). Se necessario aggiungere
un inattivante.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale –esecuzione delle analisi 7
Europea
USP
Armonizzata
Incubare le 9 provette a 30-35°c
per 5 gg. Registrare il numero di
provette con crescita per ogni
livello di diluizione. Se la lettura
è difficoltosa eseguire delle
subcolture nello stesso brodo o
su agar (TSA) per 18-24h.
Determinare il numero più
probabile di batteri per g o ml
usando la tabella.
Incubare, quindi verificare
che i tre controlli siano
limpidi. Contare il numero di
provette torbide per ogni
livello di diluizione e
confrontare i numeri con la
tabella riportata.
Incubare le 9 provette a 30-35°c
per 5 gg. Registrare il numero di
provette con crescita per ogni
livello di diluizione. Se la lettura è
difficoltosa eseguire delle
subcolture nello stesso brodo o su
agar (TSA) per 18-24h.
Determinare il numero più
probabile di batteri per g o ml
usando la tabella.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Tabel
l
adel
l
’
MPN
Numero di provette che hanno
mostrato crescita
g o ml di prodotto per provetta
MPN/g o ml
di prodotto
Limiti di
confidenza
(95%)
0.1
0.01
0.001
0
0
0
<1
0 - 9.4
0
0
1
3
0.1 - 9.5
0
1
0
3
0.1 - 10
0
1
1
6.1
1.2 - 17
..
..
..
..
..
2
2
1
28
9 - 94
..
..
..
..
..
2
3
0
29
9 - 94
..
..
..
..
..
3
1
1
75
17 - 199
..
..
..
..
..
3
3
2
1100
200 - 4000
3
3
3
< 1100
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Conta aerobica totale - esecuzione delle analisi 8
Interpretazione dei risultati
Europea
USP
La conta batterica si considera -uguale al numero medio di
colonie trovate su TSA. La
conta fungina si considera
uguale al numero medio di
colonie trovate su SDA. La
conta aerobica totale è la
somma della conta batterica e
della conta fungina come
descritto sopra. Se c’
è
evidenza che su entrambi i
terreni crescono gli stessi tipi
di microorganismi, questo può
essere corretto. Con l’
MPN si
ha la conta batterica.
Armonizzata
La TAMC si considera uguale al
numero di colonie trovate su
TSA. Se si trovano colonie di
funghi, queste fanno parte
della TAMC. La TYMC si
considera uguale al numero
medio di colonie trovate su
SDA. Se si trovano colonie di
batteri, queste fanno parte
della TYMC. Se la TYMC supera
il limite a causa della presenza
di batteri, si può usare un SDA
con antibiotici. Con l’
MPN si ha
la conta batterica.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Frequently asked questions on chapter 2.6.12
Microbiological examination of non-sterile
product: total viable aerobic count
When are you actually supposed to do the negative control:
when testing the suitability of the method, or when testing
the product, or in both situations?
You are supposed to do the negative control at the same time
as when you are testing the product.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Frequently asked questions on chapter 2.6.12
Microbiological examination of non-sterile
product: total viable aerobic count
What is the purpose of the negative control?
The purpose of this negative control is to show that there is
no contamination during the testing of the product.
If a positive result is obtained with a negative control, the
test can be regarded as invalid and may be repeated..
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Frequently asked questions on chapter 2.6.12
Microbiological examination of non-sterile
product: total viable aerobic count
Does it have to be done every time the product is tested or
during the method validation or is it possible to do it
periodically?
It is preferable to do a negative control every time that the
product is tested.
Elisa Baretta - Italfarmaco S.p.A.
Analisi del testo e confronto con le
vecchie monografie
Cristina Bandera - Montefarmaco
•Si tratta di test che intendono determinare la
pr
esenzaol
’
assenzadipar
t
i
col
ar
imi
cr
or
gani
smi
che ( per motivi diversi) sono considerati
particolarmente indesiderabili in una categoria di
prodotti.
•Si tratta di test più complessi che creano una
pressione selettiva a favore di alcuni organismi a
discapito di altri per distinguere visivamente le
diverse tipologie.
Cristina Bandera - Montefarmaco
Europea
In questo metodo generale si
pr
oponel
’
us
odial
c
unit
er
r
eni
selettivi. Tipicamente i terreni
selettivi non sono in grado di
rilevare i microrganismi
danneggiati sub-letalmente.
Poiché tali germi sono rilevanti
per la qualità del prodotto, deve
essere incluso uno stadio di
resuscitazione nelle procedure
c
hepr
ev
edonol
’
us
odiques
t
i
terreni
USP
Vedi conta
Armonizzata
I test qui descritti permettono la
r
i
c
er
c
adel
l
’
as
s
enz
aodel
l
a
limitata presenza di
microrganismi specifici che
possono essere trovati nelle
condizioni descritte.
I test servono soprattutto per
determinare se una sostanza o
una preparazione possiede i
requisiti di qualità
microbiologica stabiliti.
Possono essere usate procedure
microbiologiche alternative,
compresi i metodi automatizzati,
previa dimostrazione della loro
equivalenza con il metodo di
Farmacopea
Cristina Bandera - Montefarmaco
Europea
2.6.13. MIcrobiological
examination of non-sterile
products: test for specified
micro-oraganisms
( A: Method of the European Pharmacopeia)
- Enterobacteria and certain other gramnegative bacteria
-Escherichia coli
-Salmonella
-Pseudomonas aeruginosa
-Nutritive and selective prpperties of the
media and validity of the test
-Clostridia
-Recommended solution and culture media
-Neutralising agents
USP
Armonizzata
===
Eur. 2.6.13 USP< 62>
( B. Harmonised method)
Microbiological examination of non-sterile products:
test for specified micro-organisms
1. Introduction
2. General procedures
3. Growth-promoting and inhibitory properties of the media and
suitability of the test
3-1. Preparation of tests strains
3-2. Negative control
3-3. Growth promotion and inhibitory properties of the media
3-4. Suitability of the test method
4-6. Results and interpretation
4. Testing of products
4-1. Bile-tolerant gram-negative bacteria
4-2. Escherichia coli
4-3. Salmonella
4-4. Pseudomonas aeruginosa
4-5. Staphylococcus aureus
4-6. Clostridia
4-7. Candida albicans
5. Recommended solutions and culture
Cristina Bandera - Montefarmaco
Europea
Se il prodotto da essere
esaminato possiede attività
antimicrobica, questa deve
essere adeguatamente
neutralizzata
USP
Vedi conta
Cristina Bandera - Montefarmaco
Armonizzata
Se il prodotto da essere
esaminato possiede attività
antimicrobica, questa deve
essere se possibile rimossa o
neutralizzata come descritto al
capitolo 2.6.12 ( < 61>).
Se sono utilizzati dei tensioattivi
per la preparazione del
campione, deve essere
dimostrata la loro assenza di
tossicità verso i microrganismi e
la loro compatibilità con
eventuali inattivanti usati, come
descritto in 2.6.12 ( < 61>).
Metodo- Neutralizzante
Sostanza inibente
Glutaraldeide, mercuriali
Sodio idrogeno solfito (sodio bisolfito)
Fenolici, alcoli, aldeidi, sorbato
Diluizione
Aldeidi
Glicina
Composti dell’
ammonio quaternario,
parabeni, bi-guanidi
Lecitina
Composti dell’
ammonio quaternario,
iodio, parabeni
Polisorbato (Tween)
Mercuriali
Tioglicolato
Mercuriali, alogeni, aldeidi
Tiosolfato
Sodio EDTA
Ioni calcio o magnesio
Cristina Bandera - Montefarmaco
Ricerca patogeni –esecuzione: bile tolerant gramnegative bacteria
Europea
USP
(Enterobacteria and certain other gramnegative bacteria)
===
Sebbene il test sia stato designato per ricercare
i batteri che appartengono alla famiglia delle
Enterobacteriaceae, si riconosce che possono
essere trovati anche altri tipi di microrganismi
(ad es. Aeromonas e Pseudomonas).
Come armonizzata, ma:
- Campione preparato come metodo per conta (
10 g diluiti 1:10) da cui si preleva la quantità
corrispondente ad 1g
- incubare con LB ( Lactose Broth)a 35-37°C
per 2-5 ore
- 1 g o 1 ml in100 ml di EEB per 18-48 ore a
35-37°C
- Subcolture in VRBA a 35- 37°C per 18-24
ore
- Il test è passato se non ci sono colonie di
gram-negativi.
- Contare le colonie di gram-negativi ben
sviluppate, rosse o rossastre.
Armonizzata
Preparare un campione da almeno 1g e diluirlo 1:10 come descritto per la
conta, ma usando TSB.
Mescolare ed incubare a 20-25°C per 2-5 h (tempo sufficiente a
resuscitare i microrganismi, ma non a permetterne la moltiplicazione).
Assenza
Se non prescritto diversamente inoculare EEB con un volume della
preparazione precedente corrispondente ad 1g di prodotto ed incubare a
30-35°C per 24-48 h.
Fare subcolture su piastre di VRBA ed incubare a 30-35°C per 18-24 h.
Il prodotto è in specifica se non si ha crescita di colonie.
Test quantitativo
Inoculare adeguate quantità di EEB con la preparazione precedente o con
sue diluizioni, così che contengano 0.1, 0.01 e 0.001 g o ml di prodotto.
Incubare a 30-35°C per 24-48 h.
Per ogni coltura fare subcolture su VRBA ed incubare a 30-35°C per 18-24 h.
Leggere le piastre ed annotare su quali si ha crescita di colonie. Interpretare
i risultati con la tabella dell’
MPN
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0.1 g or
0.1 ml
0.01 g or
0.01 ml
0.001 g or
0.001 ml
Probable number
of bacteria per
gram o millilitre of
product
+
+
+
> 103
+
+
-
<103 and > 102
+
-
-
-
-
-
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<103 and > 102
< 10
Ricerca patogeni- esecuzione: Escherichia
coli
Europea
USP
Armonizzata
Preparare il campione come descritto per la
conta ed usare 10 ml o la quantità
corrispondente ad 1 g o ml per inoculare 100
ml di TSB. Omogeneizzare ed incubare a 3537°C per 18-48 h.
Agitare il contenitore, trasferire 1 ml di TSB in
100 ml di MCB ed incubare a 43-45°C per
18-24 h.
Fare subcolture su una piastra di MCA ed
incubare a 35-37°C per 18-72 h.
La crescita di colonie rosse, non mucoidi di
bastoncelli gram-negativi indica la possibile
presenza di E. coli. Questo va confermato
con adatti test biochimici, come la produzione
di indolo.
Il prodotto è conforme se non si vedono
colonie del tipo descritto e o se i test
biochimici sono negativi.
Aggiungere al campione contenuto in un
adeguato contenitore 100 ml di LB ed
incubare (30-35°C per 24-48 h).
Esaminare il campione: se si ha crescita
strisciare con un’
ansa su MCA, chiudere ed
invertire la piastre ed incubare (30-35°C per
24-48 h).
Se nessuna colonia è simile a quelle della
tabella (tipica colorazione gram negativa,
cocco-bacilli, colonie rosso mattone con
eventuale alone di bile precipitata) il prodotto
è conforme.
Se si trovano colonie simili alla descrizione
strisciare ognuna su Levine EosinMethylene Blue Agar. Se dopo incubazione
nessuna colonia è blu-nera con la luce
trasmessa e con riflessi metallici con la luce
riflessa il prodotto è conforme. Altrimenti
confermare la presenza di E. coli con altri
adeguati test biochimici e colturali.
Preparare un campione da almeno 1g e
diluirlo 1:10 come descritto per la conta ed
usare 10 ml o la quantità corrispondente ad 1
g o ml per inoculare un’
adeguata quantità di
TSB. Mescolare ed incubare a 30-35°C per
18-24 h.
Agitare il contenitore, trasferire 1 ml di TSB
in 100 ml di MCB ed incubare a 42-44°C
per 24-48 h.
Fare subcolture su una piastra di MCA ed
incubare a 30-35°C per 18-72 h.
La crescita di colonie indica la possibile
presenza di E. coli. Questo va confermato
con test di identificazione.
Il prodotto è conforme se non sono presenti
colonie o se l’
identificazione è negativa.
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Europea
USP
Preparare il campione come descritto per la
conta ed usare TSB come diluente.
Omogeneizzare ed incubare a 35-37°C per
18-24 h.
Trasferire 1 ml di TSB in 10 ml di TBG
(Tetrathionate bile brilliant green broth) ed
incubare a 41-43°C per 18-24 h.
Fare subcolture su almeno due tipi di piastre
tra DCA( Deoxycholate citrate agar), XLD
(Xylose, lysine, deoxycholate agar )e BGA
(brilliant green phenol red lactose sucrose
agar) ed incubare a 35-37°C per 18-72 h.
La probabile presenza di Salmonella è
indicata dalla crescita di colonie
corrispondenti alla tabella. La crescita di
colonie ben sviluppate, rosse, con o senza
centri neri su terreno TSIA ( triple sugar iron
agar) indica la possibile presenza di
Salmonella. Questo va confermato con test di
identificazione.
Il prodotto è conforme se non sono presenti
colonie o se l’
identificazione è negativa
Aggiungere al campione contenuto in un
adeguato contenitore 100 ml di LB ed
incubare 30-35°C per 24-48 h.
Esaminare il campione: se si ha crescita
mescolare agitando delicatamente. Pipettare
porzioni da 1 ml in flaconi contenenti 10 ml di
SCB ( Selenite) e 10 ml di TBG(
Tetrationato Medium) ed incubare a 3035°C per 12-24 h.
Strisciare con un’
ansa su BGA, XLD e BSA
ed incubare 30-35°C per 24-48 h.
Se nessuna delle colonie è simile alla
descrizione della tabella, il campione è
conforme.
Se sono presenti colonie simili, inocularne
alcune rappresentative con un ago in una
provetta a butt-slant di TSIA, prima
strisciando sullo slant, poi infiggendo l’
agar.
Se non si ottengono slant rossi (alcalini) e
butt gialli (acidi) con o senza annerimento da
produzione di H2S, il campione è conforme.
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Armonizzata
Preparare il campione come descritto per la
conta ed usare la quantità corrispondente a
non meno di 10 g o ml per inoculare
un’
adeguata quantità di TSB. Mescolare ed
incubare a 30-35°C per 18-24 h.
Trasferire 0.1 ml di TSB in 10 ml di RVB (
Rappaport Vassiliadis Broth) ed incubare a
30-35°C per 18-24 h.
Fare subcolture su piastre di XLD ed
incubare a 30-35°C per 18-48 h.
La crescita di colonie ben sviluppate, rosse,
con o senza centri neri indica la possibile
presenza di Salmonella. Questo va
confermato con test di identificazione.
Il prodotto è conforme se non sono presenti
colonie o se l’
identificazione è negativa.
Aspetto delle colonie Aspetto delle colonie
Terreno
Eur. Ph
USP
DCA
Ben sviluppate, incolori
===
XLD
Ben sviluppate, rosse con o senza
centri neri
Rosse,con o senza centri neri
BSA
===
Nere o verdi
BGA
Piccole, trasparenti, incolori, rosa
o bianco-opaco, spesso circondate
da un alone rosa o rosso
Piccole, trasparenti, incolori, o da
rosa a bianco-opaco,
frequentemente circondate da un
alone rosa o rosso
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2
Europea
USP
Armonizzata
Preparare il campione come descritto
per la conta ed usare 10 ml o la
quantità corrispondente ad 1 g o ml
per inoculare 100 ml di TSB.
Omogeneizzare ed incubare a 3537°C per 18-48 h.
Fare subcolture su una piastra di CA
( cetrimide agar) ed incubare a 3537°C per 18-72 h.
Il prodotto è conforme se non si ha
crescita. Se si verifica crescita di
bastoncelli gram-negativi, trasferire
alcune colonie morfologicamente
differenti in TSB ed incubare a 4143°C per 18-24 h.
Il prodotto è conforme se non si ha
crescita a 41-43°C.
(cerotti)
Aggiungere al campione 100 ml di
TSB, mescolare ed incubare 30-35°C
per 24-48 h.
Esaminare il campione: se si ha
crescita strisciare con un’
ansa su CA,
chiudere ed invertire la piastre ed
incubare 30-35°C per 24-48 h.
Se nessuna colonia è simile a quelle
della tabella il prodotto è conforme.
Preparare un campione da almeno 1g
e diluirlo 1:10 come descritto per la
conta ed usare 10 ml o la quantità
corrispondente ad 1 g o ml per
inoculare un’
adeguata quantità di
TSB. Mescolare ed incubare a 3035°C per 18-24 h. (cerotti)
Fare subcolture su una piastra di CA
ed incubare a 30-35°C per 18-72 h.
La crescita di colonie indica la
possibile presenza di P. aeruginosa.
Questo va confermato con test di
identificazione.
Il prodotto è conforme se non sono
presenti colonie o se l’
identificazione
è negativa.
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Europea
USP
Armonizzata
Preparare il campione come descritto
per la conta ed usare 10 ml o la
quantità corrispondente ad 1 g o ml
per inoculare 100 ml di TSB.
Omogeneizzare ed incubare a 3537°C per 18-48 h.
Fare subcolture su una piastra di
BPA ed incubare a 35-37°C per 1872 h.
La presenza di colonie di gram
positivi nere, circondate da un alone
chiaro indica la presenza di S. aureus.
La conferma deve essere effettuata
con adatti test biochimici, come la
coagulasi e la desossiribionucleasi.
Il prodotto è conforme se non sono
presenti colonie del tipo descritto o
se i test biochimici sono negativi.
Aggiungere al campione 100 ml di
TSB, mescolare ed incubare 30-35°C
per 24-48 h.
Esaminare il campione: se si ha
crescita strisciare con un’
ansa su
VJA (o BPA o MSA), chiudere ed
invertire la piastre ed incubare 3035°C per 24-48 h.
Se nessuna colonia è simile a quelle
della tabella il prodotto è conforme.
Preparare un campione da almeno 1g
e diluirlo 1:10 come descritto per la
conta ed usare 10 ml o la quantità
corrispondente ad 1 g o ml per
inoculare un’
adeguata quantità di
TSB. Mescolare ed incubare a 3035°C per 18-24 h. (cerotti)
Fare subcolture su una piastra di
MSA ed incubare a 30-35°C per 1872 h.
La crescita di colonie gialle/bianche
circondate da un alone giallo indica la
possibile presenza di S. aureus.
Questo va confermato con test di
identificazione.
Il prodotto è conforme se non sono
presenti colonie del tipo descritto o se
l’
identificazione è negativa.
Cristina Bandera - Montefarmaco
Terreno
Aspetto delle Fluorescenza
Aspetto
colonie
al
l
’
UV
microscopico
VJA
Vogel Johnson agar
Nere con alone giallo
===
Cocchi gram+ in
grappoli
MSA
Sal Agar medium
Gialle con aloni gialli
===
Cocchi gram+ in
grappoli
BPAB
Baird-Parker Agar
Nere, brillanti, con aloni
chiari da 2 a 5 mm
===
Cocchi gram+ in
grappoli
CA
Cetrimide Agar Medium
Verdastre
verdastre
Bastoncelli gram-
PA per F
Pseudomonas agar
medium for Detection
of Fluoreiscin
Da incolori a
giallognole
Giallastra
Bastoncelli gram-
PA per F
Pseudomonas agar
medium for Detection
of Pyocynanin
Verdastre
Blu
Bastoncelli gram-
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Testdel
l
’
ossi
dasiedeipi
gment
i
Test della coagulasi
Trasferire le colonie sospette con
un’
ansai
npr
ovet
t
ei
ndi
v
i
dual
i
contenenti 0.5 ml di plasma di
mammifero (preferibilmente
coniglio o cavallo). Incubare in
bagnomaria a 37°C, esaminando
le provette dopo 3 h e ad
intervalli fino a 24 h. Usare anche
controlli positivi e negativi. Il
prodotto è conforme se non si
osserva alcuna coagulazione.
Trasferire le colonie sospette con
un’
ansasuPseudomonas agar per
la fluorescina e per la
piocianina.Incubare per non meno di
3 gg a 35 +/-2°C. Esaminare sotto
una lampada UV per evidenziare le
caratteristiche in tabella. Confermare
l
apr
esenzaconl
’
os
si
das
i
.Por
r
el
e
colonie a contatto con N,N-dimetil-pfenilendiammina diidrocloruro. Il
prodotto è conforme se non si
sviluppa un colore rosa tendente al
porpora. La presenza può essere
confermata con altri test colturali e
biochimici
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Ricerca patogeni- esecuzione Clostridia
Europea
USP
Armonizzata
Test per prodotti in cui è essenziale
escludere la presenza di Clostridi
patogeni. Generalmente hanno una
conta bassa.
===
Preparare il campione come descritto per la conta.
Usando una diluizione 1:10 ( con un volume
minimo di 20 ml) non meno di 2 g o 2 ml di
prodotto.
Prelevare due uguali porzioni ( 10 ml)
corrispondenti ad almeno 1 g o ml. Scaldare una
porzione a 80°C per 10’
e raffreddare rapidamente.
Trasferire 10 ml di ogni porzione in 2 contenitori
con 100 ml di RCM. Incubare in anaerobiosi a
30-35°C per 48 h. Fare subcolture su Columbia
Agar ed incubare in anaerobiosi a 30-35°C per
48 h.
La crescita anaerobica di bacilli, con o senza
spore, catalasi negativi indica la presenza di
clostridi.
Se non si ha crescita o se la catalasi è positiva il
prodotto è conforme.
Preparare il campione come descritto
per la conta. Prelevare due uguali
porzioni corrispondenti ad 1 g o ml.
Scaldare una porzione a 80°C per 10’
e raffreddare rapidamente.
Trasferire 10 ml di ogni porzione
in 2 contenitori con 100 ml di
RCM (Reinforced medium for
Clostridi). Incubare in anaerobiosi a
35-37°C per 48 h. Fare subcolture
su Columbia Agar con
Gentamicina ed incubare in
anaerobiosi a 35-37°C per 48 h.
Se non si ha crescita o se la catalasi
è positiva il prodotto è conforme.
Se si ha crescita fare subcolture su
Columbia senza Gentamicina ed
incubare in aerobiosi e anaerobiosi.
La sola crescita anaerobica di bacilli
gram +, con o senza spore, catalasi
negativi indica la presenza di
Cristina Bandera - Montefarmaco
Clostridium spp.
Europea
USP
Armonizzata
Preparare un campione come descritto per la conta ed
usare 10 ml o la quantità corrispondente ad 1 g o ml
per inoculare 100 ml di Sab Broth e mescolare.
Incubare a 30-35°C per 3-5 gg.
Fare subcolture su una piastra di SDA ed incubare a
30-35°C per 24-48 h.
La crescita di colonie bianche può indicare la presenza di
C. albicans. Questo va confermato con test di
identificazione.
Il prodotto è conforme se non sono presenti colonie del
tipo descritto o se l’
identificazione è negativa
Cristina Bandera - Montefarmaco
Europea
USP
Per testare la sterilità del terreno
e del diluente e l’
esecuzione
asettica del test, eseguire
l’
analisi usando sol. fisiol.
peptonata pH 7.0 come
campione. Non ci deve essere
crescita di micro-organismi
===
Cristina Bandera - Montefarmaco
Armonizzata
Per verificare le condizioni di
test eseguire un controllo
negativo usando il diluente
invece del campione. Non ci
deve essere crescita.
In caso di crescita deve essere
condotta un’
investigazione
Frequently asked questions on chapter 2.6.13
Microbiological examination of non-sterile products: test for
specified micro-organisms
PARAGRAPH
CONCERNED
QUESTIONS
3.1 Preparation of the test
strain
Can I use other strains than those that
are cited in the Ph. Eur.?
You must use the micro-organisms that are
cites in this chapter, or equivalent strains
from other culture collections.
3.2 Negative control
When are you actually supposed to do
the negative control: when testing the
suitability of the metodo, or when
testing the product, or in both
situations?
You are supposed to do the negative control
at the same time as when you are testing the
product.
3.2 Negative control
What is the purpose of the negative
control?
The purpose of this negative control is to
show that there is no contamination during
the testing of the product. If a positive result
is obtained whit a negative control, the test
can be regarded as invalid and may be
repeated
3.2 Negative control
Does it have to be done every time the
product is testd or during the method
validation or is it possibile to do it
periodically?
It is preferable to do a negative control every
time that the product is test
ANSWERS
Cristina Bandera - Montefarmaco
Frequently asked questions on chapter 2.6.13
Microbiological examination of non-sterile products: test for
specified micro-organisms
PARAGRAPH
CONCERNED
4.1 Bile-tolerant Gram-negative
bacteria
QUESTIONS
ANSWERS
What are “the Bile-tolerant Gramnegative bacteria”
?
There in no strict definition of this
group of micro-organism. They are
defined operationally as those microorganisms that show growth in the
stated conditions on Violet Red Bile
Glucose Agar medium. They include
Pseudomonas such as Burkolderia
capacia. Gram negative bacteria that
grow in the presence of bile salts and
whoch are non-lactose fermenting but
able to utilise glucose, can grow on
the agar eg. some Pseudomonas,
Aeromonas and Yerdinia species
Cristina Bandera - Montefarmaco
Frequently asked questions on chapter 2.6.13
Microbiological examination of non-sterile products: test for
specified micro-organisms
PARAGRAPH
CONCERNED
4.1.3-2 Interpretation
QUESTIONS
ANSWERS
In chapter 5.1.4-1, acceptance criteria
for microbiological quality of nonsterile dosage form the specification
for bile-tolerant gram-negative
bacteria in given in CFU. In chapter
2.6.13 under 4. Testing of products, it
is stated that is determinad for bile.tolerant gram-negative bacteria. This
is a discrepancy, beaucose CFU ia a
measure of viable bacterial numbers
whereas the determined number of
bacteria would enfolded all cells,
dead and living: Could you advise on
the correct units to be used for the
Bile-tolerant test? Should it be most
probable of bacteria/ml or CFU/ml or
both these units are inerchangeable?
There is a little discrepancy, because
“
bacteria”pergi
nitself is not correct
since these are indeed colonies.
However in this context the words
can be considered as
interchangeable
Cristina Bandera - Montefarmaco
Frequently asked questions on chapter 2.6.13
Microbiological examination of non-sterile products: test for
specified micro-organisms
PARAGRAP
CONCERNED
QUESTIONS
ANSWERS
4.2 Escherichia coli
In 4-2-2 selection and subculture, what is
the purpose of the elevated temperature
42-44 °C?
Can one utilise an alternative
temperature range, eg.35-37°C provided
that recovery of E. coli during
qualitficatio?
The purpose of the elecated
temperature,42-44°c is to allow for
selective conditions for E. coli. The
selected temperature is usually a
compromise between sensitivity and
specificity as not all strains of E. coli will
grow, or grow and produce gas, at these
higer incubation temperatures.
An alternative temperature range would
depart from the Ph. Eur. Methos, but you
can always use altermìnative methods as
described in the general notice of the Ph.
Eur. (chapter 1.2)
4.2.3 Interpretation
If 10 g of sample is added to the initial
broth for a test such as E. coli ( 4.2), but
an amount is immediately suvcultured
into a second broth that is only
representative of 1g of actual product
and this broth in incubated. At the end of
testing, can this test be classified, for a
negative resuklt, as “nonedetected per
10g”oras “nonedetecte perg”
The quantity is preincubated is 1 g
therefore the outcome of the test is
“
abcsence i
n1g”For salmonella you will
note that an “absance i
n10g”t
es
thas
been implemented
Cristina Bandera - Montefarmaco
Frequently asked questions on chapter 2.6.13
Microbiological examination of non-sterile products: test for
specified micro-organisms
PARAGRAP
CONCERNED
QUESTIONS
ANSWERS
4.5.3 Staphylococcus aureus
Interpretation
It is observed that on selective media of
S. aureus, yellow colonies of grampositive cocci in chains are seen, but
the yellow colonies are without clear
zones in the test sample. Whereas
positive culture of gram-positive cocci in
clusters surrounded by yellow zones
Your product can be contaminated,
maybe not by the species described in
the Ph. Eur. but by another
microoraganism. Good laboratory
practice should make you thik that there
is a problem and that you should
investigate (eg identify the species and
find out whre it come from). Probably the
product cannot be released. But it is up
to the QC laboratory manager to decide.
4.6 Clostridia
For which pharmaceutical products or
raw materials is it prescribed to search
for clostridia?
For powdered animal organs, products
with risk of faecal contamination by
clostridia and possible proliferation,
natural raw materials, possible telluric
contamination. However it has not been
introduced in any monograoh yet. The
test is particularly relevant, where a
preparations in exposed to anaerobic or
low-oxygen conditions during use
Cristina Bandera - Montefarmaco